专利名称：：一种病毒抗原的纯化方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种病毒抗原纯化方法。
背景技术：
：由于人用疫苗的普及率高、用量大，且使用对象多为婴幼儿和儿童，因此世界卫生组织和各国药物管理部门均对疫苗中残留杂蛋白和残留DNA的量有严格的要求。在传统粗制疫苗包括全毒疫苗的基础上，纯化病毒成分制备纯化疫苗，已成为今后发展的必然趋势。病毒抗原的纯化是疫苗研究及生产中的一个关键问题。疫苗分离纯化研究方兴未艾，国内外关于疫苗及其分离纯化的论文和专利也相应逐年递增。针对不同的疫苗制品应选用不同的分离纯化路线，但一般而言，都包括两个基本阶段初分离和纯化(见图l)。初分离阶段的主要任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物(如果产物在细胞内)，浓缩产物和去除大部分杂质等，这一阶段可选用的分离方法包括细胞破碎技术、离心沉降和各种沉淀方法等，纯化阶段则选用各种具有高分辨率的技术以使产物和少量干扰杂质尽可能分开，达到所需的质量标准，超速离心技术和各种层析技术成为当前达到此目的的主要方法。灭活疫苗或减毒疫苗来源于经减毒或灭活工艺而得的活病原体，或者从被感染的病原体中分离得到的不具传染性的病毒颗粒。这种疫苗由全颗粒菌体或病毒组成，其纯制过程相对于一些亚单位疫苗、基因工程疫苗的生产工艺要简单许多，主要在于去除病毒核酸和杂蛋白，一般只涉及简单分离，早期大多釆取连续离心、沉淀、过滤或萃取等物理、化学方法提纯。由于具有操作简单、工艺经济且易于放大等特点以及有一定的安全性记录等原因，连续离心法、沉淀和过滤技术在疫苗的分离中仍被普遍采用，但以前那种由简单分离得到的灭活疫苗和减毒疫苗一般均存在纯度、活力以及安全性偏低的缺点，很难再通过药物管理机构的批准。随着层析技术的日臻成熟，沉淀、离心和过滤技术在疫苗的分离纯化过程中虽仍被广泛应用，但更多的只是作为起始步骤，用于初分离过程。层析技术因其条件温和、重复性好、便于产业化，层析技术己逐渐替代沉淀和离心等传统技术并与之相结合成为疫苗分离纯化的主流。但现有文献中所建立的层析分离纯化工艺大多还滞留在实验室阶段，适应于大规模生产的纯化工艺还有待研究和开发；同时新疫苗高纯度的生产目标带来的往往是纯化技术路线的复杂性，这势必会对活性疫苗的回收率和生产高效性产生负面影响。因此，需要开发出适应于大规模生产的、高纯度的病毒抗原纯化工艺
发明内容本发明的目的是提供一种纯化效果好的病毒抗原纯化新方法，且工艺条件温和、重复性好、便于产业化。为此，本发明公开了一种病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括阴离子交换柱纯化步骤。本发明的创新点在于纯化方法中采用了阴离子交换柱纯化步骤，阴离子交换柱中的阴离子交换树脂作为纯化介质，其具有高吸附载量的特性，属于琼脂糖凝胶离子交换剂。该介质在分离蛋白质时具有分辨率高，操作简单，重复性好等优点。其原理为由于待分离的蛋白质分子在不同pH下可分别带有不同属性的电荷，从而在作为固定相的离子交换剂和流动相的洗脱液之间发生可逆交换，通过调节洗脱液的pH值，或改变离子浓度等方法，使蛋白质分子在固定相表面发生吸附与解吸附的可逆性变化，达到分离不同蛋白目的。在一定的pH环境下，病毒蛋白及杂蛋白均可带有负电荷，易吸附到阴离子交换剂上，通过改变洗脱溶液的pH和/或离子强度，病毒蛋白及杂蛋白被依次洗脱，达到进一步分离病毒原液中包括宿主细胞蛋白(HostCellProtein,HCP)在内的残余杂蛋白及残余DNA的目的。在一实施例里，所述的病毒抗原可为包括甲型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、流行性出血热、流感病毒、乙型肝炎病毒表面抗原、轮状病毒或人乳头瘤病毒蛋白抗原的中之一，其中优选包含甲型肝炎病毒的的病毒抗原；以上所提及的病毒，如甲型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、流行性出血热、流感病毒、乙型肝炎病毒表面抗原、轮状病毒或人乳头瘤病毒，可以在灭活之前或灭活之后进行纯化，优选在纯化后进行病毒灭活。在一实施例里，一种病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述纯化阶段包括下列步骤a)疏水层析纯化；b)浓縮洗脱液；c)分子筛层析；d)阴离子交换柱纯化；e)分部收集蛋白洗脱峰；其中，在一实施例里，所述疏水层析纯化步骤为病毒原液经疏水柱吸附，吸附完毕用1.0mol/LPB(pH6.4pH7.8)溶液淋洗2-5CV(柱床体积)后，用0.02mol/LPB(pH6.4pH7.8)溶液进行线性洗脱2-8CV，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脱峰；其中，所述疏水柱优选为PhenylSepharose、OctylSepharose、或ButylSepharose型疏水凝胶柱中之一。在一实施例里，所述分子筛层析步骤为将浓缩处理的液体上样于分子筛凝胶，上样量为1-15%CV(柱床体积)，用PBS溶液进行洗脱，收集含有目的病毒抗原的蛋白洗脱峰；其中，所述分子筛凝胶优选S印harose型分子筛凝胶。在一实施例里，所述阴离子交换柱纯化步骤为所得含有目的病毒抗原的蛋白洗脱液上样于阴离子交换柱，用0.01mol/LPBpH7.4溶液淋洗后，用含0.52.0mol/LNaCl的0.01mol/LPBpH5.87.4溶液进行线性洗脱，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脱峰。在一实施例里，所述的阴离子交换柱填料为CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型阴离子凝胶中之一。在一实施例里，所述的病毒抗原原液在精纯化前可以用MWCO-100300KD的超滤膜进行浓縮。在一实施例里，上述病毒抗原纯化方法，其特征在于所述病毒抗原为甲型肝炎病毒抗原。正如本
技术领域：
人员所公知的，本发明所公开的病毒抗原纯化方法，还包括采用组织培养技术或基因工程技术表达、收获病毒抗原；初分离；纯化阶段步骤。在一实施例里，上述病毒抗原纯化方法还包括初分离阶段步骤，其选自等电点沉淀法、盐析法或有机溶剂抽提法，优选有机溶剂抽提法。在一实施例中，所述有机溶剂抽提法为破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以4000rpm的速度28'C离心20分钟，吸取上层蛋白水相。上述纯化过程中，淋洗或洗脱液体体积可根据不同病毒或不同表达培养体系的加以变化和调整，这是本
技术领域：
的技术人员所应该具备的技术常识。6本发明所公开的方法的优点为在生产规模下，实现了对病毒抗原的纯化，疫苗成品中的杂质蛋白及残余DNA含量大大降低，并且所生产的病毒抗原免疫原性好、回收率较高，大大地提高了疫苗成品的安全性；同时本方法工艺条件温和、重复性好、便于大规模地产业化生产。图l病毒抗原的纯化流程图。图2PhenylSepharose6FastFlow疏水凝胶纯化色谱图。图3Sepharose4FastFlow分子筛凝胶层析色谱图。图4QSepharoseFastFlow型离子柱纯化色谱图。图5SDS-PAGE电泳图。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。材料来源Vera细胞工作种子细胞ATCC系列号为No:CCL-81YN-5株HAV:保藏号为CCTCCNO:V200104中国典型培养物保藏中心主要设备和试剂细胞超声破碎仪SONICSVCF1500，最大输出功率为1500W超滤器Pellicon2CassetteFilter;Biomax-100A(MWCO100KD)(Millipore公司)；超滤浓縮器，(MWCO100KD)(Millipore公司)；色谱纯化仪AKTAPikrt(GEHealthcare公司)色谱柱BPG140/950;INdEX140/500(GEHealthcare公司)纯化介质PhenylSepharose、OctylSepharose、ButylSepharose型疏水凝胶(GEHealthcare公司)；Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶；CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型阴离子凝胶；(GEHealthcare公司)小牛血清购自兰州民海生物技术有限公司；细胞培养液为199培养基(GIBCO);实施例l:甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原原液和成品制备参考中国专利号ZL0210685.9中的描述中的描述生产甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原原液和成品。病毒抗原原液生产方法如下a.细胞复苏；取工作细胞库中的1支或几支细胞管，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清的199培养基后置37士rC培养。b.细胞扩增及培养待复苏细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶或其他适宜的消化液消化Vero细胞进行传代扩增，置35土1'C培养2128天收获。c.接种HAV:将YN-5株甲肝病毒接种于Vero细胞。d.接毒细胞的收获和合并将培养21~28天的细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，同一细胞消化批的多瓶细胞收获液，以每分钟30004000转、28'C离心30分钟，收集细胞沉淀，在无菌条件下合并为1批。e.纯化用细胞超声波粉碎仪以1200W1600W输出功率破碎细胞。破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲垸，振摇20分钟，以每分钟4000转的速度28'C离心20分钟，吸取上层蛋白水相，向离心杯中补充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反复提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超滤膜进行浓縮；超滤浓縮液中加入PB缓冲盐，并使缓冲盐充分溶解，经PhenylSepharose6FastFlow型疏水凝胶吸附，吸附完毕用1.0mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集电导值低于50mS/cm的洗脱液；收集的洗脱液用MWCO=100KD的超滤膜进行浓縮，浓縮至适当体积(该体积根据浓縮液的粘度情况，一般控制在柱床体积的5%以内)后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液进行洗脱，收集第二洗脱峰；将收集的洗脱液用超滤浓縮器将缓冲液置换成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，完成病毒抗原原液制备。甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)成品生产方法如下a)甲醛处理将上述病毒抗原原液加入终浓度为1:4000的甲醛，经37土1'C、12天灭活。b)超滤浓縮，即得成品。实施例2:甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原原液和成品制备病毒抗原原液生产方法如下a.细胞复苏；取工作细胞库中的1支或几支细胞管，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清的199培养基后置37土rC培养。b.细胞扩增及培养待复苏细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶或其他适宜的消化液消化Vero细胞进行传代扩增，置35士1'C培养2128天收获。c.接种HAV:将YN-5株甲肝病毒接种于Vero细胞。d.接毒细胞的收获和合并将培养21~28天的细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，同一细胞消化批的多瓶细胞收获液，以每分钟30004000转、28'C离心30分钟，收集细胞沉淀，在无菌条件下合并为1批。e.纯化用细胞超声波粉碎仪以1200W~1600W输出功率破碎细胞。破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以每分钟4000转的速度28。C离心20分钟，吸取上层蛋白水相，向离心杯中补充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反复提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超滤膜进行浓縮；超滤浓縮液中加入PB缓冲盐，并使缓冲盐充分溶解，再经PhenylSepharose6FastFlow型疏水凝胶吸附，吸附完毕用l.Omol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集电导值低于50mS/cm的洗脱液(参见图2);收集的洗脱液用MWCO-100KD的超滤膜进行浓縮，浓縮至适当体积(该体积根据浓縮液的粘度情况，一般控制在柱床体积的5%以内)后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液进行洗脱，收集第二洗脱峰(参见图3);将该收集液上样于QSepharoseFastFlow型阴离子柱，用O.Olmol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用含0.6mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集第一洗脱峰(参见图4)。将收集的洗脱液用超滤浓縮器将缓冲液置换成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)成品生产方法如下a)甲醛处理将上述病毒抗原原液加入终浓度为l:4000的甲醛，经37士rC、12天灭活；b)超滤浓縮，即得成品。实施例3:甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原原液制备病毒抗原原液生产方法如下a.细胞复苏；取工作细胞库中的1支或几支细胞管,将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清的199培养基后置37士rC培养。b.细胞扩增及培养待复苏细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶或其他适宜的消化液消化Vero细胞进行传代扩增，置35土rC培养2128天收获。c.接种HAV:将YN-5株甲肝病毒接种于Vero细胞。d.接毒细胞的收获和合并将培养21~28天的细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，同一细胞消化批的多瓶细胞收获液，以每分钟30004000转、28'C离心30分钟，收集细胞沉淀，在无菌条件下合并为1批。e.纯化用细胞超声波粉碎仪以1200W160t)W输出功率破碎细胞。破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以每分钟4000转的速度28'C离心20分钟，吸取上层蛋白水相，向离心杯中补充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反复提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超滤膜进行浓縮；超滤浓縮液中加入PB缓冲盐，并使缓冲盐充分溶解，再经OctylSepharose4FastFlow型疏水凝胶吸附，吸附完毕用1.0mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集电导值低于58mS/cm的洗脱液；收集的洗脱液用MWCO=100KD的超滤膜进行浓縮，浓縮至适当体积(该体积根据浓縮液的粘度情况，一般控制在柱床体积的5%以内)后上样于Seph咖se4FastFlow型分子筛凝胶，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液进行洗脱，收集第二洗脱峰；将该收集液上样于SOURCE30Q型阴离子柱，用0.01mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用含0.6moi/LNaCl的0.01mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集第一洗脱峰。将收集的洗脱液用超滤浓縮器将缓冲液置换成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。实施例4:甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原原液制备病毒抗原原液生产方法如下a.细胞复苏；取工作细胞库中的1支或几支细胞管，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清的199培养基后置37±TC培养。b.细胞扩增及培养待复苏细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶或其他适宜的消化液消化Vero细胞进行传代扩增，置35士rC培养2128天收获。c.接种HAV:将YN-5株甲肝病毒接种于Vero细胞。d.接毒细胞的收获和合并将培养21~28天的细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，同一细胞消化批的多瓶细胞收获液，以每分钟30004000转、28。C离心30分钟，收集细胞沉淀，在无菌条件下合并为1批。e.纯化用细胞超声波粉碎仪以1200W1600W输出功率破碎细胞。破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲垸，振摇20分钟，以每分钟4000转的速度28。C离心20分钟，吸取上层蛋白水相，向离心杯中补充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反复提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超滤膜进行浓縮；超滤浓縮液中加入PB缓冲盐，并使缓冲盐充分溶解，再经ButylSepharoseFastFlow型疏水凝胶吸附，吸附完毕用1.0mol/LPB(pH7.2)溶液淋洗后，开始用0.02mol/LPB(pH7.2)溶液进行线性洗脱，收集电导值低于61mS/cm的洗脱液；收集的洗脱液用MWCO=100KD的超滤膜进行浓縮，浓缩至适当体积(该体积根据浓縮液的粘度情况，一般控制在柱床体积的5%以内)后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液进行洗脱，收集第二洗脱峰；将该收集液上样于DEAESephadexA-50型阴离子柱，用0.01mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用含0.8mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH6.0)溶液进行线性洗脱，收集第一洗脱峰。将收集的洗脱液用超滤浓縮器将缓冲液置换成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。实施例5:甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原原液制备病毒抗原原液生产方法如下a.细胞复苏；取工作细胞库中的1支或几支细胞管，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10%小牛血清的199培养基后置37土rC培养。b.细胞扩增及培养待复苏细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶或其他适宜的消化液消化Vero细胞进行传代扩增，置35土rC培养2128天收获。c.接种HAV:将YN-5株甲肝病毒接种于Vero细胞。d.接毒细胞的收获和合并将培养21~28天的细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，同一细胞消化批的多瓶细胞收获液，以每分钟30004000转、28。C离心30分钟，收集细胞沉淀，在无菌条件下合并为1批。e.纯化用细胞超声波粉碎仪以1200W1600W输出功率破碎细胞。破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以每分钟4000转的速度28'C离心20分钟，吸取上层蛋白水相，向离心杯中补充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反复提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超滤膜进行浓縮；超滤浓縮液经CaptoQ型阴离子胶吸附，吸附完毕用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，用含2.0mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集含甲肝病毒抗原蛋白的洗脱液；收集的洗脱液加入PB缓冲盐，并使缓冲盐充分溶解，经PhenylSepharose6FastFlow型疏水凝胶吸附，吸附完毕用l.Omol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液进行线性洗脱，收集电导值低于50mS/cm的洗脱液；收集的洗脱液浓缩至适当体积(该体积根据浓縮液的粘度情况，一般控制在柱床体积的5%以内)后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液进行洗脱，收集第二洗脱峰；将收集的洗脱液用超滤浓縮器将缓冲液置换成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。实施例6按常规的方法和市售的试剂，对实施例1~5所得的病毒抗原原液(简称抗原原液)和成品分别进行总蛋白浓度、抗原滴度、残留DNA含量、残留牛血清白蛋白含量、HCP含量检测；结果如表l。表1.相关物质含量检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从表1和表2可知，与现有方法(实施例l)比较，采用本发明所述方法生产的甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)成品的残留DNA含量、残留牛血清白蛋白含量、HCP含量均大大降低，并且抗原滴度没有减少，其抗原回收率也没有显著地减少。实施例7SDS-PAGE电泳将实施例1和2所制备纯化的甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原进行SDS-PAGE电泳，然后银染。结果参见图4，1:标准分子量蛋白；2:实施例1所制备纯化的甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原；3:实施例2所制备纯化的甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原。结果表明与常规的层析纯化比较，经过本发明纯化方法得到的甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)病毒抗原中残留蛋白的组分和含量大大降低。实施例8狂犬病毒抗原纯化狂犬病毒抗原纯化方法如下a)收获的病毒灭活液用MWCO=100KD的超滤膜进行浓縮至适当体积，用1:1000的e—丙内酯4'C灭活24小时，37'C水解2小时。b)病毒灭活液上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶，(上样体积一般为柱床体积的3%)用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液进行洗脱，收集第一洗脱峰。c)将该收集液上样于QSepharoseFastFlow型阴离子柱，用0.01mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，开始用含1.0mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH5.8)溶液进行阶段梯度洗脱，收集含病毒抗原蛋白的洗脱峰。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。权利要求1.一种病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述纯化方法中包括阴离子交换柱纯化步骤。2.根据权利要求1所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于所述的病毒抗原可为包括甲型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、流行性出血热、流感病毒、乙型肝炎病毒表面抗原、轮状病毒或人乳头瘤病毒蛋白抗原的中之一。3.根据权利要求1所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于所述阴离子交换柱的填料为CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型阴离子凝胶中之一。4.根据权利要求1所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括下列步骤a)疏水层析纯化；b)浓縮洗脱液；C)分子筛层析；d)阴离子交换柱纯化；e)分部收集蛋白洗脱峰。5.根据权利要求4所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述疏水层析纯化步骤为病毒抗原经疏水柱吸附，吸附完毕用pH6.47.81.0mol/LPB溶液淋洗；然后pH6.47.80.01mol/LPB溶液进行线性洗脱，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脱峰。6.根据权利要求5所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述疏水柱选自PhenylSeph咖se、OctylSepharose、或ButylSeph咖se型疏水凝胶柱。7.根据权利要求4所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述的浓縮洗脱液步骤采用MWCO=100~300KD的超滤膜进行浓縮。8.根据权利要求4所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述分子筛层析步骤为将疏水层析纯化收集的液体上样于分子筛凝胶，上样量为1-5%CV，用0.01mol/LPBSpH6.47.4溶液进行洗脱，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脱峰。9.根据权利要求8所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述分子筛凝胶优选Sepharose型分子筛凝胶。10.根据权利要求4所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换柱纯化步骤为所得含有目的病毒抗原的蛋白洗脱液上样于阴离子交换柱，用0.01mol/LPBpH7.4溶液淋洗后，用含0.52.0mol/LNaCl的pH5.87.40.01mol/LPB溶液进行线性洗脱，收集目的病毒抗原的蛋白洗脱峰。11.根据权利要求10所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换柱的填料为CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型阴离子凝胶中之一。12.根据权利要求4所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于所述纯化方法还包括初分离步骤，其选自等电点沉淀法、盐析法或有机溶剂抽提法。13.根据权利要求12所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于所述初分离阶段的方法为有机溶剂抽提法。14.根据权利要求13所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于所述有机溶剂抽提法为破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以4000rpm的速度28。C离心20分钟，吸取上层蛋白水相。15.根据权利要求4-14所述的病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述病毒抗原为甲型肝炎病毒抗原。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种病毒抗原纯化方法。本发明公开了一种病毒抗原纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括阴离子交换柱纯化步骤。本发明所公开的纯化方法的优点为在生产规模下，实现了对病毒抗原的纯化，疫苗成品中的杂质蛋白及残余DNA含量大大降低，并且所生产的病毒抗原免疫原性好、回收率较高，大大地提高了疫苗成品的安全性；同时本方法工艺条件温和、重复性好、便于大规模地产业化生产。文档编号C07K1/00GK101638427SQ20081004368公开日2010年2月3日申请日期2008年8月1日优先权日2008年8月1日发明者毅刘,刘昊智,施松明,超程申请人:上海泽润生物科技有限公司