专利名称：：能调控未折叠蛋白质反应的多形汉森酵母的新基因和使用该基因提高分泌效率的方法
技术领域：
：本发明涉及一个来源于多形汉森酵母CK/w(yww;^fl)能调控未折叠蛋白质反应(UPR)的新基因和使用该基因提高重组蛋白质分泌表达效率的方法，特别是通过识别、修饰和优化HpHACl基因来提高重组蛋白质分泌表达效率的方法，其中//p/WC/基因编码/ofyww7/2"中未折叠蛋白质反应的一个关键调节因子，并阐明了//p/i4a介导的调节机制。
背景技术：
：包括酵母在内的所有真核细胞都有一个叫内质网(ER)的细胞器来负责运送分泌性蛋白质和膜蛋白质。这就是说被运送到细胞外而非细胞质的分泌性蛋白质在核糖体被翻译并立即易位到内质网。在这种分泌途径中，错误折叠的蛋白质被蓄积而产生内质网应激从而活化应激反应机制即UPR,这是为了消除所产生的内质网应激(或者分泌应激)反应。从单核的真核微生物酵母到最高级的真核生物人的所有真核细胞内都发现有UPR。采用2000年(Cell101，249,2000)的传统酵母即酒酿酵母(S.匿v油e)在基因水平上进行了酵母的UPR机理的研究。它证实了UPR的潜在调控和作用机理(Cell107,103，2001;Nature415,92，2002)。酵母的URP最初显示主要受调控转录因子Haclp的调控，Hac/p由S."revWae里的ii4C7基因编码。然而，随后对高等生物URP机理的研究更加地活跃，除了与哺乳动物同系物的Haclp相应的XPB1蛋白质外，还发现了大量的调节因子如ATF6和PERK蛋白质。酵母作为单核的真核微生物和高等的真核生物一样具有相同的细胞器，它们的分泌机制也彼此非常相似。因此，酵母被认为是易于低成本表达人源蛋白质的优良的重组蛋白质表达宿主。在动物细胞表达体系中，具有表达人源复杂糖蛋白质的优势。然而，这个体系的主要缺点是产率低、成本高以及建立细胞系的周期长。此外，病毒和朊病毒感染的风险也成为问题，这是因为动物细胞非常类似于人细胞。相反，酵母是一个更实用的表达系统，它可以在较低成本下容易产出想得到的重组蛋白质并且已经有数千年被人类利用于发酵过程。目前，一些酵母菌抹具有GRAS(公认安全)状态。在各种酵母种属中，传统的酵母S.cerev/w'ae是生物学研究的一个主体并且已将其开发为生产重组蛋白质的宿主。然而，相比较于其他工业用酵母如巴斯德毕赤酵母或者多形汉森酵母，51.c"eWw》e分泌机能活化的有工业用途的蛋白质的能力较低。因此，非酿酒酵母菌逐渐代替51.ce^w'wV^成为分泌表达的宿主。最近，曱基营养型酵母H.polymorpha作为一个具有优良分泌表达重组蛋白质能力的宿主引起了人们很大的兴趣。大量成功使用po(yww7/2a表达体系生产肌醇六磷酸酶(13.5g/L)和医用乙型肝炎疫苗的案例被报道。尤其是，乙肝疫苗大量生产的实现归功于//.pofymo7^a作为生产宿主的经济的优势，以便重组疫苗可以低价供给给许多第三世界国家，从而有助于改善全人类的福利。H.polymorpha已经是国际公认的一个为工业和医疗用途大量生产重组蛋白质的优良宿主体系。因此，使用//.;o/jww7^a生产重组蛋白质技术的发展在生物
技术领域：
被认为非常有益。相应地，在工业和市场领域，也有必要通过提高它表达和分泌重组蛋白质的能力将其H.polymorpha开发成为有效地生产高品质分泌蛋白质包括人源糖蛋白质的宿主体系。在过去的十年里，本发明者已经进行了将H/K^WW^/jfl开发为分泌表达重组蛋白质宿主的基础和应用研究，并在最近开发了一个全基因组微点阵体系来分析Hpo/jwwp/za在基因水平的调控机制。为了提升细胞重塑技术来优化//pofywo^p/za的分泌表达能力，我们分离出一个H/0(yww7^a/i4a基因(i/;/i4C7),它编码在未折叠蛋白质反应中所涉及的一个重要调节转录因子，并开发了它的缺失和过表达菌抹，以便于分析它们的特征。此外，本发明者为了给理解减轻分泌应激的URP机理提供一个基础，对它们进行了微矩阵分析，以及提供了一种优化Hpofymo/7/w的分泌表达能力的方法，因此完成了本发明。
发明内容技术问题本发明的一个目的是提供了一种蛋白质，所述的蛋白质具有增强在减轻分泌应激的反应中所涉及的基因的表达，其中该蛋白质具有SEQIDNO:3表示的氨基酸序列或者具有与其有卯％或更多同源性的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供了编码所述蛋白质的核酸，优选包含SEQIDNO:2或者SEQIDNO:1表示的核酸序列，其中在进行特异于该基因的剪接前SEQIDNO:1是SEQIDNO:2的前体，或SEQIDNO:l的片段。本发明的另一个目的是提供一个重组载体，所述载体包含的核酸所编码的蛋白质具有增强在减轻未折叠蛋白质应激反应中所涉及的基因的表达的能力，其中该蛋白质具有SEQIDNO:3所表示的氨基酸序列或者与其有90%或更多的同源性的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供一个用重组载体转化的大肠杆菌宿主细胞。本发明的另一个目的是提供一个用重组载体转化的//.jwfywowto宿主细胞。本发明的另一个目的是提供含有减少的未折叠蛋白质反应的//.jw(ym07^fl突变抹，它可通过缺失或突变/^/WC/基因而获得，其中////i4C7基因编码一种新的转录因子。该转录因子能增强在减轻未折叠蛋白质应激反应中所涉及的基因的表达。本发明的另一个目的是开发一种显示细胞良好生长的生产宿主，在该宿主里HpHACl基因能持续表达。本发明的另一个目的是提供一种制备生产宿主的方法，该宿主有改善的重组蛋白质分泌表达的能力，其中7fp/"a基因是持续表达或者过表达的。附图简述图1A说明了Hpo/ymor/^a的Z/;/i4C/基因的核酸序列。并且图1B说明了逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析剪接的HpHACl基因以及其图解。RT-PCR的产物通过琼脂糖凝胶电泳根据大小的不同得到分离，通过剪接得到的氨基酸序列大小减小的核酸片段经分析证实具有HAC1的特异性剪接位点，下划线的位置(图1)。由于剪接而改变的剪接前后的每个终止密码子如粗体所示。图2A显示了///wfywor/^a和5".cem;/w'oe/i4。蛋白质的氨基酸序列分析结果。图2B是显示两个酵母菌HAC1蛋白质间具有高度同源性的结构域的图。图3A和B显示了7/./wfywwp/w分泌应激减轻反应URP(未折叠蛋白质反应)诱导条件的探究结果。图3A是基于剪接状态的HpHAClmRNA的条件下的分析结果，图3B是H/w(ywor//z"基因(HpKAR2、HpPDIl、HpEROl)相当于S.cerev/w'ae内的已知的URP靶基因的表达水平变化时的分析结果。野生型的H.polymorpha菌抹被培养到指数生长期，用5ug/ml的衣霉素，5mMDTT(二硫苏糖醇)和BlefddinA的最佳浓度处理30分钟，60分钟和120分钟，收集用于实验。图4是为了删除//.;ofywow^中的HpHACl基因显示的融合PCR和体内DNA重组过程的图。图5A是分析野生型的//./w/jwwp/za和一个//p/￡4C/缺失突变(/7;^acW)林的生长特征的图。在液体培养中，两个菌抹于OD600值为0.1时原始接种，每两小时测量一次OD600值。而且，在两个菌林的指数生长期时培养基连续稀释10倍，分别将每个稀释的样本的2p1滴加到仅加肌醇，同时加入肌醇和衣霉素的基本固体培养基上，再继续培养两天分析它们的生长特征(如图5)。图6是建立一个/^//fld蛋白质过表达的细胞系过程的图。被剪接的HpHAClmRNA通过RT-PCR被扩增，并将其克隆到H户ofymw7/a的表达载体，通过遗传重组技术构建一个pGAP-HpHACls载体。进而，该载体被转化到//./w/少ww7/za菌4朱中制备过表达的菌抹。图7A和B显示的是野生型的//.jwfymor/7/2a和//;^ac/z(突变林在指数生长期(OD600=0.5),通过DNA微点阵实验分析得到的全基因组表达过程和结果的图语。图7A显示的是整个微点阵实验的设计，图7B是比较每个基因表达差异的散点图。图8A和8B显示的是通过两组微点阵实验，得到的被蛋白质(/////(^//7)调控的UPR耙基因的筛选结果。图8A显示的是两组微点阵实验的设计图，图8B显示的是通过微点阵实验筛选得到的被Z/p/i4C/调控的UPR靶基因的数目，其分类依照酵母中分泌表达的功能进行。优选实施方式本发明涉及提高重组蛋白质生产率的细胞重建技术，通过优化被积极地用作宿主用于制备重组蛋白质的//.;w/jwor;^a的蛋白质分泌表达来实现。在所有真核细胞里，被分泌到胞外的蛋白质共翻译转运到内质网，在其中蛋白质进行折叠和修饰。因此，在使用一个过表达启动子或者类似物而分泌大量过表达的重组蛋白质的情况下，过量的重组蛋白质导致内质网应激，这是由于内质网过量承载折叠和修饰中的蛋白质造成的。由于过表达而不恰当的被折叠和修饰的错误蛋白质蓄积在内质网，这将在细胞内产生应激而抑制细胞生长和细胞凋亡。如果不恰当折叠和修饰的错误蛋白质蓄积在内质网，就产生分泌应激，这将激活称为URP(未折叠蛋白质反应)的计数机制来减緩分泌应激。在传统的酵母S.cewWw'ae中，被IRE1(Irelp)编码的膜蛋白质主要识别未正确折6叠的蛋白质，并且其核酸酶被激活从而使得本领域公知的Irelp的唯一底物即HAC1前体mRNA断裂。断裂的HAClmRNA被tRNA连接酶连接，最终，此HAC1特异的剪接导致通过翻译产生活性HAC1蛋白质。本发明鉴定了H;w/少wor/7teDL-1菌抹中的HpHACl基因，它是基于曱基营养型酵母，H/wfywwp/Kz(Levine和Cooney,Appl.Microbiol.,26，982-990)的基因组信息，并发现在分泌应激时该基因同时经历一个HAC1特异地剪接机制。经剪接的和活化地HpHAClmRNA核酸序列被表示为SEQIDNO:2，信使RNA的前体的核酸序列被表示为SEQIDNO:1。在一个实施方案里，本发明提供了一种蛋白质，该蛋白质具有增强URP通路中所涉及的耙基因的表达的能力，其中该蛋白质的氨基酸序列表示为SEQIDNO:3或者与其氨基酸序列具有90%或更多的同源性。一般而言，由于/WC/基因的mRNA的前体具有的二级结构，该结构阻碍了翻译过程，只有通过Irelp的剪接过程才能导致Zi4C7mRNA的翻译。因此//p/foc/;的氨基酸序列由剪接后的核酸序列决定，然后被表达的//p/Zac/p具有转录因子活性以增强URP通路中的一个基因家族的表达。在本发明中公开的具有转录因子活性的的氨基酸序列被表示为SEQIDNO:3。根据本发明，发现H戶fywov^中的转录因子HpHaclp具有SEQIDNO:3表示的氨基酸序列，它是HAC1特异剪接的结果。此外，通过实施例5中描述的微点阵实验，显示该蛋白质能增强URP通路中所涉及的輩巴基因表达。因此，只要蛋白质具有增强URP靶基因表达的活性，那么与HpHaclp有90%同源性的蛋白质或其片段就都包括在本发明中。如本文所用，术语"同源性"涉及与野生型氨基酸序列的相似程度，本发明包含与编码本发明HpHACl蛋白质的氨基酸序列具有优选75%或者更多的同源性的氨基酸序列，更优选85%或者更多，甚至更优选90%或者更多，最优选95%或者更多。同源性的比较通过肉眼或者商业用的序列对比程序进行。商业用的计算机程序能计算两个或者更多序列间的同源性百分比，而且这个同源性百分比可通过相邻序列而计算。如本文所用，术语"URP把基因"表示的是为了减緩内质网中的分泌应激反应使之表达增强的基因，包括在内质网中通过协助蛋白质折叠和修饰来增强分泌效率的基因。优选的，它包含通过实施例5中的微点阵实验而识别的基因家族。在另一个实施方案里，本发明提供了编码所述蛋白质的核酸序列。编码HpHACl蛋白质的核酸优选具有SEQIDNO:1或者2表示的核酸序列。SEQIDNO:1表示非活性的前体mRNA,—旦发生分泌应激，它通过切割和连接，又称为剪接，变为SEQIDNO:2表示的mRNA。本发明者将具有SEQIDNO:2表示的核酸序列的H.polymorpha的HpHACl基因保存在基因库里(储存号码DQ679915),它被翻译成活性蛋白质。此外，制备了包含该基因的重组载体pGAP-HpHACls，将其转化到大肠杆菌DH5a菌抹(E.coli)中并于2006年6月13日储存于KCTC(韩国典型培养中心，韩国生命工学研究院，52,Ueun-dong，Yusung-gu,Daejeon-si，韩国)(保存号KCTC10960BP)。在另一个实施方案里，本发明提供了一个重组载体，所述载体包含编码具有增强URP靶基因表达的转录因子活性的蛋白质的核酸，以及表示为SEQIDNO:3的氨基酸序列或者与其有90%或者更多的同源性氨基酸序列。该重组载体优选包含编码具有增强URP靶基因表达的转录因子活性的蛋白质的核酸序列，以及表示为SEQIDNO:3的氨基酸序列或者与其有90%或者更多的同源性的氨基酸序列。如本文所用的，"载体"是指任何将DNA引入宿主细胞的一般的工具，包括一般的载体如质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体和病毒载体。优选的载体包括基因表达的调控元件如启动子，起始密码子，终止密码子，多聚A信号，增强子，以及用于膜靶向或分泌的信号序列或引导序列，并根据该目的制备了大量的栽体。在另一个实施方案里，本发明提供了重组载体转化的大肠杆菌宿主细胞，优选以保存号KCTC10960BP保存的被转化的宿主细胞。此外，本发明制备了一个经转化的宿主，其中HpHACl蛋白质通过将重组载体引入H/w/>ww7/za而持续表达，该宿主具有改善分泌表达能力的特征，这是由于HpHACl蛋白质的持续表达，通过过表达的URP靶基因而实现的。在另一个实施方案里，本发明提供了被重组载体转化的H;w/_ymorp/7a宿主细胞。本发明制备了一个//./ofywo^/za突变抹(H^ac/4),为了解释緩解Hpofywwp/zfl分泌应激的URP反应机理，其中的Fp/i4C/基因被删除。通过相关领域建立的方法进行了仅特异灭活基因组中輩巴基因的方法，在此没有限制。本发明为了特异地删除//p/MC/基因，釆用了结合PCR方法和体内同源重组的方法。用在HpHACl基因的5'和3'端含有选择性标记物的载体转化H.polymorpha以诱导基因组和载体的同源重组。在另一个实施方案里，本发明提供了一个UPR减少的H.polymorpha突变抹，其中HpHACl基因被删除或发生突变。当依照本发明构建的HphaclA菌林在常规的复合培养基YPD中培养时，发现通过与野生型菌林的比较，HphaclA菌抹的生长从指数生长期晚期开始到稳定生长期极大地延迟(如图5A)。此特点是H.polymorpha所特有的，因为其他HAC1基因缺失的酵母菌抹一直报道在复合培养基中没有任何明显的生长缺陷表型。此外，常规的HAC1基因缺失的酵母菌林的生长不能离开肌醇，也就是说，它们是肌醇营养缺陷型的。然而H.polymorphaHphaclA菌抹不是肌醇营养缺陷型的(如图5B)。我们发现HphaclA菌林在固体培养基中生长延迟，这与肌醇的存在无关。此外，相比较于野生型菌林，在包含衣霉素的固体培养基中培养的情况下，发现HphaclA菌林的生长极大地被抑制，其中衣霉素是一种能通过抑制N-结合糖蛋白质的糖基化作用而诱导分泌应激的物质。如上所述，在一般的发生酵母中没有发现，相比较于野生型菌抹，HphaclA菌抹在包含葡萄糖的复合培养基里指数生长期生长变慢的特征，这说明HpHaclp在调节正常生长和分裂的基因表达中起重要作用。与一般的酵母类似，相比较于野生型菌抹，HphaclA菌抹的生长在分泌应激条件下例如衣霉素和二硫苏糖醇的处理更加受抑制。本发明通过微点阵实验分析了基因组的表达模式的差异，就在生长模式开始出现不同之前使用指数生长期的野生型和HpHACl缺失的菌林进行试验。相比较于野生型菌抹，HphaclA菌抹的基因表达是更减少的，该基因被认为是由调节转录因子HpHaclp调节，它包含如前分类的一般酵母中UPR輩巴基因。另一方面，相比较于野生型菌抹，HphaclA菌抹的基因表达是增加的，该基因包含许多应激反应基因而不是URP靶基因。这些证明当减緩分泌应激增加分泌效率的HpHACl基因缺失时，即使在通常生长条件下细胞也变得应激。因此，为了减緩分泌相关应激，其他应激反应基因被显著表达。在另一个实施方案里，本发明提供了一种构建生产宿主的方法，为了减緩生长过程中的分泌应激而保持良好生长，其中的HpHACl基因是持续表达的。本发明中的URP靶基因的表达直接受HpHaclp调节，通过用野生型H.polymorpha以及HphaclA突变菌抹进行微点阵实验而得到筛选。在HpHACl的调控下，在内质网中具有促进蛋白质折叠功能的分子伴侣基因，和二疏键形成(KAR2、EROl、SCJ1、LHSl、PDI1)中所涉及的基因，以及协助糖蛋白质糖基化的许多蛋白质家族都包含于此基因家族中。此外，在内质网和高尔基体间通过参与小泡运输而促进蛋白质分泌(SEC66、SEC61、SEC31、SEC4、TPM1、VPS29、SEC21、SEC26和RET2)的基因也包含在其中。如上所述，分析通过HpHaclp而表达增加的基因家族的结果，证实了HpHACl的功能是增加H.polymorpha的分泌表达效率。特别是，分泌作用和糖蛋白质糖基化的能力得到改善，从而用于制备适于分泌表达人糖蛋白质的生产宿主用于医疗用途。因此，具有改善的表达和分泌重组蛋白质能力的H.polymorpha作为生产宿主，可通过持续表达或过表达HpHaclp而被制备。本发明中所生产的重組蛋白质的实例包含细胞因子诸如促红细胞生成素，干扰素oc，干扰素p,干扰素y以及粒细胞集落刺激因子；诸如因子VIII,因子IX,以及人蛋白质C的凝结因子；诸如免疫球蛋白质，抗原结合片段，双特异性抗体，单链抗体以及双特异抗体的治疗性抗体；Fc融和蛋白质；治疗性酶类诸如葡糖脑苷脂酶，a-半乳糖苷酶，a左旋艾杜糖苷酸酶以及oc葡萄糖苦酶；内皮生长因子；生长激素释放因子；Typanosomacruzi反式唾液酸酶；HIV胞膜蛋白质；甲型流感病毒红细胞凝集素；流行性感冒神经氨酸酶；牛肠激酶激活剂；牛疱渗病毒1型糖蛋白质D;人血管他丁；人B7-1，B7-2和B-7受体CTLA-4;人凝血激酶；生长因子(如血小板衍生生长因子)；人a-抗胰蛋白质酶；組织型纤维蛋白质溶酶原；纤溶酶原活化因子抑制剂1;尿激酶；纤溶酶原；以及凝血酶。本发明方法所生产的重组蛋白质可通过该领域的一般方法纯化，纯化的方法可依照所纯化的特定蛋白质的特征来选择。纯化的方法有沉淀反应，免疫吸附法，分馏法，各种色镨仪，但不限于这些。在另一个实施方案里，本发明提供了一种制备生产宿主的方法，为了改善重组蛋白质表达和分泌能力，其中的HpHACl基因是持续表达或过表达的。实施例实施例1:H.polymorpha内HpHACl剪接的证实从最近完成(Ramezani-Red等人，FEMSYeastRes.,4,207-5，2003)的H.polymorpha的基因组序列数据库证实H.polymorpha的一个ORP(开放读码框)与编码URP转录因子的S.cerevisiaeHACl基因具有最高同源性(如图1)。然而，两个酵母基因间的同源水平非常低(大约15%),以便进行了一些实验证实了H.polymorpha同源性所估计的功能。为了证实H.polymorpha基因与S.cerevisiaeHAC1基因真正相关，利用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析了H.polymorpha基因在UPR诱导的条件下是否进行了一个非常规的剪接作用，它是公知的ScHACl.AH.polymo卬ha菌林的最典型特征。用不同浓度的二石克苏糖醇处理DL-I(Levine和Cooney,Appl.Microbiol.,26,982-990,(1973))，DTT是引起URP的物质。回收细胞，在液氮中迅速冷却细胞并储存于-7()Gc。此外，用DEPC(二乙基焦磷酰胺)处理过的水清洗冰里冻存的细胞使其慢慢融解，RNA被分离如下将750|u1的TES溶液(10mMTris-ClpH值为7.5,1mM乙二胺四乙酸，pH值为8.0，0.5%十二烷基^5克酸钠)和同体积的酸性苯酚-氯仿溶液加入细胞，然后65°C加热10分钟，旋涡振荡IO秒钟。随后重复该程序1小时。接下来，将细胞在冰上冷却1分钟，旋涡振荡20秒钟，然后室温下以14,000转/分离心15分钟。将700pl的上清液小心的转移到一个新管内，用酸性苯酚-氯仿溶液将其混勻，然后4QC下以14,000转/分离心5分钟。再将600卩1的上清液小心的转移到一个新管内。用同体积的氯仿-异戊醇溶液将上清液混匀，然后相同条件离心。最后，取出上清液加入2.5倍体积的100%的乙醇和1/10体积3M的醋酸钠，旋涡振荡10秒钟，将反应产物储存于-70V，30分钟(-2(^C大约16小时)，用70%的乙醇清洗。空中干燥沉淀物后将其溶于水。测量OD280和OD260的值定量RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳来检测其纯度。用100ug纯化的RNA进一步按照生产商的说明，用RNeasyMini试剂盒(Qiagen,美国)纯化。最终得到的RNA的浓度和纯度用OD280和OD260的值以及如上所述的凝胶电泳来检测。用纯化的RNA作为模板通过RT-PCR来合成cDNA。随后，用合成cDNA作为模版，一对寡核苷酸(HpHACl-S-for,HaHACl-S-rev)作为引物(见表1)进行聚合酶链反应。用琼脂糖凝胶电泳来分析其PCR产物。结果显示出H.polymorpha细胞样本中HpHAClmRNA剪接产生的两条带，其中该细胞样本经过5mM二硫苏糖醇处理15分钟(如图IB)。该图表右边条带显示的是HpHAClmRNA通过剪接作用从无活性形式(HpHACIu)变为有活性形式(HpHACIi)。分析所获得的PCR片段的核酸序列来证实HpHAClmRNA剪接的位置，如图1A加下划线处。活性HpHACl蛋白质的C端氨基酸序列很明显变为一个新的序列。无活性形式的终止密码子在剪接中也被切割，被一个新的随后的终止密码子所替代。基于上述结果，被剪接的HpHACl和ScHACl的氨基酸序列的同源性通过网上(GENEDOC,http:〃www.psc.edu/biomed/genedoc)的软件进行分析。两种酵母HAC1蛋白质之间显示出低的同源性，即8%相同，15%相似。然而，发现基序和亮氨酸拉链结构域间的同源性相当高，即68%相同，77%相似(如图2)，这些区域作为两个蛋白质里的调控转录因子是重要的DNA结合位点。表1基因引物基本序列HpHAClHpHACl-S-正向5，-CATGAATTCGGCAATTATCGGAAGATGGC-3'HpHACl-S-反向5，-CATAAGCTTACTTGTAGATGACATGTAGTGC-3'HpACTlHpACTl-正向5'-TTCGATTGTCGGAAGACCTAGACA-3'HpACTl-S-反向5，-TACCGTGCTCAATTGGGTATCTCA-3'HpKAR2HpKAR2-正向5,-TGCAATCATCTATGCTCTGT-3'HpKAR2-反向5，-GTGGTACCAAGATCTATGCC-3'HpPDlHpPDl-正向5'-AAGGTACCCTTTTCCTGAAT-3'HpPDl-反向5'-GATCACCGGATATCCTACCA-3'HpE腦HpER01-正向5'-AGAATTAACACTTTGATCGG-3'HpER01-反向5，-TGTTCTCGAACTGATGGAAG-3'HpHACl-NHpHACl-N-正向5'-CCTAAACACGCACGCCTCACAGCTGTTGAGAGCAGTCAT-3'HpHACl-N-反向5'-GCACAGTGTTGTATCAAACG-3，HpHACl-CHpHACl-C-正向5'-CCAACGGTAAGAAATTCAAG-3'HpHACl-C-反向5'-CGTATTACCAAACCGCTTACGTACGCTTACGTACGCTCTTTTAATAGCGTGCAT-3'Len-NLenN-正向5'-GTACGTAAGCGGTTTGGTAATACG-3'LenN-反向5'-CAAACATGTTGTTGGTGACA-3'Len-CLenC-正向5，-TTGGTGGAATCTACTTTGGT-3，LenC-反向5，-GTGAGGCGTGCGTGTTTAGG-3'HpHAClsHpHACls-正向5'-CCGGAATTCATGACTGCTCTCAACAGCTC-3'HpHACls-反向5'-CCCAAGCTTTCACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAAGACAAATAGTCGTCAAATTC-3'12实施例2:多形汉森酵母里的诱导UPR(未折叠蛋白质反应)条件的探索为了检测UPR是否被诱导，使用RT-PCR来检测HpHAClmRNA的剪接作用(如图3A)和常规URP靶基因的表达水平的增加(如图3B)。为了诱导不同的分泌应激用应激诱导剂如衣霉素，DTT(二硫苏糖S孚)和BlefeldinA来处理来源于H.polymorphaCBS4732的A16菌林，所述分泌应激分别包括糖基化作用抑制，应激反应减低，以及内质网中蛋白质运输抑制。在被处理的细胞内检测了诱导UPR的应激诱导剂的浓度。首先，为了培养酵母细胞，使用以葡萄糖为主要碳源的YPD(l。/。酵母提取液，2%细菌用蛋白质胨和2%葡萄糖)培养基。细胞培养于3mlYPD培养基，170转/分，37QC，16小时，并接种于OD600值为0.1的50mlYPD培养基中。当细胞的OD600的值接近于0.3到0.4时收获细胞。均等地重悬细胞于仅有YPD的培养基里和含有不同浓度的衣霉素，DTT(二硫苏糖醇)和BlefeldinA的PH值为5.4的YPD培养基中，然后在相同条件下培养。在培养后不同时间点30分钟，1小时和2小时，分别收获细胞并测OD600值。之后，提取RNA,纯化并做RT-PCR如例1。为了证实HpHAClmRNA的剪接作用，使用了两个引物HpHACl-S-for和HaHACl-S-rev(如表1)。通常的URP靶基因的表达水平，利用表2中描述的成对的引物通过PCR被证实。从对通过不同浓度的衣霉素，DTT和BlefeldinA处理的样本的HpHAClmRNA的剪接作用的4企测结果中，发现适宜的HpHACl的剪接模式出现于以下浓度，5吗/ml衣霉素，5mMDTT,和5吗/mlBlefeldinA。该时间过程实验证明，经衣霉素和BlefeldinA处理的每个样本的剪接模式能分别抑制分泌蛋白质糖基化作用或者抑制蛋白质从内质网运输，不同于经DTT处理的样本，它能抑制二硫键诱导内质网应激作用。经衣霉素和BlefeldinA处理的样本中，剪接程度随着孵育时间而增加。与此同时，经DTT处理的样本的剪接程度很小，在30分钟时有一个最大值，随后减小(如图3A)。半定量RT-PCR采用相当于S.cerevisiaeUPR靶基因ScKAR2、ScPDII和ScEROl的H.polymorpha基因(HpKAR2、HpPDIl、HpEROl),显示它们的表达水平是由一般的酵母的URP增加的。作为对照，HpACTl的RT-PCR是在相同条件下完成的。结果发现，HpKAR2，HpEROl和HpPDII的表达水平的增加是由内质网应激而产生的。实施例3:HpHACl基因缺失和过表达的菌抹的构建和特征为了构建H.polymorpha的HpHACl缺失突变体，HpHACl基因通过融合PCR和体内DNA重组而被删除(Oldenburg等人,NucleicAcidRes.,25，451，1997)。在初级的PCR中，四对引物如表1所示被用来扩增LEU2基因的N端和C端(N端；LeuN-for，LeuN-rev,C端；LeuC-for,LeuC-rev)以及HpHACl基因(N端，HpHACl-N-for，HpHACl-N-rev，C端；HpHACl-C曙for，HpHACl-C-rev)。然后，在第二级融合PCR中，两对？1物被用来连接HpHACl基因的N端和LEU2基因的N端(HpHACl-N-for,LeuN-rev):以及LEU2基因的C端和HpHACl基因的C端(LeuC-for，HpHACl-C-rev)。所获得的每一个DNA片段被导入酵母细胞中，筛选出通过体内DNA重组得到的HpHACl基因缺失的转化细胞(如图4)。起先，在缺乏亮氨酸的基本培养基中生长的LEU2+转化抹经选择后，通过PCR选择HpHACl基因缺失(HphaclA(had::LEU2))的H.polymorpha突变抹，同时将一个野生型与所获得的重组体的HpHACl的扩增DNA片段进行比较。为了构建HpHACl基因过表达的H.polymorpha突变抹，HpHACl基因过表达的载体制备如下。PCR以例1所得的cDNA为模板，以一对寡核苷酸(HpHACls—for和HpHACls—rev)为引物(如表l),扩增经限制性内切酶EcoRI和HindIII切割的HpHACl基因片段，然后连接到经EcoRI/Hindlll处理的包含HpLEU2基因作为可选标记和HARS的pGAP载体(如图6)中.所得到的包含cDNA片段的重组载体pGAP-HpHACls，相当于剪接的HpHAClmRNA,通过PCR和序列分析进行筛选。之后，所得到的载体被导入H.polymorpha细胞，接着筛选在缺乏亮氨酸的基本培养基中生长的LEU2+转化抹。从转化体中提取的染色体DNA用来分析pGAP-HpHACls的存在。结果，转化的DL1-Hls菌抹最终形成，其中HpHACl基因的多余的拷贝被过表达。实施例4:H.polymorph的野生型和HpHACl基因缺失型菌林的基因表达图谱如实施例3中所提到的，为了研究HpHACl基因缺失型菌抹的生长慢于野生型菌抹的原因，应用了最具代表性的功能基因组学方法的DNA微矩阵进行分析。引入了LEU基因的H.polymorphaDL1菌抹的衍生体DL1L菌林被作为野生型菌抹，实施例3中构建的菌抹被作为HpHACl基因缺失型菌抹(HphaclA)。两种菌抹被培养于含葡萄糖作为主要碳源的YPD复合培养基，并于指数生长期收获每个菌林。从每个H.polymorpha菌抹中分离并纯化RNA，通过DNA微矩阵分析(如图3)两种菌抹间全基因表达图谱的差异。14具体实验方法详述如下H.polymorphaDL1和HphaclA菌林被培养于3mlYPD培养基，170转/分，37GC，16小时，然后将酵母细胞接种于OD600值为0.1的50mlYPD培养基中，在同样条件下培养接种的细胞，当OD600的值为0.5时收获细胞，相当于在观察到生长差异出现前的指数生长期。采用例l所述的相同方法，从收获的细胞中分离和纯化总RNA。cDNA的制备，杂交和荧光标记的所有实验依照生产商的说明书使用一个3DNATMSubmicro表达微阵检测试剂盒(GenisphereCo.)进行。简言之，用70|ug的总RNA合成cDNA,加入试剂盒提供的RT引物在80°C反应10分钟。反应的RNA在冰上冷却，RNA酶抑制剂，Superase-InTM,RT緩冲液，dNTP混合物以及逆转录酶混合物加入其中。此反应在42。C进行2小时，然后加入3.5ul0.5M的氬氧化钠/50mM乙二胺四乙酸溶液终止反应。为了使DNA/RNA杂交体变性，反应物在65QC孵育20分钟，用1MTris-HCl緩冲液(pH值为7.5)中和。所得到的cDNA反应物是通过PCR纯化试剂盒(QiagenCo.)纯化和浓缩的。加入杂交緩冲液和L-亮氨酰-(3-奈酰胺dT阻滞物80。C,10分钟，然后50。C,20分钟。之后，将反应的cDNA滴到阵列载玻片上，于暗处45。C杂交18小时。用2xSSC(标准枸椽酸盐水)/0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)，2xSSC，0.2xSSC和蒸馏水清洗载玻片，然后使之完全干。接着，将荧光分子、3DNA捕获剂和杂交緩冲液混合后80。C反应10分钟，然后50。C,20分钟。反应物滴在上述载玻片上，于暗处50。C杂交6小时。然后用与上述相同程序清洗载玻片，最终得到用于观察的微点阵载玻片。用ScanArray5000扫描微点阵载玻片，得到图像文件。此外，用GenePix4.0程序(Axon)处理图像使数据正态化，此过程包含三步点搜寻，量化，背景测定。用同样的程序来分析表达的差异。对在指数生长期的野生型和HphaclA菌林转录子语图分析的结果显示在不同基因表达模式上显著的差异，尽管在观察到生长差异前捕获它们(如图7B)。HphaclA型菌抹的H.polymorpha基因的表达明显比野生型减少，该基因被认为在URP里受调控转录因子HpHaclp的调节，它主要包括相当于一般酵母S.cerevisiae(如表2)里所识别的UPR耙基因的基因。尤其是HpHACl基因的缺失减少了一些基因族的表达，如促进内质网里蛋白质折叠的分子伴侣基因(KAR2、EROl、SCJ1、LHS1),参与糖蛋白质糖基化的基因(0ST1、OST4、SWP1、WBP1、STT3、MNN2、MNN9、KTR1、KTR4、PMI40、PMT2、PMT5),以及参与蛋白质分泌的基因(ERV41、VIP36、SEC53、YSY6、EMP79)。表2功能表达减少的基因蛋白质折叠KAR2,ERO1,SCJ1,LHS1,HAC1糖基化OST1,0ST4,STT3,WBP1,SWP1,PMT2,PMT5，PMT40，MNN2,MNN9,KTR1,KTR4分泌ERV41,VIP36,SEC53，YSY6,EMP70蛋白质降解CPS1,门冬酰胺酶,酰胺酶N,YBR139WHphaclA型菌林的基因的表达比野生型菌林明显增加的基因被证明编码参与修复应激反应的热休克蛋白质(HSPs),如HSP26、HSP78、HSP12、HSPIO、HSP42、HSP104、HSP60、DDR48、SIT1、STIl、SIS1和HSC82;参与去除自由基诱导体内DNA和蛋白质损伤的基因(SKN7、SOD2、HYR1);促进蛋白质折叠的基因(MTL1、MDJ1、DNAJ、CRP6);参与错误折叠蛋白质降解的基因(PRB1、BUL1、CDC48、HUL5);参与保护生物结构的海藻糖的合成的基因(TPS1、TPS3)(如表3)。这些结果说明编码减緩分泌应激反应所涉及的基因的正向转录因子的HpHACl基因的缺失，导致其他应激减緩基因更多的表达，而不是通过HpHacl蛋白质的调控来减緩分泌应激。也就是说，可解释为一些参与减緩分泌应激的基因家族由于HpHACl基因的缺失而不能行使正常功能，其他应激减緩基因的表达是增加的，是因为这是一种代偿机制。表3功能表达增加的基因应激反应HSP26，HSP78,HSP12,HSP10,HSP42,HSP104，HSP60，DDR48,SIT1,SIS1,HSC82氧化应激S認7,S0D2,HYR1海藻糖TPS1,TPS3蛋白质降解PRB1，BUL1,CDC48,HUL5蛋白质折叠MTL1,MDJ1,DNA,CRP6细胞壁DNA4,ECM13,BGL2，GSC2，WSC4,CCW1,CRH1信号作用MSG5,CMK1转运作用SIT1,ITR1,AGP2,PMC1,ENB1,TNA1实施例516受HpHacl蛋白质调控的UPR耙基因的筛选为了筛选受HpHacl调控的UPR耙基因，进行了两组孩i矩阵分析。首先，培养野生型菌^f朱到指^:生长期，并分为两组。一组用衣霉素或者DTT处理后连续培养，另一组没有任何处理作为对照进行培养。两组分别于处理后30分钟，60分钟，120分钟时间点收获细胞，然后用实施例4的方法进行微矩阵分析(如图8A左侧)。为了进行第二次微矩阵分析，野生型和HphaclA型菌抹培养到指数生长期，然后用衣霉素或者DTT处理两种菌抹的细胞，于处理后30分钟，60分钟，120分钟时间点收获细胞并进行微矩阵分析(如图8A右侧条带)。第一次微矩阵分析时，筛选用衣霉素或者DTT处理后表达增加的所有基因，以便将响应分泌或分泌相关应激的基因家族选出。在第二次微矩阵分析时，为了筛选受HpHaclp直接调控的UPR靶基因，在分泌应激条件下，分析野生型和HphaclA型菌林表达模式的差异。因此，在第二次微矩阵分析时，依赖HpHaclp表达增加的基因被筛选，它存在于第一次微矩阵分析的所筛选到的基因列表里，使得由HpHACl基因缺失导致的间接效应被移除。此外，在两次微矩阵分析里，细胞经历了由衣霉素或者DTT处理导致的分泌应激，它分别抑制了二硫键形成和蛋白质糖基化，仅筛选在两种分泌应激时表达增加的基因以去除由每次反应导致的可能副作用。基于如上所述的严格的筛选标准，被筛选的受HpHaclp调控的UPR靶基因如表4所示。被碎选的基因主要包括有特殊功能的基因家族。具体是，具有促进内质网里蛋白质折叠作用的分子伴侣基因；参与二硫键形成的基因(KAR2、EROl、SCJ1、LHS1、PDI1);参与糖蛋白质糖基化的基因(ALG5,OPU24、0ST1、OST2、OST4、SWP1、WBP1、KTR1、OCR5、CPU7、MNN4、MNNIO、KTR4)作为HpHACl的调节子被包含在内(如图犯)。此夕卜，参与分泌蛋白质从内质网向高尔基体运输的基因(SEC66、SEC61、SEC31、SEC4、TPM1、VPS29)的基因以及参与反方向从高尔基体向内质网小泡运输的基因(SEC21、SEC26、RET2)的表达显著依赖于HpHaclp的存在。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>寡糖(Oligosacchry)转移酶OSTl，OST2,0ST4,SWP1，WBP1高尔基体/o-连接糖基化KTR4,KTR1,MNN2,MNN4，MNN10，OCR5蛋白质折叠侣伴分子LHS1,SCJ1,KAR2二硫键的形成E腦,PDIl蛋白质降解门冬酰胺酶,酰胺酶N,CUE1小泡运输/运输发育(内质网-高尔基体)SEC31,SEC4，TPM1,VPS29反向(高尔基体-内质网)SEC21,SEC26，RET2细胞壁生物合成DCW1细胞骨架ARC35,CAP2,ARP2,SLA2，ARC19，ARC15,PAN工业用途在本发明里，鉴定了HpHACl基因是H.polymorpha里未折叠蛋白质反应的关键调节因子，并且HpHAClmRNA的剪接形式能够编码活性HpHACl蛋白质，它们的核酸序列也被鉴定。此外，本发明的受HpHacl蛋白质调控的UPR靶基因的表达通过微矩阵分析被鉴定。根据本发明，提供了提高分泌表达和H.polymorpha生长能力的方法，可通过HpHACl蛋白质的持续表达或过表达而实现。此外，根据本发明，具有改善的分泌表达能力和生长能力的H.polymorpha可被发展为生产宿主。本发明建立的H.polymorpha的分泌表达体系可被用作大量生产工业和医疗用途的分泌蛋白质，从而实现低成本生产大量蛋白质。相应地，本方法被用作生产有工业和医疗用途的重组蛋白质，以便減低病人的经济负担，有助于改善全人类的社会福利。18权利要求1.一种具有增强基因表达活性的蛋白质，所述的基因参与减缓分泌应激，其中该蛋白质具有SEQIDNO3表示的氨基酸序列或与其有90％或更多同源性的氨基酸序列。2.—种编码权利要求1所述的蛋白质的核酸或其片段。3.根据权利要求2所述的核酸或其片段，具有SEQIDNO:1或2表示的核苦酸序列。4.一种包含权利要求2所述的核酸或其片段的重组载体。5.—种包含SEQIDNO:2表示的DNA基因的重组载体。6.—种具有保存号KCTC10960BP的重组载体。7.—种用权利要求4所述的重组载体转化的多形汉森酵母突变抹。8.—种具有降低未折叠蛋白质反应的多形汉森酵母突变抹，其中来源于多形汉森酵母的转录因子基因坊xtt4C/缺失或发生突变。9.一种增强基因表达的转录因子基因i/p/i4C7，所述的基因参与减緩蛋白质分泌应激(保存号DQ679915)。10.—种制备重组蛋白质的方法，包括使用权利要求7或8所述的突变林作为宿主的步骤。11.一种通过权利要求10所述的方法制备并获得的重组蛋白质。全文摘要本发明涉及一个调控未折叠蛋白质反应(UPR)的多形汉森酵母新基因和使用该基因增强分泌表达重组蛋白质效率的方法。更具体地说，通过识别、修饰和优化HpHACl基因来增强分泌表达重组蛋白质效率的方法，该基因编码H.polymorpha里未折叠蛋白质反应机制的关键调节因子，该调控机制由此基因介导。依照本发明建立的H.polymorpha的分泌表达体系可被用作大量生产有工业和医疗用途的分泌蛋白质，从而实现低成本生产大量蛋白质。相应地，本方法被用作生产有工业和医疗用途的蛋白质，以便减低病人的经济负担，有助于改善全人类的社会福利。文档编号C07K14/39GK101506229SQ200780022527公开日2009年8月12日申请日期2007年6月13日优先权日2006年6月16日发明者吴斗炳,姜贤雅,文惠妍,李尚基申请人:韩国生命工学研究院