用于疫苗的高滴度重组流感病毒的利记博彩app

专利名称：：用于疫苗的高滴度重组流感病毒的利记博彩app用于疫苗的高滴度重组流感病毒相关申请的交叉引用本申请要求2006年3月31日提交的美国申请系列号NO.60/787,766的提交日期的权利，其公开内容通过引用合并在此。政府支持本发明是在来自国家卫生研究所的拨款编号AI044386的政府支持下做出的。在本发明中美国政府拥有某些权利。背景阴性-正义RNA病毒纟皮分类为七个科(弹状病毒科(A/^Z)<io"w>z'<iae)，副粘病毒科(尸ar"，;coW〃'(i"e),丝状病毒科(F,7ov/r/d"e)，十專尔纟内病毒一牛(Sor"av/〃'Jae),正粘病毒牙+((9w/zom>aovz>/<i(3e),布尼亚病毒科(5w"j^rW".c/—和沙粒病毒科(/1re加wnGfae)),其包括常见的人类病原体，例如呼吸道合胞体病毒、流感病毒、麻渗病毒和埃博拉(Ebola)病毒，以及对家禽和家畜产业具有重要经济影响的动物病毒(例如，新城疫病毒和牛瘟病毒)。前四个科的特征在于非片段化的基因组，而后三个科具有分别包括六到八个、三个或两个阴性-正义RNA片段的基因组。阴性-正义RNA病毒的一般特征是它们的RNA基因组的阴性极性；即，病毒RNA(vRNA)是与mRNA互补的，因而本身不是传染性的。为了启动病毒转录和复制，vRNA必需通过病毒聚合酶复合物和核蛋白分别转录成正链(plus-sense)mRNA或cRNA;对于A型流感病毒，病毒聚合酶复合物包括三种聚合酶蛋白质PB2、PB1和PA。在病毒复制期间，cRNA充当了新的vRNA分子的合成的模板。对于所有的阴性链RNA病毒，在vRNA和cRNA的5'和3'末端的非编码区:l或对于病毒基因组的转录和复制都是关键的。不同于细胞或病毒mRNA转录产物，cRNA和vRNA都既不在5'末端帽化也不在极3'末端多聚腺苷化。9许多病毒蛋白质的基本功能已经生物化学地和/或在病毒感染的环境中阐明了。然而，反向遗传学系统已经显著地增进了我们对阴性链片段化和非片段化RNA病毒关于它们的病毒复制和致病性、以及关于活体减毒病毒疫苗开发的认识。作为在分子病毒学中使用的术语，反向遗传学被定义为产生具有来自克隆的cDNA的基因组的病毒(综述参见Neumann等，2002))。为了启动阴性链RNA病毒的病毒复制，vRNA或cRNA必须与聚合酶复合物和核蛋白共同表达。狂犬病病毒是第一种完全从克隆的cDNA产生的非片段化的阴性-正义RNA病毒Schnell等(1994)通过编码全长cRNA的cDNA构建体和L、P和N代表的蛋白质表达构建体的共转染，都处在T7RNA聚合酶启动子的控制下，产生了重组狂犬病病毒。用提供了T7RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染，引起了传染性的狂犬病病毒的产生。在这个T7聚合酶系统中，处在T7RNA聚合酶的控制下的全长cRNA的最初的转录产生了非帽化的cRNA转录产物。然而，形成T7RNA聚合酶的最佳的起始序列的三个胍核苷酸附着在5'末端。为了产生对于生产性传染性周期必须的cRNA转录产物的可信的3'末端，肝炎A核酶(HDVRz)序列被用于在cRNA转录产物的3'末端精确地自动催化裂解。自Schnell等(1994)的初步报告开始，利用类似技术的反向遗传学系统引起了许多非片段化阴性链RNA病毒的产生(Conzelmann,1996;Conzelmann，1998;Conzelmann等，1996;Marriott等，1999;Munoz等，2000;Nagai,1999;Neumann等，2002;Roberts等，1998;Rose，1996)。最初的拯救操作的改进包括从稳定转染的细胞系(Radecke等，1996)或从蛋白质表达质粒(Lawson等，1995)的T7RNA聚合酶表达，或热激操作来提高拯救效力(Parks等，1999)。根据T7聚合酶系统，Bridgen和Elliott(1996)从克隆的cDNA产生了布尼奥罗病毒(Bunyaviridae科)，并展现了通过T7聚合酶系统人工地产生片段化的阴性-正义RNA病毒的可能性。在1999年，基于细胞RNA聚合酶产生了基于质粒的反向遗传学技术，用于完全从克隆的cDNA产生片段化的A型流感病毒(Fodor等，1999;Neumann和Kawaoka,1999)。核仁酶RNA聚合酶I合成核糖体RNA,其象流感病毒RNA—样，不含有5'帽或3'polyA结构。侧翼是RNA聚合酶I启动子和终止子序列的、含有流感病毒cDNA的构建体的RNA聚合酶I转录引起了流感vRNA合成(Fodor等，1999;Neumann和Kawaoka,1999;Neumann禾口Kawaoka,2001;Pekosz等，1999)。该系统是高效的，转染后48小时产生了质粒转染的细胞的每毫升上清液超过108个传染性病毒颗粒。需要的是完全地从克隆的cDNA制备高滴度的正粘病毒例如A型流感病毒的方法。发明概述本发明提供了包含本发明的多种流感病毒载体的组合物，例如，对于制备重配体(reassortant)病毒有用的那些，包括7:1重配体，6:1:1重配体、5:1:2重配体和5:1:1:1重配体。在本发明的一个实施方式中，所述组合物包括用于vRNA产生的载体，所述载体选自包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可4喿作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体。所述组合物还包括用于病毒蛋白质产生的载体，所述载体选自编码流感病毒PA的载体、编码流感病毒PBl的载体、编码流感病毒PB2的载体和编码流感病毒NP的载体，以及任选地编码NP、NS、M例如M1和M2、HA或NA的一种或多种载体。优选的，编码病毒蛋白质的载体进一步包括转录终止序列。在一个实施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及任选的NA的cDNA具有来自在有胚蛋中复制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及4壬选的NA的序列，HA的cDNA具有来自不同的流感病毒毒林的序列(来自具有相同或不同HA亚型，即，异源HA的异源流感病毒分离物)。对于来自在有胚蛋中不生长到高滴度的病原性H5N1病毒的HA,至少NA的cDNA具有在有胚蛋中复制到高滴度的Nl流感病毒的序列。在一个实施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括与一序列(多核苦酸)相应的核酸分子，所述序列编码高滴度的，例如大于108EID50/mL,例如109EID50/mL、1010EID50/mL或更高的滴度流感病毒的至少一种蛋白质。在有胚蛋中具有高滴度的本发明范围内的重配体，对于5:1:1:1重配体(具有NSK55)、5:1:2重配体(具有NSK55)和6:1:1重配体(具有NSK55)具有至少约109EID5o/mL的滴度，对于5:1:1:1重配体(具有NSK55E)或5:1:2重配体(具有NSK55E)具有至少4xl08PFU/mL的滴度。在MDCK细胞中具有高滴度的本发明范围内的重配体，对于5:1:1:1或6:1:1具有至少0.75x108PFU/mL,例如至少2.0xl08PFU/mL的滴度。在一个实施方式中，本发明包括包含5:1:2或6:1:1重配体的多种流感病毒载体的组合物。所述组合物包括包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可才喿作地连接的启动子的载体。PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的序列，其中NS的cDNA是来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒，NS的cDNA是来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒或具有异源NA的序列。HA的cDNA具有异源HA的序列，其对于至少PB1、PB2、PA、NP和M的病毒基因片段是异源的。在一个实施方式中，NS的cDNA具有位置55处的Glu。所述组合物还包括包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片辜史可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体。在一个实施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括与一序列(多核苷酸)相应的核酸分子，所述序列编码高滴度的，例如大于108EID5o/mL，例如109EID5o/mL、101QEID5()/mL或更高的滴度流感病毒的至少一种蛋白质。在一个实施方式中，本发明包括包含5:1:1:1或6:1:1重配体的多种流感病毒载体的组合物。所述组合物包括包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可4喿作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体。PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有来自在MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的序列，其中NS的cDNA是来自在MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒，其中NA的cDNA可以具有异源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有异源HA的序列。所述组合物还包括包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒13PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片l殳可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体。在一个实施方式中，PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA包括与一序列(多核苷酸)相应的核酸分子，所述序列编码高滴度的，例如大于108EID5Q/mL，例如109EID5o/mL、101GEID5Q/mL或更高的滴度流感病毒的至少一种蛋白质。如在此描述的，与野生型PR8毒一朱相比，重组(6:2重配体)病毒在蛋中生长得不太好，虽然它们具有相同的PR8"内部"基因(即，除了HA和NA的那些)。由于在蛋中的旺盛生长是灭活疫苗的生产中使用的疫苗种子病毒的重要性质，产生了在蛋中与PR8供体毒抹生长得一样好的H5N1疫苗候选物。发现的是，HA-NA平衡和PB1功能是重要的生长决定因素。根据这种认识，产生了具有PR8背景的、具有改变的HA-NA组合的一系列H5N1病毒，相对于更常规的6:2重配体，包括WHO建议的NIBRG-14病毒来评估它们在蛋中的生长。7:1重配体病毒和6:2重配体之一显示了在蛋中增强的生长。因而，对于一般在蛋中产生低滴度的疫苗病毒，用在蛋中生长良好的流感病毒的NA替换疫苗病毒的至少NA,或用来自在蛋中生长到高滴度的流感病毒的其他病毒基因片段替换疫苗病毒的除HA和NA之外所有的、或除HA之外所有的，可以产生显著更高的病毒滴度。本发明的重配体病毒的滴度可以是相应的非重配体疫苗病毒的2倍、3倍、或更高，例如7倍或更高。如还在此描述的，确定了对于重配体在蛋中的高生长速度负责的内部基因，所述重配体具有来自两种不同PR8病毒分离物的基因。最高的病毒滴度是大部分内部基因来自PR8HG(PR8(UW))的那些。特别是，5:1:2重配体(PR8(UW)PB1、PB2、PA、NP和M;PR8(Cam)NS;以及H5N1HA和NA)和6:1:1重酉己体(PR8(UW)NA、PB1、PB2、PA、NP禾口M;PR8(Cam)NS;以及H5HA)具有蛋中的高滴度。如还在此描述的，评估了对在MDCK细胞中的高生长速度负责的病毒基因，MDCK细胞是可能被批准作为疫苗病毒来源的细胞。使用来自PR8(UW)的PB2、来自PR8(Cam)的NS或来自PR8(UW)的NSK55E,以及具有长茎部(stalk),例如大于20个氨基酸但低于约100个氨基酸的茎部，例如，长度大于约40个直到约80个氨基酸，发现了在MDCK细胞中的最高生长速度。因而具有PR8(UW)PA、PB1、PB2、NP和M,以及来自PR8(UW)或PR8(Cam)的NS、来自PR8(UW)或异源NA来源的NA,以及异源HA的5:1:1:1和6:1:1重配体，在MDCK细胞中生长到最高滴度。在一个实施方式中，核酸分子相应于编码PB1、PB2、PA、NP、M和NS，以及^f壬选的NA的序列，所述PB1、PB2、PA、NP、M和NS,以及任选的NA具有与SEQIDNO:1-6或8之一编码的相应多肽基本上相同的活性。如在此使用的，"基本上相同的活性"包括一活性，其是相应的全长多肽的活性或蛋白质水平的约0.1%、1%、10%、30%、50%、90%、例如直到100%或更多，或约80%、90%或更多的可检测的蛋白水平。在一个实施方式中，核酸分子相应于编码多肽的序列，所述多肽基本上相同于SEQIDNO:l-6或8编码的多肽，例如，具有与SEQIDNO:1-6或8编码的多肽的至少80%,例如，90%、92%、95%、97%或99%的连续的氨基酸序列同一性。在一个实施方式中，分离的和/或纯化的核酸分子包含核苷酸序列，其基本上相同于SEQIDNO:1-6、8或33至'j38之一，例如，具有与SEQIDNO:1-6、8或33到38之一至少50%，例如，60%、70%、80%或90%或更高的连续核酸序列同一性，在一个实施方式中，还编码多肽，所述多肽与SEQIDNO:1-6、8或33到38之一编码的多肽具有至少80%,例如，90%、92%、95%、97%或99%的连续的氨基酸序列同一性。在一个实施方式中，分离的和/或纯化的核酸分子编码多肽，相对于由SEQIDNO:l-6或8之一编码的多肽，具有一个或多个，例如，2、5、10、15、20个或更多个保守性氨基酸替换，例如高达10%或20%的残基的保守性替换。保守性氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺的策略的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一組氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫的侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和曱硫氨酸。在一个实施方式中，保守性氨基酸替换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；赖氨酸-精氨酸；丙氨酸-缬氨酸；谷氨酸-天冬氨酸；以及天冬酰胺-谷氨酰胺。在一个实施方式中，分离的和/或纯化的核酸分子编码多肽，相对于由SEQIDNO:1-6或33-38之一编码的多肽，具有一个或多个，例如，2、3或4个非保守性氨基酸替换。例如，K55ENS和S360YPB2替换是非保守的替换。在另一个实施方式中，具有PB1、PB2、PA、NP、M和NS、以及任选的NA序列或其互补物的核酸分子，在低度严格、中度严格或严格条件下与SEQIDNO:1-6、8或33到38之一，或其互补物杂交。例如，可以采用以下条件50。C的7%十二烷基石危酸钠(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA,在50。C在2xSSC、0.1%SDS中洗涤(低度严格)，更理想地在50。C的7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA,在50。C在lxSSC、0.1%SDS中洗涤(中度严格)，更理想地仍在50。C的7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP041mMEDTA中，在50。C用0.5xSSC、0.1°/。SDS洗涤(严格)，优选的在50。C的7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP041mMEDTA中，在50。C在O.lxSSC、0.1%SDS中洗涤(更严才各)，更优选的在50。C的7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、1mMEDTA中在65°C在O.lxSSC、0.1%SDS中洗涤(非常严格)。在一个实施方式中，所述核酸分子编码多肽，其基本上相同于SEQIDNO:1-6或33到38之一，例如与SEQIDNO:1-6或33到38之一具有至少50%,例如，60%、70%、80%或90%或更高的连续核酸序列同一性，优选地具有与SEQIDNO:1-6、8或33到28之一所编码的相应全长多肽基本上相同的活性。那些核酸分子，或来自在蛋中生长良好的其他Nl毒抹的核酸分子，可以与任何HA,例如H5的核酸一起采用。16达流感蛋白质，来制备嵌合基因，例如，与其他病毒基因、包括其他流感病毒基因的嵌合基因，和/或来制备重组病毒。因而，本发明还提供了分离的多肽、重组病毒以及与本发明的核酸分子或重组病毒接触的宿主细胞。本发明还提供了多种以下的分离的和/或纯化的载体包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体，其中至少一种载体包含序列，所述序列相应于编码PB1、PB2、PA、NP、M、NS和任选的NA、或其部分的那些，所述PB1、PB2、PA、NP、M、NS和4壬选的NA、或其部分与SEQIDNO:1-6或8之一编码的相应多肽具有基本上相同活性，所述序列例如编码一多肽的序列，所述多肽与SEQIDNO:1-6、8或33到38之一所编码的多肽具有至少80%的氨基酸同一性。任选的，在包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作连接的启动子的载体的地方可以采用两种载体，例如，包含与连接到转录终止序列的流感病毒MlcDNA可操作连接的启动子的载体，和包含与连接到转录终止序列的流感病毒M2cDNA可操作连一妾的启动子的载体.本发明包括分离的或纯化的载体或质粒的用途，其表达或编码流感病毒蛋白质，或表达或编码流感vRNA，包括天然的和重组的vRNA。优选的，所述载体包含流感cDNA,例如，A型(例如，任何A型流感基因，包括15种HA或9种NA亚型的任一种)、B型或C型流感DNA(参见FieldsVirology(Fields等编，Lippincott國RavenPubl.,Philadelphia,PA(1996)的45和46章)，其通过引用特别地合并在此)，然而预想的是，任何生物体的基因可以在本发明的载体或方法中采用。cDNA相对于启动子可以是正义或反义取向的。因而，本发明的载体可以编码流感病毒蛋白质(正义)或vRNA(反义)。可以采用任何适合的启动子或转录终止序列来表达蛋白质或肽，例如，病毒蛋白质或肽，非病毒病原体的蛋白质或肽，或治疗性蛋白质或肽。本发明的组合物还可以包含感兴趣的基因或开放阅读框，例如，编码作为疫苗有用的免疫原性肽或蛋白质的外源基因。因而，本发明的另一个实施方式包括如上所述的本发明的组合物，其中所述载体之一被替换为，或者所述组合物进一步包含，包含启动子的载体，所述启动子连4妻到5'流感病毒序列，任选地包4舌5'流感病毒编码序列或其部分，连接到期望的核酸序列，例如，期望的cDNA,连接到3'流感病毒序列，任选地包括3'流感病毒编码序列或其部分，连接到转录终止序列。优选的，所述期望的核酸序列例如cDNA是反义取向的。这种组合物向可感染流感病毒用于流感病毒复制的宿主细胞中的导入产生了包含与载体的序列相应的vRNA的重组病毒。这种用于vRNA生产的载体中的启动子可以是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子以及T3启动子，任选地所述载体包含转录终止序列，例如RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶in转录终止序列，或核酶。在一个实施方式中，包含期望的核酸序列的所述载体包含感兴趣的cDNA。无论是在用于vRNA还是用于蛋白质生产的载体中，感兴趣的cDNA可以编码免疫原性表位，例如在癌症治疗或疫苗中有用的表位，或在基因治疗中有用的肽或多肽。当制备病毒时，包含感兴趣的基因或cDNA的所述载体或质粒可以替换流感病毒基因的载体或质粒，或可以附加于所有流感病毒基因的载体或质粒。多个本发明的载体可以是物理上连接的，或者每种载体可以存在于单独的质粒或者其他的，例如，线性的核酸递送工具上。vRNA或病毒蛋白质表达载体中的启动子或转录终止序列相当于vRNA的载体或质粒包含适合于在至少一种特定的宿主细胞中表达的启动子，所述宿主细力包例如禽类或哺乳动物宿主细胞，例如犬、猫、18马、牛、羊或灵长类细胞，包括人类细胞，或者优选的，包含适合于在超过一种宿主中表达的启动子。在一个实施方式中，用于vRNA产生的一种或多种载体包含启动子，所述启动子包括但不限于RNA聚合酶I启动子例如人类RNA聚合酶I启动子，RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子或T3启动子。用于vRNA载体的优选的转录终止序列包括，但不限于，RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列、或核酶。本发明的范围内的核酶包括，但不限于，四膜虫核酶、RNaseP、锤头核酶、发夹核酶、肝炎核酶、以及合成的核酶。在一个实施方式中，用于vRNA的至少一种载体包括RNA聚合酶II启动子，连接到核酶序列，连接到病毒编码序列，连接到另一个核酶序列，任选地连接到RNA聚合酶II转录终止序列。在一个实施方式中，用于vRNA产生的至少2种，优选的更多的，例如3、4、5、6、7或8种载体包含RNA聚合酶II启动子、第一核酶序列，其5'于(5'to)相应于病毒序列的序列，包括病毒编码序列，其5'于第二核酶序列，其5'于转录终止序列。每个vRNA载体中的每个RNA聚合酶II启动子可以是与任何其他的vRNA载体中的RNA聚合酶II启动子相同或不同的。类似地，每个vRNA载体中的每个核酶序列可以是与任何其他vRNA载体中的核酶序列相同或不同的。在一个实施方式中，单个载体中的核酶序列不是相同的。本发明还提供了制备流感病毒的方法。所述方法包括用多种本发明的载体接触细胞，例如，次序地或同时地，例如，采用本发明的组合物，以有效产生传染性流感病毒的数量。本发明还包括来自与所述组合物接触的细胞的分离的病毒。因而，本发明进一步提供了分离的病毒，以及与本发明的组合物或病毒接触的宿主细胞。在另一个实施方式中，本发明包括在其他载体，vRNA或蛋白质生产载体，之前，用一种或多种载体，vRNA或蛋白质生产载体，接触细胞。不需要辅助病毒感染的在此描述的产生病毒的方法，在病毒诱变研究中、在疫苗的生产(例如，用于AIDS、流感、B型肝炎、C型肝炎、鼻病毒、线状病毒、痴疾、疱渗和口蹄疫)和基因治疗载体(例19如，用于癌症、AIDS、腺苷脱氨酶、肌营养不良、鸟氨酸转氨曱酰酶缺失和中枢神经系统肿瘤)中是有用的。因而，提供了用于药物治疗(例如，用于疫苗或基因治疗)的病毒。本发明还提供了相对于病原体，例如细菌、病毒、寄生虫或恶性肿瘤来免疫个体的方法。所述方法包括向所述个体施用有效免疫所述个体的量的至少一种本发明的分离的病毒，任选地与佐剂组合。所述病毒包含vRNA,所述vRNA包含由病原体所编码的多肽或肿瘤特异性多肽。还提供的是在哺乳动物中增加或提高内源蛋白质的表达的方法，所述哺乳动物具有特征是内源蛋白质的降低数量或缺乏的症候或疾病。所述方法包括向所述哺乳动物施用在哺乳动物中增加或提高内源蛋白数量的有效数量的本发明的分离的病毒。优选的，所述哺乳动物是人。附图的简要描述附图1.各种流感病毒的滴度。附图2.用于通过反向遗传学产生H5N1/PR8重配体病毒的NlNA。VN1203fi11含有来自H5N1前体毒株GsGd96的Nl的20氨基酸(aa)插入物。VN1203fill.N2除了来自GsGd96NA的20aa之外，含有来自N2NA的14-aa,产生VN1203NA的茎部内的34-aa插入物。VN1202fill.N2N9除了来自GsGd96NA的20aa和来自N2NA的14aa之外，含有来自N9NA的14-aa,产生VN1203的茎部内的48-aa插入物。每个NA的茎部区域的预测的总长度在每个分子之下给出。附图3.H5N1/PR8重配体病毒在鸡的有胚蛋中的生长。通过用MDCK细胞的斑块滴定比较了含有无毒力形式的VN1203HA以及同源的NA(VN1203)或异源的NA(VN1203fi11、VN1203fill.N2、HK213或PR8)与PR8背景的滴度。还包括了野生型(采用的蛋)PR8的滴度用于对比。数据报告为每个病毒接种的3个蛋的平均滴度和标准偏差。附图4.H5N1重配体病毒在有胚鸡蛋中的生长动力学。我们用含有PR8NA(PR8)、VN1203NA(VN1203)或VN1203fi11NA(VN1203fi11)的相同数量(104EID50)的病毒接种了蛋。在标明的时点测定每种病毒接种的3个蛋的平均HA滴度和标准偏差。附图5.鸡红血球的病毒洗脱。含有具有不同的茎部长度的VN1203NA或PR8NA的每种病毒(1:1024的HA滴度)的20倍稀释物在微量滴定板中在4。C与鸡红血球孵育1小时。平板然后在37°C保存，记录HA滴度的降低8小时。附图6.H5N1/PR8重配体病毒在鸡的有胚蛋中的生长比较。通过用MDCK细胞的斑块滴定比4支了6:2和7:1重配体病毒，包括WHO建议的NIBRG-14毒林(VN1194/PR86:2重配体病毒)的病毒滴度。显示了用每种病毒接种的3个蛋的平均滴度和标准偏差。因而，仅用PR8的NA替换H5N1病毒的NA可以改善蛋中的滴度。附图7.具有PR8(UW)或PR8(Cambridge)内部基因的重配体H5N1病毒在有胚鸡蛋中的生长。星号表明与PR8(UW)/1194相比传染性的显著的(p<0.05,Studentt-test)降低。附图8.M和NS基因对病毒在有胚鸡蛋中的生长的影响。星号表明与PR8(UW)/1194相比传染性的显著的(p<0.05，Studentt-test)提高。附图9.PR8(UW)/1194和NIBRG-14病毒在MDCK细胞中的生长。附图10.对于相对NIBRG-14在MDCK细胞中PR8(UW)/1194的增强的生长负责的基因段的鉴定。附图11.对于在MDCK细胞中疫苗种子病毒的高生长速度负责的PB2中的氨基酸的筌定。附图12.具有不同的HA、NA和NS基因的重配体在MDCK细胞中的生长速度。星号表明与PR8(UW)/1194的相比显著地更好的病毒生长。双星号表明与表达PR8(UW)NS的病毒相比显著地更好的生长速度。附图13.含有异源NS段的H5N1疫苗种子病毒在MDCK细胞中的生长。附图14.在有胚鸡蛋或MDCK细胞中具有高生长能力的H5N1疫苗种子病毒的基因型的示意图。21附图15.PR8(Cambridge)基因的核普酸序列(SEQIDNO.28-33)。发明的详细^兌明定义如在此使用的，术语"分离的或纯化的"是指本发明的载体、质粒或病毒的体外制备、分离和/或纯化，从而它不与体内物质相关，或基本上从体外物质中纯化。分离的病毒制品一般通过体外培养和增殖、和/或经由在蛋中传代来获得，并且基本上没有其他的传染原。如在此使用的，"基本上没有"是指低于使用该病原的标准检测方法的特定传染原的检测水平。"重组"病毒是已经例如利用重组DNA技术体外操作来向病毒基因组中引入改变的病毒。重配体病毒可以通过重组或非重组技术来制备。如在此使用的，术语"重组核酸"或"重组DNA序列或片段"是指核酸，例如，是指DNA,其以及衍生自或分离自一来源，其可以随后被体外化学改变，从而它的序列不是天然发生的，或相应于天然发生的序列，所述序列不位于它们在天然基因组中所处的位置。"衍生自"一来源的DNA的实例可以是被筌定为有用的片段、然后以基本上纯的形式被化学合成的DNA序列。从来源"分离的"这种DNA的实例将是有用的DNA序列，其通过化学方法，例如通过使用限制性内切酶从所述来源上切除或除下，/人而它可以通过遗传工程的方法进一步操作，例如，扩增，以在本发明中使用。如在此使用的，"异源，，流感病毒基因或基因片段是来自流感病毒来源的，其不同于重配体流感病毒中的大多数的其他流感病毒基因或基因片段。流感病毒复制A型流感病毒具有编码总共十个蛋白质的八个单链的阴性-正义病毒RNA(vRNA)的基因组。流感病毒生命周期开始于血球凝集素(HA)与宿主细胞表面上含唾液酸的受体的结合，随后是受体介导的内吞作用。晚期内涵体中的低pH值触发了HA中的构象移动，从而暴露HA2亚单位的N-末端(所谓的融合肽)。融合肽启动病毒和内涵体膜的融合，基质蛋白质(Ml)和RNP复合物被释放到细胞质中。RNP由壳体包裹vRNA核蛋白(NP)、病毒聚合酶复合物组成，病毒聚合酶复合物由PA、PB1和PB2蛋白质形成。RNP被转运到核中，在其中发生转录和复制。RNA聚合酶复合物催化三种不同的反应具有5'帽和3'ployA结构的mRNA的合成，全长互补RNA(cRNA)的合成，以及利用cDNA作为模板的基因组vRNA的合成。新近合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白质然后组装成RNP,乂人核中输出，并转运到质膜，在此发生子代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白质在感染晚期起到重要作用，通过从唾液酸寡糖移除唾液酸，从而从细胞表面释放新组装的病毒颗粒，并阻止病毒颗粒的自我聚集。虽然病毒组装涉及蛋白质-蛋白质和蛋白质-vRNA相互作用，这些相互作用的性质很多是未知的。虽然B型和C型流感病毒在结构上和功能上类似于A型流感病毒，但存在着某些差异。例如，B型流感病毒不具有M2蛋白质。类似地，C型流感病毒不具有M2蛋白质。可以在本发明中使用的细胞系和流感病毒根据本发明，支持流感病毒的有效复制的任何细胞可以在本发明中采用，包括表达减低的或降低的一种或多种唾液酸的突变的细胞，唾液酸是流感病毒的受体。通过所述方法获得的病毒可以制成重配体病毒。优选的，细胞是WHO验证的、或是可验证的连续传代细胞系。验证这些细胞系的要求包括针对至少一个家系、生长特征、免疫学标记物、病毒易感性肿瘤发生学和保存条件，以及通过在动物、蛋和细胞培养物中测试来表征。这些特征被用于确认所述细胞没有可检测的不确定病原。在某些国家，细胞核学也是需要的。此外，肿瘤发生学在细胞中优先#:测试，所述细胞处于与用于疫苗产生的那些细胞相同的传代水平。在灭活或减毒用于疫苗生产之前，病毒优选地通过已经显示了得出一致结果的过程来纯化(参见，例如WorldHealthOrganization,1982)。优选的是建立要使用的细胞系的完整的特征，从而可以包括对最终产物的纯度的合适的测试。可以用于要在本发明中使用的细胞的表征的数据包括(a)关于它的来源、衍生和传代历史的信息；(b)关于它的生长和形态学特征的信息；(c)不确定病原的测试的结果；(d)容许细胞在其他细胞系中被明确地识别的区别特征，例如，生物化学、免疫学和细胞遗传学模式；和(e)肿瘤发生学的测试结果。优选的，使用的宿主细胞的传代水平或群体加倍是尽可能低的。优选的是，在疫苗或基因治疗制剂之前，在细胞中产生的病毒是高度纯化的。一般地，纯化操作将产生细胞DNA、其他细胞组分和不确定病原的广泛的去除。也可以使用广泛地降解或变性DNA的操作。参见，例如，Mizrahi,1990.疫苗本发明的疫苗可以包括免疫原性蛋白质，包括任何病原体的糖蛋白，例如，来自一种或多种细菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白质。因而，在一个实施方式中，本发明的流感病毒可以是流感病毒或其他病毒病原体的疫苗载体，包括但不限于慢病毒，例如HIV,B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、疱渗病毒，例如CMV或HSV或口蹄疫病毒。通过超滤来浓缩完整的病毒颗粒疫苗，然后通过区带离心或通过层析来纯化。在纯化之前或之后使用例如福尔马林或P-丙内酯来灭活。亚单位疫苗包括纯化的糖蛋白。这些疫苗可以如下制备使用通过洗涤剂处理来片断化的病毒悬浮液，通过例如超速离心来纯化表面抗原。亚单位疫苗因而主要含有HA蛋白质，还含有NA。使用的洗涤剂可以是阳离子洗涤剂，例如，溴化十六碳烷基三甲铵(Bachmeyer，1975),阴离子洗涤剂，例如脱氧胆酸铵(Laver&Webster,1976);或非离子型洗涤剂，例如以名称TRITONX100商品化的那些。还可以在用蛋白酶例如菠萝蛋白酶处理病毒颗粒之后分离血球凝集素，然后通过例如Grand和Skehel(1972)所描述的方法来纯化。裂解疫苗(splitvaccine)包含病毒颗粒，所述病毒颗粒已经经历了溶解脂质的试剂的处理。裂解疫苗可以如下制备如上获得的、灭活或不灭活的纯化的病毒的水悬浮液，通过与洗涤剂一起添加脂质溶24剂例如乙醚或氯仿在搅动下处理。病毒包膜脂质的溶解引起病毒颗粒的段裂。复原含有裂解疫苗的水相，主要由除去了它们最初的脂质环境的血球凝集素和神经氨酸酶、以及核心和其降解产物组成。然后，如果还没有进行的话，灭活残余的传染性的颗粒。灭活疫苗.本发明的灭活的流感病毒疫苗通过使用已知的方法，例如但不限于福尔马林或|3-丙内酯处理来灭活本发明的复制的病毒来提供。可以用于本发明的灭活疫苗类型可以包括完整病毒(wv)疫苗或亚病毒颗粒(SV)(裂解)疫苗。WV疫苗含有完整的、灭活的病毒，而SV疫苗含有纯化的病毒，其是用溶解含脂质的病毒包膜的洗涤剂破坏了的，随后是残余病毒的化学灭活。此外，可以使用的疫苗包括含有分离的HA和NA表面蛋白质的那些，其称为表面抗原或亚单位疫苗。一般地，对SV和表面抗原(即，纯化的HA或NA)疫苗的反应是类似的。含有与流4亍病毒免疫地相关的NA抗原和不相关的HA的实^险灭活的WV疫苗，与常规的疫苗相比似乎是较不有效的(Ogra等，1977)。含有两种相关的表面抗原的灭活疫苗是优选的。活的减毒病毒疫苗.根据已知的方法步骤，活的减毒的流感病毒疫苗也可以用于预防或治疗流感病毒感染。优选的，通过根据已知的方法(参见，例如Murphy,1993)从减毒的供体病毒转移减毒的基因到复制的分离物或重配的病毒，在单个步骤中实现减毒。由于对A型流感病毒的抗性是由对HA和NA糖蛋白的免疫反应的发展所介导的，编码这些表面抗原的基因必须来自重配的病毒或高生长的临床分离物。减毒的基因来源于减毒的亲本。在这种方法中，赋予减毒的基因优选地不编码HA和NA糖蛋白。另外的，这些基因不能^C转移到携带临床病毒分离物的表面抗原的重配体。已经评估了许多供体病毒来生产性地减毒流感病毒的能力。作为非限制性实例，A/AnnArbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应的(ca)供体病毒可以用于减毒疫苗生产(参见，例如，Edwards,1994;Murphy,1993)。另外，活的减毒的重配体病毒疫苗可以通过交配ca供体病毒和本发明的强毒复制病毒来产生。然后在存在H2N2抗血清的情况下在25。C选择重配体子代(对于强毒病毒的复制是限制性的)，H2N225抗血清抑制带有减毒的A/AA/6/60(H2N2)ca供体病毒的表面抗原的病毒的复制。已经在人类中评估了一大系列的H1N1和H3N2重配体并发现是令人满意的(a)传染性，(b)对于血清反应阴性的儿童和免疫性致敏的成年人减毒的，(c)免疫原性和(d)遗传温度。ca重配体的免疫原性平行于它们的复制水平。因而，新的野生型病毒获得ca供体病毒的六个可转移基因，可再生性地减毒了这些病毒，用于免疫易感的成年人和儿童。其他的减毒突变可以通过定点诱变导入流感病毒中来拯救带有这些突变基因的传染性病毒。减毒的突变可以被导入基因组的非编码区域，以及导入编码区域。这样的减毒突变也可以;故导入除了HA或NA以外的基因，例如，PB2聚合酶基因(Subbamo等，1993)。因而，还可以产生带有通过定点诱变导入的减毒突变的新的供体病毒，这种新的供体病毒可以以类似于以上对A/AA/6/60ca供体病毒所描述的方式用于活的减毒重配体H1N1和H3N2疫苗的产生。类似地，其他已知的和适合的减毒供体毒抹可以与本发明的流感病毒重配，来获得适用于哺乳动物的疫苗接种的减毒疫苗(Enami等，1990;Muster等，1991;Subbarao等，1993)。优选的是，这种减毒病毒维持了来自病毒的基因，其编码基本上类似于最初的临床分离物的那些的抗原决定簇。这是因为减毒疫苗的目的是提供与病毒的原始临床分离物基本上相同的抗原性，而同时缺乏传染性，达到疫苗在接种的哺乳动物中产生诱导严重病原状况的最小的改变。因而，根据已知的方法，病毒可以被减毒或灭活，被配制和施用，作为疫苗来在动物，例如哺乳动物中诱导免疫反应。用于确定这种减毒的或灭活的疫苗是否维持了与临床分离物或由此衍生的高生长毒抹相似的抗原性的方法是本领域公知的。这些已知的方法包括使用抗血清或抗体来消除表达供体病毒的抗原决定簇的病毒；化学选择(例如，金刚烷胺或金刚乙胺(rimantidine));HA和NA活^化和抑制；和DNA筛选(例如，探针杂交或PCR),来确认编码抗原决定簇的供体基因(例如，HA或NA基因)不存在于减毒病毒中。参见，例如，Robertson26等，1988;Kilboume，1969;Aymard-Henry等，1985;Robertson等,1992。药物组合物适合于接种或胃肠外或口服施用的本发明的药物组合物包含减毒的或灭活的流感病毒，任选地进一步包含无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。如本领域已知的，所述组合物可以进一步包含助剂或贝武形剂。参见，例^口，Berkow等，1987;Avery'sDrugTreatment,1987;Osol,1980;Katzung,1992。本发明的组合物一般以单次剂量(单位剂量)的形式存在。常规的疫苗一般含有约0.1到200貼、优选的10到15吗的来自每种毒抹的血球凝集素进入它们的组合物。形成本发明的疫苗组合物的主要成分的疫苗可以包含A、B或C型的病毒或任何它们的组合，例如，三种类型的至少两种、不同亚型的至少两种、相同类型的至少两种、相同亚型的至少两种、或不同的分离物或重配体。人类A型流感病毒包括H1N1、H2N2和H3N2亚型。用于胃肠外施用的制品包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和/或乳剂，其可以含有本领域已知的助剂或赋形剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及可注射的有才几酯，例如油酸乙酯。载体或闭塞敷料可以用于提高皮肤透过性并增强抗原吸收。用于口服施用的液体剂型一般可以包含含有液体剂型的脂质体溶液。悬浮脂质体的适合的形式包括乳剂、悬浮液、溶液、糖浆和酏剂，其含有本领域通常使用的惰性稀释剂，例如纯水。除了惰性稀释剂之外，这种组合物还可以包括佐剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂，或糖化剂、调味剂或芳香剂。参见，例如，Berkow等，1992;Avery's,1987;Osol,1980;和Katzung,1992。当本发明的组合物被用于向个体施用时，它可以进一步包括盐、緩冲液、佐剂或改善组合物的效力所希望的其他物质。对于疫苗，可以使用佐剂，其是可以增加特异性免疫反应的物质。通常，在呈递给免疫系统之前混合佐剂和混合物，或者单独地呈递，但是进入被免疫的生物体的相同的部位。适用于疫苗组合物的材料的实例在Osol(1980)中提供了。27疫苗中的异质性可以通过混合复制的流感病毒与至少两种流感病毒毒株，例如2-50种毒株或其中的任何范围或值来提供。具有当前的抗原性成分的A或B型流感病毒毒抹是优选的。根据本发明，利用本领域已知的技术，可以为流感病毒的单个毒株中的变异提供疫苗。根据本发明的药物组合物可以进一步或另外包括至少一种化学治疗化合物，例如，对于基因治疗，免疫抑制剂、抗炎症试剂或免疫增强剂，对于疫苗，化学治疗剂包括但不限于，丙种球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-a、干扰素-卩、干扰素i、肿瘤坏死因子-a、硫代半卡巴腙(thiosemicarbarzones)、曱吲漆腙、利福平、病毒唑、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦乙酸、无环鸟苷、双脱氧核苷、蛋白酶抑制物或更昔洛韦。分别参见，例如，Katzung(1992)和在第798-800和680-681页中引用的参考文献。组合物还可以含有可变量但是少量的无内毒素的甲醛和防腐剂，果。-、"、、、'、"、药物目的组合物(或它引发的抗血清)的施用可以是用于"预防性的"或"治疗性的"目的。当预防性地提供时，作为疫苗的本发明的组合物在病原体感染的任何症状变得显明之前来提供。组合物的预防性施用用来阻止或减弱任何随后的感染。当预防性地提供时，本发明的基因治疗组合物在疾病的任何症状变得显明之前来提供。组合物的预防性施用用来阻止或减弱与疾病相关的一种或多种症状。当治疗性地提供时，在检测到实际感染的症状时提供减毒的或灭活的病毒疫苗。化合物的治疗性施用用来减弱任何实际的感染。参见，例如，Berkow等，1992;Avery,1987;和Katzung,1992。当治疗性地提供时，在检测到疾病的症状或症候时提供基因治疗组合物。化合物的治疗性施用用来减弱疾病的症状或症候。因而，本发明的减毒的或灭活疫苗的疫苗组合物可以在感染的发作之前(以便阻止或减弱预期的感染)或在实际感染的开始之后来提供。类似地，对于基因治疗，组合物可以在失调或疾病的任何症状明细之前或在检测到一种或多种症状之后来提供。如其施用可以被接受者患者耐受，组合物被称为是"药学上可接受的"。如果施用的数量是生理学上显著的，这样的试剂被称为以"治疗有效量"施用。如果其存在引起了接受者患者的生理方面的可检测的改变，例如，增强针对至少一种传染性流感病毒的毒抹的至少一种初级或刺激体液或细胞免疫反应，本发明的组合物是生理学上显著的。如果存在着相比对照群体或患者组存在着统计学上显著的改善，提供的"保护，，不必是完全的，即，流感感染不必被完全防止或消灭。保护可以限于緩解流感病毒感染的症状的严重度或发作的快速性。药物施用病原体，例如一种或多种流感病毒的抗性。在主动免疫中，灭活的减毒的活疫苗组合物预防性地向宿主(例如，哺乳动物)施用，宿主针对该施用的免疫反应保护了免于感染和/或疾病。对于^皮动免疫，可以回收引发的抗血清，并施用给怀疑具有至少一种流感病毒毒抹引起的感染的接受者。本发明的基因治疗组合物可以通过主动免疫产生预防或治疗水平的期望的基因产物。在一个实施方式中，在足以引起免疫反应的产生的时间和数量条件下向雌性哺乳动物(或在妊娠或分娩之前)提供疫苗，所述免疫反应用来保护雌性和胎儿或新生儿(通过穿越胎盘的或在母亲的母乳中的抗体的被动掺合)。因而本发明包括防止或减弱失调或疾病，例如至少一种病原体的抹系的感染的方法。如在此使用的，如果其施用引起了疾病的症状或状况的总体或部分减弱(即，抑制)，或引起个体对疾病的总体或部分免疫性，疫苗被称为阻止或减弱疾病。如在此使用的，如果其施用引起了疾病的症状或状况的总体或部分减弱(即，抑制)，或引起个体对疾病的总体或部分免疫性，基因治疗组合物;故称为阻止或减弱疾病。本发明的至少一种灭活的或减毒的流感病毒、或其组合物可以使用如早先描述的药物组合物通过实现预期目的的任何方式来施用。例如，这种组合物的施用可以通过各种胃肠外的途径，例如，皮下的、静脉内的、皮内的、肌肉内的、腹膜内的、鼻内的、口腔的或穿表皮的途径。胃肠外施用可以通过弹丸注射，或通过一定时间内的逐步灌注。使用本发明的药物组合物的优选的方式是通过肌肉内的或皮下的应用。参见，例如，Berkow等，1992;Avery,1987;和Katzung,1992。防止、抑制或治疗流感病毒相关病理的典型方式包括在一定时期内，包括一周和约24个月之间、或其中的任何范围或值的时间，施用有效量的在此描述的疫苗组合物，作为单次治疗、或作为增强或强化给药来重复。根据本发明，"有效量，，的组合物是足以实现期望的生物学效果的组合物。要理解的是，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状态和体重，当前治疗的类型，如果有的话，治疗的频率以及希望的效果的性质。以下提供的有效剂量的范围不意图限制本发明，是代表优选的剂量范围。然而，最优选的剂量将适合于个体的受试者，如本领域的技术人员理解和可确定的。参见，例如，Berkow等，1992;Avery's，1987;和Katsimg，1992。用于哺乳动物(例如，人类)或禽类成年生物体的减毒病毒的剂量可以是约10M0"噬斑形成单位(PFU)/kg,或其中的任何范围或值。灭活疫苗的剂量可以是约0.1到200jug的范围，例如50pg的血球凝集素蛋白质。然而，剂量应当是利用现有的疫苗作为出发点通过常规方法测定的安全和有效量。每剂复制的病毒疫苗中免疫反应性HA的剂量可以被标准化为含有合适的数量，例如，1-50pg或其中的任何范围或值，或者美国公众健康服务(PHS)所推荐的数量，其通常是对于超过3岁的较大的儿童15jig每份，对于小于3岁的儿童7.5pg每份。NA的数量也可以被标准化，然而，这种糖蛋白可能在加工过程和保存期间是不稳定的(Kendal等，1980)。每个0.5ml剂量的疫苗优选地含有大约10-500亿病毒颗粒，优选的100亿颗粒。本发明将通过以下非限制性实例进一步描述。30实施例1为了开发用于A型流感/PuertoRico/8/34的反向遗传系统，根据厂家的方案利用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)从A/PuertoRico/8/34(H1N1)Madison高生长变体(PR8HG)的尿嚢液提取病毒RNA。使用MMLV-RTase(Promega)和Unil2引物合成cDNA。使用以下的通过PCR将cDNA扩增过4支引物集PB1:BaPB1國1和PB1-1735R(前方片|殳)以及PB1-903和Ba-PB1-2341R(后方片段)Ba-PB1-1CACACACGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGCA(SEQIDNO:9)173PB1-1735RGGGTTTGTATTTGTGTGTCACC(SEQIDNO:28)233PBl-卯3CCAGGACACTGAAATTTCTTTCAC(SEQIDNO:IO)Ba國PBl國2341RCACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQIDNO:ll)PB2:BaPB2-1和B21260R(前方片l殳)以及WSNPB2seq-2和Ba-PB2-2341R(后方片段)Ba-PB2陽1CACACAGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTC(SEQIDNO:12)B21260RCACACACGTCTCCATCATACAATCCTCTTG(SEQIDNO:13)31WSNPB2seq國2CTCCTCTGATGGTGGCATAC(SEQIDNO:14)Ba-PB2誦2341RNO:15)Bm-PA國1CACACACGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTAC(SEQIDNO:16)Bm-PA-2233RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTACTT(SEQIDNO:17)HA:Bm画HA-l:CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGG(SEQIDNO:18)Bm-NS-890R:IDNO:19)NP:Bm-NP-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTA(SEQIDNO:20)Bm-NP-1565RIDNO:21)NA:Ba國NA誦lIDNO:22)Ba画NA-1413R:IDNO:23)M:Bm-M-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGTAG(SEQIDNO:24)Bm國M-1027RIDNO:25)Bm-NS-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTG(SEQIDNO:26)Bm-NS誦890RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQIDNO:27)DNA聚合酶；/wNativeDNA聚合酶(Stratagene)通过凝胶电泳分离PCR产物，使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝月交提取。提取的基因使用Takara连接试剂盒ver.II(Takara)连接到pT7Blue钝的载体(Novagen)中。在5小时之后，连接的基因转化到JM109(PB2、M和NS基因)或DH5alpha(PA、PB1和NP)中。每个基因的六个菌落在TB中培养8小时。从细菌培养物提取质粒，测序每个基因的四个克隆。pT7Blue中的PA、NP、M和NS基因通过^smBI酶(NewEnglandBiolabs)切下。PB1基因通过BmI(NewEnglandBiolabs)切下。切下的基因与用&mBI消化的pPolIR载体连接过夜，pPolIR载体含有人类RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。pT7Blue中PB2基因的前部片段通过GI(NewEnglandBiolabs)和HI(Roche)切下，后部片段通过SwGI(NewEnglandBiolabs)和I(Roche)切下。混合切下的片段，通过AyaI消化。6小时之后，消化的基因利用PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化，在pPolIR载体的wBI位点之间连接过夜。连接的PB1、PA、NP、M和NS-pPolIR基因用于转化JM109(M和NS基因)或DH5alpha(PB1、PA和NP基因)过夜。转化的细菌的克隆在LB上培养过夜。连接的PB2-pPolIR被用于转化JM109过夜。从细菌培养物提取质粒，通过酶消化确认插入物。PB2-PolIR转化的细菌的菌落在LB中培养8小时。然后提取质粒，通过酶消化确认基因插入物。测序所有的pPolI构建体来确保它们不含有不希望的突变。PR8HG的pPolIR构建体转化到具有A/WSN/33(WSN)-HA和NA、A/HongKong/483/97(HK)画HAavir和NA、或A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA和NAPoll构建体，以及聚合酶蛋白质和A/WSN/33的NP的四种蛋白质表达构建体的293T人类胚肾细胞中。连续稀释来自转化的293T细胞的上清液(未稀释到ICT7),感染到9天龄的有胚鸡蛋的尿嚢腔中。收获感染的鸡蛋的尿嚢液，通过HA分析测试它们的病毒滴度(表1)。表1具有PR8基因和以下的HA和NA基因的病毒用以下稀释度的293T上清液接种的鸡蛋的尿嚢液的HA滴度(HAU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>HA阳性实例(在l(T2具有WSN-HANA的病毒和在未稀释时具有HK-HAavirNA的病毒)被连续稀释10-2到1(T8,lOOpl的每种稀释物感染到有胚鸡蛋中。收获感染的鸡蛋的尿嚢液，通过HA分析测试它们的病毒滴度(表2)。从质粒制备的A/PuertoRico/8/34(H1N1)的50%蛋传染性剂量(EID50)是101033/ml,HA滴度是1:3200。制备了具有来自A/HongKong/213/2003(H5N1)的HA和NA基因以及来自PR8HG的其余A性流感病毒基因的重组病毒。该重组病毒的滴度是10ia67EID5o/ml,HA滴度是1:1600。表2具有PR8基因和以下的HA和NA基因的病毒每个稀释度中的HA滴度(HAU/ml)l(T2l(T3io-4lev510-6l(T7l(T8WSN-HANA160404032040640<1HK-HAavirNA400800400400400800<1PR8基因的序列:PAAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGATTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCGATGATTGTCGAGCTTGCGGAAAAAACAATGAAAGAGTATGGGGAGGACCTGAAAATCGAAACAAACAAATTTGCAGCAATATGCACTCACTTGGAAGTATGCTTCATGTATTCAGATTTTCACTTCATCAATGAGCAAGGCGA35GTCAATAATCGTAGAACTTGAAGCACAGATTTGAAATAATCGAGGGAAGAAGTAGTAAACAGTATTTGCAACACTACAGGTACCAGATTTGTATGATTACAAGGAGAATAACAAGGAGAGAAGTTCACATATACTATCTGATCTGAGAAAACACACATCCACATTTTCTCCCACAAAGGCAGACTACACTCTCGATGAAGACCAGACTATTCACCATAAGACAAGAAATGTTCCTTTCGTCAGTCCGAGAGAGGAGAAGAAAATCACAGGAACAATGCGCAAGCTTGCCGTTCTCCAGCCTTGAAAATTTTAGAGCCTATCGGCTACATTGAGGGCAAGCTGTCTCAAATGAATTGAACCTTTTTTGAAAACAACACCACGGGCCTCCCTGTTCTCAGCGGTCCAAATTCATTAAGCATTGAGGACCCAAGTCATGAAGGATGCAATCAAGTGATCCAAATGCACTTTTGGATCGCACAATGGCCTGGACGGCTGAGAAACCAAAGTTTCGATTCATCGAAATTGGAGTAGAAAAGGCCAATAAAATTAAGTTCACTGGGGAAGAAATGGAAAGCAGGGCTAGGATCAAAGCCAGCAGAGGCCTCTGGGAGACAATTGAAGAAAGGTTTGACCAAAGTCTCCCGCCGAACGTGGATGGATTCGAACCGAAGTCCAAAGAAGTAAATGCTAGACCACTTAGACTTCCGAATCTGCTGATGGATGCCTTAAAAGAGGGAATACCGCTATATG36<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>GCCCATGTTCTTGTATGTGAGAACAAATGGAACCTCAAAAATTAAAATGAAATGGGGAATGGAGATGAGGCGTTGCCTCCTCCAGTCACTTCAACAAATTGAGAGTATGATTGAAGCTGAGTCCTCTGTCAAAGAGAAAGACATGACCAAAGAGTTCTTTGAGAACAAATCAGAAACATGGCCCATTGGAGAGTCCCCCAAAGGAGTGGAGGAAAGTTCCATTGGGAAGGTCTGCAGGACTTTATTAGCAAAGTCGGTATTCAACAGCTTGTATGCATCTCCACAACTAGAAGGATTTTCAGCTGAATCAAGAAAACTGCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGGGACAACCTGGAACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATATGAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCTTCTTGGTTCAACTCCTTCCTTACACATGCATTGAGTTAGTTGTGGCAGTGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT(SEQIDN0:1)PB1AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACCTTACTTTTCTTAAAAGTGCCAGCACAAAATGCTATAAGCACAACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCTTACAGCCATGGGACAGGAACAGGATACAC38CATGGATACTGTCAACAGGAGGAAGATGGACAACAAACACCGAAACTGGATGATGGGCCACTGCCAGAAGACAATGAACCATTGTGTATTGGAGGCGATGGCTTTCCTTGTTTGAAAACTCGTGTATTGAAACGATGGAGAGACAAGCTGACACAAGGCCGACAGACCTAACCAACCTGCTGCAACAGCATTGGCCAACAAATGGCCTCACGGCCAATGAGTCTGGAAGGTGTAATGGAGTCAATGAACAAAGAAGAAATAGAGAAAGAGACGGGTGAGAGACAATATGAAGAACAATGGGTAAAAAGAAGCAGAGATTGTAGAGCATTGACCCTGAACACAATGACCAATAAAACGGAGAGCAATTGCAACCCCAGGGATACTTTGTTGAGACACTGGCAAGGAGTATAAGGGTTGCCAGTTGGAGGCAATGAGAAGAATAAGGAAGATCACATCAGTACTCAGAAAAGGCACCGCAACTCAACCCGATAAGTGGTTATGCCCAAACAGAGGAATCCCATCCTGGTATTGTTGTTCAGCAAACACGAGTTGACTGGACTCTAAATAGAACAATAGAAGTGTTCAGATCACTCATAGACTTCCTTAAGGAGGGGATCACAACTCATTTTCCTAAGAAAATGATAACACAGAACAAAAGGAGTTATCTAATAGATGCTGAGAGAGGGAAGCTGCAAATAAGGGGGTTTGTATGTGAGAAACTTGAACAATCAGCAAAGTTGGCAAATGTTG39GATGACCAATACTGGAGATAACACCAAATGGGCCATGATCACATATATGATTCTAAGTATTGCTCCAATAAAAGGGTATATGTTTGAGAGTGCAGAAATGCTAGCAAGCAGAAAGAAGATTGAAAAAATCTTGAGCCCTGGAATGATGATAGGCGTCTCCATCCTGAATCACTGGTGGGATmT/^TTr>A八1VJVJ丄H丄GCACCCAATCATGAAGGGATCTGTAAGCTACTTGGAATCAGAACAGGTACATTTGAATTCGCCAATTTCAGCATGGAGCTGTCAGCGGACATGAGTATTGACAATGATCTTCTCAGGACAGAACGAAAATCCAGAAATCAATGTTCTCAACAAGAGTATGTCGATTTGAACGACCGCTCTGGGCATGTTCTTGGACAAAATCCTCTGACGTCAAGCCGGAATATGAGCAAACAAGTTTTTTCCCAGTTTTGAGTTACTGTCCGAACTTTCCAGAATCCTCGCCCGAATGGACAAAATGGCAAACTTAGAAATATTTCAATTAATAGAGGGAATATGTTAAGAGATACACCATTTTGCTCTGTCGACAGGTGAAAAAGTCTTCTATCGTTAGGGGTGTCTGCATCAAAAACTTTCACCATCGGATGTTTTTTTCAGAAATGGAGACTGGGACTCAAATACCGATTCAACAAGACTGCATCAGCACTGTATTAAGACTACTTGATTGTGAATTTTATCGAACTACATAAACATGGGTTTGTTGGATCAACGAAATATGATAA40<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>PB2AGCGAAAGCAGGTCAATTATAAGAACTACGAAATCTAATGTCGCAGTCTCAAAACCACCGTGGACCATATGGCCATAATCACAGGAGAAGAACCCAGCACTTAGGATGAAATCCAATTACAGCAGACAAGAGGATAACGGGAGCAAGGACAAACTTTATGGAGTAAAATGAGTGATGGTATCACCTCTGGCTGTGACATGTAACAAATACAGTTCATTATCCAAAAATCTGTCGAAAGGCTAAAGCATGGAACCTTTGGCAGTCAAAATACGTCGGAGAGTTGACATAAAGTGCCAAGGAGGCACAGGATGTAATCATGGGTGGGAGCCAGGATACTAACATCGGAATCGGAAGAAAGAAGAACTCCAGGATTGCAAAATACATGTTGGAGAGAGAACTGGTCCGCAAAAGGTGGAACAAATTCAATATGGAAAGAATAAGCACCCGCGAGATACTCACAAAGAAGTACACATCAGGAAGATGGATGATGGCAATGAAATAAATGATTCCTGAGAGAAATAATGATGCCGGATCAGACCGGTGGAATAGGAATGGACCAAACAAAACTTATTTTGAAAGACCTGTCCATTTTAGAAACCATCCTGGTCATGCAGATCTCAAAGTTGTTTTCCCTAACGAACAACTAACGATAACCAAAGATTCTCCTTTGATGGTTGCATCGAGATTCCTCCCAGTGGCT42GCAGTGTGTACATTGAAGTGATGCTGGGAACAGATGTATACTCCAGGAGGTTGATCAAAGCTTGATTATTGCTGCTAGGAGTATCAGCAGATCCACTAGCATCTTTATTGGATTGGTGGAATTAGGATGGTAGACATCCTAGCAAGCCGTGGATATATGCAAGGCTGCAATCCTTCAGTTTTGGTGGATTCACATTTAAGCAAGAGAGAGGAAGAGGTGCTTACGGGCAAGAGTGCATGAGGGATATGAAGAGTTCACAAGCCATACTCAGAAAAGCAACCAGGAGATTGGAGAGACGAACAGTCGATTGCCGAAGCAATCACAAGAGGATTGTATGATAAAAGCAGTCAAATAGGGCGAATCAACGATTGAATCCTATGTCAGAAGGATGCGAAAGTGCTTTTTCAAAAACAATGTGATGGGAATGATTGGGATATTGCGAGATGTCAATTGCATTTGACTCAAGGAACGGAAGTGAGGAATGATGATGACATAGTGAGAAGAGCTGCAGAGATGTGCCACAGCACACATAGGCAGAACCCAACAGAAGTGGGACTGAGAATTAGCTCAAGAACAAGCGGATCATCAGTTCTTCAAACATTGAAGATAATGGTTGGGAGAAGAGCAACAATTCAGCTGATAGTGAGTGGAATTGTGGCCATGGTATTTTGAGGTGATCTGAATTTCGTCCATCAACTTTTAAGACATTTTTGGGGAGTTGAACCTATCGCCGACATGACTCCAAGCATC43TGAGAGGAGTGAGAATCAGCCTCCAGCACGGAGAGGGTAGTGGTGAGCATGGGACCAACGAGGAAATGTACTACTGTCTCCAGGGAACAGAGAAACTGACAATAACTTACGATTAATGGTCCTGAATCAGTGTTGGTCAAGAAACTGGGAAACTGTTAAAATTCAGTGGTTACAATAAAATGGAATTTGAACCATTTCAGTAGAGGCCAATACAGTGGGTTTGTAAGAACATGTGCTTGGGACATTTGATACCGCACAGAGCAGCCGCTCCACCAAAGCAAAGTAGAATGGAATGTGAGGGGATCAGGAATGAGAATACTTATTCAACTATAACAAGGCCACGAAGAGACGCTGGCACTTTAACTGAAGACCCAGATGAACGCTGTTCTGAGGGGATTCCTCATTCTGGGGGCCAGCACTAAGCATCAATGAACTGAGCAGCTAATGTGCAAAATGGGTGTAGATGAGTATGACCGTTTTTTGAGAATCCCCGAGGAGGTCAGTGAAACATCATCGTCAATGATGTGGGATACCTATCAATGGATCATCACCCAGAACCCTACAATGCTATCTTTAGTACCTAAGGCCATTCTGTTCCAACAAATGAGGGTAATAAAACTTCTTCCCTTCCAGTTCTCCTCATTTACTGTTGTAAGGGGCAATTCTCCTGTCACAGTTCTCGGAAAGGATGGCACAGCTGGAGTGGAGTCCAAAGAAGACAAGAGATATGACCTTGCGAAAGGAGAGAAG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>CTGATGCAAGCAGGTGCTGCAGTCAAAGGAATGATCAAACGTGGGATCAAACGAAAAACAAGAATTGCTTAATTTCAAACTGCTGCACAACGGAACCCAGGGAATGCTGATGCACTCATATTGAGAGGGTGTGTGTATGGACCTGCCGTATACTCTCTAGTCGGAATAGAGTACAGCCTAATCAGACCAATGTGGATGGCATGCCATTCTTTCATCAAAGGGACGAAGGTAGTTCAAATTGCTTCCAATGTTGAACTGAGAAGCAGGTACACCAATCAACAGAGGGCATCCTCAGTACAGGTTCAACTCTGTTGGAACAATGATCGGAACATGAAAGAATAAAGCAATGAGTTCGAAGATCGGTTGCTCAGCCAGTGGGTCCCTTTCAGAATGAGAATCCGCCGCATTTGGCTCCCAAGAAAAATATGGATGGGCCATAATGCGGGCCAACCCTAGGAGGTGGTGATGGATTCTGGAGGGGTGCAACATTTGGATCAAGTCTCACTTTTCCAAGTCCTGCACGACTTTGACTGCTTCAAAAGCACACAAGAAGATCTAAGGGGAAGCTTTGACTATGGAAGGACCAGAAGATCAGCATACTCTGGAGCCGATTGGTCAGAGTGAGAATGGCTCAAAGGGAGAGAGAGAGCTAGCACGGTCCTGCCTGCCTAAGGGAGGGAACAGCCAAGTAGTCAACTGGAGTATTAAGCCCACTAGAGGTCAAGTACACTGGAGGAAACAACCTACGTT46AGAAATCTCCCTTTTGACAGAACAACCATTATGGCAGCATTCAATGGGAATACAGAGGGGAGAACATCTGACATGAGGACCGAAATCATAAGGATGATGGAAAGTGCAAGACCAGAAGATGTGTCTTTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAGCGAGCCCGATCGTGCCTTCCTTTGACATGAGTAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTACGACAATTAAAGAAAAATACCCTTGTTTCTACT(SEQIDNO:4)MAGCAAAAGCAGAGGTCGAAACGTACGTACTCGAGATCGCACAGAGACTTGTTGAGGTTCTCATGGAATGGACTAAGGGGATTTTAGGATTAGGACTGCAGCGTAGACGCTATCCAAATAACATGGACAAAGAGATAACATTCCATGGGGCTGCACTTGCCGGTAGATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGTAAAAAACTACCTTGTTTCTACT(SEQIDN0:5)NSAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGGATCCAAACACTGTGTCAAGC48TTTCAGGTAGTTGCAGACCAAGAACTAGGCGATCAGAAATCCCTAAGAGGGACAGCCACACGTGCTGGAAAATCCGATGAGGCACTTAAATACCTAACTGACATGACTCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCGATCATGGATAAGAACATCGACCGGCTGGAGACTCTAATAATTGTTGGCGAAATTTCACAGGATGTCAAAAATGCAGTTGATAACACAGTTCGAGTCTCCAGTAATGAGAATGGGAGACTGGCGGGAACAATTAGGTCAAGAAGTGAGACACAAACTGACATTTATGCAATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAAAGGGGCAGTACTCTCGGTCTGGACATCAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTGAGGAAATGTCAAGGGACTGGTCCATGCTCAGGCCCTCTTTGTATCAGAATGGACCAGGATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGGGAGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAA49AGCCTTACATCTATTGCTTGAAGTGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGT(SEQIDNO:6)HAACCTACTGGTCCTGTTATGTGCACTTGCAGCTGCAGATCACTGTTGACACAGTACTCGAGAAGAATGTGACAGTTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTATTTCATCGACTATGAGGAGCTGAGGGAGCAATTGAGGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGACTGTGGGGTATTCATCACCCGCCTAACAGTAAGGATGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATACGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCCGGCATCATCACCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGAGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTATTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAACACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCATCTGAGATTAGAATTTCAGAGATATGAGGAAAAACACCCTTGTTTCTACT(SEQIDNO:7)NAAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATT51<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>实施例2流感病毒A/HongKong/213/2003(H5N1，HK213)在鸡中全身地复制，引起致死性感染。此外，这个病毒对于鸡胚胎是致死的。因而，虽然它的表面蛋白质与当前传播的病原性的禽流感病毒是高度相关的，HK213不能用作疫苗毒林，因为在有胚鸡蛋中生长它的尝试引起了不良性质的尿嚢液的产生。另外，这种高毒力病毒在疫苗的生产中使用对于疫苗工作者是不安全的。为了测试使用A/PR/8/34作为主要疫苗毒林的可能性，HK213(含有多个碱性氨基酸)的血球凝集素(HA)基因的裂解位点从强毒表型突变成无毒表型(从RERRRKKR(SEQIDNO:29)到——TETR(SEQIDNO:30))。含有突变的HA基因的病毒在鸡中产生非致死的、局部的感染。另外，突变的病毒对于鸡胚胎是非致死性的。因而，有胚鸡蛋中突变病毒的生长产生高质量的尿嚢液，并且在这种减毒的形式中，病毒对于疫苗生产者是安全的。含有来自HK213的神经氨酸酶(NA)和突变的HA基因、以及来自在鸡蛋中比其他A/PR/8/34PR8毒株生长更好10倍(1010EID50/ml;HA滴度:1:8,000)的高滴度A/PR/8/34(H1N1,HG-PR8)病毒(实施例1)的所有其余基因的重组病毒，在有胚鸡蛋中产生。这种重组病毒表达与当前传播的病原性禽流感病毒相关的表面蛋白质，在有胚鸡蛋中生长到高滴度(附图1)。因而，用当前传播的流感病毒毒抹的基因替换HG-PR8的HA和NA基因产生了可以安全地生产的疫苗毒株，并展现了PR8-HG作为主疫苗毒抹的用途。实施例3在1997年香港，高度病原性的H5N1禽流感病毒从鸟类直接传播给人类，引起18起确认的感染和6起死亡(Subbarao等，1998;Claas等，1998)。在2004年6月，H5N1病毒的地理分布扩展到亚洲，波及几个邻近的欧洲国家和非洲。总共地，在越南、泰国、柬埔寨、印度尼西亚、中国、土耳其和伊拉克，感染病毒的96人死亡(Li等，2004;WHO)。这些致死的发作和大流行的持续威胁导致了用于人类的H5N1病毒疫苗的开发。然而，由于病原性的H5N1病毒在有胚鸡蛋中难以生长并构成对疫苗生产者的严重生物安全问题，反向遗传学53-故用于产生疫苗候选物(Subbarao等，2003;Webby等，2004;Stepha謂n等，2004;Wood&Robertson,2004)。具有来自病原性H5N1毒抹的修饰的无毒力类型血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因、以及来自在鸡蛋中生长良好的供体病毒的所有其余基因的重组(6:2重配体)病毒，处于通过这种方法产生的候选物之中。世界卫生组织(WHO)建议A/PuertoRico/8/34(H1N1;PR8)作为供体病毒，由于它在人类中的安全性和在蛋中的旺盛生长(Wood&Robertson,2004;Webby&Webster,2003)。近来，显示的是这种重组病毒与野生型PR8毒株相比在鸡蛋中生长的不那么好，虽然它们具有相同的PR8"内部"基因(即，除了HA和NA之外的基因)(Horimoto等，2006)。由于在蛋中的旺盛生长是灭活疫苗的生产中使用的疫苗种子病毒的重要性质，如下所述的，产生了在蛋中与PR8供体毒抹生长得一样好的H5N1疫苗候选物。首先，通过使用在鸡蛋中不良生长的PR8和WSN毒抹之间的重配体分析确定对这种性质负责的基因，确定了PR8在蛋中的高度生长的分子基础。发现的是，HA-NA平衡和PB1功能是重要的生长决定因素。根据这种认识，产生了具有PR8背景的、具有改变的HA-NA组合的一系列H5N1病毒，相对于更常规的6:2重配体，包括WHO建议的NIBRG-14病毒来评估它们在鸡蛋中的生长。方法细月包,口病毒293T人类胚肾细胞维持在具有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco修饰的Eagle's最低必需培养基(DMEM)中。Madin-Darby犬肾脏(MDCK)细胞在具有5%新生小牛血清和抗生素的MEM中生长。为在人类疫苗生产中使用的生物安全测试之后建立的非洲绿猴VeroWCB细胞(Sugawara等，2002)维持在具有抗生素的无血清的VP-SFM培养基(GIBCO-BRL)中。细胞维持在5%C〇2、37。C中。分离自人类的A/Vietnam/1194/2004和A/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1194和VN1203)毒株，在37。C在10天龄有胚鸡蛋中增殖2天，在这之后，收获含有病毒的尿嚢液，用于进一步的实验。使用这些病毒的所有实验在3级生物安全防范实验室中进行。WHO建议的疫苗种子病毒NIBRG-14(VN1194/PR86:2重配体病毒)由英国国家生物学标准和控制学会的Drs.JohnWood和JimRobertson好意地赠送。质粒的构建和反向遗传学为了产生A型流感病毒的重配体，使用了基于质粒的反向遗传学(Neumann等，1999)。来自VN1194或VN1203的病毒RNA同使用商业的试剂盒(ISOGENLS,NipponGene)从尿嚢液提取，通过使用逆转录酶(SuperscriptIII;GIBCO-BRL)和含有H5病毒的RNA片段的3'末端的共有序列的引物来转变成cDNA。全长cDNA然后用ProofStart聚合酶(QIAGEN)和H5亚型特异性引物对PCR扩增，克隆到质粒中处在人类聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子的控制下(Poll质粒)，产生分别含有VN1194或VN1203HA基因的PolI-VN1194/HA或PolI-VN1203/HA构建体。通过利用背对背引物对的逆反PCR，之后连接，野生型VN1194或VN1203病毒的HA裂解位点序列(RERRRKKR;SEQIDNO:29)^皮改变，来产生无毒力类型的序列(RETR;SEQIDNO:31),如在Horimoto等(2006)中描述的，其^^开内容通过引用合并在此。含有VN1203NA基因的PolI-VN1203NA通过使用Nl特异性引物的RT-PCR操作(如上所述)来构建。通过逆反PCR制备一系列的pPollNA突变体。使用PolI-VN1203NA作为模板，构建pPolI-NAfill,其编码来自A/goose/Guangdong/1/96(H5N1;GsGd96)NA、插入48-Pro和49-Ile之间的的20个氨基酸(aa)(CNQSIITYENNTWVNQTYVN;SEQIDNO:32)的插入物的突变NA。如Castrucci等(1993)所描述的构建pPolI-NAfill.N2和-NAfill.N2N9，其中来自每种NA亚型的茎部区域的N2(12aa)或N2+N9(12+12aa)序列被插入42-Asn和43-Gin之间的茎部中。所有这些构建体进行测序来确保不存在不需要的突变。使用了来自A/WSN/33(H5N1;WSN)和PR8毒4朱的早先生产的Poll构建体系列用于反向遗传学。(Horimoto等，2006;Neumann等，1999)。另夕卜，在这项研究中使用了含有来自A/HongKong/213/03(H5N1;HK213)和A/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)的NA基因的Poll构建体(Horimoto等，2006;Kobasa等，2004;Peiris等，2004)。55处在鸡p-肌动蛋白启动子控制下表达WSN或PR8NP、PA、PB1或PB2的质粒一皮用于所有反向遗传学实验(Horimoto等，2006;Neumann等，1999)。简要地，Poll质粒和蛋白质表达质粒与转染试剂Trans-IT293T(Panvera)混合，在室温下孵育15分钟，然后添加到293T细胞。转染的细胞在Opti-MEMI(GIBCO-BRL)中孵育48小时。对于在VeroWCB细胞中的反向遗传学，电极(Amaxa)被用来根据厂家的说明书转染质粒混合物。转染后十六小时，新制备的VeroWCB细胞添加到转染的细胞上，6小时后向培养物添加TPCK-胰蛋白酶(1|ug/ml)。转染的细胞在无血清VP-SFM中孵育总共4天。收获含有传染性病毒的上清液，通过限制稀释在有胚鸡蛋中生物学克隆，并用于进一步的实验。在蛋中病毒复制的性质病毒接种到IO天龄的有胚鸡蛋的尿嚢腔中，在37。C孵育48小时。尿嚢液中的病毒然后通过利用0.5%鸡红血球或0.8%豚鼠红血球或在蛋中的HA分析来滴定，以确定病毒的中值蛋传染性剂量(EID5o)/ml。对于某些病毒，用MDCK细胞和TPCK胰蛋白酶(1|ig/ml)进行噬菌斑滴定。在接种1(^EID5o的的之后在蛋中评估某些病毒的生长动力学。鸡红血3求的病毒洗脱分析含有1:1024的HA滴度的病毒的50pl两倍稀释物在微量滴定板中与50)il的0.5%鸡红血球在4。C孵育1小时。平板然后在37。C保存，周期性地记录HA滴度的降低。具有6.8mMCaC12的磷酸盐緩冲盐水用作稀释剂。结果PR8在鸡中的高生长性质的分子基础虽然PR8是WHO推荐的用作供体病毒来产生基于反向遗传学的H5流感疫苗，它的高生长性质的分子基础是不完全了解的。据说M基因对于PR8在蛋中的旺盛生长负责(Subbarao等，2003),但是这个声明在公开的原始数据中没有找到(Kilbourne等，1969)。因而，利用在蛋中不良生长的WSN毒抹进行了重配体分析。表3显示了就在有胚鸡蛋中的病毒生长而言PR8对比WSN毒林的HA和NA之间的相容性。所有的重配体测试病毒比野生型WSN生长得更好，但是低于蛋适应的PR8,表明表面糖蛋白和内部蛋白质都对PR8的高生长性质负责。表3.通过在有胚鸡蛋中的病毒生长评估的PR8对比WSN毒4朱的HA和NA之间的相容性_重配体的基因构成HA滴度b)HANA6种其他的》鸡RBC豚鼠RBCWSNWSNWSN16/832/8PR8WSNWSN64/3264/32WSNPR8WSN16/1632/16PR8PR8WSN128/128128/128WSNWSNPR864/6464/64PR8WSNPR864/12864/128WSNPR8PR8512/512512/512PR8PR8PR82048/20482048/2048a)编码内部蛋白质PB1、PB2、PA、NP、M和NSd和基因。b)用0.5%鸡RBC和0.8%豚鼠RBC在HA分析中评估的每种重配体病毒在鸡蛋中的生长显示了来自两个独立实验的HA滴度。由于与PR8的相比，含有PR8糖蛋白和来自WSN的所有六种内部蛋白质的重配体病毒的生长在蛋中剧烈地降低(表3和4),产生了一系列的重配体病毒来确定对这种性质负责的内部蛋白质。含有WSNPB1和来自PR8的所有其余基因的单基因重配体病毒不良地生长，处于与含有所有编码内部蛋白质的WSN基因的重配体类似的水平，而含有PR8PB1和编码所有其余内部蛋白质的WSN基因的重配体复制到高滴度(表4)。因而，与早先暗示M片段的作用的报告(Subbarao等，2003)相比，PR8PB1可能具有病毒基因组在蛋中复制的最佳的聚合酶活性。表4通过在有胚鸡蛋中的病毒生长评估的、在PR8和WSN病毒的编码内部蛋白质的基因之中的相容性重配体的基因构成a)<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>"在所有重配体病毒中HA和NA基因都来源于PR8,而编码内部蛋白质的一些基因来自WSN毒株。W使用在0.5。/。鸡RBC中的HA分析评估每种重配体病毒在鸡蛋中的生长速度。显示了三个独立实验中获得的HA滴度。具有在鸡蛋中增强的生长能力的H5N1疫苗种子候选物的产生在较早的研究中，显示了WSN在蛋中的生长通过延长NA茎部以提高NA功能来增强茎部越长，病毒的复制越好(Castmcci等，1993)。这个发现促使产生一系列的H5N1病毒，其包含具有PR8背景的突变的或异源的Nl,并比较它们在蛋中的生长。A/Vietnam/1203/2004(H5N1;VN1203)NA含有在它的茎部区域中的20-氨基酸(20-aa)删除(因而，茎部中的24aa)。因此，构建了突变的NA,VN1203fi11,其含有象H5N1前体病毒A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)的44-aa的茎部(Xu等，1999)，以及其他的NA突变体，VN1202fill.N2和VN1203fill.N2N9，其含有较长的茎部，分别是58-和72-aa(附图2)。还检查了在茎部中含有44-aa的来自A/HongKong/213/03(H5N1;HK213)的异源N1。还测试了来自H1N1毒4朱例如PR8、A/Kanagawa/173/2001(H1N1;Kanagawa)和WSN的NA,所有这些都在茎部中具有24aa。利用这些NA构建体，产生了总共八种重配体病毒，七种6:2和一种7:1，具有修饰的无毒力型VN1203HA和PR8背景(表5)。用修饰的无毒力型的A/Vietnam/1194/2004(H5N1;VN1194)HA构建了其他系列的重配体病毒。通过与含有亲本VN1203NA的构建体比较，仅含有修饰的VN1194HA和VN1203fi11NA的组合的7:1重配体病毒和6:2重配体显示了在蛋中的增强的生长。表5H5N1/PR8重配体病毒在有胚鸡蛋中的病毒滴度a)HA滴^传染性滴度(1og2/logwEID5o/ml)实来自以下的NA《野生型HAb)验VN12(BVN1203fi11VN咖MN2VN120SffllN2N9HK213PR8WSN環203192ifl.4/8.9df)3s9.6ifl.5/8.8i0.69:2ifi.5/8.9:!fl.49.0ifl.0/8.8iD.59劍.5/8細.19滅4A4ifl2<1.0膨10.7±0.6/103±0.429.肚歸.4ifl29細.0".7i0283iD.6/8.6:!￡)28.01fl.0/ND8.7iD.6/8.51D.39.7ifl.6/10.1±O2ND/NDND/ND11舰0/lO3也4VN119418.7ifi.6/8.7:!fl29.3ifl.6"3±0.293i0.6"2遊9.0iD.0/8.6ifl2ND扁9.0ifl廳:tf).9<1.0/5，210.7iflM0.im2&)用病毒(104EID50)接种蛋(10天龄)，在37。C孵育48小时；测定尿嚢液中的病毒滴度。W两种H5HA基因(VN1203和VN1194)被用于产生具有PR8背景的重配体病毒。VN1203和VN1194的HA裂解位点被修饰成无毒力型H5HA的。￡)对于VN1203构建体，使用3到5个蛋进行两个独立实验，而对VN1194进行单次实验。。总共八个NA基因被用于产生重配体病毒；制备三个插入突变的NA(VN1203fi11、VN1203fill.N2和VN1203fill.N2N9)通过与亲本VN1203NA比较来评估NA茎部长度对蛋中的病毒生长的影响；其他NA来自H5N1人类分离物(HK213)或H1N1病毒(PR8，Kanagawa和WSN)。因而，除了含有PR8NA(7:1重配体)的之外所有的重配体病毒是具有PR8背景的6:2重配体病毒。6)还评估了野生型PR8的生长作为每个实验的对照。O通过HA或传染性分析评估了每个重配体病毒的生长，报告为HA滴度的平均值士s.d.(1og2)/传染性滴度的平均值士s.d.(logl。EID5Q/ml)。通过与含有VN1203HA和VN1203NA或VN1194HA和VN1203NA的标准病毒的相比，显著增强的HA和传染性滴度(p<0.05，t-测验)以黑体字显示。ND,没有测定。通过储备病毒的噬菌斑分析的选定重配体病毒的进一步测试展现了与含有亲本VN1203NA的病毒相比，含有PR8NA的重配体病毒的高于3倍的滴度(p=0.003，Studentt-test)，而它不象蛋适应的PR8生长得那么好(附图3)。具有PR8、VN1203fi11或VN1203NA的重配体病毒在蛋中的生长动力学的评估显示了具有PR8NA的病毒(7:1重配体)的优越的生长速度(附图4)。为了测定在7:1重配体病毒中观察到的高生长性质的分子基础，通过评估鸡红血球的病毒洗脱物的分析来测试了重配体病毒的NA功能(附图5)。含有PR8或VN1203fi11NA的重配体病毒与亲本VN1203NA的相比更快速地从红血球洗脱，表明PR8或VN1203fill.NA的更高的NA活性。这些结果支持了高NA功能增强蛋中的病毒生长的思想(Cast脇i等，1993)。使用WHO建议的疫苗种子病毒NIBRG-14在这项研究中产生的H5N1疫苗种子候选物在蛋中的生长比较为了验证候选种子病毒在H5N1疫苗的生产中的潜力，在相同的实-险条件下与WHO提供的NIBRG-14病毒的传染性滴度比较它们的传染性滴度。含有VN1194或VN1203衍生的HA和来自我们的PR8毒抹的所有其他基因的7:1重配体病毒在蛋中显示了比NIBRG-14病毒显著更高的滴度(p<0.05,Studentt-test),如通过EID50(表6)和噬菌斑滴定(附图6)所评估的。有趣地，通过噬菌斑滴定，即使是含有来自VN1194病毒的HA和NA的6:2重配体病毒也比NIBRG-14(以及VN1194/PR86:2重配体病毒)生长得显著更好(约7倍，口=0.047)(附图5)。在具有相同的VN1194HA和NA的两种6:2重配体病毒的生长中的这种差异表明，这项研究中使用的PR8毒株对于在蛋中的疫苗生产期间支持高的病毒生长要优于用来产生NIBRG-14的毒林。表6在这项研究中使用WHO建议的疫苗种子病毒(NIBRG-14)产生的H5N1/PR8重配体病毒的比较a)<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>^通过用每种病毒接种蛋(r^3)、在指定的时间收获尿嚢液、并测定EID5G,来评估重配体病毒的生长。数据显示为传染性滴度的平均值土s.d.(log1QEID5。/ml)。通过与NIBRG-14的比较显著地增强的传染性滴度(p<0.05，t-test)以黑体字显示。W通过HA/NA的衍化来分类。VN1203和VN1194的HA裂解位点都^1修饰为无毒力型H5HA的。200780020095.1转滔也被54/593讨论产生了具有都来自H5N1人类分离物的修饰的无毒力型HA和NA基因、以及来自PR8毒抹的所有其余基因的重组病毒(6:2重配体)，并用作种子疫苗用于现在在人类临床实验中测试的灭活流感疫苗(Wood&Robertson,2004)。这样使用的种子毒4朱必须在有胚鸡蛋中生长良好。虽然蛋适应的PR8满足这些要求，某些6:2重配体病毒尽管含有来自PR8的六种内部基因，不在蛋中生长良好(表3和5)。在此展现的是，蛋适应的PR8在鸡蛋中的生长收到HA和NA表面糖蛋白的功能平衡的影响。可能的是，具有PR8背景和来自高病原性禽类病毒的表面糖蛋白的某些6:2重配体病毒的低产量不仅是产自关于在蛋中生长的HA-NA功能不平衡，还来自PR8的禽类表面糖蛋白基因和内部基因之间的遗传(和/或功能)不相容性。在此显示的是，在PR8的内部基因之中，PB1对于它在蛋中的高生长是非常重要的。这个信息暗示了基于反向遗传学的H5N1疫苗生产的另一种策略；也就是说，单独的PB8PB1基因可能足以产生用于疫苗种子病毒的强力生长的重配体。因而，通过使用来自PR8以外的毒株的、编码非PB1内部蛋白质的基因，人们可以避免禽类和PR8病毒之间的遗传学不相容性。剖析PR8PB1在蛋中的高生长性质的分子基础的研究将是相当令人感兴趣的。例如，人们将分析PR8和WSN的PB1或PB1-F2之间的结构和功能差异(其分别相差18和10个氨基酸；Chen等，2004)。这项研究中产生的7:1重配体病毒比WHO建议的6:2重配体病毒NIBRG-14复制得显著更好(噬菌斑滴定超过20倍)。即使除了来源的PR8毒林之外与NIBRG-14相同的6:2重配体也比建议的病毒复制更好7倍。这些发现表明，这项研究中使用的PR8毒株可能是用于基于反向遗传学的流行疫苗生产的优越的供体病毒。人们可以争辩说，由于NA蛋白质中的抗原性差异，7:1重配体病毒将诱导保护性免疫反应的损失(虽然PR8和高度病原性的病毒都含有N1NA)(Murphy等，1972;Kilboume等，1968;Chen等，2000)。然而，由于HA是灭活疫苗中主要的保护性抗原，PR8NA所赋予的更高的生长性质将可能补偿这种较小的保护性抗原中有限的抗原性错配。在高病原性禽流感病毒引起的大流行的情况下，鸡蛋将供应短缺。提出的是在这种情况下，具有在蛋中增强的生长性质的基于7:1重配体的疫苗种子病毒将提供了用于基于反向遗传学的H5疫苗病毒产生的吸引人方案。实施例4为了鉴定对于H5N1疫苗种子病毒在有胚鸡蛋中的高生长速度负责的基因，评估了具有PR8(UW)或PR8(Cambridge)内部基因的重配体H5N1病毒在有胚鸡蛋中的生长(附图7)。所有重配体病毒的HA和NA基因都来自A/Vietnam/1194/2002。所有其他基因来自PR8(UW)或PR8(Cambridge),其还提供了NIBRG-14疫苗毒抹的非HA和非NA基因。当大部分内部基因来自PR8(UW)时获得了更高的滴度。M和NS基因对病毒在有胚鸡蛋中的生长的影响在附图8中显示。对于PR8(UW)/1194誦CamM和PR8(UW)/1194-CamNS,M和NS基因片段分别来源于PR8(Cambridge),而另一个内部片段来自PR8(UW)。HA和NA片段来源于A/Vietnam/1194/2004。最高的滴度是PR8(UW)的M基因片段和PR8(Cambridge)的NS基因。附图7-8中的结果显示了PR8(UW)的聚合酶亚单位(PA、PB1和PB2)和NP基因增强了H5N1疫苗种子病毒在有胚鸡蛋中的生长。并且，PR8(Cambridge)的NS基因增强了H5N1疫苗种子病毒在有胚鸡蛋中的生长。为了鉴别对于H5N1疫苗种子病毒在MDCK细胞中的高生长速度负责的基因和氨基酸，评估了PR8(UW)/1194和NIBRG-14病毒在MDCK细胞中的生长。附图9中的数据显示了，在MDCK细胞中，PR8(UW)/1194的生长显著好于NIBRG-14的。此外，PR8(UW)的PB2片段增强了疫苗种子病毒在MDCK细胞中的生长(附图10)。在PR8(UW)的PB2中位置360的酪氨酸残基可能对疫苗种子病毒在MDCK细胞中的高生长速度负责(附图11)。为了鉴定对于H5N1疫苗种子病毒在MDCK细^9包中的高生长负责的基因的组合，测定了具有不同的HA、NA和NS基因的重配体的MDCK细胞中的生长速度。来自PR8(Cambridge)的NS和具有长茎64部的NA(例如，来自A/HongKong/213/2003或VN1203Fi11)增强了病毒在MDCK细胞中的生长(附图12)。为了确定NS中的哪些氨基酸对H5N1疫苗种子病毒在MDCK细胞中的高生长速度负责，测量了含有异源NS片段的H5N1疫苗种子病毒在MDCK细胞中的生长。在NS1的位置55处从K[PR8(UW)NS]到E[PR8(Cambridge)]的氨基酸替换增强了H5N1疫苗种子病毒在MDCK细胞中的生长(附图13)。附图14概括了在有胚鸡蛋或MDCK细胞中具有高生长能力的H5N1疫苗种子病毒的基因型。参考文献Avery'sDrugTreatment:PrinciplesandPracticeofClinicalPharmacologyandTherapeutics,3rdedition,ADISPress,Ltd.,WilliamsandWilkins，Baltimore,MD(1987).Aymard-Henry等,Virology:APracticalA叩roach,OxfordIRLPress,Oxford,119-150(1985).Bachmeyer，Intervirologv,5:260(1975).Berkow等,eds.,TheMerckManual，16thedition,Merck&Co.,Rahway,NJ(1992).Bridgen等，Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A,21:15400(1996).Castrucci&Kawaoka,J.Virol.,^Z:759(1993).Castrucci等，J.Virol.,^￡:2725(1995).Chen等，Emerg.Infect.Dis.,M:630(2004).Chen等，Vaccine,腦214(2000).Claas等，Lancet,351:472(1998).Conzelmann等，J.Gen.Virol.,22:381(1996).Conzelmann等，TrendsMicrobiol.,4:386(1996).Conzelmann,A腿.Rev.Genet，12:123(1998).Cozelmann等，J.Virol.，^:713(1994).Edwards,J.InfectDis.,169:68(1994).Enami等，Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.,^2:3802(1990).Enami等，Virology,185:291(1991).65Fodor等，J.Virol.,21:9679(1999).GrandandSkehel，Nature,NewBiology,238:145(1972)Hatta等，Science,221:1840(2001).Horimoto等，J.Virol.,組3120(1994).Horimoto等，Vaccine,M:3669(2006).Keitel等，inTextbookofInfluenza,eds.Nickolson,K.G.,Webster,R.G.，andHay,A.(Blackwell，Oxford),pp.373-390(1998).Kendal等，InfectImmunity,2^:966(1980).Kilbourne等，J.Virol.,2:281(1968).Kilbo画e,Bull.M2WorldHealthOrg.,虹653(1969).Kilbo腦e,Bull.WorldHealthOrg.,化643(1969).Kobasa等，Nature,431:703(2004).Kovesdi等，丄Curr.Opin.Biotechnol.,旦:583(1997).Laver&Webster,Virology,^:511(1976).Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，21:4477(1995).Li等，Nature,430:209(2004).Marriott等，Adv.VirusRes.,2:321(1999).Mizrahi,(ed.),VimlVaccines,Wiley隱Liss,NewYork,39-67(1990).Munoz等，AntiviralRes.,4^:91(2000).Murphy等，NewEngl.J.Med.，,:1329(1972).Murphy,Infect.Dis.Clin.Pract，&174(1993).Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，M:5177(1991).Nagai等，Microbiol.Immunol.，41:613(1999).Nagai,Rev.Med.Virol.,2:83(1999).Neumann等，Adv.VimsRes.,，65(1999).Neumann等Ncumami等N6unmmi等Neumann等[.Gen.Virol.,83:2635(2002)J.Virol.，21:9690(1997).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:9345(1999)■Virology,287:243(2001).Ogra等，J.Infect.Dis.,這499(1977).Co.Osol(ed.),Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingEastern,PA1324-1341(1980).Parks等，J.Virol.，21:3560(1999).Peiris等，Lancet,363:617(2004).Pekosz等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,￡^:8804(1999)Radecke等，EMBOJ.,14:5773(1995).Roberts等，Virology,247.1(1998).Robertson等，Biologicals,巡:213(1992).Robertson等,GiornalediIgieneeMedicinaPreventiva,29:4(1988).Rose,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,93:14998(1996),Schnell等，EMBOJ.,U:4195(1994).Stephenson等，LancetInf.Dis.,4:499(2004).Subbarao等，J.Virol.,@:7223(1993).Subbarao等，Science,279:393(1998).Subbamo等，Virology,305:192(2003).Sugawara等，Biologicals,祉303(2002).Webby&Webster等，Science,巡:1519(2003).Webby等，Lancet,巡:1099(2004).Wood&Robertson,Nat.Rev.Microbiol.,2:842(2004).WorldHealthOrganizationTSRNo.673(1982).WorldHealthOrganization.ConfirmedhumancasesofavianinfluenzaA(H5N1).Xu等，Virology,261:15(1999).所有公开物、专利和专利申请通过引用合并在此。虽然在以上的说明书中已经相对于某些优选的实施方式描述了本发明，为了例示的目的阐述了许多细节，对于本领域技术人员明显的是，本发明对于其他实施方式是敏感的，在此描述的某些细节可以;故显著地改变而不背离本发明的基本原理。权利要求1.一种组合物，其包含7:1重配体的多种流感病毒载体，包含a)包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体，其中PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的cDNA具有来自在有胚蛋或MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的序列，并且其中所述HA的cDNA具有异源HA的序列；以及b)包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、以及包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体。2.—种组合物，其包含5:1:2或6:1:1重配体的多种流感病毒载体，包括a)包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可才喿作地连接的启动子的载体，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的序列，其中NS的cDNA来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒，其中NA的cDNA来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒或具有异源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有异源HA的序列；以及b)包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体。3.—种组合物，其包含5:1:1:1或6:1:1重配体的多种流感病毒载体，包括a)包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有来自在MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的序列，其中NS的cDNA来自在MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒，其中NA的cDNA具有异源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有异源HA的序列；以及，b)包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片^R可操作连接的启动子的载体。4.权利要求1到3的任一项的组合物，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA编码多肽，所述多肽具有与SEQIDNO:1-5编码的相应多肽基本上相同的氨基酸序列。5.权利要求1到3的任一项的组合物，其中NA、PB1、PB2、PA、NP、M和NS的cDNA编码多肽，所述多肽具有与SEQIDNO:1-6和8编码的相应多肽基本上相同的氨基酸序列。6.权利要求3的组合物，其中NS的cDNA编码多肽，所述多肽具有与SEQIDNO:38编码的相应多肽基本上相同的氨基酸序列。7.权利要求1到6的任一项的组合物，其中所述启动子是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T3启动子或T7启动子。''8.权利要求1到7的任一项的组合物，其中所述HA是A型HA。9.权利要求1到7的任一项的组合物，其中所述HA是B型HA。10.权利要求1到8的任一项的组合物，其中所述NA是Nl。11.权利要求1到8的任一项的组合物，其中所述HA是H5。12.权利要求1到11的任一项的组合物，其中a)的多种载体包含RNA聚合酶I启动子或RNA聚合酶II启动子。13.权利要求12的组合物，其中RNA聚合酶I启动子是人类RNA聚合酶I启动子。14.权利要求1到12的任一项的组合物，其中b)的所有载体g含RNA聚合酶II启动子。15.权利要求1到14的任一项的组合物，其中a)的每种载体处在独立的质粒上。16.权利要求1到14的任一项的组合物，其中b)的每种载体处在独立的质粒上。17.权利要求1到16的任一项的组合物，其中b)的每种载体进一步包含RNA转录终止序列。18.权利要求1到17的任一项的组合物，其中所述NA或HA是嵌合的NA或HA。.19.权利要求1到18的任一项的组合物，其中HA的cDNA不编码多肽，所述多肽相应于SEQIDNO:7编码的多肽。20.权利要求1或2的组合物，其中NA中茎部的长度大于20个氨基酸。21.权利要求1、2或3的组合物，其中所述HA是无毒力的H5HA。22.—种制备流感病毒的方法，其包括以有效产生传染性流感病毒的数量用以下之一接触细胞包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体，其中PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的cDNA具有来自在有胚蛋或MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS的序列，和其中所述HA的cDNA具有异源HA的序列；以及包含与编码流感病毒PA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒Ml的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体；包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的序列，其中NS的cDNA来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒，其中NA的cDNA来自在有胚蛋中复制到高滴度的一种或多种流感病毒或具有异源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有异源HA的序列；以及包含与编码流感病毒PA的DNA片l殳可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片段可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体；或包含与连接到转录终止序列的流感病毒PAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB1cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒PB2cDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒HAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NPcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒NAcDNA可操作地连接的启动子的载体，包含与连接到转录终止序列的流感病毒McDNA可操作地连接的启动子的载体，以及包含与连接到转录终止序列的流感病毒NScDNA可操作地连接的启动子的载体，其中PB1、PB2、PA、NP和M的cDNA具有来自在MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒的序列，其中NS的cDNA来自在MDCK细胞中复制到高滴度的一种或多种流感病毒，其中NA的cDNA具有异源NA的序列，以及其中HA的cDNA具有异源HA的序列；以及包含与编码流感病毒P乂的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB1的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒PB2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NP的DNA片l殳可操作连接的启动子的载体、任选的包含与编码流感病毒HA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒NA的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒Ml的DNA片段可操作连接的启动子的载体、包含与编码流感病毒M2的DNA片段可操作连接的启动子的载体、或包含与编码流感病毒NS2的DNA片段可操作连接的启动子的载体。23.权利要求22的方法，进一步包括分离所述病毒。24.通过权利要求23的方法获得的病毒。25.用权利要求24的病毒感染的细胞。26.权利要求25的细胞，其是有胚蛋中的细胞。27.权利要求23的细胞，其是MDCK细胞。28.—种免疫个体对抗病原体的方法，包括向所述个体施用有效免疫所述个体的数量的权利要求24的病毒。29.—种分离的重组流感病毒，包含来自在有胚蛋中复制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M和NA的病毒片段，在位置55具有Glu残基的NS的病毒片段，以及异源HA的病毒片段。>30.权利要求29的分离的重组病毒，其中复制到高滴度的流感病毒是PR8HG。31.—种分离的重组流感病毒，包含来自在有胚蛋中复制到高滴度的流感病毒的PB1、PB2、PA、NP和M的病毒片段，在位置55具有Glu残基的NS的病毒片段，来自在有胚蛋中或在MDCK细胞中复制到高滴度的病毒的NA的病毒片段，以及异源HA的病毒片段。32.权利要求31的分离的重组流感病毒，其中所述PB1、PB2、PA、NP和M的病毒片段来自PR8HG。33.权利要求31或32的分离的重组流感病毒，其中所述NA的病毒片段来自PR8。34.权利要求31或32的分离的重组流感病毒，其中所述NA的病毒片段对于PB1、PB2、PA、NP和M的病毒片段是异源的。35.权利要求31到34的任一项的分离的重组流感病毒，其中所述HA的病毒片段是H5的。36.包含权利要求24或29到35的任一项的分离的重组病毒的灭活的流感病毒疫苗。37.—种分离的重组流感病毒，其包含PB2的病毒片段，所述病毒片段编码在位置360处具有丝氨酸、并具有与SEQIDNO:3编码的相应多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的活性的PB2，但是所述病毒片段不编码具有SEQIDNO:3的PB2。38.权利要求37的分离的重组病毒，其具有相对于SEQIDNO:3的一个或多个但是低于20个替换。39.权利要求37的分离的重组病毒，其具有相对于SEQIDNO:3的一个或多个但是低于25个替换。40.权利要求38或39的分离的重组病毒，其中所述一个或多个替换包括保守性替换。全文摘要本发明提供了对于制备高滴度流感病毒有用的组合物，例如在没有辅助病毒的情况下，其包括来自在有胚鸡蛋或MDCK细胞中复制到高滴度的流感病毒分离物的至少五个内部基因。文档编号C07K14/11GK101472941SQ200780020095公开日2009年7月1日申请日期2007年3月29日优先权日2006年3月31日发明者堀本泰介,村上晋,河冈义裕申请人:沃弗-威斯康星校友研究基金会