寡核苷酸的合成的利记博彩app

专利名称：：寡核苷酸的合成的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及用于制备寡核苷酸的方法。
背景技术：
：寡核苷酸是生命科学中的重要化合物，在不同领域具有重要作用。例如，它们在基因表达分析领域中作为探针来使用，在PCR中或针对DNA测序作为引物来使用。此外，还存在多种潜在的治疗性应用，包括，即，反义寡核苷酸。应用数目的增长要求大量的寡核苷酸，因此，针对研究改进的合成方法存在着持续的需要。针对总体性概述，参见，例如"Antisense-FromTechnologytoTherapy"BlackwellScience(Oxford,1997)。在寡核苷酸的合成中构建块(buildingblock)的一个显著类型是亚磷酰胺；参见例如S丄.Beaucage,M.H.Caruthers,TetrahedronLetters1859(1981)22。这些核苷的亚磷酰胺、脱氧核糖核苷、以及它们的衍生物的是可商购的。在通常的固相合成中，使用3'-0-亚磷酰胺，但是在其他的合成操作中也使用5'-0以及2'-0-亚磷酰胺。在这些核苷的亚磷酰胺的制备中的一个步骤是这些(受保护的)核苷的亚磷酰化。亚磷酰化作用之后，这些所制备的亚酰胺(amidite)通常通过使用成本密集性方法(例如色谱法)进行分离。分离之后，这些敏感的亚酰胺必须在特殊的条件下(例如，低温、无水)进行存储。在存储过程中，这些亚酰胺的质量可能由于一定程度的分解和水解而被减低。这两种副反应均可出现并且这些结果是可检测的。最普遍地，在对剩余的3'-、5'-或2'-0羟基集团进行亚磷酰化之前，对在核苷中存在的羟基基团以及氨基基团以及其他官能团进行保护。然后，将这些亚磷酰胺结合至核苷酸或寡核苷酸的羟基基团上。在亚酰胺结合过程中使用这些已分离的亚酰胺还可以导致部分水解。亚磷酰胺是昂贵的化合物。脱氧亚酰胺(deoxyamidite)的典型性价格在每克40,00欧元的范围内。相对应的RNA构建块甚至更加昂贵。WO2006/094963披露了用于制备寡核苷酸的一种方法，包括以下步骤在一种活化剂I的存在下合成一种氨基磷酸酯，并且在一种活化剂II的存在下进行结合。对作为活化剂II的四唑衍生物、吡啶鎗盐以及4,5-二氰基咪唑进行了说明。发明概述本发明的一个目的是提供用于制备寡核苷酸的一种方法，克月艮了现有技术中这些缺点中的至少一些。本专利申请涉及在专利申请WO2006/094963中所披露的发明的一项改进，该专利申请的内容通过引用结合在本专利申请之中。本发明具体涉及使用一种改进的活化剂II来制备根据WO2006/094963的权利要求1的一种寡核普酸的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于制备一种寡核苷酸的一种方法，包括以下步骤a)提供具有以下化学式的一种含羟基的化合物其中B是一个杂环g以及i)R2是H、一个受保护的2，-羟基基团、F、一个受保护的M基团、一个O-烷基基团、一个O-取代的烷基、一个取代的烷M或一个C4'-02'亚甲基(methylen)连接R3是ORVNHR"3、NR3R3,其中R3是一个羟基的保护基团、一个受保护的核苷酸或一个受保护的寡核苷酸，R"3、R'"3独立地是胺的保护基团，并且R5是OH或ii)R2是H、一个受保护的2，-羟基基团、F、一个受保护的氨基基团、一个O-烷基基团、一个O-取代的烷基、一个取代的烷氨基或一个C4、02'亚甲基连接R3是OH并且R5是OR'5并且R'5是一个羟基的保护基团、一个受保护的核苷酸或一个受保护的寡核苷酸或iii)R2是OHR3是ORVNHR"3、NR3R3，其中R3是一个羟基的保护基团、一个受保护的核苷酸或一个受保护的寡核苷酸，R"3、R"'3独立地是胺的保护基团，并且R5是OR'5并且R'5是一个羟基的保护基团、一个受保护的核苷酸或一个受保护的寡核苷酸b)将所述化合物与一种亚磷酰化试剂(phosphitylatingagent)在具有以下化学式I的一种活化剂(活化剂I)的存在下进行反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R=烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基Rp112=11或者一起形成一个5至6元的环XpX2=独立地N或CH之一Y-H或Si(R4)3，其中Rj=烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基B=去质子的酸以便制备一种亚磷酰化的化合物c)在一种活化剂II的存在下，将未经分离的所述亚磷酰化的化合物与具有以下化学式的一种第二化合物进行反应，该活化剂II选自下组，其构成为咪唑、咪唑鎗盐，其中对Rs、R3、R2、B独立地进行选择，但是Rs、R3、R2、B具有如以上所定义的相同含义。"咪唑"是一种未取代的杂环化合物；IUPAC名称是l,3-二唑或l，3-重氮环戊-2，4-二烯。"咪唑錄"是以上所定义的一种质子化形式的咪唑。与在WO2006/094963中所明确地披露的活化剂II相比，上述的活化剂II对于引发步骤(c)的反应是高度有效的并且是有利的，特别是达到了工业安全并考虑到了环境保护。根据本发明，通过使用具有化学式I的活化剂(它优选地是咪唑(imidazol)的衍生物)通过将一种核普、核苷酸或寡核苷酸的羟基基团进行亚磷化而制备了这种亚磷酰化的化合物。无需纯化或分离，所制备的敏感的亚磷酰胺与核苷、核苷酸或寡核苷酸的羟基基团在不同于活化剂I的一种活化剂II的存在下进行结合。没有所制备的亚磷酰胺的分离，没有从活化剂I中分离这种亚酰胺。优选地，这种反应在相同的反应容器中继续进行。活化剂II可以在活化剂I的存9在下使用。用于亚酰胺结合的现有技术的活化剂对这种亚酰胺的功能的活化具有高度的反应性。使用这种用于亚磷酰化作用的活化剂还产生了一定程度的"过"应"(例如3，-3，副产物)。为了克服这种问题以及其他问题，对这种活化剂的反应性进行了调节.在这种情况下，这种反应M择性地停止在基本上没有副产物(例如3，-3，-副产物)的亚酰胺水平上。仅此结果(原位生成亚酰胺)允许通过以亚酰胺结合为起始而继续进行整个方法。活化剂II有能力诱发结合步骤。加入活化剂II之后，这种亚酰胺会以亚酰胺结合来开始。作为活化剂化合物，咪唑以及咪唑鐵盐是适宜的，即，咪唑与一种酸(优选一种强酸)的盐。这些适宜的^1，例如三氟醋酸盐、三氟甲磺酸盐、二氯乙酸盐、甲磺酰基(mesyl)、甲^t酰基(tosyl)、邻氯酚盐(o-chlorophenolate)。对于用咪唑来构建盐类而言，具有低于4,5的pKa的酸^l优选的。在一个实施方案中，所述活化剂是一个质子化的N-1-(H)咪唑。抗衡离子通常地如在WO2006/094963中所说明。三氟醋酸盐作为抗衡离子是优选的。使用咪唑的一个特别优选的反应方案在图2中示出，其中Rl(CHrOH)和R2(CHrOH)表示(寡)核苷或-核苷酸。咪唑或咪唑鐵可以与其他活化剂II(例如，在WO2006/094963中所披露的那些)结^^吏用。在一个第二方面，所述活化剂是四唑-贫的。"四唑"应被理解为具体是指在WO2006/094963中所说明的四唑化合物。四哇-贫应被理解为是指在溶液中一定量的四唑，该量值是每摩尔含羟基的化合物中小于l摩尔(如在WO2006/094963的权利要求1中所说明)。该量值优选是每摩尔的含羟基的化合物中小于0.5摩尔并且更优选每摩尔的含羟基化合物中小于0.1摩尔。在这一方面，所述活化剂优选^^本上没有或完全没有四唑的。在第二方面所优选的活化剂^!^艮据第一方面的那些活化剂。在这两个方面所优选的溶剂是C-H酸性溶剂，特别是含有一个羧基基团的那些溶剂。此类溶解可以选自，例如酯类，如乙酸乙酯或乙酰乙酸乙酯以及酮类。丙酮是优选的。除其他之外，本发明覆盖了根据WO2006/094963的权利要求l的一种方法，其中活化剂II是具有一个N、H键的咪喳。优选地，这种咪唑是质子化的N-1-(H)咪唑。本发明进一步覆盖了根据WO2006/094963的权利要求1的一种方法，其中活化剂II是四唑-贫的。优选地，这种活化剂II是具有一个N、H键的咪唑，优选是质子化的N-1-(H)咪唑。结合之后，典型地4吏用了氧化反应(PO形成)或硫化作用(PS形成)。对于PO形成而言，过氧化物法是优选的。有可能进行这个反应，无需任何萃取步骤(碘氧化要求一些萃取步骤)来。在硫化作用的情况下，有可能使用针对疏化作用所已知的每种试剂(即，PADS、S-Tetra、beaucage)。一种优选的用于PS形成的试剂^l^克。生产成本的差别有利于硫的使用。在一个实施方案中，该^^应可以在丙酮的存在下进行。与含羟基的化合物的羟基基团相比，这种亚磷酰化试剂能够以一个或多或少等摩尔的比值来使用。在另一个实施方案中，可以对其进行过量使用，例如在含羟基的化合物中3至5mol/mo1的羟基基团。在另一个优选的实施方案中，在权利要求1的步骤b)之后加入一种高分子醇。适宜的高分子醇包括聚乙烯醇(PVA)，如从Merck,Darmstadt可商购的PVA145000。优选的是具有颗粒大小>120jtm(80%)的大孔PVA。具有羟基基团或其他能够形成烯醇的化合物的膜也是适宜的。这种活化剂I能够化学计量地，催化地(3摩尔％至50摩尔％，优选10摩尔％至30摩尔％)或过量进行4吏用。在一个优选的实施方案中，这种活化剂I具有选自下组的一个化学式，该纟且的构成为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中Y是H或Si(R4)3，其中Rt-烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基B=去质子的酸R是甲基、苯基或千基。这些活化剂的制备，例如说明于Hayakawaetal，J.Am.Chem.Soc.123(2001)8165-8176中。在一个实施方案中，这种活化剂与一种添加剂结合使用。这些添加剂可以选自具有化学式I以及其他杂环碱(例如吡啶)的未质子化形式的化合物。活化剂与添加剂之间的适宜的比值是l:l至1:10。在一个优选的实施方案中，这种活化剂可以按照一种"原位，，^Mt来进行制备。在这种情况下，这种活化剂将不会被分离，这导致了改进的反应结果。目标分子的7jc解或分解受到抑制。对于在寡核苷酸(二、三、四、五、六、七以及八聚体)的3，-和/或5，-位上的一个高产的亚磷酰化反应而言，这种活化剂的原位制备以及与一种添加剂的结合是优选的。如以上所说明，亚磷酰化在寡核苷酸以及在构建块的亚磷酰胺的合成中是尤为有用的。因此，在一个优选的实施方案中，这种含幾基的化合物包括一个糖部分(moiety)，例如一个核普或由其衍生的一个低聚物。此类核苷是，例如腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤核苷以及尿嘧啶、脱氧腺苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胸腺嘧咬核苷、脱氧胞嘧啶以及它们的衍生物，可任选地包括多种保护基团。通常，它们会在其杂环的官能度上适宜地受到保护并且除应该被亚磷酰化的那一个羟基之外，在其所带的多个羟基上适宜地受到保护。典型地，二甲氧三苯甲基、单甲氧三苯甲基或叔丁基二甲基-曱硅烷基(TBDMS)作为5'OH-基团的保护基团来使用，允许3'-OH基团的亚磷酰化作用。其他有可能的基团是磷酸酯类(phosphatesters)以及H-膦酸酯类，参见例如5'國0國位3'-0-位3'-0-位对于磷酸酯以及磷酸二酯而言，R可以选自烷基、芳基、烷芳基。苯基是优选的。针对5'、3'以及2'的其它的羟基的保护基团在本领域内是已知的，例如TBDMS。总体而言，这种亚磷酰化试剂可以与在使用l-H-四唑的亚磷酰化反应中的试剂相同。在一个优选的实施方案中，它具有以下化学式其中Z表示一个离去基团，例如-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、对國CH2C6H4CH2CN、(CH2)2-5N(H)COCF3、CH2CH2Si(C6H5)2CH3、或-CH2CH2N(CH3)COCF3，并且R和112独立地是仲氨基N(R3)2，其中R3是具有从1个至大约6个碳的烷基；或者R3是一个杂环烷基或杂环链烯基的环，该环含有从4至7个原子，并且具有高达3个选自氮、^琉和氧的杂原子。一种典型的亚磷酰化试剂是2-氰基乙基-N,N，N，，N，-四异丙基亚磷酰二胺。其他优选的亚磷酰化试剂是噁哇磷烷(oxazaphospholidine)衍生物，如在通过引用所结合的N.Oketal.,J.Am.Chem.Soc.2003，125，8307至8317中所说明。这种亚磷酰化试剂允许合成寡核苷酸，其中核苷酸之间的键可以按照立体选择性的方式被转化成硫代磷酸酯。此类所合成的非对映立体选择性的核苷酸之间的硫代磷酸酯(phosphotWoate)的连接对将硫代磷酸酯作为反义药物或免疫刺激性药物来使用具有令人希望的作用。图1示出了相L据本发明的一个反应方案。去质子的酸B-的适宜的例子是三氟醋酸盐(trifluoroacetat)、三氟甲磺酸盐、二氯乙酸盐(dichloroacetat)、甲磺酰基、曱^t酰基、邻氯酚盐。具有低于4.5的pKa的^A优选的。优选地，它们具有低亲核性。在一个实施方案中，该反应是在一种分子筛的存在下进行以便将反应介质干燥。总体而言，在A^过程中水应该被排除或通itxt介质进行干燥而进行固定。也有可能将本发明的活化剂I与这种亚磷酰化试剂相结合，并且^加入羟基组分。还有可能将活化剂I与含羟基的化合物相结合，并且此后加入这种亚磷酰化试剂。在使用一种添加剂的情况下，在加入亚磷酰化试剂之前将这种活化剂与这种羟基组分相混合。对于"原位，，生成这种活化剂而言，在加入这种添加剂之后在受控的反应温度下优选将所选择的酸加入。可以在加入所选择的酸之前或之后将这种亚磷酰化试剂加入。对于加入酸和亚磷酰化试剂而言，可以在结束或开始时将这种核苷组分加入。在一个优选的实施方案中，将这种活化剂所对应的碱，含羟基的化合14物，以及这种亚磷酰化试剂进行结合并且将这种酸加入以使反应开始。然后，在一种活化剂II的存在下将这种亚磷酰化的化合物(亚磷酰胺)结合至一个核苷、核苷酸或寡核苷酸的一个羟基基团上。在如以上所说明将一种化合物进行反应之后，将所制备的三酯进行氧化。例如，氧化反应可以用来制备稳定的磷酸酯键或硫代磷酸酯键。如在此所使用，寡核苷酸也覆盖了寡核苷、寡核苷酸类似物，经修饰的寡核普酸、核苷酸模拟物，以及处于RNA和DNA的形式的类似物。总体而言，这些化合物包括所连接的单体的亚单元的主链，其中每个所连接的单体的亚单元直接或间接地附连至一个杂环碱部分上。将这些单体的亚单元、单体的亚单元与杂环碱部分相连接的这些连接结构在结构上是可变的，从而产生了对于所得到的化合物的多种模体形式(motives)。本发明的尤为有用之处在于合成具有化学式Xn的寡核苷酸，其中每个X是选白A、dA、C、dC、G、dG、U、dT，并且11=2至30，优选2至12，更优选2至8或2至6，以及它们的包括保护基团的衍生物。本领域内已知的修饰是杂环碱，糖或将这些单体的亚单元相连接的连接结构的修饰。核苷酸之间的连接的变化是，例如说明于通过引用所结合的WO2004/011474中，从第ll页的底部开始。这些典型的衍生物是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、曱基以及烷基膦酸酯以及膦耽基乙跣衍生物。其他典型的修饰是在糖部分上。或者核糖(ribrose)是被一个不同的糖所取代，或者这些位置中的一个或多个是用其他基团(如，F、O-烷基、S-烷基、N-烷基)所取代。优选的实施方案是2'-甲基以及2'-曱猛乙氧基。所有这些修饰在本领域内都是已知的。关于杂环碱部分，存在着在本领域内所使用的多个其他的合成的碱，例如5-甲基-胞嘧啶、5-羟基-甲基-胞嘧啶、叶黄素、次黄嘌呤、2-Jl^腺嘌呤、腺嘌呤的6-或2-烷基衍生物以及鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶(2-thiouracyl)。此类修饰还披露于WO2004/011474中，从第21页开始。当在合成中使用时，这些碱通常具有保护基团，例如N-6-节基腺嘌呤、N-4-节基胞嘧咬或N-2-异丁醃基鸟嘌呤。总体而言，所有的并非旨在用于另外反应的及JI基团必须受到保护，尤其是糖的羟基基团。在涉及寡核苷酸合成的实施方案中，有用的是在醛或酮的存在下进行反应，这些搭或酮可以作为反应介质或者作为针对其他溶剂的一种共溶剂来使用。适宜的化合物是可以形成烯醇的那些化合物。这些典型的化合物具有化学式RiR;rC=O,其中和R2独立地是H或者由1至20个碳原子构成，这些原子可以单独地形成环状结构，或者R和R2—起形成环状体系，其中并非R和112都是H。一种非常优选的酮是丙酮。丙酮的存在淬灭了任何量的胺(像二异丙胺(DIPA))的活性，它在亚磷酰化的过程中得到释放。这可以用于具有类似结果(没有分解)的更短或更长的寡核苷酸的亚磷酰化作用。还可使用其他具有化学式Rx-C(-O)-Ry的酮化合物(其中Rx和Ry独立地是d-C6烷基或一起形成一个环烷基)，只要它们在例如在a-位置上具有一个CHr基团的胺的存在下能够形成烯醇化物。本发明通过以下非限制性的实例进一步进行解释。实例l将5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯基甲基)-N-异丁酰基-2，-脱氧鸟嘌呤核苷U-G-OH)以及N-甲基咪唑総三氟醋酸盐(MIT)溶解于丙酮和二氯甲烷(1:1)中，并且加入分子筛.在室温下猛烈搅拌将这个悬浮液加至BisPhos在二氯曱烷的溶液中。加入3，-0-块茎糖基(Levulinyl)-]\-异丁酰基-2，-脱氧鸟噪呤核苷(HO-G-l)、乙硫基四唑(ETT)或咪唑鎗三氟乙酸盐(IT，CHK346/06)以及NMI溶解于丙酮和二氯曱烷(1:1)中的溶液。该M之后跟随RP-HPLC，并且在完全转化之后，加入CuroxM400。该^^应之后跟随RP-HPLC，并且在完全转化之后4吏用一个过滤步骤以除去分子筛，之后跟随使用丙酮/二氯甲烷(1:1)的一个洗涤步踝。将这种溶液转移至MTBE中以俊/fit^应产物发生沉淀。将沉淀过滤，用MTBE洗涤，并且在减压条件下在40°C下进行干燥。加料产量[gl1%1d-G"OH[mmolBisPhos[mmol]MIT[mmol]HO-G-llrninolETT/IT[mmol]117,9412515,6318,7319,8812,0632,78215,4610815,6317,191，6812,0628,893n.b.n.b.1,561,721,841,212,2316<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实例3将5'-0-(4，4，-二曱氧基三苯基甲基)-N-异丁酰基-2，-脱氧鸟嘌呤核苷(d-G-OH)以及NMI溶解于丙酮和二氯甲烷(1:1)中，并且加入分子筛。在室温下逐滴加入BisPhos，并且还逐滴加入TFA在二氯曱烷中的溶液。该反应之后跟随RP-HPLC，并且完全转化之后加入3，-0-块茎糖基胸腺嘧咬核苷(Levulinyltymidine)(HO-T-l)以及咪唑溶解于丙酮和二氯甲烷(1:1)中的溶液。此外，逐滴加入TFA在二氯曱烷中的溶液。该^1应之后跟随RP-HPLC，并且完全转化之后，加入CuroxM400。该反应之后再跟随RP-HPLC。完全M之后，将其过滤以去除分子筛，用丙酮/二氯甲烷(1:1)洗涤，并且转移至MTBE中以4吏产物发生沉淀。将沉淀过滤，用MTBE洗涤，并且在减压条件下在40。C下进行干燥。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1.一种用于制备寡核苷酸的方法，包括以下步骤a)提供具有下式的含羟基的化合物其中B是杂环碱基并且i)R2是H、受保护的2’-羟基、F、受保护的氨基、O-烷基、O-取代的烷基、取代的烷氨基或C4′-02′亚甲基键R3是OR′3、NHR″3、NR″3R′″3，其中R′3是羟基的保护基团、受保护的核苷酸或受保护的寡核苷酸，R″3、R′″3独立地是胺的保护基团，并且R5是OH或ii)R2是H、受保护的2’-羟基、F、受保护的氨基基团、O-烷基、O-取代的烷基、取代的烷氨基或C4′-02′亚甲基键R3是OH并且R5是OR′5并且R′5是羟基的保护基团、受保护的核苷酸或受保护的寡核苷酸或iii)R2是OHR3是OR′3、NHR″3、NR″3R′″3，其中R′3是羟基的保护基团、受保护的核苷酸或受保护的寡核苷酸，R″3、R′″3独立地是胺的保护基团，并且R5是OR′5并且R′5是羟基的保护基团、受保护的核苷酸或受保护的寡核苷酸b)使所述化合物与亚磷酰化试剂在具有下式I的活化剂(活化剂I)的存在下进行反应以制备亚磷酰化的化合物其中R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基R1、R2＝H或者一起形成5至6元的环X1、X2独立地＝N或CHY＝H或Si(R4)3，其中R4＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基B-＝去质子的酸c)在活化剂II的存在下，使未经分离的所述亚磷酰化的化合物与具有下式的第二化合物进行反应，该活化剂II选自咪唑、咪唑鎓盐以及它们的混合物，其中对R5、R3、R2、B独立地进行选择，但是R5、R3、R2、B具有如上相同的含义。2.如权利要求l所述的方法，其中所述具有式I的活化剂具有选自以下各项的式其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>丫其中Y是如在权利要求1中所定义R是甲基、苯基或苄基。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述亚磷酰化试剂具有下式II<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中Z代表离去基团并且Ri和&独立地是仲氨基。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亚磷酰化试剂是2-氰基乙基-N,N，N，，N，-四异丙基亚裤酰二胺。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述去质子的酸衍生自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、邻氯酚盐。6.如权利要求1至5中任何一项的方法，其中所述反应在丙酮的存在下进行。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述亚磷酰化试剂的用量是1.0至1.2mol/mo1所述含羟基的化合物中的羟基。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述亚磷酰化试剂的用量是3至5mol/mo1所述含羟基的化合物中的羟基。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤b)之后加入高分子醇。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述高分子醇是聚乙烯醇。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述去质子的酸衍生自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸(三氟曱磺酸盐)、邻氯酚盐以及它们的混合物。12.如权利要求1至11中任一项的方法，其中所述反应在丙酮的存在下进行。13.如权利要求12所述的方法，其中至少95%(重量/重量)的反应介质是丙酮。14.如权利要求1至13中任一项的方法，其中反应混合物包含小于0.5摩尔的四唑或四唑衍生物/每摩尔步骤c)的所述第二化合物。15.如权利要求14所述的方法，其中所述反应混合物包含小于0.1摩尔的四唑或四唑衍生物/每摩尔步骤c)的所述第二化合物或不包含四唑或四哇衍生物。全文摘要用于制备一种寡核苷酸的一种方法，包括以下步骤a)提供具有化学式(1)的一种含羟基的化合物，其中B是一个杂环碱基，并且基团R₂、R₃和R₅是如在说明中所定义；b)在具有化学式(I)的一种活化剂(活化剂I)的存在下，将所述化合物与一种亚磷酰化试剂进行反应，其中R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基；R₁、R₂＝H或者一起形成一个5至6元的环；X₁、X₂＝独立地N或CH之一；Y＝H或Si(R₄)₃，其中R₄＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂芳基；B＝去质子的酸；以便制备一种亚磷酰化的化合物；c)在一种活化剂II的存在下，将未经分离的所述亚磷酰化的化合物与具有化学式(1)的一种第二化合物进行反应，该活化剂选自下组咪唑、咪唑鎓盐以及它们的混合物，其中对R₅、R₃、R₂、B独立地进行选择，但是R₅、R₃、R₂、B具有如以上定义的相同含义。文档编号C07H21/00GK101679474SQ200780053003公开日2010年3月24日申请日期2007年11月21日优先权日2007年5月22日发明者克里斯蒂娜·基希霍夫,奥拉夫·格罗塞尔,安德烈亚斯·舍恩贝格尔,安德烈亚斯·霍尔菲尔德,迈诺尔夫·朗格申请人:集润德斯股份公司