专利名称：：用于诊断个体中破裂的动脉粥样硬化损伤的存在的肽的利记博彩app用于诊断个体中破裂的动脉粥样硬化损伤的存在的肽本发明涉及与个体中破裂的动脉粥样硬化斑块相关的抗体(repturedatheroscleroticplaque-associatedantidodies)相在的诊断试剂和诊断分析中的用途。动脉粥样硬化是一种动脉的慢性炎性疾病并且其特点在于脂类，细胞，细胞废物，细胞外基质的聚积和动脉内层膜(内膜)的钙化。这些累积形成所谓的动脉粥样硬化斑块。心血管疾病，当前，在西方社会是死亡和疾病的主要原因，很快将成为全世界的主要健康问题。包括心肌梗塞(MI)和中风的大量急性临床表现，不是由于进行性管腔狭窄和緩慢生长的、稳定的、动脉粥样硬化斑块的存在，而是由于在不稳定的斑块表面上闭塞性血栓的形成。现已很好地阐述了区别稳定和不稳定斑块的形态学标准，其包括大的脂核、薄的纤维帽和内皮蚀损的存在和纤维帽或不稳定斑块的周边区域内的炎性过程的存在。这些形态学标准的主要局限在于它们只能在介入术后应用。结果，无法实现用于非侵入性地识别不稳定或破裂的斑块的标记和在体外快速、敏感并且特异的用于识别具有破裂的或破裂倾向的损伤的患者的实验。尽管动脉粥样硬化发病机理方面的知识增加和有一些循环炎症标记，例如C-反应蛋白，纤维蛋白原和白细胞介素与心血管疾病相关的暗示，但是仍然难以轻易获得用于破裂的动脉粥样硬化损伤的非侵入性诊断的生物标志物和用于具有未来心血管事件的高风险的个体患者的识别的高预测值。因此，本发明的目的是提供一种这样的用于破裂的动脉粥样硬化损伤的非侵入性诊断的生物标志物。在鉴定本发明的肽的研究中，本发明的肽与患有破裂斑块的个体的血清中存在的抗体特异性结合。为了鉴定这些肽，使用了cDNA表达文库。为了创建主要在破裂的动脉粥样硬化损伤中表达的cDNA的表达文库，将主要在破裂斑块(rupturedplaques)(如Faberetal(CircRes.89:547-554(2001)所述)中表达的>3000cDNA的SSH库再克隆(re-cloned)，并且将cDNA以融合蛋白形式与丝状噬菌体M13的次要衣壳蛋白pVI—起表达。为了富集与来源于已知带有破裂斑块(在此定义为"破裂血清")的患者的混合血清(pooledsera)中的抗体特异性结合的肽，进行四轮连续的血清抗原选择(SAS)。随后，以ELISA检测各丝状噬菌体克隆，检测其是否与来自患有破裂性动脉粥样硬化斑块的个体的血清相互作用。当大部分噬菌体展示肽在来源于具有破裂性动脉粥样硬化损伤的患者的混合血清和来源于具有稳定斑块的患者的混合血清和健康对照都表现出阳性反应时，有四个克隆的阳性反应可以区分来源于具有破裂损伤的患者的混合血清与来源于具有稳定斑块的患者的血清和对照血清(见图10)。序列分析表明这四个克隆代表两种不同的抗原肽。进一步的，发明人着眼于仅与破裂血清反应两种抗原El(图1)和E12(图2)。用一大组个体血清检测克隆E1和E12(破裂血清，n=38;稳定血清，n=23;正常血清，n=10)。克隆El对38个破裂血清中的22个(58%)表现出明显的反应(OD45。样品均值/(OD45。空噬菌体均值+3,SD)比值>1)，与此相对，在检测的稳定血清和年龄与性别相匹配的对照血清中没有观察到反应。另外，在38个患者血清中的15个中(40%),克隆E12表现出增强的反应性，而稳定的血清和对照血清中没有检测到阳性(见图11A和B)。针对克隆El和E12的血清反应的组合，即使进一步使灵敏度增加到74%，其特异性仍然保持在100%(图11C)。为了测定观察到的破裂血清的阳性反应是否确实是由于来自破裂斑块的序列，将五种破裂血清与代表克隆El和E12的cDNA插入物的合成肽Ac-El-Lys-冊2(Ac-VRGFTMLTRLVLNLK-Niy和Ac-E12-Lys-NH2(Ac-VHIIRSSLIYALFTRSISNYK-NH2)、以及非特异性肽一起预温育。如图12A中所示，与肽Ac-El-Lys-NH2和Ac-El2-Lys-NH2—起预温育，明显抑制了特异性IgG抗体/噬菌体El和IgG抗体/噬菌体E12复合物的形成。相反，随机肽的加入不能抑制针对克隆El和E12的血清反应。由于检测抗克隆E1和E12的组合物的血清提高了分析的灵敏度到74%,因此对是否另外的噬菌体展示肽的包含物可以进一步增加灵敏度进行了检测。为此，来源于第4轮选择的一组192个随机选择的重组噬菌体用6种破裂血清，6种稳定血清和6种对照血清检测。所检测的192个克隆中，118个噬菌体展示肽表现出与至少一种破裂血清的阳性反应，而106个克隆单独地与一种或多种破裂血清相互作用。该组(panel)的106个克隆包含7种不同的重组噬菌体，所述重组噬菌体对于鉴定破裂血清具有100%的灵敏度和100%的特异性。表2'破划序列也示于图3-7中表2克隆mp1(SEQ工DNO:3)mp23(SEQ工DNO:4)mp36(SEQIDNO:5)mp64(SEQIDNO:6)mpl79(SEQIDNO;:7)氨基酸序列GSGGGSGGGQVGQIFRYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPRICYSPNHFPVSFGREFITRYVEFRAGTTALVLDYW丽工QPRTEKLNRLTIVCSLDGLTASHLPEPFQNEQRSPHHYVFFTDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNN,NTIGNW因此，本发明涉及与个体中的破裂的动脉粥样硬化斑块相关抗体相互作用的肽，该肽包含下列氨基酸序列之一的免疫反应部分'SEQSEQSEQSEQIDIDIDIDNO:NO:NO:NO:SEQIDNO:5:SEQIDNO:6:SEQIDNO:7VRGFTMLTRLVLNLVHIIRSSLIYALFTRSISNYGSGGGSGGGQVGQIFRYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPRICYSPNHFPVSFQREFITRYVEFRAGTTALVLDYWNNIQPRTEKLNRLTIVCSLDGI/TASHLPEPFQNEQRSPHHYVFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNNQKLNTIGNW在本发明的进一步的具体实施方式中，涉及抗原，其包含下述氨基酸序列之一的免疫反应部分SEQIDNO:8:SEQIDNO:9:SEQIDNO:10:SEQIDNO:11:GQVRGFTMLTRLVLNLGQVHIIRSSLIYALFTRSISNYSSREFITRYVSSKEFRAGTTAIjVILDYWNNIQPRTEKIiNRLTIVCSiLDGLTASHLPEP，EQRSPHHYVFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKN在本发明的另一个具体实施方式中涉及抗原，其包含下述氨基酸序列之一的免疫反应部分SEQSEQSEQSEQSEQSEQIDNO:IDNO:IDNO:IDNO:IDNO:IDNO:12:13:14:15:16:17:SEQIDNO:18:GSGGGSGGGPSRPDLLENSGQVRGFTMLTRLVLNLGSGGGSGGGPSRPDIiLENSGWH11RSSLIYALFTRSISNYGSGGGSGGGPSRPDLLENSGSGGGSGGGQVGQIFGSGGGSGGGPSRPDIiLENSRYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPRICYSPNHFPVSFQGSGGGSGGWAKSARSSREFITRYVGSGGGSGGWAKSARSS郎F跳TTALVLDYWNNI(2PRTEKLNRIiTIVCSLDGLTASHLPEPFQNEQRSPHHYVFF1FDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNGSGGGSGGGPSRPDIJiENSNQKXNTIGNW在本发明的进一步的具体实施方式中，涉及抗原，包含下述氨基酸序列之-SEQIDNOSEQIDNO:21SEQIDNO:22-的免疫反应部分:19:MPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLAL11GLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGS^GGSGGGPSRPDIJiENSGQVRGFTM]LTRI;VL肌SEQIDNO:20:MPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSD工SAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIF工FDVKQK工VSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDLIiENSGCVHIIRSIYALFTRSISNYMPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQLILPSNAIiPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDIiLENSGSGGGSGGGQVGQIFMPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSDISAGLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDIAENSRYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPRICYSPNHFPVSF(QMPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGWAKSARSSREE"ITRWMPVUGIPmRFLGFKLVTLFGYL^TFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSD工SAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGWAKSARS幼EFRAGTTALVLDYW画IQPRTEKLNRLT工VCSLDGLTASHLPEPFQ,RSPHHYVFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNMPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDLLENSNQKLNTIGNWSEQIDNO:23:SEQIDSEQIDNO:25:、23和25中的SGGGSGGGPSRPDLLENS部分来自pVI部分和pSP6B的连接肽。连接肽序列如黑体所示。斜体所示的氨基酸来自人工克隆序列。SEQIDNO:23-24GGWAKSAR部分来自pVI部分和载体pSP6C的连接肽。连接肽序列如黑体所示。斜体所示的氨基酸来自人工克隆序列。"免疫反应部分(Immunoreactivepart)，，在此定义为对应于SEQIDNO:1-25的氨基酸序列的部分，所述部分表现出与稳定血清和正常血清的反应相比增强的与破裂血清的反应活性。所述的免疫反应部分不需要额外的已知技术例如PepScanT"法就可以识别。在此所用的"增强的反应活性"，一般地，指根据本发明的肽与破裂血清的反应和相同肽与稳定血清和/或正常血清的反应之间的任何统计学上有意义的区别。更优选的，"增强的反应活性"表示比值(0D^样品均值/(OD^空噬菌体均值+X,SD)>1。优选的，X大于l，更优选的，至少为2，更优选的，为3或更多。"破裂血清(Rupturedserum)"是来源于有破裂斑块的一个个体的血清或来源于有破裂斑块的多个个体的混合血清(pooledserum)。"稳定血清，，是来源于个体的血清或多个个体的混合血清，所述个体有稳定斑块，但不存在破裂斑块的迹象。"正常血清，，是来源于个体的血清或多个个体的混合血清，所述的个体未患有临床相关的心血管疾病。本发明的肽包含与根据SEQIDN0S:1-25的氨基酸序列的免疫反应部分结构上同一或功能上相似的氨基酸序列或其保守变体。该肽除了构成免疫反应部分的氨基酸之外，可能包含另外的氨基酸，这些氨基酸可能对整个肽的免疫反应性有贡献，也可能没有，或可能有助于所述肽与固体支持物的结合，从而使得能够进行标记或用于其他目的。组成免疫反应部分的氨基酸不必要是连续的氨基酸。该肽的保守变体也是本发明的一部分。在此所用的术语"保守变体"表示用其它的生物学上相似的残基取代氨基酸残基。保守变体的举例包括疏水残基的取代，例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或曱硫氨酸，另外，或者是一个极性残基的取代，另外，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酸取代天冬酰胺等。术语"保守变体"还包括取代氨基酸替换非取代亲本氨基酸和/或非天然氨基酸替换天然氨基酸的使用，如果所述肽的抗体包含取代应。通过使用常规的筛选方法，例如通过用来自于已知患有破裂斑块的患者的血清检测保守变体抗原，本领域的技术人员很容易确定是否变体肽具有本发明的肽必须的生物学活性，而不必采用多余的实验。根据另一方面，本发明涉及用于检测个体中破裂的动脉粥样硬化损伤的诊断试剂，其中所述的试剂包含至少一种肽，所述的肽包含如SEQIDN0S:1-25任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分。在本发明优选的具体实施方式中，诊断试剂包含与仅使用一种肽相比，用于增加灵敏度的肽的组合物。适用的组合物是包含如SEQIDN0S:1、8、12和19任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的肽和包含如SEQIDN0S:2、9、13和20任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的肽一起。进一步的具体实施方式中，将一种或多种包含如SEQIDN0S:3-7，10-11，14-18和21-25任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的肽加入这种混合物。任选地，包含如SEQIDN0S:1、8、12和19任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的肽与包含如SEQIDN0S:3-7，10-11，14-18和21-25任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的一种或多种肽结合。在另一个可选的具体实施方式中，包舍如SEQIDNOS:2，9，13和20任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的肽与如包含SEQIDN0S:3-7，10-11,14-18和21-25任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分的一种或多种肽结合。此外，各个肽组合物可以包含一种以上的肽，所述的肽包含SEQIDN0S:1，8，12和19任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分，和/或一种以上的肽，所述的肽包含SEQIDN0S:2，9，13和20任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分，和/或一种以上的肽，所述的肽包含SEQIDNOS:3-7,10-11，14-18和21-25任一所示的氨基酸序列的免疫反应部分。上述的肽組合物可以作为一组肽，能够用于测定患有破裂的动脉粥样硬化损伤的个体中存在的抗体指紋。根据本发明，当被检测的样品中的抗体与至少一种本发明的肽反应时，样品是阳性的。本发明的肽可以是分离的肽，其至少包含SEQIDNOS:1-25任一的免疫反应部分。然而，这些肽或其免疫反应部分仍然可以存在于噬菌体中。因此，用于诊断个体中破裂的动脉粥样硬化损伤的存在的抗原可以是分离的肽还可以是噬菌体展示肽或包含本发明的肽的噬菌体裂解物。噬菌体可以是任何丝状噬菌体并且优选M13或其变体。根据其进一步的方面，本发明涉及一种方法，其用于诊断来源于个体的样品中抗体的存在，所迷的抗体指示个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在，其中样品与肽或诊断试剂接触并且检测所述的肽或试剂与抗体间形成的免疫复合物。在进一步的具体实施方式中，本发明涉及一种用于诊断来自个体的样品中抗体的存在的检测试剂盒，所述抗体指示个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在，其中检测试剂盒包含本发明的一种或多种抗原或诊断试剂和任选地用于使形成的免疫复合物可视化的工具(means)。被检测的来自个体的样品可以是体液，例如血液，血清，血浆等，或组织样品，优选动脉粥样硬化斑块组织。在样品中存在的抗体可以与抗原结合。除去不结合的抗原后，抗原-抗体复合物可以通过各种已知的技术的方法被检测并且定量。中，预先测定量的抗原(其是肽或诊断试剂)吸附于固相蛋白质结合表面。然后，用于分析抗体的检测样品与具有结合其上的抗原的表面接触。检测样品中的抗体与固化的抗原结合，因此形成抗原抗体复合物。随后该复合物被检测，通过任意检测试剂例如与抗原-抗体复合物中的固定的抗体结合的抗体-酶结合物。当通过酶作用时变色的底物用于定量结合的抗体-酶结合物的量，其指示检测样品中的抗体浓度。任选地，与抗原-抗体复合物中的抗体结合的检测试剂是放射性标记的试剂，优选抗体。然后，结合的检测试剂的量通过结合的放射活性的量的方法定量。在另一个具体实施方式中，抗原和被检测的抗体之间的免疫复合物被形成，然后从未结合的抗原和抗体中分离，例如通过在固体支持物上捕获复合物，并且定量。固体支持物可以是任何固体支持物，其在上面所描述的诊断分析中使用并且可以是例如，微量检测孔或试管、管或毛细管的内壁、膜、滤纸、试纸或颗粒表面，例如，举例为，乳胶粒、红细胞、染料溶胶，金属溶胶或溶胶颗粒形式的金属组合物，栽体蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。在优选的具体实施方式中，因此，本发明的诊断试剂可以包含一种或多种任何形式的肽，即如分离的肽，如噬菌体展示肽，如噬菌体裂解物中的肽等，和一种适合的支持物。在优选的具体实施方式中，底物。可用的标记底物为，特别的，放射性同位素，荧光化合物，化学发光化合物，酶，染料溶胶，金属溶胶或溶胶颗粒形式的金属化合物等。酶促标记系统的例子包含过氧化物酶/抗过氧化物酶(PAP)系统，碱性磷酸酶/抗碱性磷酸酶(APAAP)系统，亲和素-生物素和生物素-链霉亲和素系统。基于试剂的性质和进一步的特征，发生的免疫化学反应是所谓的夹心反应，凝集反应，竟争反应，抑制反应或其他检测方式。这些检测方式是现有技术已知的。用于检测样品中免疫复合物的形成的技术手段是已知的并且都属于本发明的范围，其基于与破裂的斑块相关的抗体结合的新的识别肽的使用。在此所用的"破裂的斑块相关的抗体"是指存在于来自患有发明的肽结合进行检测。正常血清或来自具有稳定斑块的个体的血清不具有明显的可检测量的与所述肽特异性结合的抗体。本发明将进一步在下列实施例中进行阐述并且不以任何方式限制于本发明。在说明书和实施例中参考下图。图1A表示克隆El的核苷酸序列。图1B表示克隆E1的氨基酸序列。图1C表示克隆El的全长融合蛋白。图2A表示克隆E12的核苷酸序列。图2B表示克隆E12的氨基酸序列。图2C表示克隆E12的全长融合蛋白。图3表示克隆mpl的全长融合蛋白。图4表示克隆mP23的全长融合蛋白。图5表示克隆mp36的全长融合蛋白。图6表示克隆mp64的全长融合蛋白。图7表示克隆mpl79的全长融合蛋白。图8表示具有pVI序列，连接肽和多克隆序列的空噬菌体展示栽体pSP6B的核苷酸序列和氨基酸序列。图9表示具有pVI序列，连接肽和多克隆序列的空噬菌体展示载体pSP6C的核苷酸序列和氨基酸序列。图10表示不同的抗原与混合破裂血清的反应。反应用OD^样品均值/(OD45。空噬菌体均值+3'SD)的比例表示。#-具有相同插入物的克隆。图ll表示与克隆El(A)和克隆E12(B)的血清反应。图11C表示克隆E1和E12的灵敏度和特异性。图12分别表示合成肽Ac-El-Lys-NH2和Ac-E12-Lys-NH2消耗人破裂血清的抗噬菌体E1(A)和E12(B)的抗体的能力。反应用0D45。样品均值/(OD45。空噬菌体均值+3,SD)的比例表示。实施例实施例1关于混合血浆的本发明的抗原的ELISA使用展示破裂斑块富含的cDNA表达文库的噬菌体的两种克隆在ELISA中检测这些克隆与混合患者血清的反应。为了选择主要在破裂的动脉粥样硬化损伤中表达的cDNAs表达文库的克隆，使用大于3000的石皮裂斑块的富含的cDNA的SSH文库(Faberetal.CircRes.89:547-554(2001)中描述)。所述文库再克隆到噬菌体展示载体pSP6A，B和C中(Huftonetal.JImmunolMethods.231:39-51(1999))。用这些载体，将SSHcDNA片段与丝状噬菌体M13的次要衣壳蛋白pVI以全安全在框阅读的形式连在一起使之以融合蛋白形式表达。用来自已知患有破裂的动脉粥样硬化斑块的患者的混合血清(=破裂血清)多轮选择后，两种如图1和2所示的克隆E1和E12被选出，因为它们表现出与混合的破裂血清增强的反应活性(比例为0Dw样品均值/0045。空噬菌体均值+3*80)(图10;背景-空噬菌体)。在96孔平底微量滴定板(Falcon,FranklinLakes,NJ)中进行筛选，所述的96孔平底微量滴定板在4"C用200n1兔抗人IgG(10"g/ml包被緩冲液)/孔过夜包被。随后，用PBST(PBS中0.1%(v/v)Tween20)两次冲洗板再用PBS两次冲洗，在室温下用2%MPBS(PBS中2%脱脂奶粉(=脱脂乳))封闭2小时，再用PBST冲洗3次和用PBS冲洗3次。在96孔圆底板中(Costar，Corning,NY)，50jul预吸附的混合血清(反复流经与E.coliTG1和感染的E.coliTG1裂解物的抗生素连接的Sepharose6MB柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)以除去与涉及噬菌体-宿主感染相关的抗原反应的抗体；2。/。MPBS中1:IOO稀释)加入到lOOja1以1:1在4%MPBS中稀释的粗噬菌体上清液中。混合物在37匸孵育1小时，然后在室温下孵育30分钟。下一步，预温育的血清-噬菌体混合物转移到封闭并冲洗的兔抗人IgG包被的微量滴定板，并在37t:孵育l小时，然后在室温下孵育30分钟。冲洗后，加入150pl(在2。/。MPBS中1:5000)结合抗噬菌体(抗M13)单克隆抗体(Amersham，Uppsala，Sweden)的辣根过氧化物酶(HRP)并在室温下孵育1小时。冲洗后，每孔加入100jLi13，3、5，5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液(10mg/ml)。通过加入50jil2NH2S04/孔终止反应。在450nm下用Novapath微量滴定板分才斤4义(Biorad，Hercules,CA)分析平板。使用个体患者血清的ELISA基本如上所述。不过，不用进行抗细菌和噬菌体相关蛋白的血清的吸附，因为在背景信号中观察不到吸附的和未吸附血清的区别。各个检测进行三份三次。批内和批间的变率都<5%。4个克隆(Al，A7，El和E12)表现出对混合的破裂血清的增强的反应活性(比例为0045。样品平均值/0045。抗噬菌体平均值+3*30)，与它们对稳定的和正常血清的反应活性相比(见图10)。因此，这些抗原表现出破裂斑块特异性抗体信号。此外，双倍稀释血清和减少重组噬菌体的量导致ELISA反应活性的降低，明显表示了所观察的相互作用的特异性(数据未出示)。实施例2抗原El和E12的详细血清学分析用大量个体血清检测克隆El和E12(n-38对应破裂血清，n=23对应稳定血清，和n-10对应正常血清)。表1显示了详细的患者特征。血清样品获取自进行周围血管手术的患者(DepartmentofGeneralSurgery,AcademicHospitalMaastricht)并且在-20EC储存。对照血清(n=10)源自年龄和性别相同的血液捐赠者(n-10)，来自荷兰血库(Sanquin)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在38个破裂血清的22个中，克隆El表现出显著的反应活性(58%)，但对检测的稳定血清和年龄和性别相同的对照血清种没有观察到反应活性。另外，在38个患者血清的15中，克隆E12表现出增强的反应活性(40%),而稳定血清和对照血清都未检测到阳性(见图IIA和B)。针对克隆El和E12的血清反应活性的组合，将灵敏度进一步增加到74%，而特异性保持在100%(图11C)。实施例3破裂斑块特异性抗原组的血清学分析抗克隆El和E12的反应活性组合增加分析的灵敏度到74%。因此，检测包括的克隆的量的扩增是否可以进一步增加灵敏度。因此，检测6种破裂血清，6种稳定血清和6种正常血清与来自4轮选择的一组192个随机选择的重组噬菌体的反应活性。用这组192个克隆，获得一种用于鉴定的100%灵敏度和100%特异性的破裂血清。单独地与一种或多种破裂血清反应的55个克隆与克隆El同一，同时36个克隆与克隆E12同一。另外的15个克隆还单独地与破裂血清相互作用。这15个克隆具有如表2中给出的5个不同的氨基酸序列。实施例4合成肽与破裂血清的反应活性的抑制为了检测是否观察到的破裂血清的反应活性是由于克隆的特异性，来源于破裂斑块的，cDNA插入序列，5种破裂血清与代表由噬菌体克隆El和E12表达的蛋白VI-破裂斑块特异性抗原融合蛋白的克隆特异性部分的合成肽El(Ac-VRGETMLTRLVLNLKNH2)和E12(AC-VHIIRSSLIYALPTRSISNYK-NH2)以及非特异性肽一起预温育。通过标准手册固相肽合成方法，制备合成肽Ac-El-Lys-NH2和Ac-E12-Lys-NH2，并且随后通过反相HPLC纯化。5个个体患者的15n1血清在存在50ng随机肽、合成肽Ac-El-Lys-NH2(Ac-VRGFTMLTRLVLNLK-NH2)或Ac-E12_:Lys-NH2(AcVHIIRSSLIYALFTRSISNYK-NH2)的情况下，在37。C预温育20分钟，在室温预温育20分钟并在4TC预温育20分钟。随后，通过在20，OOOg下旋转，沉淀肽/IgG复合物并弃去。2轮消耗后，在如上所述的ELISA中检测对噬菌体El和E12的反应活性。如图12所示的，与Ac-El-Lys-NH2("肽El")和Ac-E12-Lys-NH2("肽E12")—起预温育，明显抑制了特异性IgG抗体/噬菌体El和IgG抗体/噬菌体E12复合物的形成，而抗克隆El和E12的血清反应活性没有被随机肽的加入抑制。权利要求1.能够与破裂的动脉粥样硬化斑块相关的抗体相互作用的肽，所述肽包含下列氨基酸序列之一的免疫反应部分SEQIDNO1VRGFTMLTRLVLNLSEQIDNO2VHIIRSSLIYALFTRSISNYSEQIDNO3GSGGGSGGGQVGQIFSEQIDNO4RYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPRICYSPNHFPVSFQSEQIDNO5REFITRYVSEQIDNO6EFRAGTTALVLDYWNNIQPRTEKLNRLTIVCSLDGLTASHLPEPFQNEQRSPHHYVFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNSEQIDNO7NQKLNTIGNW2.如权利要求1所述的肽，包含下列氨基酸序列之一的免疫反应部分SEQIDNO.-8:GQVRGFTMLTRLVLNLSEQIDNO:9:GQVHIIRSSLIYALFTRSISNYSEQIDNO:10:SSREFITRYVSEQIDNO:11:SSKEFRAGTTALVLDYW丽IQPRTEKXNRLTIVCS:LDGLTASHIjPEPFQNEQRSPHHYVFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKN3.如权利要求1或2所述的肽，包含下列氨基酸序列之一的免疫反应部分SEQIDNO:12:GSGGGSGGGPSRPDIiLENSGOVRGFTMLTRLVLNLSEQIDNO:13:SEQSEQIDNO:IDNO:1415:SEQIDNO:16:SEQIDNO:17:SEQIDNO:18:GSGGGSGGGPSRPDIJiENSGOVH11RSSLIYALE1TRSISNYGSGGGSGGGPSRPDIiLENSGSGGGSGGGQVGQ工FGSGGGSGGGPSRPDliLENSRYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPR工CYSPNHFPVSFQGSGGGSGGWAKSARSSREFITRYVGSGGGSGGWAKSARSSiEFRAGTTALVLDYWNNIQPRTEKLNRIiTIVCSIiDGLTASHLPEPFQNEQRSPHHYVFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNGSGGGSGGGPSRPDLLENSNGKLNTIG卿4.如权利要求1-3任一项中所述的肽，包含下列氨基酸序列之一的免疫反应部分SEQIDNO:19:MPVLLGIPKLIiRFIiGFIAVTLFGYLLTETjKKGFGKIAIMSLFLALIIGLNSILVGYLSDISAGLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDIjLENSGQVRGFTMLTRLVLNLSEQIDNO:20:MPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSDISAGLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYV工LSVKAAIF工FDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDIiENSGQVHIIRSSLIYALFTRSISNYSEQIDNO:21:MPVLLGIPLLLRETjGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSiLLVGYLSDISAGLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDUiENSGSGGGSGGGQVGQIFSEQIDNO:22:MPVLLGIPLIiRFLGFLLVTLFGYLI/TFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSIIiVGYLSDISAGLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDIiLENSRYKDFVNVIQGPQHPCVCRVPSKLSCSSRCQPVNFPPYPRICYSPNHFPVSFQSEQIDNO:23:MPVLLGIPLLLRFLGFKLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLAL工IGLNSILVGYLSD工SAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGWAKSARSSREFITRYVSEQIDNO:24:MPVLLGIPLLLRFLGFIXVTLFGYLLTFIjKKGFGK工AIAISLFLAL工IGLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQL工LPSNALPCFYVILSVKAAIF工FDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGWAKSARSSiEFRAGTTALVLDYWNNIGPRTEKLiNRLTIVCSLDGIiTASHLPEPFQNEQRSPHHWFFFDKFRREEMCVPRGGEPDHTGSRVPPKKKNSEQIDNO:25:MPVLLGIPLLLRFLGFLILVTLFGYXIVrE^LKKGFGKIAIMSLFLALIIGLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDKGSGGGSGGGPSRPDLLENSNQKLNTIGNW。5.如权利要求l-4任一项中所述的肽用于诊断的用途。6.如权利要求5中所述的肽，其中的用途是用于个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在的诊断。7.如权利要求6中所述的肽，其中的诊断包含个体的体液或组织样品中抗体的检测，所述抗体通过与一个或多个肽结合指示所述个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在。8.如权利要求7中所述的肽，其中的体液样品是血液、血清、血浆。9.如权利要求7中所述的肽，其中的组织样品是动脉粥样硬化斑块组织。10.如权利要求1-4中任一项所述的一种或多种肽在制备诊断试剂中的用途。11.如权利要求lO中所述的用途，其中的诊断试剂用于个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在的诊断。12.如权利要求11中所述的用途，其中的诊断包含个体的体液或组织样品中抗体的检测，所述抗体通过与诊断试剂结合指示所述个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在。13.用于检测个体中破裂的动脉粥样硬化损伤的诊断试剂，特征在于所述的试剂包含至少一种肽，包含如SEQIDNOS:1-25的任一个中所示的氨基酸序列的免疫反应部分。14.如权利要求13中所述的诊断试剂，其中的一种或多种肽结合于固相。15.用于诊断来自个体的样品中抗体的存在的方法，所述抗体指示个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在，所述方法特征在于，所述的样品与根据权利要求13或14的诊断试剂接触并且检测所述的试剂和抗体之间形成的免疫复合物。16.用于诊断来自个体的样品中抗体的存在的检测试剂盒，所述抗体指示个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在，其特征在于，所述的检测试剂盒包含根据权利要求13或14的诊断试剂和任选地用于使形成的免疫复合物可视化的工具。全文摘要本发明涉及能够与破裂的动脉粥样硬化斑块相关的抗体相互作用的肽，所述的肽包含根据SEQIDNOS1-25的氨基酸序列之一的免疫反应部分。本发明进一步涉及包含肽的诊断试剂，方法的应用以及用于诊断来自个体的样品中抗体的存在的方法和检测试剂盒，所述抗体指示个体中破裂的动脉粥样硬化斑块的存在。文档编号C07K7/00GK101454339SQ200780016356公开日2009年6月10日申请日期2007年5月4日优先权日2006年5月5日发明者C·B·J·M·克勒特鲁斯,M·J·A·P·德门申请人:马斯特里赫特大学/马斯特里赫特心血管研究院