专利名称：Atl肽的固相合成方法
技术领域：
本发明涉及多肽类药物的制备方法，尤其涉及一种ATL肽(C85H141N27015)的固相 法合成方法。属生物技术领域。
技术背景ATL肽化学名乙酰-精氨酰-酪氨酰-酪氨酰-精氨酰-色氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰胺 (Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 ),化学结构式为NH2分子式C85H141N27015 分子量1781.24。ATL肽是在Ac-RYYRWK-NH2六肽的基础上改构而来的，此六肽是从合成组合化 学肽库中被NOP(Nociceptin/orphanin FQ peptide receptor)选择性筛选出来的肽。孤啡肽 (nocieeptin或orphanin FQ)是阿片受体样受体(ORLl或LC 132)的内源性配体，在痛觉调 节、心血管系统、离子通道、依赖和耐受、学习和记忆等方面具有广泛的生物学活性。 ATL肽是利用SIP (Structure inducing probes)技术设计出NOP受体的新型配体，在原 六肽的基础上增加了其代谢稳定性。美国专利US 7,244,701中有合成本品的报道包括化学合成法和生物重组合成法， 生物合成法是近年发展起来的新合成方法，但生物表达技术目前尚不成熟。同时，产品 的纯化和产率方面离产业化生产尚有较大距离。报道的化学合成法包括1，液相合成 法(solution phase peptide synthese),2，基于Menifield-类型树脂的固相合成，包括Boc/Bzl 和Fmoc/tBu策略。3，基于TentaGel Resin(PEG-PS)类型树脂的固相合成，Fmoc/tBu策 略。然而，液相合成法存在(1)反应步骤多，路线冗长。(2)中间体不易纯化分离， 实际操作中溶剂蒸除难度较大。(3)目前试剂和所用氨基酸侧链保护基的来源和制备难 度较大等不足。Merrifield类型树脂为载体，合成保护ATL树脂后，将肽从树脂上切下 来所要求的条件比较苛刻，该方法采用HF裂解方式，必须拥有一台HF气体发生装置 才能实现裂解，对于大量的肽树脂只能分两次裂解，生产规模受到限制。另外，HF是 一种强腐蚀性的气体， 一旦泄漏会对人造成极大的伤害。再者，此合成i法将肽从树脂 上裂解下来后，抽去HF用稀乙酸抽提，抽提物经冷冻干燥后，生产周期长，成本高。TentaGd Resin(PEG-PS)类型树脂目前成本较高，不适合于大批量的制备和工业化生产。 发明内容针对上述技术不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便，单步縮合反 应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，总收率高的ATUt(C85H141N27015)的固相法合成方法。本发明所述ATL肽固相法合成方法的技术方案是:采用MBHA树脂作为固相载体， 首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc-Lys(2-Cl-Z)，釆用Boc保护氨基酸的程序接肽法 完成ATL的备成，用乙酸酑对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱 除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树 脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇-水梯度 洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。本发明提供的ATL肽固相法合成方法的具体步骤是1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行縮合反应 连接保护氨基酸，制备H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)- Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl墨Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z). MBHA树脂其中所述MBHA树脂的化学结构为MBHA树脂可采用市售产品，如天津南开和成科技公司生产的规格为subst. 0.8mmol/g,DVB:l%, Mesh 100-200的MBHA树脂。制备步骤如下(1) 向MBHA树脂中加入5y。三乙胺DCM溶液洗2 3次；再用二氯甲烷、乙醇交 替洗树脂2 3次，抽干；(2) 向上述树脂中加入1 5当量Boc-保护氨基酸，1 5当量的HOBt，而后加入1~5 当量的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌1~6小时，抽干，得 Boc-Arg(Mts):Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA树脂；其中，所述HOBt 用二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液溶解，所述N,N-环 己基碳二亚胺用二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液溶解；G)树脂用二氯甲垸、乙醇交替洗3次，抽干；(4) 树脂用50。/。三氟醋酸/二氯甲垸(DCM)洗1 ~2次； ，(5) 树脂用二氯甲烷洗2 3次，得112 ^^^(1^3)-1)0"(2-;6]^)-丁71(2-81:-2)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA树脂；2) 用乙p酐对N端进行乙酰化修饰将50±2 k量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)墨Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)陽Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂中，室温搅拌5 6小时，抽干；树脂用二氯甲烷、乙醇交 替洗2 3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-a-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-M BHA;3) 用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br國Z)-Tyr(2-Br-Z)濕Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 20。/。哌啶/DMF溶液，室温搅拌反应20 30分钟除Trp的甲酰基(For)保护基，抽干，二 氯甲垸，乙醇交替洗涤2 3次后，得到除Trp外的ATL树脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z) -Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z》Lys(2-Cl-Z)-MBHA;4) 切割反应脱除侧链保护基团并切割树脂以10ml/g树脂的量将切割试剂加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z) -Arg(Mts)醫Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-C-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2需C墨 Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，冰水浴下搅拌反应3小时后，过滤，收集滤液，用三氟醋酸 洗涤滤除的树脂，洗涤液与滤液合并后浓縮，之后加入其100 150倍体积量的冷乙醚， 即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；其中所述切割试剂是体积配比为..三氟醋酸(TFA):三氟甲磺酸(TFMSa)'.硫 代苯甲醚(thioanisole):乙二硫醇(1,2-ethanethiol) =80:8 9:8 9:4 5的混合溶液；5) ATL肽粗品的纯化ATL肽粗品用5%醋酸水溶液溶解，经0.45mn微孔滤膜过滤后，直接上样到反相 C,8键合硅胶装填色谱柱，采用梯度6 9%甲醇-水流动相进行梯度洗脱分离，收集目的 组分，浓縮/1,冷冻干燥，得到纯ATL肽。上述ATL肽的固相合成方法中，步骤l)所述Boc-保护氨基酸在MBHA树脂上依 次进行縮合反应连接的氨基酸是Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Trp(For)-OH， Boc-Arg(Mts)-OH, Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH， Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH 。上述ATL肽的固相合成方法中，步骤l)中(2)优选的方法是向上述树脂中加入 2 4当量Boc-保护氨基酸，2 4当量的HOBt，而后加入2 4当量的N,N-二环己基碳 二亚胺(DCC)，室温下搅拌3~5小时，抽干，得 Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA树脂。 .上述ATL肽的固相合成方法中，步骤l)中(2)所述的二氯甲烷与N,N-二甲基甲 酰胺的混合威是指二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1 : 0.1 1的混合液。优选是指二氯甲烷N，N-二甲基甲酰胺体积比为1 :0.6 1的混合液。上述ATL肽的固相合成方法中，步骤3)所述室温搅拌反应优选是30分钟。上述ATL肽的固相合成方法中，步骤4)所述切割试剂是体积配比优选三氟醋酸 (TFA):三氟甲磺酸(TFMSa):硫代苯甲醚(thioanisole):乙二硫醇(1,2-ethanethiol) =80:8:8:4的混合溶液。上述ATL肽的固相合成方法中，步骤5)所述反相d8键合硅胶装填色谱柱的装载 量为5 200mg/克d8键合硅胶。本发明的方法是一种ATL全合成的新方法，为固相法， 一次完成制备侧链保护的 ATL肽，有以下特点(1)采用Boc-保护氨基酸，配比为1 5摩尔；采用MBHA树脂 作为固相合成载体，采用取代值为0.8mmol/克树脂，(2)采用哌啶脱除Trp侧链甲酰基 保护，(3)采用三氟甲磺酸切割ATL肽树脂，同时完成对剩余侧链保护基的去除，切割 试剂由三氟甲磺酸、三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇组成，切割完毕后直接得到肽酰胺 的形式，(4)采用高效液相色谱方法进行纯化分离，采用反相d8键合硅胶装填，装载 量为5 200mg/克C,8键合硅胶，采用甲醇-水作为洗脱流动相，梯度洗脱方法。
图1为本发明工艺流程框图。图2为ATL肽HPLC检测图。图3为ATL肽经质谱MS确证图。
具体实施方式
实施例1H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备(1) 将MBHA树脂50g (40tnmo1)放于多肽合成反应器中，用5%三乙胺DCM溶 液5 7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次， 抽干。(2) 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82,8g及HOBt27.0g ， N,N-环己基碳二亚胺41.2g用 500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.8)溶解后，' 加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟；用二氯甲烷5 7ml/g 洗2次，每次2分钟；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例2H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备(1) 向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每 次8分钟；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。(2) 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF溶液(二氯甲烷N，N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.9)溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4)用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟； 得H2N-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA 。实施例3H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作(O向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。(2) 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF (二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.9)溶液溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例4H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl隱Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺 DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2 分钟/次，抽干。(2) 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲垸N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.8)溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； ' 用二氯甲垸5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例5H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 5。/o三乙胺DCM溶液5 7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替 洗2次，2分钟/次，抽干。(2) 将Boc-Lys(2-CI-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.9)溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。 .(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟；用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA 。实施例6H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBH A的制备跳(1),旨H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)德HA 中加入5。/。三乙胺DCM溶液5-7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml 交替洗2次，2分钟/次，抽干。(2) 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲垸ZDM.F溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.9)溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲垸(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲垸5 7ml/g洗2次，每次2分钟；实施例7H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-C1-Z)-MBHA的制备跳(1) I^^H2N-Lys(2"a-Z)iys(2"Cl-Z>Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-a-Z)-Lys(2-Cl-Z)--MBHA中加入5。/。三乙胺DCM溶液5 7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲垸、乙 醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。 -(2) 将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt27.0g ，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 1)溶解后，加入树脂 中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例8H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备操作(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2"Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分 钟；用二氯甲烷、乙醇各300nU交替洗2次，2分钟/次，抽干。 (2)将Boc-Trp(For)-OH66.5g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 1)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Trp(For)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)德HA。实施例9H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Ci-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备操作U)向树脂H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 mi/g洗2 次，每次8分钟；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽千。(2) 将Boc-Arg(Mts)-OH91.3g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二 氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N，N-二甲基甲酰胺体积比为h 1)溶解后，加入树脂中， 室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2);的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲垸5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Ly s(2-Cl-Z)-MBH A 。实施例10H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-a-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备操作(1)向树脂H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液 5 7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。 .—，(2) 将Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH98.9g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.9)溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Tyr(2-Br-Z)-Aig(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-ClrZ) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-p-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例11H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl陽Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作(1)向树脂H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺 DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2 分钟/次，抽干。(2) 将Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH98.9g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲垸N，N-二甲基甲酰胺体积比为1: 0.9)溶解后，加入树 脂中，室温搅拌5小时，抽干。(3) 将(2)的产物用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲垸5匸7ml/g洗2次，每次2分钟；得H2N-Tyrj;2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例12H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2國Cl國Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2國Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作(1)向树脂H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替 洗2次，2分钟/次，抽干。 -(2)将Boc-Arg(Mts)-OH91.3g及HOBt27.0g ，N,N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml 二 氯甲烷/DMF溶液(二氯甲垸N,N-二甲基甲酰胺体积比为1: 1)溶解后，加入树脂中， 室温搅拌5^时，抽干。G)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。(4)用50。/。三氟醋酸/二氯甲垸(DCM) 10ml/g洗1次，20分钟； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分钟得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) 誦Lys(2-Cl-Z)-Lys(2陽Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)德HA。实施例13Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys (2-CI-Z)-Lys(2陽Cl-Z)-Lys(2-Cl隱Z)墨Lys(2國Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作(1)向树脂H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For) -Lys(2-Cl-Z)墨Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-M BHA中加入i。/。三乙胺DCM溶液5 7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲垸、乙醇各 300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。(2) 将乙酸酐142ml禾Q 400 ml DMF加入树脂(H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Tip(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA)中，室温搅拌5小时。(3) 抽干。树脂用二氯甲垸、乙醇各600ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。得 Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl -Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例14Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2 -Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备 操作向树脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2墨Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 20。/。哌啶/DMF溶液500 ml,室温搅拌反应20分钟，抽干。树脂用二氯甲垸、乙醇300ml 交替洗3次，2分钟/次，抽干。得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)陽Lys(2陽Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。实施例15Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2的审U备 操作(1)辨树脂Ac國Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-tys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA真空干 燥，称重得194.4g淡黄色树脂。肽树脂收率95%。 -(2)量取苯甲硫醚160ml、乙二硫醇80ml，加入树脂中，冰水浴搅拌下加入三氟醋酸1600 ml，反应10分钟后，缓慢滴加160ml三氟甲磺酸，滴加完毕后室温反应3小时，过滤， 滤除树脂，用150ml三氟醋酸洗涤树脂，洗涤液与滤液合并后浓縮，之后加入15L冷 乙醚，即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，得ATL肽的粗肽制品57.02 g 。粗品收率79%。粗品纯度经HPLC检测为83%，见图2。实施例16分离纯化 装置d8制斧柱(150xl000mm) 装载量5 2^)mg/克d8键合硅胶 洗脱液A: 0.1%TFA/H2O 洗脱液B:甲醇 流速400ml/min 紫外检测波长:220 nm操作(1) ATL肽粗品30 g用500ml 5%醋酸水溶液溶解， (2) 0.45pm微孔滤膜过滤，(3) 滤液直接上样，(4) 6~9%甲醇-水流动相进行梯度洗脱，收集保留时间为10.340分钟组分峰的洗 脱液(见图l)，(5) 浓縮，冷冻干燥；得ATL白色疏松粉末20.3g。(6) 其他低于98%洗脱液合并，浓縮后，回收。(7) 依此方法处理完毕所有肽粗品后，合并得ATL肽共计2L2g ，分离纯化收率 70.6%。产品经质谱MS确证(谱图见图3)，总收率为56.5%。
权利要求
1.一种ATL肽的固相合成方法，包括下列步骤1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接保护氨基酸，制备H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂(1)向MBHA树脂中加入5％三乙胺DCM溶液洗2～3次；再用二氯甲烷、乙醇交替洗树脂2～3次，抽干；(2)向上述树脂中加入1～5当量Boc-保护氨基酸，1～5当量的HOBt，而后加入1～5当量的N，N-二环己基碳二亚胺，室温下搅拌1～6小时，抽干，得Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；其中，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解，所述N，N-环己基碳二亚胺用二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解；(3)树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗3次，抽干；(4)树脂用50％三氟醋酸/二氯甲烷洗1～2次；(5)树脂用二氯甲烷洗2～3次，得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；2)用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰将50±2当量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂中，室温搅拌5～6小时，抽干；树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗2～3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；3)用哌啶脱除Trp的甲酰基侧链保护基向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液，室温搅拌反应20～30分钟除Trp的甲酰基保护基，抽干，二氯甲烷，乙醇交替洗涤2～3次后，得到除Trp外的ATL树脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；4)切割反应脱除侧链保护基团并切割树脂以10ml/g树脂的量将切割试剂加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，冰水浴下搅拌反应3小时后，过滤，收集滤液，用三氟醋酸洗涤滤除的树脂，洗涤液与滤液合并后浓缩，之后加入其100～150倍体积量的冷乙醚，即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；其中所述切割试剂是体积配比为三氟醋酸∶三氟甲磺酸∶硫代苯甲醚∶乙二硫醇＝80∶8～9∶8～9∶4～5的混合溶液；5)ATL肽粗品的纯化ATL肽粗品用5％醋酸水溶液溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，直接上样到反相C18键合硅胶装填色谱柱，采用梯度6～9％甲醇-水流动相进行梯度洗脱分离，收集目的组分，浓缩后，冷冻干燥，得到纯ATL肽。
2. 如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤l)所述Boc-保护 氨基酸在MBHA树脂上依次进行縮合反应连接的氨基酸是Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)國OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)隱OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)國OH, Boc墨Lys(2-C1-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Trp(For)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH, Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH, Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH。
3. 如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤l)中(2)是向上 述树脂中加入2 4当量Boc-保护氨基酸，2 4当量的HOBt，而后加入2 4当量的 N,N- 二环己基碳二亚胺，室温下搅拌3 5小时，抽干，得 Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA树脂。
4. 如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤l)中(2)所述的 二氯甲垸与N,N-二甲基甲酰胺的混合液是指二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1 : 0.1 1的混合液。
5. 如权利要求4所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤l)中(2)所述的 二氯甲垸与N，N-二甲基甲酰胺的混合液是指二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺体积比为1 : 0.6 1的混合液。
6. 如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤3)所述室温搅拌 反应是30分钟。
7. 如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤4)所述切割试剂 是体积配比为三氟醋酸:三氟甲磺酸:硫代苯甲醚:乙二硫醇=80:8:8:4的混合溶液。
8. 如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤5)所述反相C18 键合硅胶装填色谱柱的装载量为5 200mg/克ds键合硅胶。
全文摘要
本发明公开了一种ATL肽的固相合成方法。采用MBHA树脂作为固相载体，首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc-Lys(2-Cl-Z)，采用Boc保护氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。本发明的方法条件具有单步缩合反应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，操作简单易行，总收率高的特点。
文档编号C07K1/06GK101255187SQ20081001426
公开日2008年9月3日 申请日期2008年2月18日 优先权日2008年2月18日
发明者厉保秋 申请人:济南环肽医药科技有限公司