抗Lewis^y和Lewis^b抗原的抗癌抗体的利记博彩app

专利名称：抗Lewis^y和Lewis^b抗原的抗癌抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及包含用于治疗癌症的抗体或抗原结合片段的结合复合 物。特别地，本发明提供包含与Lewisy和Lewisb抗原结合的抗体或抗 原结合片段的结合复合物，其中抗体或抗原结合片段是多聚体形式。 结合复合物诱导过表达Lewi^和LewiSb的肿瘤细胞细胞死亡。
背景技术：
Lewi^和Lewisb是乳腺癌、肺癌、结肠癌和卵巢癌过表达的复杂 碳水化合物。因此，它们可能代表了单克隆抗体(mAb)治疗的好耙 点。Lewisy半抗原是在2型血型低聚糖上发现的双岩藻糖化的四糖 (Fucal-2Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAc)。该抗原是Lewisb半抗原的位置异 构体(Fucal-2Gaipi-3(Fucal-4)GlNAc和Lewisx半抗原的岩藻糖化衍 生净勿(Abe ef a/. (1986) Aasearc/z 46: 2639; Kim a/. (1986)
Ca"ceri "e^r/2 46: 5985)。 Lewisy在乳腺、支气管、胰腺、生殖泌尿 系统和在胃肠道深部腺体表达。相反，Lewisb在表面上皮表达(Sakamoto a/. (1989) Ca"cer 7 esearc/7 49: 745-52; Kitamura W a/. (1994) iVoc. 胸/. icad 91: 12957-61 )。
IgM小鼠mAb C14用标准融合流程抗原发结肠直肠肿瘤细胞而产 生，并与Lewisy和Lewisb (延伸的和非延伸的)抗原结合(Brownda/. (1983)3: 163; Brown & a/. (1984) /"A / C露w 33: 727; Durrant d o/. (1993) Z/j^nWowa 12: 647-60)。 C14抗体与78%的结肠直 肠癌结合(Durrant"a/. (1989) J TVa". Owcer/"" 81: 688-95)，然而其 作为鼠IgM不适合进行体内研究。为生产该抗体的IgG变种，用C14 mAb免疫大鼠，并纯化产生的大鼠抗C14抗体。以这种抗血清和 C14gp200抗原免疫大鼠，接着将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，结 果产生5种IgG mAb， 2禾中IgG3 (SC101/23、SC101/29 mAb)和3种IgGl (SC101/33、 SC101/42和SC101/43;这5种抗体以前已经以"692" mAb 公开)。所有IgG变种均识别Lewisy和Lewisb抗原并证实与C14特异性相同。此外，薄层层析和ELISA显示这些抗体与延伸的和非延伸的
Lewisy和Lewisb半抗原结合，而不与Lewisx半抗原或H血型半抗原结 合(Browne/. (1983)6/謹'.3: 163)。
与Lewisy和Lewisb抗原结合的抗体是已知的，然而，SC101 mAb 的独特性在于其能够识别Lewi^和Lewisb决定簇。没有别的mAb并且 仅有一种稀有的凝集素识别这两种分子的相似小平面。Lewis y/b主要 作为糖酯在神经酰胺骨架上表达。最近，结晶学的研究己表明LewiSy 特异性抗体能具有非常不同的结合位点，这些位点适应半抗原内N-乙 酰基-葡萄糖胺或岩藻糖残基(Ramsland " a/. (2004) J Mo/. B/o/. 340: 809-18) 。 SC101由于其结合位点适应于由于彼此互为立体异构体而非 常罕见的LewW和Lewisb的方面而再次不同。令人进一步感兴趣的是 这些抗体在包括胃肠道的绝大多数正常组织中不能识别糖酯类，这可 能由于神经酰胺或其它非常相关的分子中的空间位阻效应。这使得 SC101抗体的组织分布很独特，但却与许多上皮肿瘤牢固结合(Brown
(1983)5/固-.3: 163)。
在最初鉴定这些抗体与原发分解(primary disaggregated)的结肠 直肠肿瘤的结合过程中，观察到这些抗体可诱导细胞死亡。细胞死亡 能通过包括细胞凋亡和胀亡(oncosis)的许多机制而发生。细胞凋亡 依赖于半胱天冬酶(caspase)，其特点为细胞萎縮、皱折(ruffling)质 膜的染色质浓縮和边集(margination)，最终使细胞解体进入凋亡小体。 胀亡是坏死性细胞死亡的早期阶段并以膜通透性状态不断增加导致细 胞肿胀为标志。坏死是指细胞死亡之后出现的形态学改变并能在凋亡 和胀亡之后出现。
本发明人现已证明SC101/29 mAb杀死了肿瘤细胞，该抗体直接在 体内和体外经由与经典胀亡有许多相似之处的独特机制杀死过表达 Lewisin Lewisb的肿瘤细胞。
发明简述本发明的第一方面提供了包含与LewW和Lewisb抗原结合的抗体 或抗原结合片段的结合复合物，其中抗体或抗原结合片段是多聚体形 式。
本发明的第二方面提供了用于诱导过表达Lewi^和Lewisb抗原的 肿瘤细胞细胞死亡的方法，其包含对受试者使用有效量的本发明第一 方面所述的结合复合物。
本发明的第三方面提供了治疗需要此种治疗的受试者癌症的方 法，其包含对受试者使用治疗有效量的本发明第一方面所述的结合复 合物。
本发明的第四方面提供了用于诱导过表达Lewi^和Lewisb抗原的 肿瘤细胞细胞死亡的药物组合物，其包含本发明第一方面所述的结合 复合物和药学上可接受的载体或稀释剂。


图la:显示了 SC101与新鲜分解的结肠直肠肿瘤细胞的结合，如 通过间接免疫荧光测定的和流式细胞术分析的。每个柱指明了单个肿 瘤的平均荧光强度。显示了 SC101与结肠直肠肿瘤细胞系Cok)205、 C170、 HT29和LoVo的结合以作比较。
图lb:显示了 SC101/29 mAb抑制LoVo和C170细胞的IC50生 长曲线。生长抑制％以暴露于SC101/29 mAb的细胞数目/暴露于对照 mAb的细胞数目表示。生长抑制曲线中的有活性细胞的数目利用MTS 通过读取490nm处的光密度值确定。
图lc:显示了 SC101/29 mAb抑制Colo205和HT-29细胞的IC50 生长曲线。生长抑制％以暴露于SC101/29mAb的细胞数目/暴露于对照 mAb的细胞数目表示。生长抑制曲线中有活性细胞的数目利用MTS 通过读取490nm处的光密度值确定。
图2a:显示以30昭/mlIgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Chl 1 、 30^ig/ml BR96 4小时或以30昭/ml SC101/29 mAb 30分钟、2小时或4小时处理 2xl05 Colo205细胞。细胞于室温在暗室中用PI染色15分钟，并用 FC500流式细胞仪488nm (发射620nm FL3)进行分析。图2b:显示以30jig/mlIgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Chll、 30吗/ml BR96 4小时或以30昭/ml SC101/29 mAb 30分钟、2小时或4小时处理 2xl05 C170细胞。细胞于室温在暗室中用PI染色15分钟，并用FC500 流式细胞仪488nm (发射620nm FL3)进行分析。
图2c:显示以30吗/mlIgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Ch11、 30昭/ml BR96 4小时或以30昭/ml SC101/29 mAb 30分钟、2小时或4小时处理 2xl05 HT-29细胞。细胞于室温在暗室中用PI染色15分钟，并用FC500 流式细胞仪488nm (发射620nm FL3)进行分析。
图2d:显示以30吗/ml IgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Chl 1 、 30|ig/ml BR96 4小时或以30吗/ml SC101/29 mAb 30分钟、2小时或4小时处理 2xl05 LoVo细胞。细胞于室温在暗室中用PI染色15分钟，并用FC500 流式细胞仪488nm (发射620nm FL3)进行分析。
图2e:显示在存在0-10jiM多柔比星30分钟条件下，用l-100pg/ml SC101/29 mAb处理2xl05 Colo205、 C170、 HT-29或LoVo细胞4小时。 细胞用FC500流式细胞仪488nm (发射575nm FL2)进行分析。
图2f:显示细胞以识别p-糖蛋白的mAb (0.3-30pg/ml)染色，并 用FC500流式细胞仪488nm (发射525nm FL1)进行分析。
图3a:显示以SClOl/29或SC101/43或2种mAb处理2xl05 C170 细胞1小时。细胞于室温在暗室中用PI染色15分钟，并用FC500流 式细胞仪488nm (发射620nm FL3)分析。
图3b:显示以100|ig/ml IgG、与卵白素混合的100吗/ml IgG、 100昭/ml SClOl/29, 100jig/ml SC101/43-生物素或100(ig/ml生物素化的 交联卵白素的SC101/43处理2xl05 C170细胞1小时。细胞于室温在暗 室中用PI染色15分钟，并用FC500流式细胞仪488nm (发射620nm FL3) 进行分析。
图3c:显示100(ig/ml小鼠SC101/29-人IgG2嵌合抗体30分钟， 接着以交联的抗人IgG抗体(0-100昭/ml)处理lx105 Colo205细胞。 室温孵育3小时后，于暗室中细胞以7AAD染色20分钟，并用Cell Quanta SC MPL 488nm进行分析。显示了两组样品中死亡(7AAD+) 细胞的平均百分数。图3d:显示在0、 1或10(iMz-FMK-vadpan-半胱天冬酶抑制剂存 在条件下，以100jig/ml同型阴性对照mAb、 100ng/ml抗-Fas或100(ig/ml SC101/29 mAb处理5xl05 C170细胞约12小时。于室温暗室中将细胞 用膜联蛋白V和PI染色15分钟并用FC500流式细胞仪488nm (发射 525nmFLl、 620nmFL3)进行分析。
图3e:显示将2xl06 C170细胞暴露于IgG (30吗/ml)阴性对照4小 时，SC101 l-4小时或0.5M山梨糖醇30分钟(阳性对照)。以冰冷的 Tris抽提缓冲液+ 0.5mMNaV04抽提细胞，并在SDS-PAGE的每个泳 道加入75jig总蛋白。10%凝胶于130V分离90分钟并将其在BioRad 半干印迹仪上(12V恒定电压)转移70分钟，转至PVDF膜上。该膜 经封闭，并且每2ml P-p38、 P-JNK或P-ERK(1% BSA TBS-T)用 探测，洗膜并用ECLPlus+显色。
图4a:显示证明SC101/29 mAb、 5-FU/甲酰四氢叶酸或联合使用 SC101/29mAb与5-FU/甲酰四氢叶酸对生长于裸鼠的C170异种移植物 生长的效应的图。于第12、 16、 19和23天时，C170异种移植物的生 长通过测定以SC101/29 mAb i.p(0.2mg)、对照抗体i.p(0.2mg)和5-FU/ 甲酰四氢叶酸(12.5mg/kg; iv)处理动物时的横断面面积(mm2)而测定。 分析第23天的结果的变异显示了当将SC101/29 mAb与未处理的对照 组进行比较时p0.004的显著性数值，将对照组加5-FU/甲酰四氢叶酸 组与SC101/29 mAb加5-FU/甲酰四氢叶酸组进行比较时p<0.020。
图4b:显示未处理小鼠(组1)、单独接种SC101/29mAb (组2)、 单独接种5-FU/甲酰四氢叶酸(组3)或联合接种SC101/29 mAb和5-FU/ 甲酰四氢叶酸(组4)的终末肿瘤重量。
图4c:显示未处理的、单独接种SC101/29mAb、单独接种5-FU/ 甲酰四氢叶酸或联合接种SC101/29 mAb和5-FU/甲酰四氢叶酸的小鼠 的重量。
图4d:显示以SC101/29 mAb ip (0.2mg)、 5-FU/甲酰四氢叶酸 (12.5mg/kg iv)或联合使用SC101/29 mAb (0.2mg)和5-FU/甲酰四氢叶酸 (12.5mg/kg iv)处理的带C170异种移植物的动物的存活数据。在第7天 给予SC101/29 mAb，然后每周3次。在第1、 3、 5和7天给予5-FU/甲酰四氢叶酸。当联合给予5-FU/甲酰四氢叶酸时，与载体对照小鼠相
比，SC101/29mAb显著增强了存活(p=0.0163 Log Rank)
图5:显示代表10吗或100吗SC101/29 mAb或载体对照对 C170HM2肝脏转移裸鼠模型最终肝脏肿瘤重量的效应的图。
发明详述
本发明人已证明，包含与Lewi^和Lewisb抗原结合的抗体或抗原 结合片段的结合复合物诱导了过表达LewW和Lewisb的肿瘤细胞细胞死亡。
在第一方面，本发明提供包含与Lewi《和Lewisb抗原结合的抗体 或抗原结合片段的结合复合物，其中抗体或抗原结合片段是多聚体形 式。
本文所用术语"抗体"是指由4条多肽链，即通过二硫键互连的2 条重链(H链)和两条轻链(L链)组成的免疫球蛋白分子。每条重链 由重链可变区(HCVR或Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区包含3 个结构域，CH1、 Ch2和Ch3。每条轻链由轻链可变区(LCVR或VJ 和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。Vh和Vl区能 进一步细分成高度可变区，称为互补性决定区(CDR)，其被那些更 加保守的称为框架结构区(FR)的区域分隔开。毎条Vh和V^由3个 CDR、4个FR组成，其从氨末端到羧末端以下列顺序排列FR1 、CDR1 、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。
本文所用的术语抗体的"抗原结合片段"是指一种或多种表现出 结合抗原的能力的免疫球蛋白的成分或衍生物。已表明，抗体的抗原 结合功能能通过全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的"抗原结合 片段"中的结合片段的例子包括(i) Fab片段， 一种由V。 VH、 Cl 和Ch1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段， 一种包含在其铰链 区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和Ch1结 构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的Vl和VH结构域组成的Fv 片段；(v)由单条VH结构域或VL结构域(van den Beuken " a/. (2001) 嵐脂，310, 591)组成的dAb片段(Ward " "/ (1989)胸脏341: 544-546);(vi)分离的互补性决定区(CDR);和(vii)通过同源框架区融合的互补性决定区，如Qiu"a/. (2007) A^wre5/ofec/zw /ogy 25(8): 921-929中所述的那些。而且，尽管Fv片段的2个结构域V^和VH由 分离的基因编码，但用重组的方法能将其通过合成接头连接起来，该 接头能使其被制成单条蛋白链，其中Vl和VH结构域配对以形成单价 分子(称作单链Fv (scFv); (Bird " a/. (1988) 5We騰242: 423-426; Huston & a/. (1988)7Vaf/. Jcad SW 85: 5879-5883)。这种单 链Fv也包含在术语抗体的"抗原结合片段"内。其它形式的单链Fv 和相关分子如双抗体或三抗体也包含在其中。双抗体是2价抗体，其 中Vh和V^结构域在单条多肽链上表达，但使用了太短以至于不能使 同一链上的2个结构域之间形成配对的接头，从而强迫结构域与另一 条链的互补性结构域配对并产生2个抗原结合位点(见如Holliger "a/. (1993) P賜.扁.腦90: 6444-6448; Poljak " a/. (1994) 5Vra"匿2: 1121-1123)。
本发明的必要特征为抗体或抗原结合片段是以多聚体的形式。抗 体或抗原结合片段与Lewisy和Lewisb抗原结合使得抗原被交联。Lewisy 和Lewisb抗原交联对于介导过表达Lewisy和Lewis b的细胞的肿瘤细 胞死亡可能是重要的。
本文所使用的术语"多聚体"是指形成彼此连接的2条或多条抗 体或抗原结合片段。而且，多聚体可是同源或异源多聚体。例如，多 聚体可是同源或异源二聚体、同源或异源三聚体或更高。同源多聚体 是包含相同抗体或抗原结合片段的多聚体，而异源多聚体是包含至少2 条不相似的抗体或抗原结合片段的多聚体。然而，不管多聚体的组成 如何，每条抗体或抗原结合片段必须与Lewi^和Lewisb抗原结合。
在本发明的优选具体实施方式
中，多聚体是同源或异源二聚体。
在本发明的另一进一歩优选具体实施方式
中，抗体不天然二聚体 化或多聚体化。
本文所用的术语"结合Lewi《和Lewisb抗原"是指与LewiSy和 Lewisb抗原结合以使Lewisy和Lewisb抗原交联的抗体或抗原结合片段。
本文所用的术语"结合"是指，抗原与抗体的免疫球蛋白可变区 以lpM或更低的解离常数(Kd)的结合，解离常数如通过使用例如 BIAcoreTM表面等离子体共振系统和BIAcoreTM动态评价软件(例如2.1版本)的表面等离子体共振分析测定的。特异性结合相互作用的亲和
或解离常数(Kd)优选约500 nM至约50 pM，更优选约500 nM或更 低，更优选约300 nM或更低，并优选至少约300 nM至约50pM，约 200 nM至约50 pM，并更优选至少约100 nM至约50pM，约75 nM至 约50 pM,约10 nM至约50 pM。
在本发明的某些具体实施方式
中，抗体或抗原结合片段是双体或 多体。在本发明的其它具体实施方式
中，双体或多体包含修饰的Fc结 构域。
在本发明的其它具体实施方式
中，包含抗体或抗原结合片段的多 体是IgG抗体。在本发明的进一步具体实施方式
中，多体是双体IgGl 抗体。
虽然一些抗体(如IgG3)在体外或体内形成二聚体，但IgGl抗体 以单体形式存在。为了使单体抗体或其抗原结合片段可诱导过表达 Lewis"n Lewisb抗原的肿瘤细胞的肿瘤细胞死亡，Lewis^B Lewisb抗 原的交联通过单体抗体或抗原结合片段的卵白素/生物素交联而进行。 此外，单体抗体或抗原结合片段可通过重组工程交联，例如通过使CH3 区基因上丝氨酸突变成为半胱氨酸，使得在单体的羧末端形成链间二 硫键(Caron ef (1992) / 她d 1191-1195)。这依次促进Lewisy 和Lewisb抗原的交联。
在第二方面，本发明提供了诱导过表达LewW和Lewisb抗原的肿 瘤细胞细胞死亡的方法，该方法包含对受试者使用有效量的结合复合 物，其包含与Lewisy和Lewisb抗原结合的抗体或抗原结合片段，其中 抗体或抗原结合片段是多聚体形式。
在第三方面，本发明提供了治疗需要此种治疗的受试者中癌症的 方法，该方法包含对受试者使用治疗有效量的本发明第一方面所述的 结合复合物，该结合复合物与LewW和Lewisb抗原结合。
术语"治疗有效量"是指在本发明的癌症情况下，足以治疗或缓 解指定疾病或失调或其一种或多种症状和/或足以预防或减少疾病或失 调发生的抗体或抗原结合片段的量(包括包含其抗体或抗原结合片段 的药物组合物)。当用于与治疗方法和抗体或其抗原结合片段(包括包含其抗体或 抗原结合片段的药物组合物)的用途有关时，"需要此种治疗"的个 体可以是被诊断出患有癌症或以前已经过癌症治疗的个体。
在本发明的优选具体实施方式
中，癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠 癌或卵巢癌。
在第四方面，本发明提供了包含本发明第一方面所述的结合复合 物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，其用于诱导过表达
Lewis"n Lewisb抗原的肿瘤细胞细胞死亡。
"药学上可接受的载体或稀释剂"包括任何和全部溶剂、分散介 质、包衣剂、抗生素、抗真菌剂、等渗或吸收延迟剂等等具有生理相 容性的物质。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲 液、葡萄糖、甘油、醇等等及其组合物的一种或多种。在许多情况下， 优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯 化钠。
组合物可是多种形式，包括液体、半固体或固体的剂型，如液体 溶液(如可注射溶液和难溶溶液)、分散液或混悬液、片剂、丸剂、 散剂、脂质体或栓剂。优选地，用于免疫的组合物是可注射的溶液形 式。给药可是静脉、皮下、腹腔、肌内、经皮、鞘内和动脉内给药。 优选地，剂量形式的范围是每公斤体重每日、每周、每2周或每3周 或每月给药从约0.001 mg至约10mg，更优选地，每公斤体重每周给 药约0.05mg至约5 mg。
该组合物也可配制成灭菌粉末以制备灭菌注射溶液。
在某些具体实施方式
中，结合复合物可与载体一起制备，该载体 可保护化合物使不易快速释放，如控释成分，包括埋植剂、经皮贴片 和微囊递送系统。可使用相容性多聚体，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、 聚乙醇酸、胶原、多正酯类或聚乳酸。
也可将该组合物进行配制以用于口服给药。在该具体实施方式
中， 抗体可包括在硬或软壳明胶胶囊、压制入片剂或直接掺入受试者的饮 食中。
也可将组合物配制成用于直肠给药的形式。可将本发明的结合复合物给药以在体外和体内结合并鉴定选定的 细胞，以在体内结合并破坏选定的细胞，或以在体内渗入并破坏选定 的细胞。
在优选具体实施方式
中，将组合物给予到人。
为了更清晰地理解本发明的性质，将参考下述非限制性实施例公 开其优选形式。
实施例l
材料和方法
细胞系
C170是来源于原发肿瘤的直肠结肠细胞系(Durrant" a/. (1986) & / Ca"cw 53:37-45) 。 Colo205、 HT-29和LoVo是从ATCC获得的直 肠结肠细胞系。将所有细胞在含10%胎牛血清(FCS F6178; Sigma, Poole, UK)的RPMI 1640培养基(BE12-702F; Cambrex Bio Science, Berkshire, UK)中培养。
单克隆抗体
识别Lewis"n Lewisb半抗原的SC101 mAb按照以前描述的方法 (Brown a/. (1983) B/asc/. 3: 163; Durrant a/. (1993)场6r/(io附a 12:647-60)纯化。抗-Fas (人的激活的)克隆Chll (05-201)抗体获自 Upstate, Br96和IgG阴性对照来自Sigma (15381)。
对结肠直肠肿瘤细胞的抗体结合
肿瘤样品在进行结肠直肠癌切除时获得。将肿瘤仔细剪碎，并于 37°C用0.05%胶原酶(IV型，Boehringer Mannheim, Lewes, UK)消化 20分钟，并用SC101/29和山羊抗小鼠FITC(Dako Ltd， Bucks UK; 1:100 稀释)进行间接免疫荧光染色。将肿瘤细胞系等分(105)并用SC101/29 mAb或抗-P-糖蛋白(表明多药耐药性，BD Pharmingen， San Diego, California USA)于4°C于各种浓度下染色30分钟。用培养基 (RPMI/10%FCS)冲洗2遍后，将细胞与二抗(山羊抗小鼠FITC)于 4。C孵育30分钟，然后冲洗一遍，用FC500流式细胞仪488nm进行分 析(发射525nmFLl)。
体外杀死结肠直肠肿瘤细胞在平底96孔板的各个孔中加入等量lxl(^结肠直肠细胞系C170、 Colo205、 HT-29禾nLoVo细胞，并于37°C放置过夜使贴壁。次日，以 100、 30、 10、 3、 l或0吗/ml的SC10/29mAb(10(Vl/孔)处理细胞。使 用同型匹配的阳性或阴性对照抗体以进行比较。使用3孔平行。在向 每个孔中加入溶液Cell Titer96 Aqueous One Solution (G3580; Promega, Southampton, UK)之前，将细胞在存在抗体的情况下于37。C放置5 天，读取490nm光密度值。
摄入PI
将2xl05 Colo205、 C170、 HT-29或LoVo细胞用30jig/ml IgG、 300ng/ml抗-Fas、 30昭/ml BR96或SC101/29 mAb处理30分钟、2小 时、4小时。接着，在暗室中于室温将这些细胞用PI (630110; BD Biosciences, Oxford, UK)染色15分钟，然后用FC500流式细胞仪488nm (发射620nmFL3)进行分析。 ,.摄入7AAD
将lx105 Colo205细胞于室温在磷酸盐缓冲液(PBS)中用100|ig/ml 小鼠SC101/29-人IgG2嵌合抗体孵育。30分钟后，加入不同浓度的交 联的抗人IgG抗体(0-100吗/ml; Sigma)，并将细胞于室温孵育3小时。 然后将细胞于暗室中用7AAD (Beckman Coulter)染色20分钟，并用Cell Quanta SC MPL 488nm (Beckman Coulter;发射滤光片670LP FL3)进
行分析。
MDR细胞系摄取药物
将2xl05 Colo205、 C170、 HT-29或LoVo细胞于37°C用0、 1、 3、 10、 30或100吗/ml SC101/29 mAb处理30分钟。在细胞中加入多柔比 星至终浓度为0、 1或IO^iM并于37°C孵育1小时。将细胞用冰冷的 5x磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗并用FC500流式细胞仪488nm (发射575nm FL2)分析荧光。
半胱天冬酶依赖的细胞死亡抑制实验
将5xl05 C170细胞等分加入24孔平底灭菌板的单个孔中并于 37°C放置6小时使细胞贴壁。用lOOpg/ml同型匹配的阴性对照mAb、 100ng/ml抗-Fas或100(ig/ml SCI01/29 mAb和0、 1或lOjaM z-FMK-vad (G7232; Perbio Science, UK)处理细胞。将细胞于37°C放回过夜并随后用钙磷脂结合蛋白V和PI染色15分钟，用FC500流式细胞仪488nm (发 射525nm FL1， 620nm FL3)分析荧光。
经由应激相关激酶的信号传递(signalling)
将2xl06 C170细胞暴露于IgG (30吗/ml)阴性对照4小时、SC101 (30吗/ml) 1-4小时或0.5M山梨醇30分钟(阳性对照)。用冰冷的抽 提缓冲液(50mM Tris pH 7.4、 2mM EDTA、 2mM Na4P207、 2mM benzamadine、 lmM PMSF 、 0.5mM NaV04 、 0.5mM DTT 0.1% Triton-X-lOO)抽提细胞，蛋白质浓度用标准的BioRad蛋白质检测方 法测定，并在SDS-PAGE的每个泳道上上样75昭总蛋白。10%凝胶 于130V分离90分钟并用BioRad半干转膜仪(12V恒定电压)运行 70分钟将蛋白质转到PVDF膜上。膜用1%牛血清白蛋白(BSA)、 Tris缓冲盐溶液0.05%吐温-20 (TBS-T)封闭1小时，并且每2ml P-p38、 P-JNK或P-ERK(Promega)用溶于1。/。BSATBS-T的ljil进行杂交检测。 随后将膜用TBS-T冲洗3遍并用山羊抗兔HRP (GaR HRP; Dako, P0448) 杂交检测，用TBS-T冲洗3遍，用ECLPlus+显色。
体内研究
预防模型。将结肠直肠肿瘤细胞系C170在裸鼠中连续传代以进行 维持。为了治疗，处死小鼠并摘除肿瘤。将40只雄性小鼠随机分配成 4个实验组，皮下注射麻醉剂(Hypnorm,Roche/Hypnovd, Jannsen)将 其麻醉，将肿瘤仔细剪碎并将3mr^的小块植入小鼠体内。 一组小鼠于 第1、3、5、7、21和22天静脉(iv)注射5-FU/甲酰四氢叶酸(12.5mg/kg) 进行处理。小鼠腹腔(ip)注射0.2mg的SC101/29 mAb，每周3次。 对照小鼠接受SC101/29 mAb、 5-FU/甲酰四氢叶酸或单独的载体。在 第12、 16、 19和23天时用测径器测定肿瘤大小并计算肿瘤的横截面 积。在实验终点，将肿瘤称重以评价抗肿瘤效果。将动物称重以评价 治疗的毒性。
治疗模型。将结肠直肠肿瘤细胞系C170在裸鼠中连续传代进行维 持。为了治疗，处死小鼠并摘除肿瘤。将40只雄性小鼠随机分配成4 个实验组，皮下注射麻醉剂将其麻醉，将肿瘤仔细剪碎并将3mm3的 小块植入小鼠体内。小鼠用3mn^的C170异种移植物进行了外植。于 第l、 3、 5、 7天对各组小鼠静脉注射5-FU/甲酰四氢叶酸(25mg/kg)，
16并且，如果适用的话，从第28天开始循环。小鼠静脉注射0.2mg的 SC101/29 mAb，每周3次，对照组小鼠接受单独的SC101/29 mAb或 对照小鼠用5-FU/甲酰四氢叶酸处理产生的IgG抗体。
转移模型。将C170HM2细胞在体外在37°C、 5% C02、潮湿条 件下在含有10。/。热灭活FCS的RPMI 1640培养基中培养。细胞生长至 亚融合状态时用0.025% EDTA进行收集，用上述培养基冲洗2遍，并 重悬，为用于体内给药，将溶于lml体积的灭菌PBS (pH7.4)的1.5 x 106个细胞注射入30只雄性裸鼠的腹腔内。将动物分到其治疗组，治 疗于第1天开始并贯穿整个研究。在第1天时，将各组小鼠静脉注射 lOjig或IOO吗的SC101/29 mAb或载体对照进行处理，此后每周3次。 40天时处死小鼠，评估小鼠体重和肿瘤重量。
统计分析
通过使用用于PC的Minitab程序上的Analysis of Variance和Log Rank进行统计分析。
实施例2 结果
对结肠直肠肿瘤细胞的抗体结合
以前表明SC101 mAb结合Lewisy和Lewisb半抗原。图la中显示 新鲜分离的结肠直肠肿瘤强烈着色。该mAb也结合分离的卵巢和胃部 月中瘤(Brown "a/. (1983)说osd. i ep, 3:163)。此外，这些抗体诱导了 加速的原发肿瘤细胞细胞死亡。用SC101/29和SC101/33抗体的免疫 组织化学和流式细胞仪实验明显地与下列类型的肿瘤细胞系和肿瘤异 种移植物结合卵巢、乳腺、肺、前列腺和胰腺(数据未显示)。
体外杀死结肠直肠肿瘤细胞
为了进一步研究这种杀细胞作用，筛选许多细胞系与SC101/29 mAb结合(图la)并抑制细胞增殖(图lb和lc)的能力。C170和 Colo205细胞系都能与SC 101/29 mAb结合，然而，多数原发肿瘤显示 更强的结合。相反地，SC101/29 mAb与HT-29和LoVo细胞微弱结合， 其结合水平相当于与原发肿瘤结合的20%。特别有趣的是，SC101/29mAb抑制C170和Colo205细胞的增殖，但不能抑制表达低水平Lewisy 和Lewisb抗原的HT-29和LoVo细胞的增殖。 存活力测试
为了评价SC101/29 mAb介导的细胞死亡的机制，将碘化丙锭(PI) 一种在等渗条件下仅能进入无活力细胞的荧光化合物，用作探针以鉴 别那些血浆膜失去完整性的细胞。如图2a和2b所示，SC101/29mAb 使Colo205和C170细胞的通透性快速增加，以至以上75%的细胞早在 用抗体处理后30分钟就PI强烈着色。在同一条件下，当用已知诱导 凋亡性细胞死亡的抗-CD95抗体孵育，或与对照小鼠IgG抗体孵育4 小时后，少于10。/。的细胞摄入PI。相似地，BR96， 一种仅结合Lewisy 而不结合Lewisb的mAb，在4小时时间内也不能显示出明显摄入PI。 与细胞增殖抑制一致，SC101/29 mAb不能诱导抗原表达低的HT-29和 LoVo细胞PI摄入。
还分析了 SC101/43改变膜通透性的能力，然而与SC101/29形成 直接对照的是，它不能诱导PI摄入(图3a)。然而，它在阻断SC101/29 诱导的PI的摄入方面是非常有效的，这提示它结合同一或密切相关的 表位。如果SC101/43通过卵白素/生物素交联，它也能诱导有效的细胞 杀死作用。同样地，嵌合SC101/29IgG2抗体的交联导致直接杀死结肠 肿瘤细胞(图3c)。由于SC101/29是以天然二聚体存在的小鼠IgG3， 因此这些结果提示，由于其二聚体结构，Lewi/和Lewisb的交联对于 SC101/29诱导细胞胀亡是重要的，而SC101/43作为IgGl需要人工交 联。
MDR细胞系药物摄入
膜丧失完整性使得小分子得以进入细胞。这一点可以通过使用荧 光药物多柔比星证明；在许多(arangeof)细胞暴露于SC101/29 mAb 后，表达高水平抗原并显示膜丧失完整性的细胞系(Cok)205和C 170) 的多柔比星的摄入作用增强，而具有低抗原密度的细胞(HT-29和LoVo， 图2e)则并非如此。这种效应甚至在表达p-糖蛋白的细胞(C170)也 得到证实(图2f)，这提示SC101/29造成的膜搅动抑制药物通过该泵 的外泌。
半胱天冬酶依赖的细胞死亡抑制实验膜完整性快速丧失通常导致胀亡，其中膜上形成的小孔继续增大 直到这些孔得以释放大的胞浆蛋白，如LDH。同时，PI显示丧失完整
性，未见同时释放来源于C170细胞的LDH。缺乏LDH的释放质疑 C170细胞中胀亡的启动，因此，为了确定鉴定的PI染色并不归因于人 工模仿的经典凋亡，使用pan半胱天冬酶抑制剂z-FMK-vad。总之， 同时已发现抗-Fas暴露仅微弱诱导C170细胞的凋亡，可发现，抑制剂 可完全逆转抗体的效应(图3d)。在z-FMK-vad存在条件下，暴露 于SC101/29mAb的肿瘤细胞未产生可分辨的效应，这提示该死亡模式 不依赖于经典凋亡途径。
经由应激相关激酶的信号传递
膜通透性与使HSP27磷酸化导致肌动蛋白聚合的p38激活密切相 关。更强的激活作用4小时后，在C170细胞中观察到弱p38激活1小 时(图3e)。与此相比较，无JNK或ERK的激活。应激活化的蛋白 激酶p38也能被一些包括5-FU的化疗剂诱导产生。所以，为了确定 SC101/29能否在体内诱导细胞死亡，能否与5- FU协同，对移植了人 异种移植物的小鼠给予了 SC101/29。
体内研究
对移植了 3mm2 C170肿瘤抽提物的小鼠，或在抗体给药之前得以 生长5天的C170肿瘤每周使用抗体3次。动物单独用SC101/29 mAb 或用5-FU/甲酰四氢叶酸或联合使用二者进行处理，持续3周。图4a 显示，单独使用SC101/29 mAb和5-FU/甲酰四氢叶酸导致新鲜移植的 肿瘤的肿瘤生长抑制(p<0.004 ANOVA)。作为对照，联合使用二者 显示出附加的生长抑制效应，仅有2/10小鼠显示了大于0.3g的移植肿 瘤重量的任何生长(图4b,pO.02，AN0VA)。所有小鼠已能很好地耐 受SC101/29 mAb的这个剂量，表现为体重或任何其它大体病理学未丢 失(图4c)。当对表达C170肿瘤的小鼠治疗性地联合给予SC101/29 mAb 与25mg/kg5-FU/甲酰四氢叶酸(时，它显著地抑制肿瘤的生长并促进 存活(图4d: p<0,0163 Log Rank)。
由于杀死细胞的机制提示了 SC101/29与微转移细胞的结合应非常 有效，SC101/29 mAb在预防肝转移中的治疗性效果用C170HM2结肠 直肠模型评价。用较低剂量lOO(ig和10吗SC101/29 mAb， 1周3次，处理小鼠6周。在研究结束时，测定摘除下来的C170HM2肝肿瘤的重 量。计算每组中位数并将数据绘图，如图5。将每组中位数和均值进行 分析以通过Mann- Whitney检验得到统计学显著性。发现IO昭和IOO吗 SC101/29mAb (组2和组3)的中位数与载体对照(组l)相比具有显 著性(pO.OOl)。由于SC101/29在该模型上如此有效以至于不需使用 低剂量5-FU。
实施例3 讨论
已鉴定了一些Lewisy抗体，但这些抗体总是与Lewif和H-2型结 构交叉反应。这能导致与正常组织的非预期交叉反应，导致临床试验 的后续毒性反应。例如，在鼠mAb BR55-2的I期研究中，其与H抗
原发生交叉反应，6/12患者出现血尿，2/9患者出现腹泻，3名患者皮 肤损害仅暂时性减轻(Tolcher"a/. (1999) / C//". (9"co/. 17:478-84)。 直接抗Lewisy的LMB-1免疫毒素(连接到假单胞菌属内毒素的B3抗 体)仅导致5/38患者发生免疫应答(Pai (1996) Ato. Med 2: 350-3)。 BR96 mAb与B血型而不是与Lewisb发生交叉反应；其胃肠结合是剂 量限制的并表现出与结合抗体相关(Saleh"a/. (2000;U C7/". 0"co/. 18: 2282-92)。最后，表明Lewisy特异性人源化抗体3S193在结合研究中 具有优良的选择性(Scott " (2000) Ca"cw Ae^wc/z 60: 254-61)并 已进入临床试验。
SC101抗体识别Lewisy和Lewisb的唯一平面。已经预言，SC101 抗体将显示与一些表达Lewisy或Lewisb的正常组织的强交叉活性，然 而，与其它Lewis抗体不同，在胃肠道内仅观察到微弱的粘蛋白染色 (Brown (1983) i^/ . 3: 163)。这提示，观察到的BR96 mAb
的胃肠道毒性可用SC101抗体避免。
SC101抗体在没有免疫效应细胞时在体外也可能在体内诱导肿瘤 细胞死亡，因为IgG3抗体是CDC和ADCC的非常弱的介质。令人非 常有兴趣的是，肿瘤细胞需要过表达Lewisy和Lewisb以被杀死。在胃 肠道80%表达和卵巢/乳腺肿瘤30%表达的水平上应易于杀死细胞，但 正常组织将被排除，这提供了良好的治疗窗。杀死细胞的机制令人非常感兴趣，这是由于SC101/29mAb造成膜完整性快速丧失。这同在渗 透压冲击和氧过多细胞中观察到的胀亡导致的细胞死亡相似(Garmyn "a/. (2001) //騰"D固她/. 117: 1290-5; Moriguchi & a/. (1996) / 所o/. C72缀271: 26981- 8; Romanshko da/. (2003)i^eeH肠/.她d 35: 978-93; Shen " a/. (2002) J所o/. C%em. 277: 45776-84; Tilley ef a/. (1996) F五^Si^tera 395: 133-6)。然而，经典的胀亡进展随后产生细 胞内容物如LDH的释放(Chen W a/. (2001) 7bx/co/.尸/zarwaco/. 171: 1-11)。细胞死亡的机制似乎与Lewisy/Lewib结构相关，因为BR96 这一特征非常清楚的抗LewiSy抗体不能表现出任何对质膜的效应。 Lewisy和Lewisb也需要交联，交联通过天然小鼠IgG3 二聚体或通过 IgGl变种的卵白素/生物素交联发生，以导致膜搅动。已描述一些其它 能诱导类似肿瘤细胞死亡的胀亡的抗体。这些抗体包括识别广泛表达 的糖蛋白的抗porimin抗体(Ma ^ a/. (2001)Ato/. JcflJ. 5W. 98: 9778-83)，识别肾相关糖蛋白的RE2 (Matsuoka (1995) / ￡xp. M^i. 181: 2007-2015)和识别新型glycotope的RAV12。然而，SC101是独特的， 因为这些抗体中无一能显示促进化疗剂的摄入，特别是在MDR细胞系 中。
细胞摄入PI伴随p38激活。这可解释膜通透性，因为最近已将p38 激活归因于HSP27磷酸化，HSP27的磷酸化导致微丝动力学发生改变
(Deschesnes (2001)嵐脂.Ce〃 12: 1569-82; Huot e aZ. (1998) CW/说o/ogy 143: 1361-73)。这种膜完整性丧失是快速事件，是细胞死 亡的上游。p38激活能导致依赖或不依赖半胱天冬酶的细胞死亡 (Deschesnes (2001) Mo/祝o/. Ce〃 12: 1569- 82)。由于SC101/29 mAb不 能诱导DNA断裂(数据未显示)，而且用pan半胱天冬酶抑制剂 z-FMK-vad抑制半胱天冬酶似乎不能阻止细胞死亡，这暗示该抗体诱 导不依赖半胱天冬酶的细胞死亡。结肠直肠肿瘤的凋亡反应相关基因 的>70%发生突变，任何围绕该反应的治疗将具有重要的治疗性价值
(Vogelstein (1988) TV. 7! Med 319: 525-32; Fulda e/1 a/. (2004) 0#r. Cfl"cwDn^7brg她4: 569-76)。 一种不依赖半胱天冬酶的机制包括从 线粒体释放凋亡诱导因子(AIF)及其移位至细胞核，在核内，它以未知的方式促进激发细胞核浓縮(Susin " a/. (2000) J！jWed 192: 571-80)。
应激相关激酶p38也能被一些化疗剂诱导并被认为在药物协同作 用中发挥枢纽作用(Olson & Hallahan (2004) 7>ewA Mo/ Met/ 10: 125-9) 。 Lewisy和Lewisb在肿瘤细胞糖蛋白和糖酯上表达，并能响应 细胞应激而被上调。确实，Lewisy响应细胞化疗应激反应的上调(Flieger "a/. (2001) C// ./ww鹏o/. 123: 9-14)，特别是响应5-FU应激的 上调已经被报导。所以，因为5-FU/甲酰四氢叶酸(5-FU/leucovrin)是 结肠直肠癌的标准化疗药物，它能上调Lewisy并激活p38 (Feng"a/. (2002) Owcer i^化arc/z 62: 1920-6)，在体内筛选联合使用SC101/29 和5-FU/甲酰四氢叶酸抑制裸鼠结肠异种移植物生长的能力。单独使用 SC101/29 mAb和与5-FU/甲酰四氢叶酸联合使用显著抑制了小的已确 诊肿瘤的生长。如果使用嵌合形式的SC101/29 mAb进行的I期临床试 验表明该抗体是安全的，那么在手术后的结肠直肠癌患者中联合使用 5-FU/甲酰四氢叶酸和SC101/29 mAb和作为比较的单独使用药物的后 续试验将启动。这种联合使用较Panorex/5-FU可更加有效，因为该抗 体无直接杀伤活性并依赖于CDC和ADCC，其由于过表达补体 (complement)调节分子而对固体肿瘤仅具有有限的成功(Li & a/. (2001) Br. / Ca"cw 84: 80-6)。
本发明人已证明，SC101/29诱导膜通透性，使其允许摄入小分子 量(<800D)药物而不释放大的细胞内成分，如LDH。 SC101/29也诱 导应激相关激酶p38而不是JNK的磷酸化，并最终诱导半胱天冬酶非 依赖的细胞死亡。这尤其是兴趣所在，因为己表明神经酰胺通过激活 p38释放包括AIF的多种线粒体蛋白质而诱导神经元细胞死亡(Ghatan "a/. (2000) / CW/说W. 150: 335-47; Stoica d cd (2005) Mo/. CW/ A^/msc/. 29:355-71)。由于Lewisy/Lewisb主要表达在糖酯上，其降解 可导致神经酰胺的增加和随后的p38激活。由于SC101/29不是通过经 典描述的途径诱导细胞死亡，它可能对已经发展出使其抵抗经典细胞 凋亡或胀亡的机制的肿瘤细胞特别有效。然而，需要更加仔细地说明 这条途径以允许进一步验证我们的杀伤实验以评价耐药的潜在机制， 并允许我们鉴别优化的肿瘤耙点。综上，SC101/29是识别Lewisy和Lewisb的新型mAb，它通过诱导 膜丧失完整性而直接诱导细胞死亡。这第一次描述了能以溶瘤细胞的 方式选择性杀死肿瘤细胞的识别血型抗原的抗体。越来越多的证据证 明p38在治疗协同反应中的作用。SC101/29与5-FU/甲酰四氢叶酸联 合使用显示出增强的杀伤作用，并可与这些药物联合使用以降低毒性 和增强治疗癌症的效果。
贯穿本说明书的单词"包含"应理解为意指包括提及的元素、整 数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其它元素、整数 或歩骤，或元素、整数或歩骤的组。
在本说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。任何本说明 书已包括的文件、行为、材料、装置、文章等的讨论仅用于提供本发 明的上下文。不应视为承认这些事物的任何或全部形成现有技术基础 的部分或是本发明相关领域的一般公知知识，当它在本申请的每项权 利要求的优先权日之前在澳大利亚或别处存在时。
本领域技术人员应理解，可对如本发明具体实施方式
中显示的本 发明进行许多变动和/或修改而不脱离广义上描述的本发明的本质或范 围。因此应视为本具体实施方式
在所有方面是解释性的而非限制性的。
权利要求
1、一种结合复合物，其包含与Lewisy和Lewisb抗原结合的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段是多聚体的形式，并且其中抗体或抗原结合片段不天然形成多聚体。
2、 根据权利要求1所述的结合复合物，其中多聚体是同源或异源 多聚体。
3、 根据权利要求1或2所述的结合复合物，其中多聚体是同源或 异源二聚体。
4、 根据权利要求1至3任一项所述的结合复合物，其中多聚体包 含IgG抗体。
5、 根据权利要求1至4任一项所述的结合复合物，其中多聚体是异源二聚的IgG2/IgG3抗体。
6、 根据权利要求1至5任一项所述的结合复合物，其中多聚体包 含并非源于相同物种的抗体或抗原结合片段。
7、 根据权利要求1至4任一项所述的结合复合物，其中多聚体是 二聚的IgG抗体。
8 根据权利要求1至7任一项所述的结合复合物，其中抗原结合 片段选自多体、结构域抗体、Fv片段、Fd片段、Fab片段、F(ab')2片 段、互补性决定区(CDR)或通过同源框架区融合的CDR。
9、 根据权利要求8所述的结合复合物，其中多体是双体或三体。
10、 根据权利要求9所述的结合复合物，其中多体是双体。
11、 根据权利要求8至10任一项所述的结合复合物，其中多体进一歩包含修饰的Fc结构域。
12、 一种用于诱导过表达Lewi^和Lewisb抗原的肿瘤细胞细胞死 亡的方法，其包含对受试者使用有效量的包含与Lewisy和Lewisb抗原 结合的抗体或抗原结合片段的结合复合物，其中抗体或抗原结合片段 是多聚体形式，并且其中抗体或抗原结合片段不天然形成多聚体。
13、 一种用于治疗受试者癌症的方法，其包含对受试者使用治疗 有效量的包含与Lewi^和Lewisb抗原结合的抗体或抗原结合片段的结 合复合物，其中抗体或抗原结合片段是多聚体形式，并且其中抗体或 抗原结合片段不天然形成多聚体。
14、 根据权利要求13所述的方法，其中癌症选自乳腺癌、肺癌、 结肠癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。
15、 根据权利要求12至14任一项所述的方法，其中将结合复合 物配制成对受试者使用的药物组合物。
16、 根据权利要求12至15任一项所述的方法，其中结合复合物 以可注射溶液的形式给药。
17、 根据权利要求12至16任一项所述的方法，其中结合复合物 通过静脉给药。
18、 根据权利要求12至17任一项所述的方法，其中结合复合物 对人使用。
19、 一种用于诱导过表达Lewi^和Lewisb抗原的肿瘤细胞细胞死 亡的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的包含与Lewi^和Lewisb 抗原结合的抗体或抗原结合片段的结合复合物，和药学上可接受的载 体，其中抗体或抗原结合片段是多聚体的形式，而且其中抗体或抗原结合片段不天然形成多聚体。
20、 一种治疗有效量的包含与Lewisy和Lewisb抗原结合的抗体或 抗原结合片段的结合复合物在制备用于诱导过表达Lewi^和Lewisb抗 原的肿瘤细胞细胞死亡的药物中的用途，其中抗体或抗原结合片段是 多聚体的形式，而且其中抗体或抗原结合片段不天然形成多聚体。
21、 一种治疗有效量的包含与Lewisy和Lewisb抗原结合的抗体或 抗原结合片段的结合复合物在制备用于治疗受试者癌症的药物中的用 途，其中抗体或抗原结合片段是多聚体的形式，而且其中抗体或抗原 结合片段不天然形成多聚体。
全文摘要
本发明提供一种结合复合物，其包含与Lewis^y和Lewis^b抗原结合的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段是多聚体的形式，并且其中抗体或抗原结合片段并不天然形成多聚体。
文档编号C07K16/30GK101547937SQ200780035160
公开日2009年9月30日 申请日期2007年9月20日 优先权日2006年9月20日
发明者L·G·达兰特, P·A·詹宁斯 申请人:阿拉纳治疗有限公司