专利名称：一种胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种融合肽及其制备，尤其涉及一种胸腺肽a1-胸腺五肽融合肽 (Tocl-TP5)及其制备方法，属于生物医药领域。
背景技术：
胸腺五肽(Thymopentin, TP5)是胸腺生成素的第32_36的氨基酸残基肽段，是一 个双向免疫调节剂，现已在临床上用于免疫缺陷病、自体免疫性疾病等的治疗。研究证 明，它的半衰期较短，只有30秒。如此短的半衰期不仅使胸腺五肽在体内的作用时间 短，而且也增加患者的用药费用，影响了胸腺五肽在临床上的效用。如果能够通过一定 的手段增加胸腺五肽的稳定性、延长其体内半泰期以减少给药剂量或延长给药周期，将会大 大提高胸腺五肽的治疗效果，降低用药费用，促进其在临床上的应用。胸腺肽al (Tocl，又称胸腺素al)，最早是从胸腺内提取的，是由28个氨基酸残基 构成的多肽。胸腺肽al在临床上也作为免疫调节剂用于病毒感染性疾病、免疫缺陷病、 自体免疫性^^病、肿瘤等的治疗。根据肽链的延长能够延长小分子肽体内半衰期的原理，利用基因工程技术将胸腺肽al 和胸腺五肽进行融合制备胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)，可延长胸腺肽al和胸腺 五肽的半衰期，并同时发挥两者的免疫调节作用，以提高疗效。经检索，本研究的相关论文 和专利还未见报道。发明内容针对胸腺五肽半衰期较短的不足，本发明要解决的问题是提供一种胸腺肽al-胸腺 五肽融合肽(Tal-TP5)及其制备方法。本发明所述的胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)，是由Tal-TP5融合基因通过 基因工程构建成表达载体pGAPZaA/Tal-TP5，再经发酵、分离与纯化等步骤后制备的， 获得的Tal-T^5融合肽经测定体外血浆半衰期为140 min，相比胸腺五肽半衰期明显延 长。本发明所述胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)，其特征是所述融合肽的氨基 酸序列如SEQ IDNO.l所示，其相对分子质量约为4470道尔顿，由相对分子质量为3208 道尔顿的胸腺肽al和相对分子质量为679.77道尔顿的胸腺五肽融合而成。或者是所 述融合肽是包含SEQ ID NO.l所示氨基酸序列的、分子量小于10000道尔顿的肽或蛋白 质。本发明所述胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)的制备方法，由以下步骤组成 (1)表达载体pGAPZaA/Tal-TP5的构建Tal-TP5融合基因通过PCR体系进行扩增，其中，设计的前导引物含五co/U位点，后序引物含AW I和凝血酶位点；将质粒pGAPZaA及纯化后的Tal-TP5融合基因均用 ￡COR I和I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的载体和Tal-TP5融合基因片断， 用T4 DNA连接酶4"连接16 h构建成表达载体pGAPZaA/Tal-TP5,转化感受态大肠 杆菌，挑取阳性克隆，用DNA电泳和序列分析鉴定重组质粒。(2) 含表达载体pGAPZocA/Tal-TP5工程菌的构建 表达载体pGAPZaA/Tal-TP5经Bln酶切后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建含表达载体pGAPZaA/Tal-TP5的工程菌；阳性克隆用含浓度为lOOOpg.mL—1抗生素 Zeocin的PYD筛选；采用PCR技术鉴定阳性克隆的Tal-TP5融合基因，用电泳和质谱 法鉴定目的Tal-TP5融合肽。(3) Tal-TP5融合肽的表达和分离与鉴定将构建的毕赤酵母GS115-pGAPZaA/Tal-TP5工程菌在30 32。C条件下，于PYD 培养基中发酵培养4 5天；离心去除酵母细胞，培养液用镍离子亲和色谱分离Tal-TP5 融合肽，并用电泳鉴定；分离的Tal-TP5融合肽进一步经凝血酶酶切后用Sephadex G-50 分离得到纯化的Tal-TP5融合肽。其中所述镍离子亲和色谱采用镍离子亲和色谱体系，包括结合缓冲液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH7.4; 洗脱缓冲液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl, 0.5 mol/L咪唑，pH7.4; Tal-TP5融合肽的脱盐体系Tris缓冲液，0.02 mol/LTris碱，0.001 mol/LEDTA， pH7.4;所述凝血酶酶切采用凝血酶酶切体系50mmol/LNH4HCO3溶液，pH8.4， 28°C4h; 所述Sephadex G-50洗脱液为50mmol/L (NH4)2S04， pH8,0。 应用本发明方法获得的胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)其体外血浆半衰期为140min，通过对脾细胞的增殖实验证明，Tal-TP5融合肽具有显著的促进昆明小鼠脾细胞增殖活性户 '具体活性研究证明方法如下1.Tal-TP5融合肽体外血浆半衰期测定 通过HPLC测定得出，测定方法由以下步骤组成(1) 色谱条件色谱柱Shim-pack VP-ODSCis 150 mmx4.6mm，5[im;柱温25°C;检测波长TP5 为215ran， Tal.为210nm, Tal-TP5为210 nm;进样量15pL;流速0.3^L。流动相TP5为乙腈水=20: 80， TFA为0.1%， Tal-TP和Tal的流动相均为乙 酸铵(5mmol/L):乙腈=10: 90，三氟乙酸(TFA)为0.1%。(2) 以上实验所得出的回收率TP5为57.97%， Tal的为70.94%， Tal-TP5的为 74.92%。G) TP€与Tal的体外血桨半衰期 根据以上实验测得TP5与Tal的体外血浆半衰期分别为5.6 min和127 min，Tal-TP5 融合肽的体外血浆半衰期为140min。2. Tal-TP5融合肽促进淋巴细胞增殖活性研究以常规MTT法进行胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Totl-TP5)对脾细胞的增殖实验， 结果Tal-TP5,融合肽具有显著的促进昆明小鼠脾细胞增殖活性。上述活性研究证实本发明制得的Tal-TP5融合肽与TP5相比，不仅保留了其免 疫活性，而且还具有半衰期长、活性好等特性，在临床上将具有好的应用前景。
具体实施方式
实施例h(1) 表达载体pGAPZccA-Ta 1-TP5的构建① 融合基因的设计与扩增设计Tal-TP5融合基因，其前端含五coRl位点，后端 含7VWI和凝血酶位点。通过常规PCR体系进行扩增，对反应物进行12 g/L琼脂糖凝 胶电泳鉴定扩增物，并用PCR回收试剂盒回收PCR产物。② 融合基因和载体进行酶切将pGAPZaA和PCR产物经￡coRI/iVW I双酶切， 并用琼脂糖凝胶电泳鉴定连接产物。③ 表达载体的构建纯化后的连接产物经T4 DNA连接酶构建为表达载体 pGAPZaA/Tccl-TP5，转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，用DNA电泳和序列分析鉴 定重组质粒。(2) 含表达载体pGAPZaA/Tal-TP5工程菌的构建① 转化表达载体pGAPZocA-Tal-TP5经Bin酶切后，转化毕赤酵母GS115感受 态细胞，构建含表达载体pGAPZaA/Tal-TP5的工程菌。② 筛选用含浓度为1000吸mL"抗生素Zeodn对阳性克隆进行筛选；采用PCR 方法鉴定阳性克隆的融合基因Tal-TP5，用电泳鉴定目的Tal-TP5融合肽，融合肽的氨 基酸序列如SEQ ID NO.l所示。(3) Tal-TP5融合肽的表达和分离与鉴定① 发酵将构建的毕赤酵母GS115-pGAPZaA-Tal-TP5工程菌在30。C条件下，于 PYD培养基中发酵培养4 5天。② 融合肽的分离除去酵母细胞的培养液用镍离子亲和色谱分离Tal-TP5融合肽， 并用电泳鉴定；Tal-TP5融合肽进一步经凝血酶酶切后用Sephadex G-50分离得到纯化的 Tal-TP5融合肽。其中所述镍离子亲和色谱采用镍离子亲和色谱体系，包括结合缓冲液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH7.4; 洗脱缓冲液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 0.5mol/L咪唑，pH7.4; Tal-TP5融合肽的脱盐体系Tris缓冲液，0.02 mol/LTris碱，0.001 moI/LEDTA， pH7.4;所述凝血酶酶切采用凝血酶酶切体系50mmol/LNH4HCO3溶液，pH8.4， 28。C4h; 所述Sephadex G-50洗脱液为50mmol/L (NH4)2S04， pH8.0。序列表<110>山东大学<120>—种胸腺肽(1 1-胸腺五肽融合肽及其制备方法<141〉2008-1-22<160>1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<221>胸腺肽0 1-胸腺五肽融合肽 <222> (1)…(39) <400> 1Glu Phe Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu lie Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu 1 5 10 15 20Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Gin Arg Lys Asp Val Tyr Leu Val Pro Arg 25 30 3权利要求
1.一种胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽，其特征是所述融合肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其相对分子质量为4470道尔顿。
2. 如权利要求1所述的胸腺肽cxl-胸腺五肽融合肽，其特征是所述融合肽是包含SEQ IDNO.l所示氨基酸序列的、分子量小于10000道尔顿的肽或蛋白质。
3. 权利要求1所述的胸腺肽al-胸腺五肽融合肽的制备方法，由以下步骤组成(1) 表达载体pGAPZaA/Tal-TP5的构建融合基因Tal-TP5通过PCR体系进行扩增，其中，设计的前导引物含五coR I位点， 后序引物含AW I和凝血酶位点；将质粒pGAPZctA及纯化后的融合基因Tal-TP5均用 ￡C0R I和iVo〗I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的载体和融合基因Tal-TP5片断， 用T4 DNA连接酶4'C连接16 h构建成表达载体pGAPZaA/Tal-TP5，转化感受态大肠 杆菌，挑取阳性克隆，用DNA电泳和序列分析鉴定重组质粒；(2) 含表达载体pGAPZaA/Tal-TP5工程菌的构建 表达载体pGAPZaA/Tal-TP5经Bln酶切后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建含表达载体pGAPZaA/Tal-TP5的工程菌；阳性克隆用含浓度为100(Hig.mU1抗生素 Zeocin的PYD筛选；采用PCR技术鉴定阳性克隆的Tal-TP5融合基因，用电泳和质谱 法鉴定目的Tal-TP5融合肽；(3) Tal-TP5融合肽的表达和分离与鉴定将构建的毕赤酵母GS115-pGAPZaA/Tal-TP5工程菌在30 32。C条件下，于PYD 培养基中发酵培养4 5天；离心去除酵母细胞，培养液用镍离子亲和色谱分离Tal-TP5 融合肽，并用电泳鉴定；分离的Tal-TP5融合肽进一步经凝血酶酶切后用Sephadex G-50 分离得到纯化的Tal-TP5融合肽；其中所述镍离子亲和色谱釆用镍离子亲和色谱体系，包括结合缓冲液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH7.4; 洗脱缓冲液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl, 0.5mol/L咪哇，pH7.4; Tal-TP5融合肽的脱盐体系Tris缓冲液，0.02 mol/LTris碱，0.001 mol/LEDTA， pH7.4;所述凝血酶酶切采用凝血酶酶切体系50 mmol/LNH4HC03溶液，pH8.4， 28。C 4 h; 所述Sepliadex G-50洗脱液为50mmol/L (NH4)2S04 ， pH8.0 。
全文摘要
本发明公开了一种胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽，其特征是所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其相对分子质量为4470道尔顿。本发明将胸腺肽α1(Tα1)基因与胸腺五肽(TP5)基因融合在一起，插入到毕赤酵母表达载体pGAPZαA中，得到重组表达质粒pGAPZαA/Tα1-TP5；利用PYD培养基产生融合蛋白，然后经凝血酶酶切后得Tα1-TP5融合肽。本发明的胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽体外血浆半衰期远长于胸腺五肽和胸腺肽α1，并能明显促进脾细胞的增殖，与胸腺五肽相比，本发明的融合肽不仅保留了胸腺五肽的免疫调节活性，而且具有半衰期长、活性好等特性，在临床上将具有好的应用前景。
文档编号C07K19/00GK101225113SQ20081001412
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者建 张, 张须龙, 曹吉超, 王凤山, 高得民 申请人:山东大学