登革病毒疫苗组分的开发的利记博彩app

专利名称：：登革病毒疫苗组分的开发的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及在登革病毒血清型1、2、3和4的基因组3'非翻译区中的突变，所述突变用在减弱登革病毒疫苗的生长特征中。相关技术的描述存在登革病毒的四种血清型(登革病毒1型[DENl]、DEN2、DEN3和DEN4)，它们每年造成估计五千万至一亿例登革热和500,000例登革病毒感染的更严重形式，公知即登革出血热/登革休克综合征(Gubler，D.J.和M.Meltzer1999病毒学研究进展(A/viw)53:35-70)。登革病毒广泛分布于世界热带和亚热带地区并且登革病毒感染病例数因登革病毒的蚊媒介-埃及伊蚊(j^fesa绍y/^)分布范围扩大而持续增加。尽管作为一种再发疾病，登革病具有重要意义，然而没有疫苗可用于其控制。免疫接种的目的是通过诱导针对全部四种血清型的长效中和抗体应答而保护免遭登革病毒病影响。需要针对全部四种血清型的同时保护作用，因为疾病严重性增加可能在具有针对异型登革病毒的预存抗体的人中出现。这种免疫接种可以用减毒活病毒疫苗经济地实现。登革病毒是属于黄病毒属的正义RNA病毒。大约11,000碱基的该病毒基因组含有编码一种多聚蛋白的单个可读框，其中所述的多聚蛋白由病毒源和细胞源蛋白酶加工成3种结构蛋白(C、prM和E)和至少7种非结构蛋白(NS)蛋白。登革病毒基因组的两个末端含有非翻译区(UTR)并且完整的基因组构造是5'UTR-C-prM-E誦NSl画NS2A-NS2B-NS3國NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'。3'UTR的长度接近400碱基并且预测其含有在登革病毒血清型中保守的几个茎环结构(Brinton，M.A.等.1986病毒学(P7ra/ogy)153:113-121，Hahn,CS.等.1987分子生物学杂志UMo/腺)198:33-41,Proutski,V.等.1997核酸研究(A^c/e/c7es)25:1194-1202，Rauscher,S.等.1997RNA3:779-791,Shurtleff,A.等.2001病毒学(Wra/ogM)281:75-87)。通过从DEN4基因组中缺失30个核苷酸(3'核苷酸第172至143位)而事先除去在所提出的3'UTR二级结构中确定为TL-2(Proutski，V.等.1997核酸研究(Wwc/e/c^c/^i^)25:1194-51202)的一个这种茎环结构(Men,R.等.1996病毒学杂志UWra/)70:3930-3937)并且此茎环结构随后命名为A30突变(Durbin,A.P.等.2001美国热带医学与卫生学杂志(^wJ7h;M^/7^)65:405-413)。与含有完整TL-2序列的亲代病毒相比，所得的病毒rDEN4A30证实在猕猴(rhesusmonkey)中弱化并且它在人类中弱化(Durbin，A.R等.2001美国热带医学与卫生学杂志UmJrrapM^/外)65:405-413)。
发明内容本发明涉及在3'非翻译区(3'-UTR)中包含突变的登革病毒或嵌合登革病毒，其中所述突变选自由以下所组成的组中(a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的A30突变和除所述A30突变外从3，-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5'方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5'边界；和(b)用登革病毒第二血清型的3'-UTR，其任选地含有突变和除所述△30突变外从3，-UTR中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3，-UTR的替换；并且涉及免疫原性组合物、诱导免疫应答的方法和制备登革病毒或嵌合登革病毒的方法。图1.弱化登革病毒的两种方法。A)(a-c)从(DEN3野生型斯莱曼/78(DEN3wtSleman/78)，SEQIDNO:l)3，-UTR中缺失额外的核苷酸。B)用登革病毒第二血清型的3，-UTR替换登革病毒第一血清型的3'-UTR。图2-5.每种DEN血清型3'-UTR的TL-1、TL-2和TL-3区的预测二级结构。显示用于构建每种二级结构模型的序列的基因库(GenBank)登录号。7仅分别使用DENl、DEN2、DEN3和DEN4的包含TL-1、TL-2和TL-3的最末278、281、276和281个核苷酸，以避免所述结构的环化以及已知并经实验验证的结构元件随后错误折叠。显示了对每个结构模型特异的mfold(根据最小自由能预测RNA二级结构折叠的软件)程序约束条件(contraints)。圏定并编号划定主要缺失边界的核苷酸，核苷酸编号始于3'基因组末端(反向编号系统)。图2-SEQIDNO:2;图3-SEQIDNO:3;图4-SEQIDNO:4;图5-SEQIDNO:5。图6-9.对登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种所绘制的A30缺失突变。所述A30突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1的第174-145位核芬酸、DEN2的第173-144位核苷酸、DEN3的第173-143位核苷酸和DEN4的第172-143位核苦酸。缺失的区域由符号A标出。图6-SEQIDNO:6;图7曙SEQIDNO:7;图8-SEQIDNO:8;图9-SEQIDNO:9。图10-13.对登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种所绘制的A30/31缺失突变。除了缺失包括A30突变的核苷酸之外，所述A31突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的第258-228位核苷酸。缺失的区域由符号A标出。图10-SEQIDNO:10;图ll-SEQIDNO:11;图12-SEQIDNO:12;图13-SEQIDNO:13。图14-17.对登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种所绘制的A86缺失突变。所述A86突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1的第228-145位核芬酸、DEN2的第228-144位核苷酸、DEN3的第228-143位核苦酸和DEN4的第228-143位核普酸。缺失的区域由符号△标出。图14-SEQIDNO:14;图15-SEQIDNO:15;图16-SEQIDNO:16;图17-SEQIDNO:17。图18.rDEN3与rDEN4或rDEN4A303，-UTR的嵌合化。A)重组3'-UTR嵌合登革病毒通过用得自rDEN4或rDEN4A30的区域替换rDEN3的3'-UTR加以构建。A30突变在3'-UTR中的相对位置由箭头标出。将rDEN3和rDEN4的开放读码框(ORF)与UTR之间的接头分别标记为接头1和接头2。也对所得嵌合病毒标出型间接头3。B)显示接头区的核苷酸和氨基酸序列。对于接头3，以小写体(lowercase)显示用来导入单一T/;a/限制酶识别位点的核苦酸置换。接头l-SEQIDNO:18(核苷酸)和19(氨基酸)；接头2-SEQIDNO:20(核苷酸)和21(氨基酸)；接头3-SEQIDNO:22(核苷酸)和23(氨基酸)。图19.在Vero细胞和C6/36细胞中的复制。比较四种突变病毒与野生型rDEN3在Vero细胞和C6/36细胞中的复制。75cm2培养瓶的汇合细胞以感染复数0.01进行感染。每日从培养瓶中取出0.5ml等分试样，持续7日。在添加SPG至1x浓度后，样品在千冰上冻结并贮存在-80。C。在Vero细胞上通过蚀斑测定法对全部样品测定病毒滴度。纟企测限是1.01og1QPFU/ml(蚀斑形成单位/毫升)。具体实施方式定义除非另外定义，本文中所用技术及科学术语具有如本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同意思。参见例如，SingletonP和SainsburyD.，微生4为学与分子生4勿学"^司典(￡)/c"on<3/"yo/Mz'cra6/o/ogy""<iAfo/ecw/ar5fo/ogy)第三版.，J.Wiley&Sons，奇切斯特(Chichester)，纽约(NewYork)，2001和费氏病毒学(Wra/ogy)第四版，KnipeD.M.和HowleyP.M编辑，LippincottWilliams&Wilkins，费城(Philadelphia)2001。术i吾"约"意指在l、2或3个核苷酸范围内。突变登革病毒和嵌合登革病毒本发明的目的是开发可以配制成安全、有效和经济的四价登革疫苗的一组型特异性活的减毒登革疫苗组分。所述A30突变在猕猴中弱化DEN4(Men,R.等.1996病毒学杂志(/Kra/)70:3930-3937)。A30突变除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中的同源结构(TL-2)(图2-5)。然而发现厶30突变在猕猴中不弱化DEN3。本发明的实施方式提供具有一个或多个造成减毒作用的突变的登革病毒和嵌合登革病毒、产生此类登革病毒的方法和使用这些登革病毒以预防或治疗登革病毒感染的方法。在本发明登革病毒中的突变(或诸突变)存在于由病毒RNA的最下游大约384个核苷酸形成的3'非翻译区(3'-UTR)中，已经证明所述的3'非翻译区在决定减毒中发挥作用。如下文进一步描述本发明的病毒和方法。可以用在本发明中的一个登革病毒实例是血清型3，斯莱曼/78(Sleman/78)毒抹。本发明对登革病毒分类群全部成员的适用性通过这样的观察结果进行推断，即，其它登革病毒毒抹的属性与任何一个登革病毒毒林的属性相似。登革病毒已经划分为四个血清型(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4)。已经在四个血清型的每一种中鉴定到众多毒抹。在表A中提供基因库(GenBank)登录号的多个登革病毒毒抹的完整基因组序列。表A.登革病毒毒抹的实例血清型毒林登录号102-20AB178040116007AF1薩7116007PDK-13AF1画81259par00AF5148831280par00AF5148781293arg00.AY2064571295arg00AF5函51297arg00AF5148891301arg00AF514876198901518AB讓20198卯1530AB画211A88AB0747611阿比让(Abidjan)AF2988071ARG0028AY2776651ARG0048AY2776661ARG9920AY2776641服-90AF2266851BR陽01-MRAF5131101BR-97-111AF3119561BR-97-233AF3119581BR-97-409AF3119571柬埔寨(Cambodia)AF3096411FGA-89AF2266871FGA-NAdldAF2266861FJ231-04DQ1935721GD05-99AY3767381GD23-95AY3734271GZ-80AF3504981Dl-hu-Yap-NllD27-2004AB2048031Dl-H隱IMTSSA-98掘AF2988081望月(Mochizuki)AB0747601Dl.缅甸(Myanmari).059-01AY7080471Dl.缅甸.194-01AY7134741Dl.缅甸.206-01AY7134751zzAY722802<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>可以在野生型感染性克隆，例如登革病毒血清型3，毒抹Sleman/78或其他野生型强毒登革病毒的感染性克隆的3，-UTR中产生突变，并且突变体随后可以在动物模型系统(例如在小鼠和/或猴模型系统)中受到测试以鉴定造成减毒的位点。减毒作用通过例如检测到降低的病毒血症进行判定。任选地导入经证明弱化野生型病毒的一个或多个额外突变至野生型登革病毒并且在(例如在小鼠和/或猴模型系统)中测试这些突变体以确定所得的突变体是否弱化。发现受到弱化的突变体随后可以用作新的疫苗毒林，其因减毒作用而具有增加的安全性。除上文所列的病毒外，在本发明中还包括包含嵌合登革病毒的登革病毒，其中所述的嵌合登革病毒包括一个或多个减毒性突变。这些嵌合体可以由登革病毒第一血清型(即背景登革病毒)组成，在所述登革病毒第一血清型中的一种结构蛋白(或诸结构蛋白)已经替换为登革病毒第二血清型的一种相应结构蛋白(或诸结构蛋白)。例如，嵌合体可以由这样的背景登革病毒组成，在所述背景登革病毒中登革病毒第一血清型的prM和E蛋白已经替换为登革病毒第二血清型的prM和E蛋白。所述嵌合病毒可以从登革病毒不同血清型的任意组合中产生。针对其寻求免疫的登革病毒是所插入的结构蛋白的来源。如上提及，在本发明病毒中被包含的突变是减毒性的。这些突变存在于登革病毒3'-UTR结构中以弱化该病毒。可以使用标准方法如位点定向诱变法在3'-UTR中产生突变。存在于登革病毒3'-UTR结构中的此类型突变的一个实例是置换作用，不过也可以使用其它类型的突变，如缺失和插入。此外，如上提及，所述突变可以单个地存在或在一个或多个额外突变的条件下存在。参照图1,采用两种方法来弱化登革病毒。在一个方面，还从3'-UTR中缺失除A30突变之外的核苷酸。在另一方面，登革病毒第一血清型的3'-UTR替换为来自登革病毒第二血清型的3'-UTR(其任选地含有A30突变和除所述△30突变外从3，-UTR中缺失核苷酸)。从3'-UTR中缺失除A30突变之外的核普酸参照图2-5，使用第一方法，登革病毒的3'-UTR含有多种保守序列基序。在图5中显示DEN43'-UTR的序列。DEN4毒抹814669的基因组含有10,646个核苷酸，其中在3，端处最后384个核苷酸是不翻译(非编码)的。各种序列组分在该区域内的位置用反向编号系统命名。这些序列包括据预测形成茎环1(SL-1)的3'远端二级结构(核苷酸第1-93位)，其中所述的茎环l含有末端环1(TL-1)。核香酸第117-183位形成含有TL-2的茎环2(SL-2)。核苷酸第201-277位形成部分地含有TL-3的一对茎环(SL-3)。虽然茎环1的一级序列在所述登革血清型中是略微不同的，然而其二级结构是严格保守的(比较图2-5)。虽然在SL-2与相邻SL-I和SL-3之间起到间隔作用的核苦酸在所述登革血清型中是不同的，然而SL-2的整体结构是极保守的。此外，9个暴露的包含TL-2的核苷酸在全部4个血清型中是相同的。正是通过A30突变除去TL-2及其起支撑作用的茎结构(约核苷酸第143-172位)。所述30个核苷酸的除去导致形成预测的新结构元件(SL-2A30)，其具有对每种登革病毒血清型均相同的一级序列和二级结构(比较图6-9)。图10-13显示其中除A30突变之外从3，-UTR中缺失核苦酸的方法。所述A30突变除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中的TL-2同源结构。除A30突变之外从3'-UTR中缺失核芬酸的方法除去TL-2同源结构及最远至并任选地包含TL-3同源结构的序列，从而这种缺失延伸最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5'边界。在图10-14内所示的方法中，约31个核苦酸的额外缺失导致形成预测的新结构元件(SL-3A31)。参照图14-17,A86突变除去登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的每一种中的TL-2同源结构并除去最远至TL-3同源结构的序列。这种缺失导致形成预测的新结构元件(SL-2A86)。在涉及缺失除A30突变之外的核苦酸的一些实施方式中，对登革病毒基17因组的3'-UTR结构开展核酸缺失以弱化该病毒，同时维持其免疫原性。所述的失包括A30缺失(以示例性方式缺失血清型3Sleman/78毒抹的核苷酸第173-143位或以其相应方式在DEN1、DEN2、DEN3或DEN4的其它毒抹中缺失；编号始于病毒基因组的3'末端)，还包括缺失与所述A30缺失连续或不连续的额外3'-UTR序列。所述A30缺失对应于3'-UTR的TL-2结构。实施方式的一种类型，称作rDENlA30/31、rDEN2A30/31、rDEN3A30/31或rDEN4A30/31,包括原始的八30缺失和同时除去原始TL-2和TL-3结构的非连续性31个核苦酸缺失。实施方式的另一类型，称作rDENlA61、rDEN2A61、rDEN3A61或rDEN4A61，包括A30缺失和缺失从所述A30缺失的3'端延伸的31个连续核苷酸。实施方式的另一类型，称作rDENlA86、rDEN2A86、rDEN3A86或rDEN4A86，包括A30缺失和缺失从所述A30缺失的5'端延伸的56个连续核苷酸。对于DEN3而言，如下在表2中显示^皮构建以含有3'-UTR缺失突变的突变病毒的完整列表。用来自登革病毒第二血清型的3'-UTR对登革病毒第一血清型的3，-UTR的替换使用第二方法，rDEN3的3'-UTR可以替换为rDEN4的3'-UTR，后者任选地含有A30突变和除所述A30突变外从3，-UTR中缺失核苷酸。其它实例包括rDEN3的3'-UTR替换为登革病毒血清型1和2的3，-UTR，后者任选地含有A30突变和除所述A30突变外从3'-UTR中缺失核苷酸。其它实例包括rDENl的3，-UTR替换为登革病毒血清型2、3和4的3，-UTR，后者任选地含有A30突变和除所述A30突变外从3'-UTR中缺失核苷酸；rDEN2的3'-UTR替换为登革病毒血清型1、3和4的3'-UTR，后者任选地含有A30突变和除所述A30突变外从3，-UTR中缺失核苦酸；并且rDEN4的3'-UTR替换为登革病毒血清型1、2和4的3，-UTR，后者任选地含有A30突变和除所述A30突变外从3，-UTR中缺失核苦酸。包含将登革病毒第一血清型的3，-UTR替换为登革病毒第二血清型的3'-UTR的实施方式包括a)rDENl-3'D2、rDENl-3'D2x、rDENl-3'D3、rDENl-3'D3x、rDENl画3'D4、rDENl-3'D4x;rDENl/2-3，Dl、rDENl/2-3，Dlx、rDENl/2-3'D3、rDENl/2-3'D3x、rDENl/2-3'D4、rDENl/2-3，D4x;rDENl/3-3'Dl、rDENl/3-3，Dlx、rDENl/3-3'D2、rDENl/3-3'D2x、rDENl/3扁3'D4、rDENl/3-3'D4x;rDENl/4-3，Dl、rDENl/4-3，Dlx、rDENl/4-3'D2、rDENl/4-3'D2x、rDENl/4-3'D3、rDENl/4-253'D3x;b)rDEN2-3，Dl、rDEN2-3，Dlx、rDEN2-3'D3、rDEN2-3'D3x、rDEN2-3'D4、rDEN2-3'D4x;rDEN2/l-3，D2、rDEN2/l-3'D2x、rDEN2/l-3'D3、rDEN2/l-3'D3x、rDEN2/l-3'D4、rDEN2/l-3'D4x;rDEN2/3-3，Dl、rDEN2/3-3，Dlx、rDEN2/3-3'D2、rDEN2/3-3'D2x、rDEN2/3-3'D4、rDEN2/3-3，D4x;rDEN2/4-3,Dl、rDEN2/4-3，Dlx、rDEN2/4-3，D2、rDEN2/4-3!D2x、rDEN2/4-3，D3、rDEN2/4-3'D3x;c)rDEN3-3，Dl、rDEN3画3，Dlx、rDEN3-3，D2、rDEN3-3，D2x、rDEN3-3，D4、rDEN3画3'D4x;rDEN3/l画3'D2、rDEN3/l-3，D2x、rDEN3/l-3，D3、rDEN3/l-3'D3x、rDEN3/l-3，D4、rDEN3/l-3'D4x;rDEN3/2-3，Dl、rDEN3/2-3，Dlx、rDEN3/2-3'D3、rDEN3/2-3'D3x、rDEN3/2-3，D4、rDEN3/2-3，D4x;rDEN3/4画3，Dl、rDEN3/4-3，Dlx、rDEN3/4-3，D2、rDEN3/4-3'D2x、rDEN3/4-3'D3、rDEN3/4-3'D3x;和d)rDEN4-3,Dl、rDEN4画3，Dlx、rDEN4-3*D2、rDEN4-3'D2x、rDEN4-3'D3、rDEN4-3，D3x;rDEN4/l画3'D2、rDEN4/l-3，D2x、rDEN4/l-3'D3、rDEN4/l-3'D3x、rDEN4/l-3'D4、rDEN4/l-3，D4x;rDEN4/2-3，Dl、rDEN4/2-3，Dlx、rDEN4/2-3'D3、rDEN4/2-3'D3x、rDEN4/2-3，D4、rDEN4/2隱3，D4x;rDEN4/3-3，Dl、rDEN4/3-3，Dlx、rDEN4/3-3'D2、rDEN4/3-3，D2x、rDEN4/3-3'D4、rDEN4/3-3，D4x;19其中x是表2中所列的突变。产生及使用登革病毒或嵌合登革病毒的方法以使用本领域的标准方法产生本发明的病毒(包括嵌合病毒)可。例如，可以将与病毒基因组相对应的RNA分子导入宿主细月包，例如Vero细胞，随后可以从所述宿主细胞(或其上清液)中纯化出子代病毒。在这种方法中，将与病毒基因组相对应的核酸分子(例如RNA分子)导入宿主细胞，从细胞已经在其中培养的培养基收获病毒，并且配制所述病毒用于接种目的。本发明的病毒可以作为主要预防剂在有感染风险的成人或儿童中施用，或可以作为次要药剂用于治疗感染患者。例如，在DEN病毒和嵌合DEN病毒的情况下，疫苗可以用在有DEN病毒感染风险的成人或儿童中，或可以作为次要药剂用于治疗DEN病毒感染的患者。可以使用本发明的DEN病毒相关性疫苗和方法加以治疗的患者的实例包括(i)在DEN病毒地方性流行地区的儿童，(ii)外国旅行者，(m)军方人员和(iv)在DEN病毒流行地区的患者。此外，可以根据本发明治疗如此地区的居民，即已经观察到该疾病正在扩大的地区(例如，超出斯里兰卡、东非和拉丁美洲)或可能观察到本病在将来扩大的地区。本发明病毒的配制可以使用在本领域中作为标准的方法实施。用在疫苗制品中的众多可药用溶液是熟知的并且可以由本领域技术人员轻易地调整以用在本发明中(参见例如，《雷明顿药物科学》(iemz'"gto"，sP/2am7aceM"ca/5We"ce)(第十八版)，编者A.Gennaro,1990，麦克出版公司(MackPublishingCo.),伊斯顿阿(Eastern)，PA)。所述病毒可以稀释在生理可接受的溶液，如无菌盐水、无菌緩冲盐水或L-15培养基中。在另一个实例中，病毒可以例如作为流体施用和配制，其中所述的流体从登革病毒或嵌合登革病毒感染的细胞培养中收获。本发明的疫苗可以使用本领域熟知的方法施用并且所施用的疫苗的适宜量可以由本领域技术人员轻易地确定。例如，本发明的病毒可以配制成在0.1-1.0ml给药体积中含有102和107个感染单位(例如蚀斑形成单位或组织培养感染剂量)的将通过例如肌内、皮下或皮内途径施用的无菌水溶液。此夕卜，本发明的疫苗可以在单个剂量中施用，或任选地，施用可以包括使用引导性剂量，随后例如在施用2-6个月之后使用加强性剂量，如本领域技术人员确定是适合的。任选地，本领域技术人员已知的佐剂可以用在本发明病毒的施用中。可以用来增强病毒的免疫原性的佐剂包括例如脂质体制剂、合成性佐剂如(例如QS21)、胞壁酰二肽、单磷酰脂A或聚磷溱。尽管这些佐剂通常用来增强灭活疫苗的免疫应答，不过也可以与活疫苗一起使用。核酸序列DEN病毒的核酸序列用于设计核酸探针和引物以在样品或标本中以高灵敏度和高特异性检测缺失或嵌合性3'-UTR。与缺失或嵌合性3'-UTR相对应的探针或引物可以用来在样品中一般地检测缺失或嵌合性3'-UTR的存在，以量化该样品中缺失或嵌合性3'-UTR的量，或以监测用来治疗DEN病毒感染的疗法的进程。所述核酸及相应氨基酸序列用作实验室工具以研究机体和疾病并开发针对该疾病的疗法和治疗。核酸探针和引物选择性地与编码缺失或嵌合性3'-UTR的核酸分子或其互补序列杂交。通过"5'选择性"或"选择性地"意指这样的序列，其与其它核酸不杂交以不妨碍充分检测所述的缺失或嵌合性3-UTR。因此，在杂交性核酸的设计中，选择性将取决于样品中存在的其它组分。杂交性核酸应当与其所杂交的核酸节段具有至少70%互补性。如本文中核酸描述所用，术语"选择性杂交"排除偶然的随机杂交的核酸并且因此具有与"特异性杂交"相同的意思。本发明选择性杂交的核酸探针和引物可以与其所杂交的序列的节段具者至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%和99%互补性，优选地85°/。或更大的互补性。本发明也构思选择性地与编码性核酸或该核酸的互补或对立链杂交的序列、探针和引物。与核酸的特异性杂交可以伴随核酸中的微小修饰和置换而进行，只要维持功能性物种-物种杂交能力即可。"探针，，或"引物"意指这样的或扩增，其中所述探针或引物可以在长度上是约5-100个核苷酸或优选约10-50个核苷酸或最优选约18-24个核苷酸。本文中提供这样的分离核酸，其在严格条件下与物种特异性核酸选择性杂交并且应当具有互补于目的序列的至少5个核芬酸，如《分子克隆实-睑手册》(^fo/gc"farC/ow'wg:4i:a6omtorvM朋"a/),第二版.，Sambrook，Fritsch和Maniatis，冷泉港实-睑室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港(ColdSpringHarbor),NY,1989中描述。所需区域的至少两种核酸分子。根据探针或引物的长度，靶区域可以在70%在缺失或嵌合性3'-UTR，在杂交性核酸(探针或引物)及与其所杂交的序列之间的互补性程度是至少足以区分与源自其它机体的核酸杂交的。本发明的核S臾序列包括起到报告检测到cDNA扩增子的作用的诊断探针，其中所述的cDNA扩增子通过使用逆转录/聚合酴随反应(RT-PCR)以及为扩增该cDNA扩增子所设计的正向扩增引物和反向扩增引物从病毒基因组RNA模板中扩增。在某些情况下，设计所述扩增引物之一以在该扩增引物3'末端处含有这样的疫苗病毒特异性突变，其使所述试验更特异，原因在于引物在靶位点处延伸和后继扩增将仅在病毒RNA模板含有该特异性突变时才发生。最近开发了基于PCR的核酸序列自动检测系统。广泛使用泰克曼(TaqMan)测定法(美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems))。新近开发的用于诊断性遗传检测法的策略利用分子信标(Tyagi和Kramer1996《自然.生物技术》(NatureBiotechnology)14:303-308)。分子信标测定法釆用与TaqMan测定法中所用染料不同的猝灭染料和报告染料。这些检测系统和其它检测系统可以由本领域技术人员使用。通过在3'非翻译区(UTR)中导入缺失或将DEN3的3'-UTR与DEN4的3'-UTR交换而产生的登革病毒3型(DEN3)疫苗组分存在四种登革病毒血清型(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4),它们在超过二十五亿人居住的世界热带和亚热带地区中传播(GublerDJ1998临床微生物学评论(ClinMicrobiolRev)11:480-496)。DEN病毒在至少100个国家呈地方流行并且比任何其它虫媒病毒造成更多人类疾病。每年，存在估计五千万至一亿例登革热和数十万例登革出血热/登革休克综合征(Gubler，D.J.和M.Meltzer1999病毒学研究进展(j&Wn)53:35-70)。DHF/DSS仍是至少8个东南亚国家中儿童入院和死亡的主要病因(世界卫生组织(WorldHealthOrganization)1997登革出血热诊断、治疗、预防和控制，第二版(DengueHaemorrhagicFever:Diagnosis,Treatment,PreventionandControl,2ndedition)，WHO,Geneva)。在过去二十年，因四种DEN血清型所致的疾病的发病率及严重性急剧增加，其原因主要是蚊子媒介即埃及伊蚊和白紋伊蚊(j^fey"/6o//"w)地理分布扩大和四种DEN血清型流行性增加(GublerDJ1998临床微生物学评论(ClinMicrobiolRev)11:480-496)。登革病毒在蚊子至人至蚊子传播的生活周期中得到维持，而城市环境中没有参与该生活周期的其它明显病毒贮存者(RiceCM,1996黄病毒科:病毒及其复制(Flaviviridae:Thevirusesandtheirreplication.).FieldsBN，KnipeDM,HowleyPM，ChanockRM，MelnickJL，MonathTP,RoizmanB,StrausSE编辑.费氏病毒学(FzW(isWra/ogy).Philadelphia:Lippincott-RavenPublishers,第931-959页)。黄病毒科成员DEN病毒具有大约直径40-60nm的球状病毒粒子，其含有单链正义RNA基因组。一个单一多肽^皮病毒蛋白酶和细胞蛋白酶以共翻译方式加工，产生三种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和至少7种非结构(NS)蛋白。DEN病毒的基因组构造是5'-UTR-C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'(UTR-非翻译区，prM-膜前体)(RiceCM，1996黄病毒科:病毒及其复制(Flaviviridae:Thevirusesandtheirreplication.).FieldsBN，KnipeDM,HowleyPM,Chanock脂，MelnickJL，MonathTP,RoizmanB,StrausSE编辑.费氏病毒学(尸/e/tfeWra/ogy).Philadelphia:Lippincott-RavenPublishers,第931-959页)。应对于DEN感染的发病率和严重性日益增加，正在寻求开发疫苗以预防DEN病毒病。一种预防DEN病毒所致疾病的经济性疫苗已经成为全球公共健康的优先考虑。与针对黄热病(YF)病毒(另一种蚊孽生的黄病毒)的减毒活疫苗伴随的成本效益性、安全性和长效性成为开发DEN病毒減毒活疫苗的可行性才莫型(在PlotkinSA5OrensteinWA编辑《疫苗》中MonathTP，1999"黄热病"(MonathTP,1999inYellowfever,PlotkinSA5OrensteinWA，eds.Vaccines)费城(Philadelphia):W.B.SaundersCo.,815-879)。此外，有效的日本脑炎(JE)病毒减毒活疫苗在亚洲使用并且针对日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒的灭活病毒疫苗是可获得的。迫切需要针对DEN病毒的疫苗，并且开发23安全和高效DEN病毒疫苗的目标还未达到，尽管付出巨大努力。有效的DEN病毒疫苗必需提供免遭每种血清型影响的保护作用，因为全部四种血清型通常在地方流行地区传播并且异源血清型的继发感染与疾病严重性增加相关。我们已经利用两种策略以产生针对每种血清型的减毒活疫苗组分，后者可以随后配制成四价制剂(BlaneyJE等.2006病毒免疫学(Wra//附mw"o/).19:10-32)。首先，已经使用反向遗传学导入减毒性30核苷酸缺失(A30)突变至每种DEN血清型的cDNA克隆的3，-UTR内(Durbin,AP等.2001美国热带医学与卫生学杂志(Jw/rrapMed//;;)65:405-413;WhiteheadSS等.2003病毒学杂志(JWra/)77:1653-1657;BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志"wJrra/7M^//^)71:811-821;BlaneyJE等20045MC4:39)。最初，发现rDEN4A30疫苗组分在猕猴中弱化(表l)并且在人类中的I/II期临床试验证实病毒感染导致轻微的病毒血症，具有强烈的免疫原性并且表现最小的反应原性，未观察到严重副作用(Durbin,A.P.等.2001美国热带医学与卫生学杂志(JTra;M^//^)65:405-413;Durbin等.2005传染病杂志191:710-718)。最近，已经发现在猕猴中也弱化的rDENlA30疫苗组分(表l)在临床试验中也具有与对rDEN4A30所观察到的相似表型；在20名志愿者中轻^f鼓病毒血症、强烈免疫原性和最小反应原性(WhiteheadSS等.2003病毒学杂志(/Wra/)77:1653-1657;BlaneyJE等.2006病毒免疫学(Wra//www"o/).19:10-32)。不幸地是，rDEN2A30和rDEN3A30疫苗组分在前临床试验期间似乎在猕猴中没有令人满意地弱化，并且没有计划在人类中测试这些疫苗组分(表1)(BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志71:811-821;BlaneyJE等.2004BMCInfDis4:39)。因此，用于疫苗开发的替代策略是通过将减毒rDEN4A30疫苗组分的结构蛋白分别替换为来自产生rDEN2/4A30和rDEN3/4A30疫苗组分的DEN2或DEN3中的那些结构蛋白而生成有抗原性的嵌合病毒(WhiteheadSS等.2003疫苗21:4307-4316;BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志(v4mJrra;M^/fy)71:811-821)。rDEN2/4A30疫苗病毒已经在人类中进行测试并且显示安全性和强烈免疫原性，同时目前计划对rDEN3/4A30病毒临床评估。表1.A30突变对猕猴中四种DEN血清型的影响病毒血症3病毒表现病毒每只猴子表平均峰值病毒滴度iu血症的猴现病毒血症(log10PFUVml±SE)何羊始佶b子％的平均日数"i参考文献Whitehead等,病毒学杂志(乂fW)'2003,77:1653Blaney等，SMC/"/2004,4:39Blaney等，美国热带医学与卫生学杂琳2004,71:811Hanley等，疫苗(Fofcd"ei2004,22:3440rDENlrDENlA30rDEN2rDEN2A30rDEN3rDEN3A30rDEN4rDEN4A3010050100100100100画謂2.80.54.02.82.32.03.02.02.1±0.10.8±0.11.9±0.11.7±0.21.4±0.21.5±0.22.2±0.21.4±0.21,23078017391363265322154a猕猴组用在lml剂量中的5.0logu)PFU所示病毒进行皮下接种。每曰收集血清，持续10日。在Vero细胞中通过蚀斑测定法测定血清中的病毒滴度。b使用所述野生型病毒在第28日血清上测定蚀斑减少性(60%)中和抗体滴度。显示几何平均值的相应稀释度。这里，我们描述通过遗传性修饰DEN3cDNA克隆的3'-UTR所产生的DEN3血清型的新疫苗组分(BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志(」w/7k^MW//;;)71:811-821)。开发拥有野生型DEN3蛋白质的全套互补物的这些DEN3疫苗组分是重要的，这出于两个原因。首先，可以在临床试验中发现现有DEN3疫苗组分rDEN3/4A30是弱化不充分或过度弱化的。其次，针对由DEN3所致疾病赋予保护作用的最佳疫苗可能需要诱导针对全套DEN3蛋白质、而非仅针对M与E的T细胞应答，其中所述的M与E是存在于rDEN3/4A30嵌合病毒中的仅有DEN3序列。为了产生另外的DEN3疫苗组分，把在3'-UTR中包含A30缺失或划定其边界的新缺失导入rDEN3cDNA克隆。可选地，将rDEN3cDNA克隆的3'-UTR替换为rDEN4或rDEN4A30的3'-UTR。在组织培养、移植具有HuH-7细胞的SCID小鼠和猕猴中就减毒表型分析活病毒。三种突变病毒(rDEN3A30/31、rDEN3A86和rDEN3-3'D4A30)具有在人类中表明它们可能具有安全性和免疫原性的前临床表型。rDEN3缺失突变体的产生25我们试图产生这样的扩大缺失突变，其包括原始A30(核苦酸第173-143位)突变。表2列出包含原始A30突变的7种缺失突变，包括A50、A61、A80、△86、A116A、A116B和A146。此夕卜,A30/31突变包括原始的A30突变和非连续型31个核苦酸缺失。也单独地产生A31突变以辨别A30或A31在A30/31缺失突变组合中的贡献。在图4中显示划定缺失边界的核苷酸在预测的DEN33'-UTR二级结构中的位置。此外，在图8、图12和图16中分别显示预测的rDEN3A30、rDEN3A30/31和rDEN3A86的DEN33'-UTR二级结构。表2.在DEN3Sleman/78的3'-UTR中产生的缺失突变<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>编号始于病毒基因组的3'端使用PCR诱变来导入9个新的缺失突变至DEN3Sleman/78cDNA质粒p3,其中所述的p3先前用来产生rDEN3A30疫苗组分(BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志(/TrapMedify)71:811-821)。使用p3-frag.4cDNA亚克隆作为PCR反应的模板，所述的PCR反应具有在表3中列出的所示成对诱变性寡核苷酸，而对于A30/31缺失突变则例外，该缺失突变使用p3-frag.4A30cDNA亚克隆作为模板。将PCR产物连接并且用来转化感受态细菌细胞。从细菌克隆中分离质粒DNA并且通过测序分析证实春栽适宜的缺失突变。为产生含有所述缺失突变的完整DEN3cDNA质粒，将源自突变p3-frag.4cDNA亚克隆中的Xpw/-」PW/片段(963个核芬酸)导入p3-7164cDNA质粒。此p3-7164质粒编码先前证明在Vero细胞中增强生长及转染效率的7164Vero细胞适应性突变(BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志(爿wJ7Vo;MWi/;;)71:811-821)。证实含有该缺失突变的全长p3质粒含有正确的3'-UTR序列。与DEN3p3质粒cDNA(Genbank#AY656169)相比时，鉴定到在rDEN3A30/31和rDEN3A86病毒中除所设计缺失之外的突变(表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4.与DEN3p3质粒cDNA(Genbank#AY656169)相比时，除所设计缺失之外在rDEN3A30/31和rDEN3A86病毒中所鉴定到的突变病毒基因核苷酸位置核苷酸置换氨基酸位置氨基酸变化rDEN3A30/31NS4B7164aU—C115Val—AlaNS4B7398C—U193Ala—ValrDEN3A86M512A—G26Lys—GluNS36076C—U521沉默NS4B7164aU—C115Val—AlaNS58623U—C353沉默NS510267bA—U末端(END)末端~>Tyr3'-UTR10455G—C——一7164突变是设计至cDNA构建体的Vero细胞适应突变。b在该核苷酸位置(A—A/U)处存在混合群体，其中所述的A—A/U把位于NS5末端处的终止密码子(UAA)变成编码Tyr的UAU。这使NS5延长2个氨基酸(Tyr-Thr-End),原因在于终止密码子仍存在于核苷酸第10271-10273位处。为回收病毒，从cDNA质粒中体外合成5'-加帽的RNA转录物并使其转染至Vero细胞或C6/36细胞。在转录并产生感染性病毒之前，接头序列通过用消化而从cDNA质粒中除去。质粒随后通过连接作用再环化、用Jcc<551(尺;wl的同切点酶，其切割留下仅单个3，核苦酸)线性化并使用SP6聚合酶进行体外转录。纯化的转录物随后转染至Vero或C6/36细胞。在C6/36细胞中成功回收到编码九种突变A30/31、A31、A50、A61、細、A86、A116A、A116B和A146中每种突变的重组病毒，而在Vero细胞中仅回收到rDENA31。rDEN3缺失突变病毒随后在Vero细胞中传代一次，尔后在Vero细胞中通过终点稀释法进行生物学克隆。克隆的病毒随后在Vero细胞中传代2至7次，目的是达到视为足够为经济性(cost-effective)生产创造条件的至少6.0log1GPFU/ml的贮存滴度。发现尽管3种重组病毒(rDEN3A50、rDEN3AU6A和rDEN3A146)有活力，然而它们在Vero细胞中的复制极有限。因此，这三种病毒不进行深入研究。测定达到至少6.01ogK)PFU/ml峰值病毒滴度的剩余6种缺失突变病毒的3'-UTR的遗传序列。对rDEN3A61、rDEN3A80、rDEN3A86和rDEN3A30/31找到了具有适宜缺失的正确3'-UTR序列。然而发现两种突变病毒含有额外的缺失或突变并且认为潜在具有不稳定基因型。首先，rDEN3A31具有核苷酸第258-228位的正确3'-UTR缺失，不过还含有核苷酸第222-198位的一个25核苷酸缺失。其次，rDEN3Al16B具有核苷酸第258-143位的正确3'-UTR缺失，不过还含有核苷酸第430-423位的一个8核苦酸缺失和在核苦酸第265位处的单一A—G置换。伴随这些病毒的潜在遗传不稳定性取消了它们作为疫苗组分的用途，从而这些病毒不进行深入研究。因此，在构建的9个原始缺失体中，发现4种突变病毒rDEN3A61、rDEN3A80、rDEN3A86和rDEN3A30/31在Vero细胞中高效复制并且对它们进一步研究。产生带有来自rDEN4或rDEN4A30中的3'-UTR的rDEN3嵌合病毒使用另一种策略来产生新的rDEN3疫苗组分，即用rDEN4或rDEN4A30的3'-UTR替换rDEN3cDNA克隆的3'-UTR(图18A)。设计3'-UTR嵌合病毒-rDEN3-3'D4A30作为四价制剂中所包含的疫苗组分，其中所述的四价制剂在全部四种血清型中共享A30缺失突变。设计rDEN3-3，D4病毒以区分3'-UTR嵌合化和A30突变对所观察任意表型的贡献。p3-3'D4A30质粒如下产生。首先，使用PCR诱变来导入限制位点至p3-frag.4cDNA亚克隆(图18B)。将PCR产物连接并且用来转化感受态细菌细胞。从细菌克隆中分离质粒DNA并通过测序分析证实适宜缺失突变的存在。为导入rDEN4A303'-UTR至p3-FragA(H/al)cDNA亚克隆，使用正向引物(5'-AACAACAACAAACACCAAAGGCTATTG-3,,SEQIDNO:32)和反向引物(5'画CCTACCGGTACCAGAACCTGTTG-3'，SEQIDNO:33)，通过PCR扩增包含p4A303'-UTR的含364个核苷酸的片段。为产生p3-frag.4-3'D4A30cDNA亚克隆，将7/;al-J^"I片段从p3-frag.4(//;al)中除去并且替换为已经由切割的p4A303，-UTRPCR片段。将p3-frag.4-3，D4A30的尸Wl-《;"I片段导入p3质粒以产生全长cDNA克隆p3-3'D4A30。证实3'-UTR和NS5接头的序列是正确的。为产生p3-3'D4，将A30缺失突变的缺失核苷酸导入p3-frag.4-3'D4A30亚克隆。筒而言之，将p3-frag.4-3'D4A30中包含A30区的Mwl-《;wl片段替换为p4的相应片段以产生质粒p3-frag.4-3'D4。为产生全长p3基因组，将p3的尸Wl-i^wI片段替换为p3-frag.4-3'D4的相应片段。确定p3-3'D4质粒的3'-UTR序列是正确的并且该序列含有A30突变丟失的30个核苷酸。为回收病毒，从cDNA质粒中体外合成5'-加帽的RNA转录物并使其转染至Vero细胞或C6/36细胞。在转录并产生感染性病毒之前，接头序列通过用印el消化而从cDNA质粒中除去。质粒随后通过连接作用再环化、用乂cc651(尺/"I的同切点酶，其切割留下仅单个3'核苷酸)线性化并使用SP6聚合酶进行体外转录。纯化的转录物随后转染至Vero或C6/36细胞。在C6/36细胞和Vero细胞中回收到rDEN3-3'D4而在Vero细胞中仅可以回收到rDEN3-3'D4厶30。突变病毒随后在Vero细胞中传代一次，尔后在Vero细胞中通过终点稀释法进行生物学克隆。rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30随后在Vero细胞中分别传代4次或6次。发现NS5-3'-UTR接头和3'-UTR的遗传序列对于rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30均是正确的。因此这两种病毒均进行深入研究。与DEN3p3质粒cDNA克隆(5'-UTR和基因)和DEN4p4cDNA克隆相比，在DEN3-3，D4A30病毒中也鉴定到突变(表5)。表5.与DEN3p3质粒cDNA克隆(5'-UTR和基因)和DEN4p4cDNA克隆(3'-UTR)相比的在rDEN3-3D4A30病毒中的突变病毒基因核苷酸位置核苷酸置换氨基酸位置氨基酸变化rDEN3-3'D4雄C250U—C52沉默NS35899U—c462沉默NS4Ba7164U—c115Val—Ala3'-UTR10534A—G———29a7164突变是设计至cDNA构建体中的Vero细胞适应突变。DEN3突变病毒在SCID-HuH-7小鼠中的复制发现四种缺失突变病毒(rDEN3A30/31、rDEN3A61、rDEN3A80和rDEN3A86)在Vero细胞中复制至高滴度并且证实具有正确3'-UTR序列，并且首先在SCID-HuH-7小鼠中评价rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30病毒。比较rDEN3-3'D4和rDEN3-3'D4A30以确定3'-UTR嵌合化和通过A30突变赋予的任何其它减毒作用对复制的影响。SCID-HuH-7小鼠含有HuH-7人肝癌细胞系的实体肿瘤并且在这种小鼠模型中的病毒复制分析充当在人肝脏中DEN病毒复制分析的代用品。众多DEN病毒突变病毒已经通过在SCID-HuH-7小鼠中评价进行鉴定(BlaneyJE等.2002病毒学(Fra/ogy)300:125-139;Hanley等.2004疫苗(Vaccine)22:3440-3448;BlaneyJE等.2006病毒免疫学(Kra//mmw"o/).19:10-32)。该小鼠模型提供这样的原始证据，即与亲代病毒rDEN3相比，rDEN3A30病毒未弱化，而与野生型亲代病毒相比时，抗原性嵌合病毒rDEN3/4A30在SCID-HuH-7小鼠中的复制受限制大约100倍(BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志MmjrrapM^///7)71:811-821)。为SClD-HuH-7小鼠中的病毒复制分析，4-6周龄SCID小鼠(Tac:Icr:Ha(ICR)-/V/c/cscid)(TaconicFarms)用含有组织培养中所增殖的107个HuFJ-7细胞的0.1mL磷酸盐緩冲盐水进行腹膜内注射。在移植后5-6周于腹膜内检测到肿瘤并且携带肿瘤的小鼠通过直接用50^1Opti-MEMI中的104PFU病毒直接接种至肿瘤而感染。血清在感染后第7曰从感染小鼠中收集并且冷冻在-80。C。在Vero细胞中通过蚀斑测定法测定病毒滴度。如表6中所示，野生型DEN3Sleman/78复制到近乎106'9PFU/ml的平均峰值病毒滴度。虽然对6种突变病毒均观察到降低的复制水平，然而复制的差异不是统计显著的。不过，与野生型DEN3病毒相比，rDEN3A86和rDEN3-3，D4A30在复制方面受限大于10倍，而rDEN3A30/31的复制受限略微低于10倍。基于这个主观临界值，选择这三种病毒进一步评价。着重指出的是与野生型rDEN4病毒相比，发现rDEN4A30病毒在SCID-HuH-7小鼠中的复制仅受限6倍，其中所述的rDEN4A30病毒在人类中具有充分表征的减毒作用和无反应原性表型(Hanley等.2004疫苗(Vaccine)22:3440-3448)。表6.突变DEN3病毒在HuH-7-SCID小鼠中的复制<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>1HuH-7-SCID小鼠组用4.0log1QPFU的所示病毒接种至肿瘤。在第7日收集血清并且在Vero细胞中测定病毒滴度。因为rDEN3-3'D4A30病毒和rDEN3A30/31与rDEN3A86病毒编码DEN3全套结构蛋白和非结构蛋白，故期望它们诱导完全互补的体液免疫与细胞免疫。与仅编码DEN3结构蛋白的嵌合性rDEN3/4A30诱导的免疫诱导作用相比，这种更完整的免疫诱导作用是有利的。DEN3突变病毒在组织培养中的复制在Vero细胞和蚊子C6/36细胞中评估rDEN3A30/31和rDEN3A86缺失突变病毒以及具有或没有A30的rDEN3-3'D4病毒的病毒复制水平。在Vero细胞中分析复制，因为这些细胞是生产基础，而在C6/36细胞中评估生长，因为在这些蚊子细胞中的减毒表型可以与充当DEN病毒传播^(某介的伊蚊中的受限复制关联(Hanley等，2003病毒学(Wra/ogy)312:222-232)。生长动力学如下评价。75cn^培养瓶中Vero细胞和C6/36细胞的汇合细胞以感染复数O.Ol进行感染。每曰取出0.5ml组织培养上清液的等分试样，持续7日，与SPG稳定剂合并并且冷冻在-8(TC。通过蚀斑测定法在Vero细胞上测定全部样品的病毒滴度。所述蚀斑测定法的检测限是1.01og1GPFU/ml。在图19中显示每种病毒在这两种细胞系中的复制动力学。在Vero细胞中，rDEN3A30/31、rDEN3八86和rDEN3-3'D4A30复制到接近于野生型rDEN3的峰值水平，并且具有与野生型rDEN3相似的动力学。这三种疫苗组分达到6.5-6.7log1QPFU/ml的峰值病毒滴度，其中所述的峰值病毒滴度表明制造全部这些病毒中每一种的可行性。在Vero细胞中，rDEN3-3'D4病毒复制到7.8logl。PFU/ml的峰值滴度，该峰值滴度比观察到的野生型rDEN3峰值滴度高几31乎100倍，表明并入DEN43'-UTR可以增进在Vero细胞中的复制。这也可能归因于rDEN3-3'D4病毒更有效地适应Vero细胞。rDEN4复制到大约8.0Iog1QPFU/ml的峰值滴度，该峰值滴度表示此嵌合病毒实现不超过它的两个亲代病毒中任何一种亲代病毒的峰值滴度(BlaneyJE等.2006病毒免疫学(Wra/7mwwwo/).19:10-32)。对C6/36细胞中病毒复制的分析证实rDEN3A86和rDEN3-3'D4A30达到比野生型rDEN3病毒的峰值病毒滴度6.9Iog1GPFU/ml低大约IO倍的峰值滴度(图19)。rDEN3-3'D4病毒复制到与所观察到的野生型rDEN3峰值滴度相似的峰值滴度。最令人震惊的结果是在C6/36细胞中观察到的rDEN3A30/31病毒复制缺乏。在第1曰后，在来自用rDEN3A30/31病毒感染的C6/36细月包的培养基中未4企测到病毒，尽管在Vero细胞中观察到高效复制。这些结果在第二独立生长曲线实验中得到证实并且显示组织培养中的宿主范围减毒表型，其中所述的宿主范围减毒表型也被认为在蚊子中与减毒表型相伴。DEN3突变病毒在猕猴中的复制和免疫原性基于SCID-HuH-7小鼠中轻微减毒和在Vero细胞中高效生长，在猕猴中评价rDEN3A30/31、rDEN3A86和rDEN3-3'D4A30。就病毒血症水平和持续期、中和抗体诱导和赋予免受野生型DEN3病毒攻击的保护作用方面比较所述突变病毒与野生型DEN3。还评价具有或没有A30突变的rDEN3-3'D4病毒以区分3'-UTR嵌合化对减毒作用的贡献。在猕猴中的减毒表型通常是临床试验中疫苗组分安全性的有力指示物，所述的疫苗组分包括rDEN4A30,rDENlA30和rDEN2/4A30(BlaneyJE等.2006病毒免疫学(Wra//附附w"o/).19:10-32)。用1()SPFU的所示病毒(表7)皮下接种含四只猕猴的组。两只猕猴用病毒稀释剂进行模拟感染。为检测病毒血症，血清在第0-8日和第10日收集并且冷冻在-80。C。通过蚀斑测定法在Vero细胞中测定血清中的病毒滴度。在第28日收集血清以检测针对DEN3的中和抗体。使用蚀斑减少中和测定法，在Vero细胞中测定针对野生型DEN3病毒的中和抗体水平。在感染后第35曰，通过皮下感染105PFUDEN3野生型病毒而对全部猴子激发。血清在第0-8日和第10日收集并且冷冻在-80。C。在Vero细胞中通过蚀斑测定法测定血清样品中的病毒滴度。32表7.rDEN3突变病毒在猕猴中的复制和免疫原性血清中和抗体滴度(稀激发后4表现病毒每只？子表平均錢病毒Jpw的几何平均-SE)哲a。症的猴子％(log10pfli/ml病毒1猴子数目SE)DEN3(Sleman/78;)41003.51.8±0.1<52530<1.0rDEN3A30/31400<1.0<53040<1.0rDEN3A86400<1.0<52240<1.0rDEN3-3'D44751.51.3±0.2<52290<1.0rDEN3-3'D4A30400<1.0<5770<1.0模拟感染200<1.0<5<51001.8士0.24弥猴组在第0日用lml剂量中的5.0logK)PFU的所示病毒皮下接种。血清在第0-8日和第10日每日收集并在第28日收集-次。2通过蚀斑测定法在Vero细胞中测定血清中的病毒滴度。3使用DEN3(Sleman/78)测定蚀斑减少性(60%)中和抗体滴度。4猴子在35日后皮下施用在lml剂量中含有5.01ogK)PFU的DEN3(Sleman/78)进行攻毒。血清在第0-8日和第10日每日收野生型DEN3Sleman/78病毒在猕猴中复制到1.8log1()PFU/ml血清的平均峰值病毒滴度，同时全部猴表现病毒血症(表7)。这些结果与先前在猕猴中对DEN3的研究相一致(BlaneyJE等.2004美国热带医学与卫生学杂志(/TrapMW//y)71:811-821)。在用三种疫苗组分rDEN3A30/31、rDEN3A86或rDEN3-3'D4A30中任意种组分感染的任何猴子中未检测到病毒血症，这显示在猕猴中对全部这些病毒的清晰减毒表型。有趣的是，在75%的猴子中检测到rDEN3-3'D4病毒，平均峰值病毒滴度是1.31og!。PFU/ml血清，这表明A30突变的存在对于弱化3'-UTR嵌合病毒是必需的。尽管缺少可检测性病毒血症，在用rDEN3A30/31和rDEN3A86感染的猴子中的平均中和抗体水平达到与野生型DEN3病毒的平均中和抗体水平1:253相似的水平(表7)。相反，rDEN3-3'D4A30病毒诱导比DEN3低三倍的平均中和抗体水平。然而，用每种疫苗组分免疫的100%猴子发生如感染后血清中和抗体水平上升四倍或更高倍所定义的阳转。因此，尽管缺少可检测性病毒血症，然而认为全部猴子受每种疫苗组分感染。测定用DEN3病毒攻毒后血清中的病毒滴度表明，用每种疫苗-组分免疫接种诱导免受可检测性病毒血症影响的完全保护，如给定观察到的中可抗体水平所预期的那样。在蚊子中的复制在安汶巨蚊(7bxoo;"c/2/tesam6o/"e"a^)中研究rDEN3和rDEN3A30/31的复制。胸内接种试验病毒的连续10倍稀释物如先前描述那样(TroyerJ.M.等2001美国热带医学与卫生学杂志(Jw/rra;M^///y)65:414-9)进行。在14日潜伏期后，分离蚊子头部并将其在稀释剂中匀浆。在蚊子头部匀浆中的病毒滴度通过蚀斑测定法在Vero细胞中测定。基于rDEN3A30/31在猕猴中弱化及其在C6/36蚊子细胞中复制受限，就高度敏感性安汶巨蚊中的感染性和复制水平方面比较rDENA30/31与野生型rDEN3(表8)。病毒的连续10倍稀释物作胸内接种并且通过14日潜伏期后在蚊子头部匀浆上开展蚀斑测定法而评估感染头部组织的能力。rDEN3和rDENA30/31的感染性是极相似的，因为50%蚊子感染剂量对于这两种病毒均是大约1013PFU(表8)。然而，rDENA30/31在感染蚊子的头部中的复制水平降低约5倍至50倍。这种降低在测试的1023和10"剂量上是显著的。此项研34究结果表明尽管通过胸内感染，rDEN3A30/31对巨蚊的感染性与野生型DEN3对巨蚊的感染性相似，然而存在对巨蚊中由A30/31突变赋予的复制水平的统计显著性限制。表8.rDEN3和rDEN3A30/31在安汶巨蚊中的复制病毒剂量a(log10PFU)测试数目感染b%平均病毒滴度e(1og,oPFU/蚊子头部)与相同剂量wt病毒^J比的P务低(logw)rDEN3wt2.320904.2±0.1d1.319534.2±0.1e0.317184.3士0.3rDEN3A30/312,312832.7±0.3d1.51,316443.1±0.3e1.10.38133.6±0.00.7a在0.2^1接种物中胸内施用的病毒滴度b通过在Vera细胞中对蚊子头部匀浆的蚀斑测定法测定接种后第14日具有可检测性病毒的蚊子的百分数。M又使用病毒呈阳性的蚊子头部的值进行计算d对于IO"PFU剂量的rDEN3和rDEN3A30/31，平均病毒滴度是显著差异的，如Tukey-Kramerpost-hoc检验确定(P<0.001)。e对于10UPFU剂量的rDEN3和rDEN3A30/31，平均病毒滴度是显著差异的，如Tukey-Kramerpost-hoc检验确定(P<0.005)。*氺尔尽管为清晰和理解目的，已经以一定的详细程度描述了本发明，然而本领域技术人员理解可以产生形式和细节的众多变化而不脱离本发明的真正范围。全部图形、表格和附注以及以上引用的专利、申请和出版物因而通过引用的方式并入。权利要求1.一种登革病毒或嵌合登革病毒，其包含在3′非翻译区(3′-UTR)中的突变，所述的突变选自以下所组成的组中(a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的Δ30突变和除所述Δ30突变外从3′-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5′方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5′边界；和(b)用登革病毒第二血清型的3′-UTR，其任选地含有Δ30突变和除所述Δ30突变外从3’-UTR中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3′-UTR进行替换。2.根据权利要求1所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突变是(a)。3.根据权利要求2所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突变除去TL-2同源结构，并且以与所述A30突变连续的连续方式除去至多到和包含TL-3同源结构的序列。4.根据权利要求3所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突变是A86突变，从而所述的A86突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1的约228至约145位核苷酸、DEN2的约228至约144位核苷酸、DEN3的约228至约143位核苦酸和DEN4的约228至约143位核苦酸。5.根据权利要求4所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的血清型是DEN3。6.根据权利要求2所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突变以与所述A30突变不连续的非连续方式除去TL-2同源结构和TL-3同源结构二者。7.根据权利要求6所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突变是A30/31突变，从而所述的A30突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1的约174至约145位核苦酸、DEN2的约173至约144位核苦酸、DEN3的约173至约143位核苷酸和DEN4的约172至约143位核苷酸，并且所述的A31突变缺失采用反向编号系统标明的DEN1的约258至约228位核苷酸、DEN2的约258至约228位核苷酸、DEN3的约258至约228位核苷酸和DEN4的约258至约228位核苷酸。8.根据权利要求7所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的血清型是DEN3。9.根据权利要求1所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，所述的突变是(b)。10.根据权利要求9所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中DEN1的3'-UTR替换为登革病毒血清型2、3或4的3'-UTR，DEN2的3'-UTR替换为登革病毒血清型1、3或4的3'-UTR，DEN3的3'-UTR替换为登革病毒血清型1、2或4的3'-UTR或者DEN4的3'-UTR替换为登革病毒血清型1、2或3的3'-UTR。11.根据权利要求IO所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其还包含所述A30突变。12.根据权利要求10所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其还包含所述A30突变和除所述A30突变外/人3'-UTR中缺失核香酸。13.根据权利要求9所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其中，DEN3的3'-UTR替换为登革病毒血清型1、2或4的3'-UTR。14.根据权利要求13所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其还包含所述A30突变。15.根据权利要求13所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其还包含所述A30突变和除所述A30突变外从3'-UTR中缺失核芬酸。16.根据权利要求9所述的登革病毒或嵌合登革病毒，其选自以下所组成的组中a)rDENl-3'D2、rDENl-3'D2x、rDENl-3'D3、rDENl画3'D3x、rDENl-3'D4、rDENl-3'D4x;rDENl/2-3，Dl、rDENl/2-3'Dlx、rDENl/2-3'D3、rDENl/2-3'D3x、rDENl/2-3'D4、rDENl/2-3'D4x;rDENl/3-3，Dl、rDENl/3-3'Dlx、rDENl/3-3'D2、rDENl/3-3'D2x、rDENl/3-3'D4、rDENl/3-3'D4x;rDENl/4-3，Dl、rDENl/4画3，Dlx、rDENl/4-3'D2、rDENl/4画3'D2x、rDENl/4-3'D3、rDENl/4-3'D3x;b)rDEN2-3，Dl、rDEN2-3，Dlx、rDEN2-3'D3、rDEN2-3'D3x、rDEN2-3'D4、rDEN2-3'D4x;rDEN2/l-3'D2、rDEN2/l-3'D2x、rDEN2/l-3'D3、rDEN2/l-3'D3x、rDEN2/l國3'D4、rDEN2/l-3'D4x;rDEN2/3-3Dl、rDEN2/3-3，DlxrDEN2/3誦3'D4、rDEN2/3-3'D4x;.rDEN2/4画3，DlxrDEN2/4-3'D3x;、rDEN3-3，Dlx、rDEN3-3'D2、rDEN3-3'D2x、rDEN3-3'D4、rDEN2/4-3，DlrDEN2/4-3'D3、c)rDEN3-3，DlrDEN3-3,D4x;rDEN3/l-3'D2rDEN3/l画3'D4、rDEN3/2-3，DlrDEN3/2-3，D4、rDEN3/4國3，DlrDEN3/4-3'D3、d)rDEN4画3，DlrDEN4-3'D3x;rDEN4/l-3'D2rDEN4/l-3'D4、rDEN4/2画3，DlrDEN2/3-3'D2、rDEN2/3-3'D2x、rDEN2/4-3'D2、rDEN2/4-3'D2x、rDEN3/l画3'D2x、rDEN3/l-3，D3、rDEN3/l國3，D3x、rDEN3/l-3'D4x;.rDEN3/2-3，Dlx、rDEN3/2國3'D3、rDEN3/2-3'D3x、rDEN3/2-3'D4x;.rDEN3/4-3，Dlx、rDEN3/4画3'D2、rDEN3/4-3，D2x、rDEN3/4-3'D3x;和、rDEN4-3，Dlx、rDEN4-3，D2、rDEN4-3'D2x、rDEN4-3，D3、rDEN4/l-3'D3、rDEN4/l画3'D3x、rDEN4/l-3'D2xrDEN4/l-3'D4x;rDEN4/2-3,DlxrDEM4/2國3'D4、rDEN4/2-3'D4x;rDEN4/3-3，Dl、rDEN4/3-3'DlxrDEN4/3-3'D4、rDEN4/3-3'D4x;其中x是表2中所列的突变。17.—种免疫原性组合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的登革病rDEN4/2-3'D3、rDEN4/2-3'D3x、rDEN4/3-3'D2、rDEN4/3-3'D2x、毒或嵌合登革病毒。18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其对于登革血清型l、2、3和4是四价的。19.一种在患者中诱导针对登革病毒的免疫应答的方法，其包括向患者给药权利要求17所述的免疫原性组合物以诱导针对登革病毒的免疫应答。20.—种产生登革病毒或嵌合登革病毒的方法，其包括导入突变至3'非翻译区(3'-UTR)，所述的突变选自以下所组成的组中(a)除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的A30突变和除所述A30突变外从3'-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5'方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5'边界；和(b)用登革病毒第二血清型的3'-UTR，其任选地含有A30突变和除所述A30突变外从3'-UTR中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3'-UTR进行替换。全文摘要本发明涉及在3′非翻译区(3′-UTR)中包含突变的登革病毒或嵌合登革病毒，其中所述突变包括除去登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-2同源结构的Δ30突变和除所述Δ30突变外从3′-UTR中缺失核苷酸，所述缺失以5′方向除去序列最远至登革病毒血清型1、2、3和4的每一种中TL-3同源结构的5′边界；或用登革病毒第二血清型的3′-UTR，其任选地含有Δ30突变和除所述Δ30突变外从3′-UTR中缺失核苷酸，对登革病毒第一血清型的3′-UTR的替换；并且涉及免疫原性组合物、诱导免疫应答的方法和产生登革病毒或嵌合登革病毒的方法。文档编号C07H21/04GK101657463SQ200780034189公开日2010年2月24日申请日期2007年8月15日优先权日2006年8月15日发明者布赖恩·R.·墨菲,斯蒂芬·S.·怀特黑德,约瑟夫·E.·布莱尼申请人:美国国有健康与人类服务部(马里兰州)