专利名称：一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程和医学生物领域，涉及一种人分化抑制因子3 (hld3)表达载体、 hld3融合蛋白、抗hld3多克隆抗体及其制备方法。
技术背景分化抑制因子(inhibitors of differentiation/DNAbinding, Id)，属螺旋-环-螺旋(HLH) 转录因子家族成员之一，对碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子活性起负调节作用，从 而抑制细胞分化[14。哺乳动物细胞含四种Id因子(Idl Id4) 。 Id3作为血清诱导的立即 早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现[5]。它参与多种细胞生物学过程，包括T细胞 和B细胞的发育、骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨发生和肿瘤 诱导的血管发生等[5'12]。 Id3的异常表达与肿瘤、肌肉萎縮、动脉粥样硬化症和炎症、干 燥综合征有关[12]。与Id家族的其他成员一样，Id3的表达在胚胎发育过程中呈动态调控状态，在细胞 发育过程中，Id基因大量表达于未分化的、增殖性细胞；随着细胞分化和成熟，Id基因 表达逐渐减少。Id3表达的不确定与多种疾病和病理状态有关，包括癌症、衰老、动脉 硬化症、肌肉萎縮和炎症等。在组织创伤后的新生过程中，Id3的表达模式也会发生改 变。并且，Id3在不同组织种类的肿瘤中具有截然不同的表达谱。在结直肠癌、星形细 胞瘤中Id3呈高表达；而在某些恶性肿瘤中如甲状腺癌、卵巢癌中反而呈下降表达趋势； 在正常肝组织中可以检测到Id3的表达，其表达水平随着慢性肝炎到肝硬化的转化而提 高，Id3在分化良好的肝癌细胞中的表达要高于分化不良的肝癌细胞。因此，Id3在肿瘤 细胞中具有复杂的表达模式和调控途径。目前国内外对W3蛋白的表达、功能及调控机制还缺乏深入研究，某些研究尚未取得 一致的结论。有关重组hld3蛋白的原核表达及其纯化、抗hld3抗体的制备目前国内外均 未见报道。 参考文献[1]Ruzinova M B， Benezra R. Id proteins in development, cell cycle and cancer[J].Trends Cell Biol, 2003, 13(8): 410-418. [2]Norton J D. ID helix-loop-helix proteins in cell growth, differentiation and tumorigenesis[J]. J Cell Sci, 2000, 113(Pt.22): 3897-3905.[3]李晓军，秦浚川。分化抑制因子研究进展[J]。生物化学与生物物理进展，2004， 31 (10) :865-869.[4]Yokota Y, Mori S. Role of Id family proteins in growth control [J] J Cell Physiol,2002, 190 (1) : 21-28. [5]Kee BL.,Rivera RR., Murre C Id3 inhibits B lymphocyte progenitor growth andsurvival in response to TGF-beta[J〗，Nat Immunol, 2001,2(3):242隱247. [6]Kee BL. Id3 induces growth arrest and caspase國2-dependent apoptosis in Blymphocyte progenitors[J]. J Immunol, 2005,175(7):4518-4527. [7]Forrest ST， Barringhaus KG, Perlegas D," a/.Intron retention generates a novel Id3isoform that inhibits vascular lesion formantion[J]. J BiolChem,2004,279(3):32897-32903. [8]Maeda Y, Tsuji K， Niftiji A, W a/. Inhibitory helix-loop-helix transcription factorsIdl/Id3 promote bone formation in vivo[J], J Cell Biol Chem,2004,93(2):337-344. [9]Damdinsuren B, Nagano H， Kondo M， " a/. Expression of Id proteins in humanhepatocellular carcinoma: relevance to tumor dedifferatiation[J], Int JOncol,2005,26(2):319-321. [10] Tsuchiya T， Okaji Y, Tsuno NH， " a/. Targeting Idl and Id3 inhibits peritonealmetastasis of gastric cancer[J]. Cancer Sci 2005,96(11):784-790. [11 ] Coppe JP, Itahana Y， Moore DH, " a/. Id-1 and Id-2 proteins as molecular markersfor human prostate cancer progression[J]. Clin Cancer Res，2004,10(6):2044-2051. [12]贾丽，李晓军.顺铂诱导Daudi细胞增殖抑制中Id3的表达分析[J].临床检验杂志，2007， 25 (3) :111-113. 发明内容本发明的目的是提供一种重组hld3原核表达载体。 本发明的另一个目的是提供一种重组hld3融合蛋白。 本发明的另一个目的是提供一种抗hld3多克隆抗体。本发明还有一个目的是提供上述表达载体、融合蛋白及抗hld3多克隆抗体的制备方法。本发明采用与硫氧还原蛋白(Trx)-组氨酸(His)融合表达的方式在大肠杆菌DE3 中高效表达Md3融合蛋白并分离纯化重组蛋白，使之作为免疫原免疫家兔制备抗hld3 多克隆抗体，为进一步研究hld3蛋白生物学功能及建立检测hld3的免疫学方法奠定基 础。本发明的技术内容包括1.hld3基因编码区cDNA片段的PCR扩增及重组克隆载 体Id3/pGEM-T的构建。2. pET32a/Trx-His-hld3原核表达载体的构建。3.hld3融合蛋白 在大肠杆菌DE3中的表达及分离纯化和鉴定。4.将hld3融合蛋白免疫家兔制备特异性 抗hld3多克隆抗体。以下是本发明的具体技术措施1. 根据GeneBank中提供的hld3 cDNA编码序列，设计一对特异引物(SEQ ID No.2， SEQ ID No.3)，以pGEM-T/Id3载体为模板(也可以常规方法获得的含hld3的基因片断 为模板)，用上述引物进行PCR扩增(结果见图1)。采用pGEM-T Easy Vector System 将纯化的PCR产物hld3 cDNA插入pGEM-T Easy载体，构建重组克隆载体Id3/pGEM-T(构建流程见图2)。测序结果见SEQ IDNo.l。2. 将PCR扩增后的hld3编码基因克隆入带有T7启动子、6个组氨酸和硫氧还原 蛋白编码基因的表达载体pET-32a的￡coi I和1位点之间，获得hld3基因的原核表 达载体pET32a/Trx-His-hld3。由于hld3基因上游融合了 6个组氨酸和硫氧还原蛋白基 因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物可用Ni-NAT树脂 进一步纯化，hld3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx-His-hld3融合基 因的hld3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因 与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx。3. 重组载体pET32a/Trx-His-hld3转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导后， 获得高效表达菌株。将转化菌在37"C进行基础培养，当细菌密度OD6oo值为0.4 0.6时， 37。C诱导4h，收集细菌，悬浮于lxBinding Buffer (20 mMTris-HCl， pH7.9， 500 mM NaCl， lOmMp-巯基乙醇，lmmol/LPMSF)，超声破碎细胞，离心后，取上清液用于 Ni-NTA亲和层析柱(Novagen公司)，分离纯化得到hld3融合蛋白，经Western blot证 实该融合蛋白具有免疫原性蛋白(Western blotting鉴定时采用抗Id3抗体)。在纯化过程中，Washing buffer I为20 mM Tris-HCl， pH 7.9， 500 mM NaCl, 10 mM p-巯基乙醇，30mmol/L咪唑；Washing Buffer II为20 mM Tris-HCl， pH7.9， 500 mMNaCl， lOmM卩-巯基乙醇，45mmol/L咪唑，可大大提高纯化效果。构建的重组表达载体按本发明所述方法转化大肠杆菌，诱导菌液中可溶性目的蛋白 浓度约为0.41g/L。蛋白得率为0.76mg/g湿菌。按本发明提供的分离纯化方法从转化菌中获得的hld3融合蛋白，经SDS-PAGE和 考马斯亮蓝染色检测，呈分子量约34KD的一条带，纯度大于90%。4.将hld3融合蛋白免疫家兔制备特异性抗人Id3抗体将纯化的重组蛋白用凝血 酶切割Trx-His-hld3融合蛋白，再并用Ni-NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx-His 的hld3蛋白，以此蛋白为抗原，免疫8周龄新西兰白兔，多点皮内、皮下注射。首次 免疫时，取纯化的重组蛋白1 mg (容积1 ml)与1 ml弗氏完全佐剂充分乳化，于每只 兔子颈背部皮内注射；15天后，加强免疫一次，剂量同上但用弗氏不完全佐剂充分乳化， 注射于颈背部皮下；两周后再次加强免疫一次；第二次加强免疫10天后，从耳缘静脉 采血检测抗体效价。用琼脂糖单向扩散试验测得兔源性抗血清的效价为1: 8;收集抗血 清，分装，于-70'C冻存。本发明有益效果本发明构建的表达载体由于在hld3基因上游融合了 6个组氨酸和硫氧还原蛋白基 因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物可用Ni-NAT树脂 进一步纯化，hld3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx-His-hld3融合基 因的Id3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因 与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx。本发明采用PCR技术获得hld3编码基因，使用限制性酶切和连接技术，将hld3编 码基因定向克隆到原核表达载体，获得hld3融合蛋白表达载体，实现了hld3在大肠埃 希菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的27%，同时也提供了一整套工程菌诱导表达 和纯化工艺。本发明运用基因重组技术，构建pET32a/Trx-His-hld3融合表达载体，并转 化表达细菌，经诱导、蛋白纯化获得Md3融合蛋白，以hld3融合蛋白为免疫原制备兔 抗hld3多克隆抗体，为进一步研究hld3蛋白的生物学功能及其在临床医学诊断中的应 用奠定基础。
图l: hld3基因片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。 其中1. DNA分子量标准(DL2000); 2. PCR产物 图2:重组克隆载体Md3/pGEM-T构建流程。图3:重组表达载体pET32a/Trx-His-hld3双酶切鉴定电泳图。 其中1、 150bpDNA分子量标准；2、 pET32a/Trx-His-hld3:经￡coi I和Sa/1酶切；3、 质粒pET32a图4:不同诱导时间下重组蛋白的SDS-PAGE分析。其中M.低分子量蛋白质标准；1. 未经IPTG诱导的pET32a/Trx-His-hld3;2 7. 经IPTG诱导1,2,4,6,8和12 h的hld3/pET32a; 图5:镍离子亲和层析纯化hld3融合蛋白的SDS-PAGE分析。 其中M.低分子量蛋白质标准；1. pET32a/Trx-His-hld3质粒转化菌裂解液上清；2. 洗杂液； 3.纯化的重组蛋白。 图6: Western blot印迹鉴定重组蛋白的特异性。其中M.低分子量蛋白质标准；1.重组蛋白具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明。实施例1:1. 根据GeneBank中提供的hld3cDNA编码序列，设计一对特异引物，在上游引 物5'端引入五②RI酶切位点；在下游引物5'端加入&!/I酶切位点，其中还包括终止密 码子TAA。上游引物5' -CGGAATTCAAGGCGCTGAGCCCGGTG- 3' (SEQ ID No.2)(下划线为五coR I酶切位点) 下游引物5' -ACGCGTCGACTTAGTGGCAAAAGCTCCTTTTG-3' (SEQ ID No.3)(下划线部分为&n酶切位点)。以pGEM-T/W3载体(见李晓军等，Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺 癌细胞A549中的表达，《中国检验医学杂志》2006年12月第29巻第12期)为模板 (也可以常规方法获得的含hld3的基因片断为模板)，用上述引物进行PCR扩增(图 1)。采用pGEM-T Easy Vector System将纯化的PCR产物hld3 cDNA插入pGEM-T Easy 载体，构建重组克隆载体hld3/pGEM-T (构建流程见图2)。测序结果见SEQ ID No.l 。。2. 用￡coR I和Sa/1从hld3/pGEM-T载体中切出hld3基因克隆到pET32a中，得到表达载体Md3/pET32a (pET32a/Trx-His-hld3)。将hld3/pET32a表达质粒转化大肠杆 菌，宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)，质粒hld3/pET32a转化采用氯化钙转化法。转化 菌的筛选从新鲜转化平板上挑取转化菌落，分别接种于含有氨苄青霉素(100mg/L) 的LB培养基，37'C振荡培养过夜，收集菌体，提取质粒酶切鉴定(图3)。3. 将转化菌接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养液，37"C振荡培养过夜。 次日将菌液以1:100的比例接种于新鲜含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养液，37°C 培养至0D6Q()值为0.4 0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,于37。C继续培养约4 h。 分别取诱导前以及诱导1 12h的菌体作SDS-PAGE电泳分析。在电泳图谱上出现一条 约34 kD的新带。光密度扫描结果显示诱导表达4h的转化菌34 kD的条带占细菌总蛋 白的27% (图4)。4. 大量收集IPTG诱导转化菌E. co/z' BL21，重悬于lxBinding Buffer (20 mM Tris-HCl， pH 7.9， 500 mMNaCl， 10 mM (3-巯基乙醇)，加入终浓度为1 mmol/L的PMSF， 置冰浴中30min。用超声波细胞粉碎机进行超声破碎。超声结束后，加入Triton X-100 至终浓度为l%(v/v)， 6000 r/min离心10 min，收集离心后上清液上样至lmL的Ni-NTA His-Bind层析柱，层析柱预先用lxBinding Buffer平衡。上样后，先用lxBinding Buffer 洗脱两次，而后用20 ml Washing buffer I (20 mMTris國HCl， pH7.9， 500mMNaCl， 10 mM卩-巯基乙醇，30腿ol/L咪唑)洗柱，再用Washing Buffer II (20 mMTris-HCl， pH 7.9， 500mMNaCl， lOmMp-巯基乙醇，45mmol/L咪唑)洗柱，收集洗脱液；用4 ml Elution buffer洗脱，收集洗脱液。对收集的各管流出液进行SDS-PAGE分析，纯化的 重组Id3融合呈分子量约35KD的一条带，纯度大于卯％ (图5)。免疫印迹(Western blotting)鉴定结果与其一致(图6)。 Westemblotting鉴定时釆用抗Id3抗体。5. 将纯化的重组蛋白用凝血酶切割Trx-His-hld3融合蛋白，再并用Ni-NTA亲和层 析柱再次分离，获得切下Trx-His的hld3蛋白，以此蛋白为抗原，免疫8周龄新西兰白 兔，多点皮内、皮下注射。首次免疫时，取纯化的重组蛋白1 mg (容积1 ml)与1 ml 弗氏完全佐剂充分乳化，于每只兔子颈背部皮内注射；15天后，加强免疫一次，剂量同 上但用弗氏不完全佐剂充分乳化，注射于颈背部皮下；两周后再次加强免疫一次；第二 次加强免疫10天后，从耳缘静脉采血检测抗体效价。用琼脂糖单向扩散试验测得兔源 性抗血清的效价为l: 8;收集抗血清，分装，于-7(TC冻存。<110〉中国人民解放军南京军区南京总医院<120> —种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法<160〉 3<210〉 1 <211> 740 〈212>腿 <213>人工序列 <220〉〈223〉重组hld3 〈400>ttctccccgc aagcgggcag ctttacactt acacaggaaa tcaagctatg gaattcacta gtgtgctgcc gctgaggagc ctggtacccg atcgactaca ggcccccacc aaaaggagct cgggagcatcgcgttggccg tgagcgcaac tatgcttccg cagctatgac catccaacgc gtgattcgga tgtcggaacg cgctgagctt gagtcccgag ttctcgacct ttcccatcca tttgccacta gacgtggcccattcattaat gcaattaatg gctcgtatgt catgattacg gttgggagct attcaaggcg cagtctggcc gctggacgac aggcactcag gcaggtagtc gacagccgetg agtcgacgcggcagctggca tgagttagct tgtgtggaat ccaagctatt ctcccatatg ctgagcccgg atcgcccggg eitgeieicceict cttagccagg ctggccgagc ctcgctccgg tsatcgaattcgacaggttt cactcattag tgtgagcgga taggtgacac gtcgacctgc tgcgcggctg gccgagggaa gctactcccg cggaaatcct cagcccctgg aacttgtcac cccgcggccgcccgactgga 60 gcaccccagg 120 taacaatttc 180 tatagaatac 240 aggcggccgc 300 ctacgaggcg 360 gggcccggca 420 cctgcgggaa 480 acagcgcgtc 540 accccctgat 600 ctccaacgac 660 ccatggcggc 720 740〈210〉 2〈211〉 26 〈212〉腿 <213>人工引物 〈220〉〈223〉上游引物〈400> 2cggaattcaa ggcgctgagc ccggtg 26〈210〉 3<211> 32〈212〉 DNA 〈213>人工引物 〈220〉〈223〉下游引物<400〉 3acgcgtcgac ttagtggcaa aagctccttt tg 3权利要求
1、一种人分化抑制因子3的表达载体，其特征是将PCR扩增后的hId3基因克隆于融合表达载体pET32a的EcoR I和Sal I位点之间，得到重组表达载体hId3/pET32a，其中hId3基因上游融合了6个组氨酸和硫氧还原蛋白基因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物用Ni-NAT树脂进一步纯化，hId3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx-His-hId3融合基因的hId3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx。
2、 一种人分化抑制因子3融合蛋白，其特征是该融合蛋白是采用权利要求1所述 的表达载体转化大肠杆菌BL21进行表达并纯化得到的。
3、 根据权利要求2人分化抑制因子3融合蛋白，其特征是该融合蛋白通过下列方 法制备得到用权利要求1所构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，在37'C进行基 础培养，当细菌密度OD6oo值为0.4 0.6时，37'C表达3 4小时；收集表达细胞，悬浮 于lxBinding Buffer (20 mM Tris-HCl， pH 7.9， 500 mM NaCl， lOmM卩-巯基乙醇，1 mmol/LPMSF)，超声破碎细胞，经离心后，取上清液用于Ni-NTA亲和层析柱分离纯 化，获得融合蛋白Trx-His-hld3。
4、 根据权利要求2或3所述的人分化抑制因子3融合蛋白的制备方法，其特征在 于包括下列步骤用权利要求1所述的重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，在37'C进行基础培 养，当细菌密度OD6oo值为0.4 0.6时，37。C表达4小时；收集表达细胞，悬浮于 1 xBinding Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.9， 500 mM NaCl， 10 mM p-巯基乙醇，1 mmol/L PMSF)，超声破碎细胞，经离心后，取上清液用于Ni-NTA亲和层析柱分离纯化，获 得融合蛋白Trx-His-hId3。
5、 根据权利要求4所述的人分化抑制因子3融合蛋白的制备方法，其特征在于在 纯化过程中，Washing buffer I为20 mM Tris-HCl， pH 7.9， 500 mM NaCl， 10 mM |3-巯基乙醇，30 mmol/L咪唑；Washing Buffer II为20 mM Tris-HCl， pH 7.9， 500 mM NaCl, 10 mM (3-巯基乙醇，45 mmol/L咪唑。
6、 一种抗hld3多克隆抗体，其特征在于它是兔源性的多克隆抗体，用凝血酶切割 权利要求2或3所述的融合蛋白Trx-His-hld3，用Ni-NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx-His的hld3蛋白，以此蛋白为抗原作为免疫抗原，免疫具有免疫活性的新西兰白兔而 得到。
7.如权利要求6所述的抗hld3多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的免疫过 程为用凝血酶切割权利要求2或3所述的融合蛋白Trx-His-hld3，用Ni-NTA亲和层析 柱再次分离，获得切下Trx-His的hld3蛋白，以此重组蛋白为免疫抗原，免疫8周龄新 西兰雄兔，背部皮下分多点注射；首次免疫时，用纯化的重组蛋白lmg与lml弗氏完 全佐剂充分乳化，于每只兔子背部皮内注射；15天后，加强免疫，剂量同上但用弗氏不 完全佐剂，注射于背部皮下；两周后使用加强免疫的方法再次加强免疫；第二次加强免 疫10天后，开始取耳缘静脉采血检测抗体效价，用琼脂糖单向扩散试验测得兔源性抗 血清的效价，收集抗血清，分装，于-7(TC冻存。
全文摘要
本发明属于基因工程和医学生物领域，公开了一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法。该表达载体是将PCR扩增后的hId3基因克隆于融合表达载体pET32a的EcoR I和Sal I位点之间，得到重组表达载体hId3/pET32a。本发明将hId3编码基因定向克隆到原核表达载体，获得hId3融合蛋白表达载体，实现了hId3在大肠埃希菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的27％，同时提供了一整套工程菌诱导表达和纯化工艺，并以hId3融合蛋白为免疫原制备兔抗hId3多克隆抗体，为进一步研究hId3蛋白的生物学功能及其在临床医学诊断中的应用奠定基础。
文档编号C07K16/18GK101275147SQ20081002540
公开日2008年10月1日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者仲爱芳, 李晓军, 伟 虞, 丽 贾 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院