糖工程化抗体的利记博彩app

专利名称：糖工程化抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及经修饰的抗体、其衍生物或片段领域。
背景技术：
制药工业越来越面临对成本有效的大规模替代性生物药物生产系统的需求。同时，基于植物的表达系统已显露出其适于作为动物细胞工厂的替代品。尤其是其低生产成本和无受人致病原污染的危险最小
化所致的异常安全性(Raskin, I. et al" Trends Biotechnol 20， 522-531(2002); Fischer, R. et al" Curr Opin Plant Biol 7,152-158 (2004))是最重要的。植物能够进行大多数较高级的真核生物的翻译后修饰(Gomord， V. & Faye， L.， Curr Opin Plant Biol 7， 171-181 (2004))。这些包括复合物糖基化、蛋白质加工和折叠，以及复合物多聚体蛋白质的組装，对有活性的治疗性抗体的生物活性和药物动力学有作用。因此，各种重组蛋白质，包括人抗体已成功地在植物宿主表达系统中表达(Hiatt， A. et al" Nature 342， 76-78 (1989); Ma, J. K. et al" NatRev Genet 4， 794-805 (2003))。
然而，植物来源的N-联寡糖与人中发现的那些相当地不同。除了在植物中通常无al，6-岩藻糖残基，在翻译后的修饰(如糖基化)的不同已显示能影响植物来源的蛋白质的特性(Daniell et al.， supra;Conrad et al. (1998) Plant MoL Biol. 38:101-109; Mann et al (2003)Nat. Biotechnol. 21:255-261 )。在植物中，N-联聚糖可含有附着于聚糖核心的N-联甘露糖的抗原性(Faye et al. (1993) Anal. Biochem.109:104-108)和/或过敏原性(van Ree et al. (2000) J. Biol. Chem，275:11451-11458) p(l，2)-木糖(Xyl)残基和与不存在于哺乳动物聚糖上的近端GlcNAc连接的a(l，3)-岩藻糖(Fuc)残基。相反，唾液酸残在成功的局部被动免疫 中不需要这些残基(Ma et al. ， supra )。
几乎在所有物种中，内质网(ER)中的糖基化加工都是保守的， 且局限于寡甘露糖(ManS-9GlcNAc2)型N-聚糖，然而经高尔基加工 成杂交体和复合型聚糖则非常多样(Helenius et al. (2001) Science 291:2364-2369)。转基因植物中表达蛋白质的ER滞留通常能提高生 产水平(Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109; Sharp et al. (2001)Biotechnol.Bioeng. 73:338-346)。但是，由于聚糖加工可影响 抗体的稳定性(Rudd et al. (2001) Science 291:2370- 2376 )，还不清 楚是否来源于具有修饰的聚糖结构的植物表达系统的抗体是有活性的 并且能给予有效的系统性暴露后预防。
至于在所被含的悬浮液的培养物中的重组蛋白质的大规模可适合 的生产平台，粗壮的藓类小立碗藓通过将几个有利的品质与-不仅在土 壤植物之间-允许有效地定点敲除基因的特别高速的同源的核DNA重 组结合，提供了绝对无动物成分的下一代生产技术(Gorr， G. & Wagner, S.， Modern Biopharmaceuticals 3， 919-929 (2005); Girke, T. et al" Plant J 15， 39-48 (1998); Schaefer， D. G. & Zyrd， J. P; Plant J 11,1195-1206 (1997))。在试图"人化，，N-联寡糖结构的努力中，根据 WO 04/057002，最近已产生了 pi，2-木糖基转移酶和al，3-岩藻糖基转 移酶基因(Axyl-t/Afuc-t)的双敲除变体。这些藓类变体合成了完全缺 乏这两个植物特异性糖残基的总糖蛋白，但它们仍不影响形态、生长、 发育和分泌重组糖蛋白的能力(Koprivova, A. et al.; Plant Biotechnol J 2, 517-523 (2004); Huether, CM. et al. Plant Biol 7， 292-299 (2005))。 同时还显示末端的，类人的1，4联半乳糖成功地附着于来自藓类的1\-聚糖(Huether, CM. et al. Plant Biol 7， 292-299 (2005); Gorr and Jost Bioprocess J 4， 26-30 (2005))。其中未公开抗体的功能特征如ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC (补体依赖性细胞毒性) 活性。
虽然已有人试图通过植物表达系统生产抗体，但也描述了变化的
7糖基化模式和对效应子功能的负面影响和这些抗体的Fc区和Fc受体 之间的相互作用所致的这些抗体的稳定性。已有报道，免疫球蛋白的 Fc部分介导的功能与它们的N-联寡糖结构有强烈的相关性(Jefferis， R. et al,， Immunol Rev 163， 59-76 (1998))。
核心岩藻糖基化寡糖尤其显示出与在效应细胞上表达的FcyRIIIa 受体(CD16 )有较微弱的结合，导致了溶解潜能的降低(Shields, R. L. et al.， J Biol Chem 277， 26733-26740 (2002); Shinkawa， T. et al" J Biol Chem 278， 3466-3473 (2003))。相反，在N-聚糖模式中酵母产生缺乏 核心岩藻糖的抗体显示了在B细胞剥夺实验中的微弱的潜能。只有高 浓度的该抗体才导致来自健康供体的B细胞衰竭。其中未公开如 ADCC和CDC活性的抗体特征。
但是，在体内生产该抗体之后，在本研究中出现的大多数N-聚糖 结构在接下来的步骤中在体外通过利用特定酶加工达到最后的N-聚 糖模式(Li et al., Nat Biotechnol， doi: 10.1038/nbtll78 (2006))。
US 6,602,684叙述了通过修饰复合物聚糖结构，如经GnTIII修饰 的对切N-联聚糖结构提高抗体的效应子功能的方法。
WO 2005/000225 A2叙述了抗狂犬病的单克隆抗体。这些抗体是 IgG、 IgA、 IgM、 IgD和IgE类，是在缺乏具有a-l，3-岩藻糖残基的 N-聚糖结构的植物中产生的，且少有过敏原性植物表位。
WO 2004/050838 A2叙迷了在无岩藻糖残基但可含有木糖的植物 中产生了抗单纯疱渗病毒的免疫球蛋白。
WO 01/31045 Al公开物涉及在植物中生产具有类哺乳动物糖结 构的蛋白质的方法。这些植物优选无有活性的岩藻糖基转移酶或木糖 基转移酶。
US 2006/0034829 Al描述了具有通式Man3GlcNAc2的N-聚糖结 构的免疫球蛋白。
US2006/0029604 Al描述了具有通式GlcNac2Man3GlcNac2的N-聚糖结构的免疫球蛋白。这些结构是经p半乳糖酶处理产生的。
WO 01/55434 Al涉及在植物中抑制碳水化合物修饰酶，尤其是GBSS和GnTI。
甚至在对抗体的开发的长期和深入的研究的观察中，仍存在对具 有改进的特征如效应子功能提高的抗体的高度需求。 本发明的目的是提供具有改进特性的抗体。
根据本发明，这一 目的是通过权利要求书要求保护的主题达到的。
发明概述
的抗体制剂，其特征在于，
* 所述抗体或其衍生物或片段包含无岩藻糖和木糖的N-聚糖 结构，且
相比未经修饰的特异于同一抗原的动物抗体制剂，在含有非 特异性动物抗体的至少10%的血清溶液(100%是未稀释的 血清)中的所述制剂的ADCC活性被少抑制至少10%，和/ 或至少90%、优选至少95%、更优选至少99%、最优选至 少100%的经修饰的抗体、其衍生物或片段缺乏C-末端赖氨 酸残基。
已发现，所述治疗性抗体的效应子功能通常受到体液中正常发现 的正常抗体背景的抑制。在天然血清中，高浓度的治疗性IgG(例如， 人IgGl或IgG3 ，或小鼠Ig-G2a )抗体是补偿过量的内源免疫球蛋白 G对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抑制所需要的。人血清具有平 均抗体浓度约11.7mg/ml，其中大部分是IgGl和IgG3 (合起来是 7.7mg/ml)。正常的血清IgG水平是阻碍治疗性IgG抗体与存在于 NK细胞上的低亲和力IgG受体(FcyRIHa，CD16)的结合的。与CD64 一起，这两个Fcy受体是介导ADCC的主要细胞受体。可通过不同的 糖基化结构提高ADCC溶解(例如，WO2006/005367 )。但是，这些 抗体仍可被非特异性血清抗体抑制(Preitner et al" Mol. Immunol. 43， 1183-1193(2003))。惊人的是，现在已发现，具有无岩藻糖和木糖， 尤其是缺乏C-末端赖氨酸，优选无半乳糖的N-聚糖结构的抗体制剂正逐渐对这一抑制有明显程度的抗性。
之所以参照特异于同一抗原的未经修饰的动物(尤其是哺乳动物)
抗体制剂是为助理解，通过使用本发明的抗体可改变该抗体的c-末端
部分的效应子功能。当然，溶解活性(ADCC)还依赖于抗体与其Fc 部分介导的溶解效应子功能(应该考虑为独立的)的靶的亲和力的。 未经修饰的抗体通常具有带有半乳糖，岩藻糖(尤其是(xl，3-岩藻糖) 和/或木糖(尤其是pi，2-木糖)的N-聚糖结构。本发明的经修饰的抗 体和未修饰(即亲本的)抗体优选均为单克隆抗体并且更优选在细胞 表达系统(例如植物细胞)中重组表达(或为重组表达设计的)。
作为比较血清溶液(可例如，稀释到约10%的血清)的替代品， 可使用非特异性抗体的抗体组合物。这样的比较抗体组合物可含有动 物的生理抗体，或它可以是本发明的(修饰)抗体的亲本(未修饰) 的抗体制剂。比较抗体可与血清抗体浓度接近，例如
0.5mg/ml画15mg/ml，优选lmg/ml-5mg/ml，更优选3mg/ml。所述比较 抗体优选是IgGl和IgG3。假设血清中大约的血清IgGl和IgG3水平 为7.7mg/ml， 10%的血清中将是0.77mg/ml的量，40%的血清中将是 3.08mg/ml的IgGl和IgG3。
具有这一抗性的新抗体，以及其衍生物、片段或制剂可在缺失 |51，2-木糖基转移酶和al，3-岩藻糖转移酶的重组细胞(优选植物细胞) 中产生。
所述抗体或其衍生物或片段的N-聚糖结构优选也是无半乳糖的。 缺乏半乳糖可通过在适当的表达系统(如特定植物细胞表达系统)中 表达，或通过用半乳糖苷酶处理，或通过在缺乏1，4半乳糖基转移酶 活性的细胞(例如动物细胞)中表达来实现。
未经修饰的抗体制剂优选与经修饰的抗体或其衍生物或片段具有 相同的抗原亲和力。
在所述制剂中，优选至少90%、优选至少95%、更优选至少99 %、最优选100%的经修饰的抗体、其衍生物或片段中缺乏C-末端赖 氨酸残基，尤其通过重链(通常可含有赖氨酸)总量确定。由于抗体可具有更多潜在含有c-末端赖氨酸的链，可理解，赖氨酸缺乏的量的 百分数是指潜在含有c-末端赖氨酸的所有链。在c-末端赖氨酸存在
的情况下，单克隆抗体是异源的(Lazar et al. ， Rapid Communications in Mass Spectrometry (18)， 3， 239 - 244， 2004 )。惊人的是已发现，含 有定量除去(或不表达)的C-末端赖氨酸的抗体比其他抗体具有明显 有利的效应子功能。本文显示，生理存在的抗体可抑制血清稀释液中 的ADCC。本发明的此实施方案中的所述缺乏C-末端赖氨酸的抗体中 不存在所述抑制效果(或明显降低)。
另外，所述抗体或其衍生物或片段的N-聚糖结构优选选自 GlcNAc2Man3，GkNAc2Man3GlcNAc 或 GlcNAc2Man3GlcNAc2 。 GlcNAc2Man3GlcNAc2结构优选由至少50% 、更优选由至少70%、最 优选至少90%的抗体、其片段或衍生物构成。在其他实施方案中，优 选的结构是GlcNAc2Man3和/或GlcNAc2Man3GlcNAc ， 其中 GlcNAc2Man3和GlcNAc2Man3GlcNAc结构尤其存在于至少30% 、优 选至少50%、更优选至少70%的经修饰的抗体或其衍生物或片段的 N-聚糖结构中。
在制备所述抗体的特别实施方案中，少于50%、优选少于30%、 更优选少于10%的抗体、其衍生物或片段缺乏N-聚糖结构。人IgG 抗体中的与Asn297结合的N-聚糖结构优选存在于大多数所述抗体制剂 中。
虽然抗体可重组地在其他有机体如植物细胞中表达，作为经修饰 的抗体(以及其片段和衍生物)的来源的动物优选是哺乳动物，特别 的实施方案中是人或小鼠，或爬行动物，特别的实施方案中是鳄鱼。
相比特异于同一抗原的未经修饰的动物抗体制剂，在含有该非特 异性动物抗体的至少10%、优选至少40%的血清溶液中的所述制剂的 ADCC活性被少抑制至少10%、尤其优选至少15%、 20%、 25%、 或甚至30%。本发明的抗体具有此对动物体液(例如血清)中发现的 其他抗体的掩蔽效应的罕见的抗性。在非特异性抗体溶液中的所述制 剂的ADCC活性优选被少抑制至少20% 、优选至少30% 。在所述抗体的优选形式中有嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，优
选IgG抗体。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述抗体制剂的优选的特征 是，相比特异于同一抗原的未经修饰的抗体制剂，CDC活性至少降低 10%。在另一个实施方案中，相比特异于同一抗原的未经修饰的动物 抗体制剂，所述制剂的ADCC活性提高至少10倍。
在优选的实施方案中，相比特异于同一抗原的未经修饰的动物抗 体制剂，在含有非特异性动物抗体的至少10%、优选至少40%的血清 溶液中的经修饰的抗体、其衍生物或片段与CD16^，的结合被少抑 制至少10%。
相比特异于同一抗原的未经修饰的动物抗体制剂，在含有非特异 性动物抗体的至少10%、优选至少40%的血清溶液中的经修饰的抗 体、其衍生物或片段的靶的受基因型为任一 CD16^的效应细胞介导 的细胞溶解优选被少抑制至少10%。
在另 一方面，本发明提供了通过在缺乏pi，2-木糖基转移酶和al，3-岩藻糖基转移酶活性的细胞(优选植物细胞)中表达编码抗体、其片 段或衍生物的核酸可得到的抗体制剂。所述抗体制剂优选还具有的特 征是具有上面所述的功能和结构优点。可理解，抗体、其片段或衍生 物可由表达所必需的一种以上的氨基酸链及一种以上的核酸分子(如， 每种链一种)构成。当然， 一种核酸分子(例如，在载体上的)可编 码一种以上的链。
也可优选在半乳糖基转移酶缺陷型细胞中得到所述抗体制剂，所 述细胞优选完全缺乏半乳糖-l-磷酸尿苷酰转移酶或任何半乳糖基转 移酶。
在特定的实施方案中，可在能将1，4键中的半乳糖残基附着于N-聚糖的末端GlcNAc残基的表达系统中得到所述抗体制剂。所述表达 系统可具有天然的半乳糖基转移酶活性，或可进行遗传工程获得特异 的半乳糖基转移酶活性。
优选在具有GnTIII活性的细胞中表达所述抗体制剂，尤其如US6，602，684或WO 99/54342中所公开。GnTIII活性导致进一步提高 了溶解的效应子功能(例如引入对切结构)。例如，用导致比未转染 或未经修饰的细胞有提高的GnTIII的表达的GnTIII基因转染所述细 胞。
本发明另一方面提供了经修饰的抗体或其衍生物或片段，其特征 在于，所述抗体的聚糖结构无岩藻糖和木糖，优选无半乳糖，且N-聚糖结构是 GlcNAc2Man3 ， 或 GlcNAc2Man3GlcNAc 或 GlcNAc2Man3GlcNAc2 。 N-聚糖结构通式优选是 -P-l,4-GlcNAc-p-l，4-GlcNAc-(p-l，4-Man)(a-l，6-Man)(a-l，3-Man)，其 中一个(或两个)a-甘露糖残基可结合另外一个P-l，4-GlcNAc(图4)。 核心糖基化通常是发现于IgG抗体中的Asn297上。
在一个特定的方面，本发明涉及识别Lewis Y抗原，且源自识别 Lewis Y抗原且含有半乳糖，岩藻糖或木糖的亲本(即未经修饰的抗 体)单克隆抗体的单克隆抗体或其衍生物或片段，其中所述单克隆抗 体的聚糖结构无岩藻糖和木糖，也优选无半乳糖，ADCC效应子功能 提高至少IO倍，所述抗体的抗原结合特异性和亲和力与所述未经修饰 的亲本批体相同或相似。对于这一实施方案，任何识别Lewis-Y的抗
体都可用作亲本抗体。
优选的亲本单克隆抗体是含有人化轻链可变区、人轻链恒定区、 人化重链可变区和人重链恒定区的抗体，其中所述人化轻链可变区可 具有如

图1所示的至少部分氨基酸序列，所述人化重链可变区可具有 如图2所示的至少部分氨基酸序列。发明的抗体的氨基酸序列优选与 亲本抗体相同。例如，抗体衍生物可以是EP 0 528 767中的嵌合抗体 之一。在特别的实施方案中，所述抗体衍生物是单链抗体(SCA)。 SCA是例如US4， 946,778中公开的。相比由相同的DNA编码，但在 动物(例如哺乳动物)宿主中表达的未修饰亲本抗体，本发明的抗体 可显示出相同或相似的装配，折叠，特异性和二价体，优选不显示更
高程度的降解或聚集。
所述抗体衍生物可选自重组抗体或人工抗体，包括单链抗体，抗体，尤其是来自动物的人源化抗体。尤其优选来自骆驼或爬行动物(如 鳄鱼)的抗体，它们对人有最小程度的抗原性。所述抗体片段可包含
或选自抗体的恒定和/或可变部分，尤其选自Fc、类Fc、 Fv、 Fab、 F(ab)2、 Fab，、 F(ab，)2、 scFv、 scfc、 VHH。所述抗体片段最优选是具 有本发明的糖基化结构的类Fc或Fc片段。
所述亲本抗体的临床效果与人IgGl分子的Fc部分的生物学活性 相关，是由其诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC )的效率决定的。ADCC 功能依赖于与粒细胞和单核细胞上的FqRIII相互作用的Fc部分的糖 基化作用(Lifely et al'， 1995， Glycobiology， 5(8)， 813-822 )。
相比所述亲本抗体的ADCC活性，即相比所述特异于同一抗原的 未经修饰的抗体制剂，本发明的抗体和/或制剂的ADCC效应子功能 提高至少5倍、优选至少10倍、更优选至少20倍、甚至至少30倍、 再更优选至少40倍、最优选甚至提高50倍。ADCC效应子功能最好 地由表达抗体所抗的抗原的细胞的细胞溶解(溶解的EC50值)决定。 已知抗体通常能抗的抗原化合物(例如，任何蛋白质、糖蛋白、核酸 等)。所述抗原可具有一个表位或一个以上的表位。所述抗体优选直 接抗如在单克隆抗体中的相同表位。
在细胞溶解实验中，利用具有靶抗原的细胞可测量相比亲本抗体 的本发明抗体的ADCC溶解活性。在抗Lewis-Y抗原的抗体的情况中， 可将Lewis-Y阳性靶癌细胞系(例如SKBR5、 SKBR3、 LoVo、 MCF7、 OVCAR3和Kato III)用作耙。
效应子细胞介导的肿瘤细胞溶解可强烈依赖于效应子细胞上的免 疫球蛋白Fc区和Fc受体之间的相互作用。已有报道，NK细胞上表 达的CD16受体根据其基因型，以不同的亲和力与IgG结合(Niwaet al., Cancer Res 64， 2127-2133 )。所以，分析了 PBMC供体的CD16 基因型，发现只有约50% (10中5)表达高亲和力基因型(CD16,s8v,v)。 用这样的PBMC供体进行的ADCC实验显示，相比表达低亲和力受 体(CD16158F/F)的NK细胞，亲本抗体制剂和本发明的抗体有强烈增 强的溶解活性。对Ovcar-3细胞的并列比较表明，本发明的抗体的溶解潜能增强了约40倍，不依赖于所选CD16表现型。
本发明的抗体可以是鼠抗体，嵌合抗体，人抗体或人源化抗体，所述抗体优选是人源化抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是IgG或其片段或衍生物，优选是IgGl或其片段或衍生物。在另一实施方案中，本发明的抗体是包括相当于人IgG的Fc区的区域的融合蛋白。
因此，在一方面，本发明也涉及在药物可接受载体或稀释液中含有本发明的抗体的药物制剂。
另外，本发明涉及所述抗体作为药物的用途。
所述药物可用作预防和/或治疗性处理的药剂，分别用于减弱或抑制患者的肿瘤细胞的生长，尤其是固体癌症的治疗，例如用于已转移的肿瘤或上皮来源的弥漫性肿瘤细胞的治疗。另外，本发明的抗体可用于治疗最少残留疾病。
本发明的抗体在给定的浓度能溶解较宽范围抗原密度的靶细胞。这一现象可能在肿瘤的治疗中有关联，尤其是因为靶抗原密度在上皮肿瘤上不能认为是恒定的，并且在初级肿瘤中和在衍生的转移肿瘤上可能是不同的。总之，由糖最佳化生产菌株表达的有活性的治疗抗体(如藓类生产抗体IGN314)显示出溶解活性增强，并可降低治疗剂量，或在给定浓度溶解较宽范围的不同抗原密度的肿瘤细胞。特别地，低抗原密度的细胞会逃过标准治疗抗体，但可被所述糖工程化抗体靶获且破坏。另外，在所有研究的细胞系上和在显示与CD16158F/F、CD16^v/v表现型都有较高亲和力的两个CD16,s8表现型上，糖最佳化抗体显示出较低的EC50值。这一较强的相互作用降低了 EC50浓度，并且降低了启动两个表现型的靶细胞溶解必需的阈值浓度。这一现象尤其对当用经典的抗体制剂治疗时将需要较高的抗体浓度才得到同样的治疗效果的具有低亲和力表现型的患者有治疗益处。
在本发明的另 一方面，提供了用于制备抗体或抗体混合物的方法，其中抗体是在缺乏pi，2-木糖基转移酶和al，3-岩藻糖基转移酶活性，优选完全缺乏pi，2-木糖基转移酶和al，3-岩藻糖基转移酶活性的细胞(优选植物细胞)中表达的，以及所述抗体可通过所述表达得到。例如，可用至少一个含有编码抗体链的核酸的载体转化细胞或植物细胞，再扩增所述细胞，并用于生产所述经修饰的抗体。
所述细胞还优选缺乏1，4半乳糖基转移酶活性的。在优选的实施方案中，所述用于表达抗体、其片段或衍生物的编码抗体、其片段或衍生物的DNA缺乏C-末端赖氨酸的密码子。
在其他实施方案中，优选利用羧肽酶(例如羧肽酶B)或在体内通过选择适当的细胞培养条件，优选通过选择动物细胞表达系统除去抗体、片段或衍生物的C-末端赖氨酸。优选在BY2细胞、胡萝卜细胞、酵母(例如，毕赤酵母或酵母)、纤毛虫、藻类或昆虫细胞中表达。
附图简述
图1:靶定Lewis Y的单克隆抗体IGN314的人化轻链可变区的序列。
图2:靶定Lewis Y的单克隆抗体IGN314的人化重链可变区的序列。序列1或2都可使用。
图3:纯化抗体IGN314的特征
(a) 纯化的IGN314与亲本抗体IGN311的比较银染SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。IGN311是人化的单克隆IgG抗-Lewis Y抗体。在非还原条件下(左)，两个样品都准确地显示了相同的蛋白质带，落在约150kDa的范围内，对应于完整的，准确组装的IgG的预期分子量。(-)同时纯化的模拟转化的培养上清液。在还原条件下(右)，可检测到约50和25kDa的唯一的蛋白质带，分别对应于IgG重链和轻链。
(b) IGN314的大小排阻HPLC分析。将滞留时间8，6min时洗脱为尖峰的表达产物鉴定为IgG。在更短的滞留时间7J和7"min出现低丰度(低于10% )的不能完全分辨的峰，可能对应于少量聚集抗体结构，如IgG多体。
(c) 通过抗独特型夹心ELISA (Runs检测)检测结合抗原的活性而证明IGN314的特异性。在图象上显示了与IGN311对比的稀释曲线。利用S型四参数拟合法绘制拟合曲线(拟合度R2>0.99)。图4: IGN311和IGN314的N糖基化
给出了通过质镨分析得到的各聚糖的结构表。通过HPLC分离从抗体IGN311 (亲本)和IGN314 (糖修饰)的重链的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条带得到的经胰蛋白酶消化的肽，并且用电喷射离子化质谱分析法分析。相对于序列TKPREEQYN297STYR (具有一个未使用的经胰蛋白酶溶解的位点)或EEQYN297STYR的糖肽的检测到的质量计算多糖质量。从各自的质量增长量演绎聚糖结构。GlcNAc-N-乙酰基葡糖胺，Man-甘露糖，Fuc-1，6连接的岩藻糖，和Gal=l，4连接的半乳糖残基。GlcNAc残基可附着于两个天线中的一个。GlcNAc残基可附着于两个天线中的一个。Fuc残基附着于近侧的GlcNAc残基。
图5:人IgGl-Fc的结构和与FcyRIII ( CD16 )的相互作用。A组IgG抗体的一般结构。小鼠IgG2a抗体通过Harris等人20(Brookhaven蛋白质数据库编码1IGT)结晶。两条重链分别显示黑色和淡蓝色。两条轻链分别显示绿色和黄色。在红色中，显示了附着于重链的Asn297的碳水化合物成分。B组人IgGl-Fc与Fc/RHI(CD16)的相互作用。结晶该复合物并公开在Brookhaven蛋白质数据库编码1T89。两条重链成分分别以淡蓝和紫色显示人Fc (包括CH1和CH2)的带状模型。附着于细胞表面(灰色盒子)的CD16的细胞外区显示绿色。不连续的线表示了两个CD16作为信号感受态分子或作为GPI连接的(非信号感受态)分子存在。在糖工程化IGN311变体中不存在的岩藻糖残基的位置划了圆圏(橘色)。
图6:通过亲本抗体IGN311 (灰线)和藓类来源的脱岩藻糖基化变体IGN314 (黑线)介导的人PBMC的ADCC介导的肿瘤细胞溶解的比较人血清对不同血清基质中的抗体介导的细胞溶解(ADCC)的影响。用恒定基质(分别10%FCS或40 % NHS )中的RPMI 1640稀释样品，并且在三份中测定人PBMC的ADCC介导的SK-BR-3紳瘤细胞的溶解。用四参数S型配合拟合数据(在所有情况中，适合度R2>0.92)。评估溶解潜能，EQ。为:在10%的FCS中，对亲本IGN311野生型和糖修饰IGN314分别为0.301ng/ml ( 95%CI:0.169-0.537 )和0.052pg/ml ( 95%CI:0.028-0.094 )，和在40 % NHS中，对亲本IGN311和糖修饰的IGN314分另'J 1.558ng/ml ( 95%CI:0.989-2.457 )和0.126ng/ml ( 95%CI:0.065-0.244 )。
图7: (A)IGN311， IGN314和人多克隆IgG的C-末端抗体肽SLSLSPG的C18层析图。(B ) IGN311的C-末端抗体肽SLSLSPGK的C18层析图；在样品IGN314和人多克隆IgG中无检测到SLSLSPGK。
发明详述
本发明所用的术语通常是本技术领域所使用的，除非另外如下定义。
术语抗体包括抗体或其抗体衍生物或片段并且这些抗体的说明书也应用于本发明的抗体制备。在这些抗体片段中，抗体的功能等当物或同源物包括含有免疫球蛋白结合区的任何多体或模拟这一结合区以及Fc区或与Fc区同源的区或至少其一部分的肽。含有与另一个多体融合的免疫球蛋白结合区或等当物的嵌合分子包括在内。
作为例子，抗体分子是完整的免疫球蛋白分子和含有包括已知为Fab、 Fab，、 F ( ab， ) 2、 Fc和F ( v )以及N-聚糖结构这些部分的抗原互补位的免疫球蛋白的那些部分。
惊人地，已发现，在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体的药物动力学提高。抗体分子上缺乏末端半乳糖残基可减少网状的内皮系统的细胞(如肝中的肝巨噬细胞)对所述的抗体分子的不需要的吸收以及经由肝细胞中脱唾液酸糖受体的吸收。这可导致抗体更少的不需要的副作用和提高的药物动力学以及增长的半衰期，导致针对表达耙细胞的抗原(例如，Lewis Y、 CD20、 Ep-CAM、 HER-2、 Erbl受体，Erb2受体)的循环抗体的有效浓度延长和更长的效应子功能。
如本文所用，本发明的抗体可在包括任何种类的可修改以表达该抗体的细胞系统的宿主细胞中表达。在本发明的范围内，术语"细胞，，指表达本发明的糖基化抗体的个别细胞，组织，器官，昆虫细胞，鸟类细胞，爬行动物细胞，哺乳动物细胞，杂交瘤细胞，初级细胞，传代细胞系，干细胞和/或遗传工程细胞，如重组细胞的培养物。
用于重组表达本发明的抗体的细胞系统可是任何细胞，组织，来
自动物王国，例如转基因山羊的有机体，CHO细胞，昆虫细胞，人细胞系。
优选，细胞是动物细胞，例如BSC-1细胞，LLC-MK细胞，CV-1细胞，CHO细胞，COS细胞，小鼠细胞，人细胞，HeLa细胞，293细胞，VERO细胞，MDBK细胞，MDCK细胞，MDOK细胞，CRFK细胞，RAF细胞，TCMK细胞，LLC-PK细胞，PK15细胞，WI-38细胞，MRC-5细胞，T-FLY细胞，BHK细胞，SP2/0， NS0细胞或它们的衍生物。
可替换地，细胞，组织，有机体也可来自真菌王国，或植物王国如酵母，烟草，水稻，苜蓿或玉米。可替换地，苜藓植物细胞可选自例i口 Physcomitrella、 Funaria， Sphagnum 、 Ceratodon、 Marchantia和Sphaerocarpos。例如苔藓植物细胞是WO04/057002中所用的Physcomitrella园片。
可替换地，可使用具有功能异常或无核心岩藻糖基转移酶和/或功能异常或无木糖基转移酶，和/或功能异常或无1、 4-半乳糖基转移喊的表达系统。
可替换地，可通过用除去残基的酶除去本发明的抗体中的半乳糖，岩藻糖和/或木糖。可使用本领域已知的导致从N-聚糖释放半乳糖，岩藻糖和/或木糖残基的任何酶，例如，a-半乳糖苷酶，p-木糖苷酶，a-岩藻糖苷酶。
或者，可使用，合成不能用作l、 3岩藻糖基转移酶和/或1、 2木糖基转移酶，和/或l、 4半乳糖基转移酶的底物的经修饰的N-聚糖的表达系统。
或者，可使用，协同表达负责C-末端赖氨酸残基的溶解的碱性羧肽酶的表达系统，导致溶解速度提高。
或者，使用含有靶向最佳定位的碱性羧肽酶的表达系统，达到增
进c-末端赖氨酸残基的溶解。
或者，可利用缺乏编码重链的核酸上的c-末端赖氨酸的密码子的 载体构建体达到除去c-末端赖氨酸残基。
或者，可通过利用具有需要的碱性羧肽酶活性的酶体内加工除去 c-末端赖氨酸残基。
根据本发明，通过将与c-末端需要的溶解相关的细胞，组织或有 机体的培养条件最佳化可改进c-末端赖氨酸残基的溶解。
本文所用的术语抗体依赖性细胞毒性(ADCC )指，通过将抗体 的Fc区与效应子细胞如杀伤细胞，天然杀伤细胞，被激活的巨噬细胞 或诸如此类的表面上存在的Fc受体结合，激活效应子细胞损伤胂瘤细 胞或诸如此类的任何活性。
可通过技术人员已知的任何适当方法确定ADCC活性增强的抗 体。实施例中叙述了一个被接受的实验方法。
提高的ADCC可通过在表示特异地溶解半最大量的靶细胞所需 要的抗体浓度的EC50降低的抗体浓度时测量的溶解潜能提高来测 定。
术语补体依赖细胞毒性(CDC)定义为结合或激活补体的直接的 细胞毒性。抗体结合它在例如肿瘤细胞的细胞表面上的乾，并且启动 补体系统，已知称为"补体级联"，产生确确实实地在细胞膜内制备洞 的膜侵蚀复合体，引起细胞溶解和死亡。
可通过技术人员已知的任何适当的方法确定CDC活性降低的抗 体。实施例中叙述了一个被接受的实验方法。
可在使半最大量的靶细胞溶解的EC50增高的抗体浓度时确定降 低的CDC活性。本发明的抗体的CDC活性可达到降低10% 、或达到 降低20%、或达到降低30%。在其他实施方案中，CDC活性未改变。
与亲本抗体相比，本发明的抗体与靶抗原例如，Lewis Y抗原， CD20， Ep-CAM或Her-2的结合活性至少80% 、优先地至少90% 、更优先地至少100%。
可能的治疗目的是有效地结合和减少肺瘤细胞，即胂瘤组织或肿 瘤的转移，或特别地是弥漫性肿瘤细胞。血液，骨髄或器官中可检测 的肿瘤细胞或微量转移的数目应该明显减少。转移的形成将延后，它 们的生长至少将慢下来。所以，通过特异的靶向免疫治疗可延长患者 的无复发寿命，所以也是总体的生存时间。
在本发明的使用范围内，尤其是分别减少，或抑制癌症患者中肿 瘤细胞的生长的治疗，也是血液透析是可能的。
根据本发明，含有药物栽体或稀释液中的本发明的抗体的药物制 剂被覆盖了。该制剂可用于制备分别用于降低或抑制患者的肿瘤细胞 的生长的预防性和/或治疗性处理的药物。与特异于同一抗原的未经修
饰的抗体相比，肿瘤细胞生长的减弱至少可提高5%。
含有本发明的抗体的制剂也可用于生产治疗优选内皮来源的固体
癌症或极微的疾病残留的药物。
本发明的抗体可用于被动免疫治疗。
同时提供的是本发明的抗体或它们的制剂用于筛选方法(优选在 体外)，包括提供患者，优选是人的样品，并且检测这些抗体与样品 中的抗原的结合事件的用途。相似地，提供的篩选方法包括提供患者 (例如人)的样品，把该样品与抗体接触，检测结合事件。有了这一 方法，就可鉴定可用本发明的抗体治疗的患者。同时，可鉴定治疗特 定疾病或患者的最佳抗体/制剂。同时提供的是诊断特定疾病的方法， 包括提供患者(可能患病)的样品，将该样品与特异于该疾病的特征 性抗原的本发明的抗体接触，检测样品中抗体与抗原的结合事件，如 果检测到结合事件诊断该疾病。
对于完全结合肿瘤细胞的特异受体(经修饰的抗体/制剂的抗原)， 通常的给药剂量每病人至少lmg/剂量，优选至少10mg/剂量，最优选 至少50mg/剂量。最大剂量将取决于最好地耐受的抗体，人源化抗体， 和人抗体的可耐受性。剂量高达每患者lg或在某些情况中高达2g的， 治 疗可能非常好地有利。惊人地i在本发明中已显示，由于ADCC活性提高，当用于治疗 和/或预防目的时抗体的量可能减少，即使剂量减少，仍产生正的治疗 效果。由于ADCC效应子功能增强，与亲本抗体的剂量方案相比，所 用的抗体的量可至少减少10%、优选至少20%、更优选至少30。/o、 再更优选至少40%、最优选至少50%。
根据所用抗体的半衰期，通常是在3-30天的范围内，治疗优选在 一定的时间间隔中重复。通过特别地衍生化抗体，将半衰期提高到几 个月是可能的，从而延长治疗间隔。
根据本发明所用的药物优选提供在适当的配方中。优选这样的配 方含有药物可接受的载体。后者包括例如，辅助试剂，緩冲液，盐和 防腐剂。优选提供准备好使用的浸剂溶液。由于抗体是相对稳定的， 基于抗体或它们的衍生物的药物具有基本的优点，它们能作为储存稳 定的溶液或作为准备好使用的形式的配方投放市场。前者优选是冷藏 拒温度到室温中的稳定储存配方。但是，根据本发明使用的药物也可 提供为冷冻或冻干形式，可在需要时冻融或再构成。
该药物的活性物质的浓度将取决于其可耐受性。基于人源化抗体 的特别好耐受的制剂可高浓度地，不进一步稀释直接对患者给药。在 优选的浓度范围0.1%-10%，优选1%-5%中，保持低的给药体积和相 应的注入时间是可能的。
通常，该药物将静脉内给药，但是，同样地也可选择另一个肠胃 外或粘膜的给药方式，将活性物质在肿瘤或转移的位点系统地或局部 地应用。
实施例
下面的实施例将更详细地但不限制地解释本发明。 实施例1:材料和方法 哺乳动物细胞系和藓类生产菌林
肿瘤细胞系TF-l( Kitamura、 T.等人，细胞生理杂志140， 323-334 (1989) ) ， Ovcar画3 (Hamilton、 T.C.等人，癌症研究43， 5379-5389(1983 ) ) ， SK-BR-3 ( Trempe、 G丄.、癌症研究最新结果57， 33-41 (1976))是从美国典型培养物收藏中心(Manassas、 CA)购买的。 利用lng/ml-100吗/ml的系列稀释中的人化的，Lewis Y特异抗体 IGN311，经由FACS分析测定粑抗原的密度(Lewis Y)。在10jig/ml 时测得的平均荧光强度(MFI)据报道可用于进一步的分析。
按照Koprivova、 A.等人(植物生物技术杂志2， 517曙523( 2004 ))、 使用Phys画itrella圆片(Hedw.) B.S.G.Axyl曙t/Muc-t双敲除系。为 了产生藓类原生质体，如已有的叙述(Hohe、 A.和Reski、 R.、植物 科学163， 69-74( 2002 ))，在光生物反应器中培养选定的Axyl-t/Muc-t 双敲除系。
生产重组抗体
利用包括中空纤维生产过程和包括蛋白质A捕获步骤的经典的降 低流过程的FCS,在SP2.0细胞中表达临床级的IGN311对照抗体。
Axyl-t/Afuc-t双敲除藓类表达的，糖工程化IGN311变体称为 IGN314。 IGN311重和轻链的编码区-除了它们各自的信号肽-被PCR 扩增(pfu聚合酶)和钝克隆进设计为利用植物信号肽分泌对应的基 因产物的藓类表达载体p127( Gorr、 G.和Jost、 W.，生物加工杂志4, 26-30 ( 2005) , Weise等人，应用孩丈生物生物技术70， 337-345 ))。 通过限制消化和测序检定了得到的构建体(分别是pl27-IGN-HC和 pl27-IGN-LC)。如Jost等人，现代遗传学47, 111-120 ( 2005)中 已有的叙述，同时使用45fig的两个构建体中的进行藓类原生质体的 转化，其中有如下的修改使用三倍的原生质体数和6倍的PEG溶液 量(加到原生质体/DNA混合物中，接着12分钟的温育)，和标准培 养基(3M;480mOsm;Jost、 W.等人、现代遗传学47， 111-120(2005))。 因为在标准培养基中产生的IgG效价相当低，所以在不同的8天中， 在总共167次转化作用中质量生产是在最佳化的培养基条件(标准培 养基与W5培养基的1:1混合物，Baur、 A.等人，生物技术杂志119， 332-342 ( 2005))下进行的。用0.01% (w/v) BSA补充所有培养基。 在转化后，将生产细胞保持在400nl培养基中，随后，每周用新鲜，其他相同的培养基替代300nl的培养基。模拟转化可作为(非和共纯 化)阴性对照。每周，将一天进行的所有转化的上清液合并，并且通 过直接加载到平衡过的lml的HiTrap蛋白质A柱(Amersham )上 纯化。通过抗独特型夹心ELISA和银染SDS-PAGE分析粗培养上清 液以及纯化的抗体。
为了生产稳定转化的植物，如已有的叙述(Jost等人，现代遗传 学47， 111-120 ( 2005 ))进行PEG-介导的直接DNA转移。该DNA 是通过用限制酶Xho I、 HindIII和Seal消化pl27-IGN-HC和 pl27-IGN-LC制备的。通过凝胶电泳，切下，和从凝胶基质中洗脱分 离相对于Xhol/Hindlll消化的，含有表达促进序列，与植物信号肽融 合的轻链或重链的编码肽和终止信号的DNA带。从Axyl-t/Afuc-t双 敲除系分离和用5fig已线性化和已洗脱的DNA构建体中的共转化原 生质体。在转化过程和随后的稀释和洗涤步骤之后，将原生质体在再 生培养基(含有6%葡萄糖，和3.6%的甘露醇的Knop培养基， pH5.6、 580mOsm)中，以5jimo1 m-2s-l温育过夜，接着以40-50nmol m-2s-l光温育7-10天。
用抗独特型夹心ELISA筛选抗体生产来分离含有两种构建体和 生产组装的IGN314的转基因系。在Knop培养基中进一步培养已鉴 定的转基因系。
确定N-联寡糖分布图
如Kolarich 、 D.和Altmann 、 Anal Biochem 285 、 64-75 ( 2000 ) 中所述通过还原SDS-PAGE分离样品IGN311和IGN314的重链。如 Kolarich、 D.出处同上所述切下考马斯染色带，脱色，脲基曱基化， 用胰蛋白酶消化和从凝胶片段中提取。在Speed Vac concentrator中 将提取物干燥，用含有0.1%甲酸的水重构。在装备标准电喷射元件， Cap-LC系统(水微质量)和10 口溶剂开关组件(Rheodyne)的Q-TOF Ultima Global进行质傳分析。首先通过Aquasil C18 precolumn (30x0.32mm、热电子)，利用水作为溶剂捕获样品。在溶剂转换之 前将分析柱保持在5%乙腈中，然后，以2jd/min的流速施加5-50%的线性梯度。所有洗脱物含有0.1%的甲酸。用倍[Glull-血纤肽B,以 串联MS方式进行TOF分析仪的质量调整。以MS方式分析样品。因 为进行了 MS和串联MS之间的无转换，特别地对糖肽的分析，无信 号丢失。用MassLynx4.0 SP4软件(水微质量)进行数据分析。 分析方法
根据制造商的说明，利用NuPAGE4-12。/。双Tris凝胶上的Novex 电泳系统(Invitrogen)，通过SDS-PAGE分析纯化的表达产物的完 整性，分子量和潜在的降解产物。凝胶被银染了 (SilverQuest;Invitrogen )。进行大小排阻HPLC，分析抗体的纯度， 完整性和潜在的降解。利用在Dionex HPLC系统中的ZORBAX G-250 (Agilent-技术)柱分析样品。为了分解潜在的集合物，和为了抑制潜 在的沉淀，将含有10 0/。乙腈(CH3CN)的220mM NaH2P04 ( pH=7.0 ) 用作流动緩冲液(流速lml/min)。在214nm和280nm在线检测流出 物。通过峰整合，在多克隆人IgG (Pentaglobin 、 Biotest)上的标准 化计算产物浓度。
根据制造商的说明，利用市场可得到的LAL检测试剂盒(Charles River实验室)确定内毒素的浓度。
在FACS-CALIBUR仪器(Becton Dickinson )上收集流动细胞计 量术数据。利用人Lewis-Y特异抗体IGN311，在浓度范围 100ng/ml-1.6ng/ml，定量研究的细胞系上的抗原表达。在10mg/ml进 行评估。
确定结合特异性
在用单克隆抗独特型抗体MMA383包被的微滴孔中，温育系列 稀释(100pg-ljig/ml)的抗体样品，在特异的夹心ELISA中分析表达 产物的结合活性(Perkins、M.等人，药物研究17， 1110-1117( 2000 ))。 在用5 % FCS封闭和洗涤后，通过与特异于人IgG 、 IgM和IgA( Zymed 、 CA)的山羊-免疫球蛋白过氧化物酶缀合物反应和用邻苯二胺/过氧化 氬染色测定结合的表达产物。将光密度(492nm )对抗体浓度(ng/ml) 的对数做图，利用GraphPad Prism 4软件，利用S型4参数配合拟合。计算EC50值，用于定量。
测定补体依赖细胞毒性(CDC )
利用Lewis Y-阳性SK-BR-3胸癌细胞系作为耙，在510-释放测 试实验中，以三份测定补体介导的细胞溶解活性。将靶细胞用lOOjiCi 的"Cr温育一小时，用培养基洗涤两次，以每孔20xl()S个细胞的密度， 以及待分析的样品的系列稀释(72ng-75jig/ml)和来自志愿者供体的 补体活性血清一起平铺在96孔的微滴板中。在C02温育器中，在37。C 温育平板l小时。收集上清液，计算释放的51Cr ("Cs")。在温育各 自含有单独的培养基和含有去垢剂(SDS)的代表样品后，测定自发 释放("Sr，，)和最大释放("Mr")的值。通过通式100x ( Cs-Sr ) / (Mr-Sr)计算补体介导的细胞毒性作为细胞溶解的百分数，对抗体 浓度(ng/ml)的对数画图，利用GraphPad Prism 4软件，利用S型 四参数配合拟合。计算EC50值，用于定量。将阴性溶解数据的样品 设定为0%。
测定抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
利用各种Lewis Y-阳性癌细胞系作为靶细胞(SK-BR-3、 TF-1、 Kato-III和Ovcar3 )，在51Cr释放测试实验中以三份测定ADCC。 将耙细胞与100nCi的51Cr温育1小时，洗涤，以每孔25xl(^个细胞 的密度铺在96孔微滴板中。结果物或细胞(来自健康的志愿者供体的 PBMC)是新鲜制备的，加到靶细胞中，直到E: T比例为40: 1，同 时加入待分析的抗体的系列稀释液(100pg-10pg/ml)。在C02温育器 中，在37。C温育16小时后，收集细胞上清液，计算释放的MCr( "Cs")。 在温育各自含有单独的培养基和去垢剂(SDS)的代表样品后，测定 自发释放("Sr，，)和最大释放("Mr")值。通过公式100X ( Cs-Sr ) /(Mr-Sr)计算细胞毒性为细胞溶解的百分数。将细胞毒性百分数对 抗体浓度(ng/ml)的对数画图，用GraphPad Prism 4软件，利用S 型四参数配合拟合。计算EC50值，用于定量。
PBMC供体的CD16基因型
通过从Koene、 H.R.等人，血液90, 1109-1114 ( 1997 )所述的方法稍微修改的基于PCR的等位基因特异限制分析实验分析CD16 ( Fc yRHIa) -158V/F)多态现象。 结果表达和鉴定IGN314
用重链和轻链表达构建体(pl27-IGN-HC、 pl27-IGN-LC)瞬时 转染藓类Axyl-t/Afuc-t原生质体，通过抗独特型夹心酶联免疫吸收测 试实验(ELISA)，每周估计培养上清液的集合物中的IgGl效价。 在标准培养条件下，发现IgGl效价相对低(0.1-0.5fig/ml)。但是， 在最佳化培养基条件下，IGN314分泌明显提高时期超过3个月。具 体地说，这在总共进行的167次转化中，在14个星期内产生了 3.8mglGN314 (总体平均6.1jig/ml)，而在样品收获5星期后已得 到2.0mg。发现粗培养物上清液的银染十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙 烯酰胺凝胶-除了藓类培养物中的污染蛋白质的一般性低背景-无对应 于蛋白质水解加工的或损伤的重链或轻链或更小的抗体片段的补充 带，证明完整的IgGl组装速度很高。合并培养上清液，进行蛋白质A 纯化，为了测定抗原结合特异性，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)，大小排阻高效液相层析(HPLC)，以及抗独特型夹心 ELISA中分析纯化的IGN314。结果给出在图3中，证明了与IgGl 组装相关的IGN314完整性，纯度和耙抗原亲和性。另外，进行重链 和轻链的肽图镨定位，在两个情况中都证实了植物信号肽以及IGN311 和IGN314的相同的初始氨基酸序列有准确的切割-包括除去两个重链 中的C-末端赖氨酸。
液体层析质量光谱分析仪(LC-MS )分析发现IGN311和IGN314 重链分别有不同的N糖基化图谱(图4)。最值得注意的是，这些样 品的核心岩藻糖基化的量，终端半乳糖基化和整体糖基化的程度是不 同的。正如可对哺乳动物宿主细胞中表达的IgG分子可预期的， IGN311差不多完全岩藻糖基化了，并且含有基本程度的终端半乳糖 基化。在这一研究中利用的糖工程化藓类菌林生产的IGN314的情况 中，未检测到含有半乳糖-或岩藻糖的聚糖结构，小量的IGN314 N-聚糖终端有甘露糖。与IGN311相反，IGN314含有相当量的非糖基化重链，而IGN311完全糖基化。两个样品中不含木糖残基。 效应子功能
比较糖工程化IGN314与IGN311的溶解潜能，并且试图覆盖可 能在癌症免疫治疗中出现的生物多样性方面。这一多样性涉及耙和效 应子细胞两者，因为在各个胂瘤靶细胞上表达的耙抗原密度不同，并 且由于遗传多态现象影响氨基酸位置158 (CD16158V/F)，患者中发现 与天然杀伤(NK)效应子细胞上表达的CD16受体的不同的等位基因 相关的IgG亲和性不同。所以，我们在一方面分析了以不同密度表达 膜Lewis Y抗原的三个不同的肿瘤细胞系(Ovcar-3、 SK-BR-3和 TF-1)。在ADCC实验之前，通过荧光辅助细胞分拣(FACS)分析 这些耙细胞系的Lewis Y密度。Ovcar-3显示最高的抗原密度，接着 是SK-BR-3和TF-1 (平均荧光强度值参见表l)。在另一方面，为了 利用确定的效应子细胞制剂，分析了外周血液单核细胞(PBMC)的 CD16^多态现象，发现约50% (10中5)表达了高亲和力CD161S8V/V 表现型(无显示)。对所有的ADCC测试都制备了来自两个表现型， 即158v/y和158f,f的供体的PBMC制剂。在测定之前证明所有样品都 无内毒素。同时也研究了模拟转化的纯化的培养上清液，无显示任何 与背景不同的溶解活性。表i概括了 ADCC实验的结果(计算的50 %有效浓度(EC50 )值)。对IGN314测定的EC50值比IGN311明 显更低，意味着与亲本抗体IGN311相比，IGN314的细胞的细胞毒性 介导的溶解潜能增强7-40倍。另外，对两个抗体都观察了靶细胞上的 Lewis Y密度和EC50浓度之间的倒置相关性。与具有低Lewis Y靶抗 原密度的细胞系(TF-1)相比，靶抗原密度升高的细胞系(Ovcar-3) 诱导同样的溶解需要的抗体浓度低得多。在具有中度抗原密度的细胞 系(SK-BR-3)上测定的EC50值，如预期的，在对高和低抗原密度 的细胞系计算的那些之间。
在CD16表现型水平，从高亲和力受体供体(158wv)制备的效应 子细胞显示比，从与IgG的亲和力据报道较低的158f,f供体中得到的 细胞溶解活性更高(Shields、 R.等人，生物化学杂志277， 267"-26740(2002) ; Niwa、 R.等人，临床癌症研究10， 6248-6255 (2004))。 在Ovcar-3靶细胞上，利用从CD16!5swv供体派生的PBMC，在溶解 实验中对两个抗体计算的EC50值比利用来自CD16158F/F供体的 PBMC,在相同的设置下得到的值低3倍。总而言之，当与IGN311 比较时，IGN314浓度最大40倍的降低能产生相同的ADCC溶解效应
(EC50) (Ovcar-3、比较表1)。并且这一降低与效应细胞CD16 的表现型(158wv或158F/F)无关。
乾细胞系Le Y密度 (MFI)效应子细 胞CD16158 表现型EC50 IGN311 (ng/ml-l)EC50 IGN3" (ng/ml-l )增强
OVCAR-3435V/V0.315 ± 0. 20.008 ± 0. 00539
OVCAR-3435F/F0. 993 ± 0. 30.025 ± 0. 0140
SK-BR-3213V/V1. 040 ± 0. 10.144 士 0. 027
TF-1109V/V5. 318 ± 3. 20.366 ± 0. 0615
表l:利用两个CD16^表现型的效应子细胞(NK)，比较不同 Lewis Y耙密度的细胞系上的IGN311和IGN314的溶解潜能(MFI: 平均荧光强度；EC50: 50%有效浓度)。
在第二套溶解实验中，利用SK-BR-3靶细胞，将激活补体(CDC) 的IGN314的溶解潜能与IGN311和脱糖基化IGN311的比较。IGN311 显示了预期的溶解曲线(EC50值19.6±1.5ng/ml)，而考虑顶上的值 以及EC50浓度，IGN314的补体介导的溶解活性剧烈降低。脱糖基化 IGN311完全无显示任何溶解活性。
血清效应
在天然的血清中，需要高浓度的治疗性IgGl抗体，由过量的内 源免疫球蛋白G补偿抗体依赖性细胞毒性的抑制。正常的血清IgG水 平正在阻止治疗性IgGl抗体与存在于NK细胞上的低亲和力IgG受 体(CD16)的结合。与CD64 —起，这两个Fq受体是主要的介导 ADCC的细胞受体。克服血清IgG的抑制影响的可能性是应用高量的 治疗性抗体。但是，这一途径耗价高，并且可能与增强的与正常组织的交叉反应，增强的补体激活引起的剂量相关的副作用，严重的第一
剂量副作用，人抗人抗体(HAHA)应答的诱导或免疫复合物的产生 有关。另 一个途径是利用已工程化提高对Fq受体的亲和力的治疗性 抗体。对于抗体与FqrR的结合，共价地附着于抗体重链的CH2区中 的保守Asn297残基的寡糖的存在是必要的(图5，图A )，这暗示了 ， 碳水化合物结构能稳定简化结合的构象。如图5，图B图解，Asn297 定位于受体结合位点的下一个；但是，碳水化合物成分显示取向偏离 界面，与受体有非特异接触。
关于糖基修饰途径，可通过将糖基化从核心岩藻糖基化的典型复 合物类型改变成缺乏这一核心岩藻糖基化的结构来增强抗体的ADCC 活性。通过产生糖基化装置基因的共转染，通过在缺乏特异的糖基化 酶的生产宿主中表达，或通过改变相关的酶的表达可产生这样的脱岩 藻糖基化的抗体。
先前已有展示，与携带特征性核心岩藻糖基化N-联寡糖模式的野 生型抗体相比，缺乏核心岩藻糖残基的Lewis Y特异性人源化抗体 IGN311的糖基工程化变体展示了在Lewis-Y阳性SK-BR-5肿瘤细胞 上有提高29倍的ADCC反应性(WO2004/062556 )。通过将乙酰葡 糖胺基转移酶III基因和IGN311重链和轻链瞬时共转染进人胚肾 -EBV核抗原细胞，通过抗体生产宿主的糖基化机器的遗传工程生成 脱岩藻糖基化IGN311，命名为IGN312。在本发明中，通过在可替换 的糖最佳化植物表达系统中，即pi、 2-木糖基转移酶和al、 3-岩藻糖 基转移酶敲除藓类Physcomitrella圆片中表达重链和轻链的IGN311 基因，显示了 ADCC活性有高达40倍的增加。总而言之，利用两条 途径-岩藻糖基缺陷的哺乳动物和植物表达系统-证实治疗性人化单克 隆抗体IGN314的ADCC潜能有明显的最高，但允许需要的治疗剂量 最小。提高的糖工程化抗体的ADCC活性至少部分是因为Fc部分与 治疗性抗体的ADCC活性的主要作用者效应子细胞，即NK细胞上的 Fc"RIII受体的结合增加。
与内源IgG相比，脱岩藻糖基化IGN314介导的亲和力提高可由
30与效应子细胞上Fqr-RIII受体的结合相关的有利的热动力学行为来解 释。还研究了是否人正常血清(NHS)影响IGN311和脱岩藻糖基化 IGN314分别实现ADCC的能力。首先，我们发现，将IGN311稀释 成正常人血清(NHS)的10%或40%显示比10%的胎牛血清(FCS) 有明显更低的ADCC活性，表明NHS明显降低IGN311的效应子功 能(图6，灰线)。相反，脱岩藻糖基化变体不受NHS影响(图6， 黑线)，另外与FCS以及NHS中野生型IGN311相比有一个有利的 ECs。值。另外，数据表明，治疗性抗体的糖基工程化可补偿内源IgG 介导的体内的抗体依赖性细胞毒性的抑制。
裂解潜能是在EC5():在10。/。FCS中，对亲本IGN311野生型和糖 修饰IG腿4分别0.301jig/ml (95%CI:0.169-0.537)和0.052ng/ml
(95%CI:0.028-0.094 )，和在40%的NHS中，亲本IGN311和糖修 饰IGN314分别为1.558ng/ml ( 95%CI:0.989-2.457)和0.126ng/ml
(95%CI:0.065-0.244 )时评估的。利用GraphPad Prism软件计算EC50 值。
另外，经典的基于抗体的治疗的局限性是效应子细胞上的 Fcy-RIII受体有功能多态现象。在人群中出现频率低的FcyRIII-158v 同工型显示与天然和糖工程化抗体有高亲和力，而占优势的同工型 FcyRIII-158F与糖工程化抗体只有低亲和力。所以，糖工程化在人血 清中溶解效应子功能增强的基础上，剧烈地增加了对被动抗体治疗的 临床应答子的数目。这些数据一起很强烈地暗示，治疗性抗体的糖修 饰预期在人中转化成较多的ADCC活性。
C-末端赖氨酸
血清来源的，以及重组生成的IgGl分子显示了与它们的C，末端 Lys残基的出现相关的微异质性。保守的C-末端Lys残基的(部分) 切割是细胞中的碱性羧肽酶的作用催化的翻译后事件(Lazar等人， 质"i普快报(18) ， 3， 239-244， 2004)。
对于两个C-末端经胰蛋白酶肽变体("SLSLSPGK"和 "SLSLSPG-")相关的人多克隆IgG的分析显示在样品中只存在加工过的变体("SLSLSPG-")。相似地，Lys缺乏变体发现唯一地存在于rAb IGN314 (在藓类细胞中表达)的样品中。与这些结果相反的是，在样 品IGN311中检测到两个肽变体(图7)。
权利要求
1.包含经修饰的抗原特异性动物抗体或其衍生物或片段的抗体制剂，其特征在于，●所述抗体或其衍生物或片段包含无岩藻糖和木糖的N-聚糖结构，且●至少90％、优选至少95％、更优选至少99％、最优选至少100％的所述经修饰的抗体、其衍生物或片段缺乏C-末端赖氨酸残基。
2. 权利要求l的抗体制剂，其特征在于，所述抗体或其衍生物或 片段的N-聚糖结构也无半乳糖。
3. 权利要求1或2的抗体制剂，其特征在于，所述未经修饰的抗 体制剂与所述经修饰的抗体或其衍生物或片段的制剂具有相同的抗原 亲和力。
4. 权利要求l-3中任一项的抗体制剂，其特征在于，相比未经修 饰的特异于同一抗原的动物抗体制剂，在含有非特异性动物抗体的至少 10%的血清溶液中所述制剂的ADCC活性被少抑制至少10%，其中所 述动物优选是哺乳动物。
5. 权利要求1-4中任一项的抗体制剂，其特征在于，所述N-聚糖 结构选 自 GlcNAc2Man3 、 GlcNAc2Man3GlcNAc 或 GlcN Ac2Man3GlcNAc2 。
6. 权利要求1-5中任一项的抗体制剂，其特征在于，所迷ADCC 效应子功能相比未经修饰的动物抗体制剂提高至少5倍、优选至少10 倍、特别优选至少20倍、更优选至少30倍，再更优选至少40倍，最 优选至少50倍，其中所述未经修饰的动物抗体优选特异于同一抗原。
7. 权利要求1-6中任一项的抗体制剂，其特征在于，不到50%、 优选不到30%、更优选不到10%的所述抗体、其衍生物或片段缺乏N-聚糖结构。
8. 权利要求l-7中任一项的抗体制剂，其特征在于，所述动物是哺乳动物，优选是人或骆驼或小鼠。
9. 权利要求1-8中任一项的抗体制剂，其特征在于，相比特异于 同一抗原的未经修饰的动物抗体制剂，在含有非特异性动物抗体的至少 10%、优选至少40%的血清溶液中所述制剂的ADCC活性被少抑制至 少15% 、优选至少20%。
10. 权利要求1-9中任一项的抗体制剂，其特征在于，在非特异性 抗体溶液中所述制剂的ADCC活性被少抑制至少20% 、优选至少30% 。
11. 权利要求1-11中任一项的抗体制剂，其特征在于，所述经修 饰的动物抗体或其衍生物或片段是嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。
12. 权利要求1-11中任一项的抗体制剂，其特征在于，相比特异 于同一抗原的未经修饰的抗体制剂，CDC活性降低至少10%。
13. 权利要求1-12中任一项的抗体制剂，其特征在于，所述制剂 是IgG抗体或其片段或衍生物的制剂。
14. 权利要求1-13中任一项的抗体制剂，其特征在于，所述制剂 是单克隆抗体、其片段或衍生物的制剂。
15. 权利要求1-14中任一项的抗体制剂，其特征在于，相比特异 于同一抗原的未经修饰的动物抗体制剂，在含有非特异性动物抗体的至 少10%、优选至少40%的血清溶液中经修饰的抗体、其衍生物或片段 与CD16^!^的结合被少抑制至少10%。
16. 权利要求1-15中任一项的抗体制剂，其特征在于，相比特异 于同一抗原的未经修饰的动物抗体制剂，在含有非特异性动物抗体的至 少10%、优选至少40%的血清溶液中经修饰的抗体、其衍生物或片段 的靶的受具有任一 CD16is8基因型的效应细胞介导的细胞溶解被少抑制 至少10%。
17. 可通过在缺失p-l、 2-木糖基转移酶和a-l、 3-岩藻糖基转移酶 活性的细胞中表达编码抗体、其片段或衍生物的核酸而得到的抗体制 剂，其中所述细胞优选是植物细胞。
18. 权利要求17的抗体制剂，其特征在于，所述细胞缺失半乳糖 基转移酶。
19. 权利要求17或18的抗体制剂，其特征在于，将所述细胞修饰 为具有GnTIII活性。
20. 权利要求1-19中任一项的抗体制剂，其特征在于，所述制剂 的经修饰的抗体、其衍生物或片段是爬行动物的，优选是聘鱼的。
21. 于药物载体或稀释剂中含有权利要求1-20中任一项的抗体制 剂的药物制剂。
22. 权利要求1-21中任一项的抗体制剂在制备用于为了分别降低 或抑制患者肿瘤细胞生长而进行预防和/或治疗性处理的药剂中的用 途，其中所述患者优选是人或哺乳动物。
23. 权利要求22的制剂的用途，其中相比使用特异于同一抗原的 未经修饰的抗体，肿瘤细胞的生长降低提高至少5%、优选至少10%、 更优选至少20%、再更优选超过30。/。、最优选超过50%。
24. 权利要求1-21中任一项的制剂在制备用于治疗实体癌症的药 剂中的用途。
25. 权利要求24的用途，其用于治疗上皮来源的实体癌症。
26. 权利要求1-21中任一项的制剂在最少残留疾病的治疗中的用途。
27. 权利要求22-26中任一项的用途，用于被动免疫治疗。
28. 权利要求22-27中任一项的用途，其中所述抗体或抗体混合物 的使用剂量为至少lmg/剂、优选至少10mg/剂，更优选至少50mg/剂。
29. 权利要求1-21中任一项的抗体制剂在体外筛选方法中的用途， 所述方法包括提供受试者样品和检测所述抗体与所述样品中的抗原的 结合事件，其中所述受试者优选是人。
30. 制备权利要求1-20中任一项的抗体制剂的方法，其特征在于， 在缺失pi、 2-木糖基转移酶活性和al、 3-岩藻糖基转移酶活性的细胞中 表达所述抗体、片段或衍生物，其中所述细胞优选是植物细胞。
31. 权利要求30的方法，其特征在于，所述细胞缺失l、 4-半乳糖 基转移酶活性。
32. 权利要求30或31的方法，其特征在于，用于表达所迷抗体、片段或衍生物的编码所述抗体、片段或衍生物的DNA缺乏C-末端赖氨 酸的密码子。
33.权利要求30或31的方法，其特征在于，优选通过羧肽酶，或 在体内通过选择适当的细胞培养条件，优选通过选择动物细胞表达系 统，来除去所述抗体、片段或衍生物的所述C-末端赖氨酸。
全文摘要
本发明涉及含有经修饰的抗原特异性动物抗体或其衍生物或片段的抗体制剂，其特征在于抗体或其衍生物或片段包含无岩藻糖和木糖的N-聚糖结构，且至少90％、优选至少95％、更优选至少99％、最优选至少100％的经修饰的抗体、其衍生物或片段缺乏C-末端赖氨酸残基。
文档编号C07K16/28GK101495514SQ200780026174
公开日2009年7月29日 申请日期2007年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者A·内彻斯盖, G·戈尔, M·斯库斯特, R·基歇斯, W·约斯特 申请人:格里革新生物技术有限公司