高效生产猪白细胞干扰素的方法

专利名称：高效生产猪白细胞干扰素的方法
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及一种高效生产猪白细胞干扰素的方法。
技术背景猪病毒性疾病仍是当前严重制约养猪业健康发展的主要传染病。而传统 的传染病治疗方案临床上有时难以凑效，尤其针对病毒病办法不多。猪病毒 性疾病至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草 药制剂预防和治疗猪病毒性疾病的试验,但治愈率较低。抗生素及磺胺类药物 基本无效。目前，猪干扰素是治疗猪病毒性疾病的有效药物。猪白细胞干扰素研发工作已取得重大突破，现在养猪场和动物医院广泛 使用。结果证明，生产的猪白细胞干扰素对治疗猪痙，猪病毒性腹竭，猪病毒性感冒等病毒性疾病。人工控制治疗猪瘟和猪病毒性腹泻总治愈率为88. 3 %和94.2 % 。95111427.1提供一种猪白细胞干扰素注射剂及其制造方法； 200410065926.5提供一种高效生产猪白细胞干扰素的方法； 200610124195.6提供一种猪p干扰素重组腺病毒及其构建方法和应用； 200610124194.1提供一种猪a干扰素重组腺病毒及其构建方法和应用。 上述申请的专利中使用常规用鸡新城疫病毒(NDV)诱导猪白细胞产生 干扰素含量低。使用该制备方法生产的干扰素含量高，显著降低了生产成本。 羧曱基茯苓多糖是一种具有新型免疫调节作用物质，能刺激人体免疫系 统的功能，诱生和促生干扰素产生，也是一种的白细胞调节素。羧曱基茯荟 多糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗放射、保肝、催眠等广泛的药理 活性，能诱生与促诱生人血细胞产生干扰素-a (IFN-a),干扰素-r (IFN-r), 白细胞介素-2 (IL-2 )，白细胞介素-6 (IL-6)，肿瘤坏死因子-a (TNF-a),与 粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞活性因子。羧曱基茯萃 多糖是一种新型的生物反应调节剂(BRM)。具有间接抗病毒、抗肺瘤作用。但有关利用鸡新城疫病毒F抹(NDV-F)和羧曱基茯苓多糖作复合干扰素 诱导剂高效制备干扰素的方法目前还未见报道。因此，提供一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，是该技术领域科研人 员急需开发的新课题之一。 发明内容本发明的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种高效生产猪白 细胞干扰素的方法。为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，其特征在于具体实施步骤如下(1) 无菌采集猪血，加入10吗/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0。C冰箱放 置；以2000-4000rpm离心猪血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉 淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含l x 105-1 x 107;(2) 白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于 37°C水浴搅拌培养0.5-2小时；(3) 再加入羧曱基茯荟多糖，使其最终浓度为25-100吗/ml，于37。C水浴 搅拌培养l-2小时；(4) 然后在上述白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最 终浓度为128-1280血凝单位/ml， 37。C摇床搅拌培养18-24小时；(5 )待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0， 4.0°C， 放置l-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制猪白细胞干扰素。本发明的有益效果是猪基因工程干扰素具有制备成本高，在临床推广 中受到很到限制。本发明利用猪血制备猪白细胞干扰素的方法其具有很多 优点制备成本低，疗效好。常规用NDV-F诱导猪白细胞产生干扰素含量低，本发明在NDV-F抹诱导白细胞干扰素过程中加入羧曱基茯苍多糖，显著 提高利用猪血制备猪白细胞干扰素的含量，显著降低了药物的成本。本产品 注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等 优点。
具体实施方式
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下 实施例1一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，具体步骤如下(1) 白细胞制备无菌采集猪血，加入抗生素和抗凝剂，4.0。C冰箱放置。以2000-4000rpm 离心猪血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度 稀释为每ml含1 xl06。白细胞的分离应在釆血后48小时内进行。活细胞数应 达到90%以上。(2) 诱生病毒采用新城鸡痘病毒(NDV) F抹，血凝效价达到适宜滴度方可投产。 (3 )培养液采用细胞培养基RPMI-1640，内含5-10%猪血清和10 pg/ml卡那霉素或庆 大霉素，也可用其它适宜培养液。(4) 生产用原水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。(5) 粗制干扰素'的制备工艺 (5.1 )诱生病毒的制备采用9-10日龄健康鸡胚，于每胚的尿嚢腔内接种适量NDV-F, 37。C培养 48-72小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿嚢液，并做无菌试 验，检验合格后合并，抽样做效价测定，放-20。C待用；(5.2) 白细胞悬液用离心法分离血浆，吸取白细胞层，然后用步骤(3)中配置的培养液稀 释，以每ml含5xl()6为宜；(5.3) 起动与诱生白细胞悬液中加入少许白细胞干扰素，使其最终浓度为600IU/ml，于37。C 水浴搅拌培养0.5小时，再加入羧曱基茯苍多糖，使其最终浓度为100吗/ml， 于37。C水浴搅拌培养1.5小时；(5.4 )再加入1024血凝单位/ml NDV-F抹进行诱生，待干扰素达到高峰值 时，收集上清，将上清经酸化和中性化后灭活病毒，即为粗制猪白细胞干扰 素；(5.5) 待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0, 4.0°C,放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制猪白细胞干扰素；(5.6) 离心收集上清即得粗制白细胞干扰素，放-20。C保存；(5.7) 留样分别作无菌试验、余毒试验及安全检验，并以微量法滴定干 扰素效价。通过此法制备的猪粗制干扰素共l次，2个批号，获得了高产量干扰 素，平均效价大于31600 IU/ml。不加入羧曱基茯茶多糖的常规诱生组干扰素平 均效价低于11340 IU/ml。干扰素效价测定采用CPE (细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定 法，以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞人羊膜细胞Wish细胞 (50)免受水泡性口腔炎病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位。以国际 单位(IU)表示，并用国家标准品校正结果。实施例2一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，具体步骤如下(1) 无菌采集猪血，加入10吗/ml青霉素、链霉素和适量抗凝剂，4.0°C 冰箱放置。以4000rpm离心猪血，收集灰黄层，用配置好的1640培养基稀释 细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含l xio7。(2) 在白细胞悬液中加入8%猪血清或血浆，混匀。(3) 在上述白细月包悬液中加入少许干护C素，4吏其最终浓度为200-300 IU/ml,于37。C水浴搅拌培养1小时。(4) 再加入羧曱基茯荟多糖，使其最终浓度为25吗/ml;于37。C水浴搅拌 培养2小时。(5 )在启动的白细胞悬液中再加入512血凝单位/mlNDV-F林进行诱生， 37。C摇床搅拌培养12-24小时。(6)待干扰素达到高峰值时，以3000rpm离心，离心收集上清，加入盐 酸调至pH2.0, 4.0°C，放置4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制猪细胞干扰素。留样测定干扰素效价，通过此法制备的猪粗制干扰素共2次，4 个批号，获得了高产量干扰素，平均效价大于25600IU/ml。不加入羧曱基茯苍 多糖的常规诱生组干扰素平均效价低于12560 IU/ml。 实施例3一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，具体步骤如下(1) 无菌采集猪血，加入10um/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0。C冰箱放 置。以4000rpm离心猪血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物， 使白细胞浓度稀释为每ml含1 xl05。(2) 白细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为800IU/ml，于37。C 水浴搅拌培养2小时。(3) 再加入羧曱基茯荟多糖，使其最终浓度为50ug/ml,于37。C水浴搅 拌培养2小时。(4 )在启动的白细胞悬液中再加入256-1280血凝单位/mlNDV-F株进行诱 生，同时在白细胞悬液中加入含5％猪血清或血浆的DMEM培养基，37°C摇床 搅拌培养12-24小时。(5)待干扰素达到高峰值时，以3000rpm离心，收集上清即得粗制猪白 细胞干扰素。留样测定干扰素效加，通过此法制备的猪粗制干扰素共2次，3个 批号，平均效价大于30480 IU/ml。不加入羧曱基茯苍多糖的常规诱生组干扰素 平均效价低于15500 IU/ml。 实施例4一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，具体步骤如下(1) 培养罐灭菌进口罐推入灭菌拒灭菌，国产罐采用管道通入高压蒸 汽进行灭菌，并先打开排气阀，使罐体充分预热和排尽罐内冷空气，使罐内 温度达120-125。C,维持30分钟，可彻底灭菌，然后停气冷却。(2) 培养液的配置用RPMI1640并按300mg/L谷氨酰胺，40000 U/L庆 大霉素或卡那霉素，2% (v/v)猪血浆进行配制，当罐体温度降至40。C时，用 Millipore多层膜过滤器将培养基滤入罐内，确保培养基无菌，开动搅拌装置及 恒温系统，使转速控制在120rpm/min,温度控制在36-37。C。(3) 制备猪白细胞悬液将9倍体积的0.83Q/。冷NH4C1加入分浆后的血细 胞中，于4。C存放10 20分钟，经2000r/min离心10分钟收集细胞，再用冷0.83% nh4c1再处理一次，尽量除去红细胞，将收集的白细胞，用PBS洗两次，用培 养液洗一次后，集中至大瓶中，与连通的导液管导入罐内，搅拌20-30分钟后， 准备好干扰素液(最终浓度为500/ml)和NDV-F抹病毒液及5。/q NaHC03，分别 与进样口的导液管接通。(4) 起动诱导先加入IFN-a悬液[按l。/o(v/v),即IOO IU/ml]，同时加入 羧曱基茯苓多糖[使其最终浓度为80pg/m1],然后搅拌培养2小时，进行起动诱 生。(5) 正式诱导打开病毒导液管，将NDV-F系(1:1280以上)导入罐内， 按10°/。加入，即512血凝单位/ml进行正式诱生，并用5% NaHC03调整pH至 7.2-7.4，搅拌培养18-20小时。(6) 收获干扰素诱导结束，由罐底部的排液管放出诱导后的细胞悬液， 离心后收上清，经6N HCL酸化至pH2.0、于4。C存放5天，再用6N NaOH调回 PH至7.0， 2500r/min离心20分钟，离心收集上清即得粗制白细胞干扰素，放 -20°。保存。(7) 除菌后无菌分装，冷冻干燥。留样测定干扰素效加，通过本发明获 得了高产量干扰素，平均效价大于为33890IU/ml。不加入羧曱基茯苓多糖的常 规诱生组干扰素平均效价低于18690 IU/ml。使用该制备方法生产的干扰素含量高，显著降低了生产成本。具体方法 如下首先取猪新鲜抗凝全血，无菌留取灰黄层，使用NDV-F和羧曱基茯苓多 糖作为复合诱生剂诱导健康猪白细胞干扰素，其包括有白细胞悬液、启动干 扰素、病毒液和培养液，经原料制备—混和—水浴搅拌、诱导培养—离心收 获—灭活病毒—解冻除菌—分装—成品包装工序制成，制成的猪白细胞干扰 素。留样分别作无菌试验、余毒试验及安全检验。通过此法制备的猪粗制干 扰素共3次，4个批号，获得了高产量干扰素，平均效价大于30720 IU/ml,无菌 试验、余毒试验均阴性，动物体内注射后均健康存活，无不良反应。本发明制备的猪干扰素具有治疗猪病毒性疾病和猪乳房炎等病毒病作用，同时对细菌性疾病也有治疗作用。用于防治猪疾病。如猪病毒性腹泻一 l占膜病、口蹄疫、猪流行热、猪流行热、蓝舌病、疯猪病白痢、猪乳房炎等疾病。用法与用量小猪2万-10万IU/头/天，育猪3万-50万IU/头/天。每日注 射1次， 一个疗程3次，病重用量略加。通过本发明获得了高产量干扰素，通过此法制备的猪粗制干扰素共7次, ll个批号，其中6个批号效价在30720IU/ml以上(最高达40960IU/ml);其余效 价在20480IU/ml以上。平均效价约为28230IU/ml，使用该制备方法生产的干 扰素含量高，显著降低了生产成本。留样干扰素无菌试验、余毒试验均阴性，动物体内注射后均健康存活，无 不良反应。副作用，对猪病毒性传染性疾病有良好治疗效果。本发明是一种广 谱抗病毒制剂，主要治疗猪病毒性疾病，例如猪蓝舌病、猪传染性鼻气管炎、 猪病毒性腹泻-黏膜病病毒性和猪轮状病毒病等。通过注射该制剂，使其与周 围细胞发生反应，诱导细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的繁殖，起到抗 病毒作用。临床实验证明利用本发明研制的猪白细胞干扰素治疗猪蓝舌病、猪传染性鼻气管炎、 猪病毒性腹泻-黏膜病病毒性和猪轮状病毒病等猪疾病共521头，治愈364头， 治愈率达69.9%;其中特别是治疗猪轮状病毒引起的腹泻有效率达95.4%，治 愈率高达92.5%,效果非常显著。病毒性腹泻患猪用干扰素单独治疗后的痊愈 率明显高于用干扰素治疗的对照组。上述参照实施例对该高效生产猪白细胞干扰素的方法进行的详细描述， 是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此 在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，其特征在于具体实施步骤如下(1)无菌采集猪血，加入10μg/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm离心猪血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1×105-1×107；(2)白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-1000IU/ml，于37℃水浴搅拌培养0.5-2小时；(3)再加入羧甲基茯苓多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴搅拌培养1-2小时；(4)然后在上述白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃摇床搅拌培养18-24小时；(5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH 2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH 7.0，即得粗制猪白细胞干扰素。
全文摘要
本发明公开了一种高效生产猪白细胞干扰素的方法，实施步骤如下(1)无菌采集猪血，加入抗生素和抗凝剂，4.0℃冰箱放置；以2000-4000rpm离心猪血，收集灰黄层，用配置好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1×10⁵-1×10⁷；(2)白细胞悬液中加入100-1000IU/ml干扰素，于37℃水浴搅拌培养2-3小时；(3)再加入羧甲基茯苓多糖，使其最终浓度为25-100μg/ml，于37℃水浴搅拌培养1-2小时；(4)在启动的白细胞悬液中再加入适量诱生剂鸡新城疫病毒，使其最终浓度为128-1280血凝单位/ml，37℃摇床搅拌培养18-24小时；(5)待干扰素达到高峰值时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，即得粗制猪白细胞干扰素。该方法生产的干扰素含量高，生产成本明显降低。
文档编号C07K1/00GK101250224SQ200810052659
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月8日 优先权日2008年4月8日
发明者古长庆 申请人:天津生机集团股份有限公司