专利名称：用于制造肽的方法
用于制造肽的方法
本申请要求美国临时申请60/832,649的权益，其内容通过参考并入本 申请中。
本发明涉及用于制造肽及其中有用中间体的方法。
肽类具有潜在的生物活性，并且现今已知相当众多的有用的基于肽之 药物。具有生物活性的肽的一个具体实例是
Ac-Nle-Asp画His画D誦Phe-Arg-Trp誦Lys画OH
(PT-141)，其是一种可用于治疗勃起功能障碍的候选药物(Drugs Fut 2004,29(6),第645页)。对于这种分子已开发了不同的合成方法。例如， Flora等人在Bioorg. Med Chem. Lett. 2005 (1065-1068 )中描述了用于该 分子的一种固相肽合成策略。然而，这种方法需要使用昂贵的王氏树脂
(Wang type resins )以及极其昂贵的保护及脱保护技术。
本发明的一个目的是提供一种可产业化的用于制造环状肽的方法，其 具有提高的环状产物产率。
因此，本发明涉及一种用于制造环状肽的方法，该方法包括
(a)提^M合到梅里菲尔德型树脂(Merrifield type resin)上的一种环状
肽，以及
(b )通过酯交^^应将该环状肽从所*里菲尔德型树脂上切下。
出人意料地，已发现根据本发明的方法允许利用低成本的试剂进行工 业恥漠的环状肽或肽衍生物的制造。在根据本发明的方法中获得的环状肽 具有高纯度并且可以更容易地纯化，根据本发明的方法避免了使用常用于 将肽M里菲尔德型树脂上除去的HF。这是特别有利的，因为使用HF 是利用梅里菲尔德型树脂进行工业目肽合成的一个障碍。
就本发明的目的而言，"梅里菲尔德型树脂"旨在具体表示一种氯甲基化的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，其可任选地被取代基所取代。更特别地优 选未经取代的氯甲基化的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
在才艮据本发明的方法中，所述环状肽的环状结构通常由2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个^J^酸 构成。该环状肽的环状结构优选地由5、 6、 7、 8、 9、 10、 11或12个^J^ 酸构成，并且更优选由6或7个M酸构成。
在根据本发明的方法中，所述环状肽优选具有由羧基与M通过分子 内>^应所形成的酰胺键。
在根据本发明的方法中，有利地使用醇或石克醇(特别是烷基醇或烷基 硫醇)来进行所述酯交^A应，特别是C1-C3醇，优选选自曱醇和乙醇。 更特别优选的是曱醇。曱硫醇或乙疏醇是优选的硫醇，特别是以其碱金属 盐的形式。
当使用醇进行该酯交M应时，所负载的环化肽优选悬浮在该醇中或 者在该醇与适当的补充溶剂之混合物中。
当使用硫醇进行该酯交M应时，所负载的环化肽优选悬浮在该硫醇 的盐在适当溶剂中的溶液中。
在根据本发明的方法中，可以适当地使用酯交换反应催化剂，其可选 自例如碱，特别是亲核性碱例如胺(特别是叔胺)或具有空间位阻的醇盐 (例如叔醇盐，如叔丁醇钾)、阴离子交换树脂(特别是季铵型阴离子交 换树月旨(quaternary anion-exchange resin ))以及特另'J选自氰4fc物和氟4匕 物的亲核阴离子M金属盐(例如氰化钾或氟化钾)。叔胺特别是二异丙 基乙胺是优选的，并且最优选三乙胺。
当使用酯交M应催化剂时，其在催化剂/溶剂混合物中的浓度通常为 0.5~3摩尔/升，优选为1~2.5摩尔/升，最优选约2摩尔/升。
在一个特别的实施方案中，使用氛基醇来进行该酯交M应，所述氨 基醇特别地是具有叔胺官能团和伯醇官能团的氨基醇，例如特别是2-二曱 基氨基乙醇。在这个实施方案中，因为氨基官能团催化了该反应，所以不 需要使用额外的催化剂。在这个实施方案中，可以避免使用有毒的催化剂， 例如在Savoie et al. Can J. Chem. 1974第2832-9页中的铊衍生物。在根据本发明的方法中，所述酯交M应通常在0。C~100°C的温度 下进行，优选10。C 60。C。特别优选约25°C的温度。
在根据本发明的方法中，所述酯交M应通常在大气压下进行。
在根据本发明的方法中，游离的环状肽酸可以从步骤(b)中得到的环 状肽酯适当地获得，其通过与磁<^应来实现，所i2t^选自例如碱性的、季 铵或碱土金属的氢氧化物或碳酸盐。具体实例包括氢氧化四丁基铵、碳酸 钾以及氢氧化锂。优选的是氢氧化锂。
在根据本发明的方法中，切割通常在pH8 10下进行。
在根据本发明的方法中，所述任选的切割通常在0。C~100°C的温度 下进行，优选为10°C~60°C。特别优选约25°C的温度。
在一个优选实施方案中，本发明涉及制造具有由羧基与氨基的分子内 反应形成之酰胺键的环状肽的方法，该方法包括
(a) 提皿合到梅里菲尔德型树脂上的线性肽，该线性肽包含具有游离 M的第一JL&酸以及具有游离g的第二M酸；
(b) 通过所述g与所述Jl^的分子内反应，对所负载的肽进行环化；
(c) 通过酯交M应将所负载的环化肽从该梅里菲尔德型树脂上切下。
、在，个实施方'案、中i所，，性肽通常在酰胺键形成试剂的存在下进，
剂，例如在Bodansky， M. ， Principles of Peptide Synthesis,第2版.Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993 ^描述的那些。酰胺键形成试剂的具体实例 选自混合酸酐以及其他酰化剂，例如活化酯或酰卣(例如氯曱酸异丁酯或 新戊酰氯)。它们可以是碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亚胺)、活化的苯并三溱衍生物(DEPBT: 3-(二乙氧基磷,氧)-1，2,3-苯并三漆-4(3H)-酮)或苯并三唑的脲鐵(uronium)或磷総(phosphonium) 盐衍生物。
一种优选的酰胺键形成试剂是二环己1^碳二亚胺。已发现这种廉价的 试剂在环化反应中提供良好的结果。本发明的方法还包括提供具有被保护 的氨基和,皮保护的氛基的线性肽前体。
在这个实施方案中，所述氨基受到第一保护基团的保护。该第一保护 基团选自例如可在使所述线性肽与所述梅里菲尔德树脂相连接的键基本 保持完整的条件下被除去的保护基团。此类保护基团的优选实例包括可通
过酸解被除去的M保护基团，其选自例如叔丁氧羰基、对甲氧基千氧 基羰基、二苯基甲lt^羰基以及优选地千l^羰基。这样的保护基的其他 实例包括可通过用金属或金属化合物还原而被除去的M保护基团，例如 三氯代乙氧基羰基。
在这个实施方案中，所述羧基受到第二保护基团的保护。该第二保护 基团选自例如可在使所述线性肽与所述梅里菲尔德树脂相连接的键基本 保持完整的条件下被除去的保护基团。这样的保护基的优选实例包括可通 过酸解被除去的U保护基团，例如选自对甲氧节基、二苯甲基以及优 选地叔丁基。此类保护基团的其他实例包括可通过用金属或金属化合物还 原而被除去的保护基团，例如三氯乙基。
在这个实施方案中，优先选择可在单一反应步骤中^L除去的第一和第 二保护基团。相应地，所述肽前体的保护基团可以在单一反应中被除去以 提供所述线性肽。可通过酸解在单一反应步骤中被除去的第一和第二保护 基团的合适组合的实例包括二苯基甲*^ /二苯甲基；对甲氧基节氧 基羰基/对甲氧节基，以及优选地叔丁氧羰基/叔丁基。可通过用金属或金 属化合物还原在单一反应步骤中被除去的第 一和第二保护基团的合适组 合的实例包括三氯代乙Hi^^/三氯乙基。
当通过酸解除去保护基团时，合适的试剂选自例如全氟烷基羧酸以 及在有机溶剂中的HC1溶液，优选极性有机溶剂(例如二噁烷或乙酸乙 酯)。用于酸解的试剂优选三氟乙酸。
当通过与金属或金属化合物反应来除去保护基团时，合适的试剂是例 如锌金属。
当所述线性肽包含侧链含有氛基的氨基酸时，才艮据本发明的方法是特 别适合的。侧链含有氨基的氨基酸的实例包括赖氨酸、鸟氨酸、二M 丁酸以及二氨基丙酸。侧链含有氨基的氨基酸的一个优选实例是赖氨酸。
8在一个特别优选的实施方案中，所述线性肽通过所述侧链含有氨基的
M酸被键合到梅里菲尔德树脂上。
在根据本发明的方法中，所述线性肽可适当地包含侧链含有氯基的氨 基酸。侧链含有氯基的氨基酸的实例包括谷氨酸和天冬氨酸。 一个优选实
例是天冬氨酸。
在一个特别优选的方面，所述线性肽同时包含侧链含有氯基的氨基酸 以及侧链含有Jl&的M酸。
以下序列
Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-梅里菲尔德树月旨
是更特别优选的。
所述侧链羧基或侧链氨基可通过上述各保护基团进行适当地保护。
本发明特别地涉及用于制造以下产物的方法 Ac國Nle-Asp-His-D-Phe画Arg画Trp-Lys画OH,
该方法包括4^供
Ac画Nle画Asp國His画D-Phe-Arg-Trp-Lys-梅里菲尔德树脂，
通过所述a与所述Jl&的分子内反应对所负载的肽进行环化，并通过酯 交M应将所负载的环化肽从该梅里菲尔德型树脂上切下。在该酯交换反 应之后，通常进行切除所述酯的操作(例如，特别是皂化反应)以得到所 述环状肽酸。
本发明还涉及键合到所*里菲尔德型树脂上的环状肽。根据本发明 的所负载环状肽优选如上文所述。
本发明还涉及
P-Nle國Asp國His國D國Phe画Arg-Trp-Lys-梅里菲尔德树脂，其中P是JL&保护基团，特别是酰基并优选乙酰基(Ac )。
本发明还涉及 P-Nle画Asp画His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-梅里菲尔德树脂， 其中P如上文所限定。
以下实例旨在以非限定性的方式对本发明进行举例说明:
本文4吏用的缩写词如下
Ac乙絲
Nle正亮氨酸
Asp天冬氨酸
His组氨酸
Phe苯丙氨酸
Arg精氨酸
Trp色氨酸
Lys赖氨酸
HF氟化氢
Fmoc9-芴甲氧g
Boc叔丁氧M
RCM氯甲基树脂(梅里菲尔德树脂
SPPS固相肽合成
Pbf2,2,4,6，7-五曱基二氢苯并呋喃，
Trt三苯甲基TFA 三氟乙酸DI 蒸馏的TIPS 三异丙基珪烷DTE 二硫苏糖醇DCM 二氯甲烷IPA 异丙醇DIEA 二异丙基乙胺DMF 二曱基甲酰胺HOBT 羟基苯并三哇DCC 二环己差^碳二亚胺TEAP 磷酸三乙铵LiOH 氬氧化锂实施例序列Ac-Nle-Asp画His-D-Phe-Arg-Trp画Lys画OH将50 g的Fmoc-Lys(Boc)-RCM树脂(取代度0.8 mmol/g)用于合成。 以10 ml/gm的浓度使用Fmoc SPPS策略进4亍合成。4吏用以下Jl&酸衍生物进行合成iiFmoc-Trp(Boc)-OHFmoc-Arg(Pbf)-OHFmoc画D-Phe-OHFmoc画His(Trt)-OHFmoc國Asp(OtBu)-OHFmoc-Me-OH脱保护使用乙酸酐进行乙酰化通过使用以下试剂对树脂上的肽进行脱保护84%TFA、 5%苯甲醚、5。/。蒸馏7JC、 3%苯曱硫醚、含2。/。DTE的30/。 TIPS。切割1~2小时。切除后使用的洗涤程序2xDCM1 xlPA2 x 5 % DIEA (在DCM中)，每次4分钟(pH试纸检测) 1 xDCM2x甲醇2xDCM 1 xDMF通过使用DMF中5当量的HOBT/10当量的DCC，在所述树脂上进 行环化反应48~72小时。使用以下程序将所述JIU^树脂上切下在室温下，在15。/。TEA(在甲醇中)中将肽树脂搅拌2天。在从树脂 切下后，加入5%蒸馏水和5当量的LiOH,并继续搅拌2小时。加入乙酸以酸化反应混合物。将树脂滤出并用含30%乙腈的TFA A緩沖液进行洗 涤。将滤液蒸发或用TFA A緩冲液稀释直至有机溶剂组分低于20。/。。过 滤并纯化溶液。纯化TEAP体系以及l^的乙酸体系得到5.0486 g纯CS341 (HPLC > 99 % )总产率12.3 %。
权利要求
1.用于制造环状肽的方法，该方法包括(a)提供键合到梅里菲尔德型树脂上的环状肽，以及(b)通过酯交换反应将该环状肽从所述梅里菲尔德型树脂上切下。
2. 根据权利要求l所述的方法，其中使用C1-C3醇、优选曱醇来进 行所述酯交换反应。
3. 根据权利要求l所述的方法，其中使用烷基硫醇、优选乙硫醇或 其盐来进行所述酯交M应。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酯交换>^应 在pH 8 ~ 10下进行。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述环状肽的环 状结构由2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个^J^酸构成。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述环状肽通过 形成该环状结构之一部分的^酸键合到所i^里菲尔德型树脂上。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述环状肽具有 由g与^J^通过分子内反应而形成的酰胺键。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中键合到所*里菲尔德树脂上 的所述环状肽由以下方式提供(a) 提皿合到所g里菲尔德型树脂上的线性肽，该线性肽包含具 有游离氨基的第一氨基酸以及具有游离羧基的第二氨基酸，并且(b) 通过该^与该#^的分子内反应将键合到所*里菲尔德型 树脂上的所述线性肽环化。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述线性肽在酰胺键形成试剂 存在下被环化，该酰胺键形成试剂选自混合酸酐、活化酯、酰基卣、碳二 亚胺、活化的苯并三噪衍生物以及苯并三唑的脲鎗或磷鐵盐衍生物。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，该方法还包括提^合到所述 梅里菲尔德型树脂上的线性肽前体，该线性肽前体具有被保护的氨基和被 保护的氛基。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述氨基受到第一保护基团 的保护，该第一保护基团选自能够通过酸解被除去的^J^呆护基团，其选自例如叔丁氧g、对甲HJ^IU^^、 二苯曱li^a^以及优选地千氧基羰基，所述羧基受到第二保护基团的保护，该第二保护基团选自能够 通过酸解被除去的g保护基团，其选自例如对甲氧节基、二苯甲基以及优选地叔丁基。
12. 根据权利要求ll所述的方法，其中保护基团的除去通过与三氟 乙i^应来进行。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中所述氨基受到第一保护基团 的保护，该第一保护基团选自能够通过用金属或金属化合物还原而被除去 的JL^保护基团，所述羧基受到第二保护基团的保护，该第二保护基团选 自能够通过用金属或金属化合物还原而被除去的a保护基团。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中保护基团的除去通过与锌金 属>^应来进行。
15. 根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述线性肽前 体的保护基团在单一反应中被除去以提供所述线性肽。
16. 根据权利要求7至15中任一项所述的方法，其中键合到所* 里菲尔德型树脂上的线性肽包含侧链含有氛基的氣基酸。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述侧链含有氨基的氨基酸 是赖氨酸。
18. 根据权利要求16或17所述的方法，其中所述线性肽通过所述侧 链含有氨基的^酸键合到所*里菲尔德树脂上。
19. 根据权利要求7至18中任一项所述的方法，其中所述线性肽包 含侧链含有絲的絲酸。
20. 根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在所述酯交换 反应之后进行切除所述酯的操作，例如特别是皂化反应，以得到环状肽酸。
21. 根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中键合到所* 里菲尔德树脂上的环状肽是Ac醒Nle-Asp-His-D-Phe國Arg-Trp-Lys國梅里菲尔德树脂。I_I
22. 鍵合到梅里菲尔德型树脂上的环状肽。
23. 根据权利要求22所述的环状肽，该环状肽是 P國Nle-Asp-His-D画Phe-Arg画Trp-Lys-梅里菲尔德树脂，其中P是Jl&保护基团。
24. 根据权利要求23所述的环状肽，其中P是乙酰基。
25. 键合到梅里菲尔德型树脂上的线性肽，其具有下式 P画Nle-Asp-His-D-Phe誦Arg-Trp画Lys國梅里菲尔德树脂，其中P是^J^保护基团。
26.根据权利要求24所述的线性肽，其中P是乙g。
全文摘要
用于制造环状肽的方法，该方法包括提供键合到梅里菲尔德型树脂上的环状肽以及通过酯交换反应将该环状肽从所述梅里菲尔德型树脂上切下。
文档编号C07K7/00GK101516903SQ200780034795
公开日2009年8月26日 申请日期2007年7月17日 优先权日2006年7月21日
发明者伯恩哈德·弗赖曼, 希马·乔希, 曼纽尔·拉莫斯, 罗兰·卡伦斯, 萨蒂什·乔希 申请人:索尔维公司