专利名称：稀有鲫β型雌激素受体及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分子生物学及环境生物学领域，其中涉及一种(3型雌激素受体及其编码基因，以及采用该p型雌激素受体作为标记物检测水生环境
化学毒性的方法和用于诊断水生动植物疾病的试剂盒。
背景技术：
雌激素是一种类固醇激素，其在体内是由芳香化酶催化雄激素转化而来的。雌激素呈脂溶性，具有众多靶组织和耙器官，其中包括生殖系统、骨骼、心血管等。目前在人体内发现的雌激素有三种雌二醇、雌酮和雌三醇。通过研究发现，雌激素是通过与细胞内相应的雌激素受体结合从而启动转录、翻译等下游事件，产生相应的生理学效应，进而调控生长、发育、配对、繁殖等一系列生命事件。
20世纪70年代，Jesen和Jacobsen等利用放射性同位素的方法发现雌激素的信号是由雌激素受体(ER)介导的，雌激素受体是一种与雌激素有高度亲和力的蛋白。至1986年，ER蛋白被纯化，Greene及其领导的两个研究小组分别完成了对ER的克隆[Greene， G丄.，Gilna, P.和Water, M.，Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNASciences, 231: 1150-1154 (1986)],并分别在Nature和Science杂志上发表了论文。至此，人们一直认为ER只有一种构型，所有的雌激素效应和抗雌激素效应都是由这种受体来调节。直到1996年，Kuiper在对大鼠前列腺研究时，在大鼠的前列腺中发现了一种新的ER蛋白[Kuiper, G.G.，Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Cloning of a novel estrogen receptor expressedin rat prostate and ovary. Proc Nat Acad Sci USA， 93: 5925-5930 (1996)],随后在人类中也发现了该蛋白的基因，人们把先前发现的称为ERa,把后来发现的称为ERJ 。
雌激素受体的结构。ER (包括ERa和ER(3)属于糖蛋白，其特异性强、亲和力高、结合容量低、受热容易破坏，是甾体激素核受体超家族中的成员，也是一类具有配体激活域的核转录因子。ERa和ERp由不同基因编码，Enmark等研究发现人类ERj3基因定位于人类染色体14q22-24处；ERa基因位于人类染色体6q25. 1处，均含有8个外显子[Enmark, E.,Pelto國Huikko, M" Gradien, K.， Lagercrantz, S" Lagercrantz,丄,Fried, G.，Nordenskjold, M.， Gustafsson, J. A" Human estrogen receptor卩國gene structure:chromosomal localization, and expression pattern, The Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism 82: 4258-4265( 1997 )〗。ERa基因长约140kb,其蛋白含595个氨基酸；ER(3基因因内含子长度不同而远小于ERa基因，长约为40kb, ERp蛋白含530个氨基酸。
依据氨基酸N端到C端的序列，从结构上将ER分为5个功能区A/B、 C、 D、 E和F，而从功能上又可分为4个区域(1)N末端为A/B区域，其中存在一个不依赖配体的激活功能区(transcription activationfUnction-1),称为AF-1区，具有高度变异性。在正常情况下，该区域还含有一个能与转录因子交互作用的反式激活区，该功能区可能参与调节配体与ER结合，调节雌激素应答基因的转录。比较ERa、 ER卩两种亚型的AF-1区发现，ERa的AF-1区含有两个不同的部位，分别调节雌激素激动剂和雌激素部分激动剂，而ER卩的AF-1区则缺少这样的双重功能，这可能是造成两种ER亚型不同功能的一个原因；(2 )中间的区域也称C区域，为DNA结合区(DNA-binding domain, DBD )。该区含有一个双锌指结构，每两个锌原子与四个半胱氨酸残基结合形成1个指状突起。第1个锌指结
构与特异识别激素应答元件有关；第2个锌指结构与受体的二聚体化有
关，二聚体化是受体调节基因转录的必要条件。与其它蛋白质的锌指结构
不同的是，ER的两个锌指结构具有协同作用，共同调节与DNA的结合。ER两种亚型在这一区域具有高度的(96%)同源性；与DNA结合区相邻的是D区或铰链区，它的特性尚不清楚；(3)C末端E/F区为配体结合区(ligand-bindingdomain, LBD)，该功能区主要是调节配体与ER的结合、受体的二聚化和应答基因表达的激活。此外，该功能区还含有与各种不同
配体结合的氨基酸序列，与配体结合相关的氨基酸残基分布于配体结合区的螺旋3-12，还能与调节蛋白相互作用；(4)羧基末端的激素依赖转录活冲生功能区(transcription activation fonction-2, AF-2)， ^亥区i或由螺4t3、 4、5和12的氨基酸组成，两种亚型ER的氨基酸序列在这一区域有较大的差异，只有56%-57%的相同氨基酸序列。因此，两种受体既有共同的配体，也有各自不同的配体。AF-2的结构和功能因结合的配体类型不同而不同，主要的变化发生在螺旋12的氨基酸位置上。
比较ERa和ER卩发现在DBD区和LBD区的氨基酸残基顺序分别有96-97%和53-56%完全一致，说明a和卩识别并结合相似的17p-雌二醇反应元件(ERE), ^旦是配体i瞽可能并不相同。ERa含有AF-l区，而ER(3缺乏AF-1区。AF-1和AF-2同源性差，而且AF-1转录激活的功能是不依赖配体的，而AF-2基因激活的功能却依赖配体的存在。对于雌激素作用的信号转导途径，多年来一直i/v为雌激素是通过与核内受体结合形成复合物，再识别DNA上的特异序列，影响耙基因的转录而产生效应，但这个经典模式并不能解释所有观察到的现象，随着ERP的发现，提示雌激素及其受体的信号转导途径非常复杂。
雌激素受体的作用途径
(1 )配体依赖(ligand dependent)途径。核内ER未与配体结合时，以多蛋白抑制复合物的非活化形式存在。雌激素受体与配体结合后，引起变构形成同源二聚体，同源二聚体再与雌激素反应元件(Estrogen responseelement, ERE)结合后形成复杂复合物。之后，ER直接或间接通过辅激活物与转录元件作用，启动转录。辅激活物包括SRC-1、 GRIP1、 ACTR、CBP/p300、TRAP220、PGC隱l和SRA等[Shang， Y.F.， Hu， X.， James, Cofactordynamics and sufficiency in estrogen receptor-regulated transcription, Cell,103: 843-852 (2000)]。 ER与其相互作用可稳定转录前起始复合物，使ERE处的染色体变得疏松。转录能力与染色体组蛋白N端乙酰化有关，组蛋白乙酰化后可使组蛋白与DNA结合不稳定，从而使染色体结构疏松。因此，ER活性所需的许多辅激活物是组蛋白乙酰转移酶(HATs)，如pl60辅激活物家族成员SRC-1和ACTR，它们通过重复的LXXIJ氨基酸基序列与有兴奋剂的ERs的AF-2区结合，作为平台结合更多HATs,如p300、CBP和p300/CBP的相关因子pCAF。与此相反，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)使组蛋白去乙酰化而抑制转录。当给予拮抗剂如他莫昔芬，ERa就与辅抑制物NCoR和SMRT结合[Smith,C.L., Cross-talk betweenpeptide growth factor and estrogen receptor signaling pathways. Biol Report58: 627-632 (1998)]。这些辅抑制物通过结合HDAC复合物如Sin3复合物，而使转录受到抑制。
(2)配体非依赖途径(ligandindependent)。多肽激素，如表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子I (IGF-1 )、胞内信使类似物8-溴-cAMP也能激活ER而促进把基因表达[Ueda, S.， Tsuda, H., Sato, K, Alternativetyrosine phosphorylation of signaling kinases according to hormone receptorstatus in breast cancer overexpressing the insulin-like growth factor receptortype. Cancer Sci 97: 597-604(2006)]。在小鼠的子宫中，同时给予EGF抗体可减弱子宫对E2的反应；相反，给予ER的拮抗剂ICI182、 780可减弱子宫对EGF的反应，可见两者的部分效应是通过对方介导的。大量研究表明，在该途径中ER被细胞中的激酶磷酸化可能是关键[Ignar誦Trowbridge， D.M., Nelson, K.G., Bidwell， M.C., Coupling of dualsignaling pathways: epidermal growth factor action involves the estrogenreceptor. Proc Natl Acad Sci UAS 89: 4658-4662 (1992); Lannigan D.A.,Estrogen receptor phpsphoiylation. Steroids 68: 1-9 (2003)]。当给予EGF或IGF后，有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)使ERa的AF-1区的第118位丝氨酸磷酸化，从而使受体与ERa特异的辅激活物p68RNA螺旋酶结合，活化耙基因。同样，ER(3的N末端的活化区也可被MAPK磷酸化，以不依赖配体的形式结合pl60辅激活物SRC-1,继而再与ERE作用，减弱ERa配体激活的转录活性。因此，同时表达两种受体亚型的细胞，总的雌激素效应可能取决于ERa/ER卩的比值[Kato, S.， Estrogenreceptor-mediated cross-talk with growth factor signaling pathways. BreastCancer 8: 3-9 (2001); Tremblay， A., Giguere, V" Contribution of steroidreceptor coactivator画l and CREB binding protein in ligand画independentactivity of estrogen receptor beta. J Steroid Biochem Mol Biol 77: 19-27(2001)]。
(3 )不依赖ERE的转录途径(ERE-independent)
ER除了与ERE结合产生效应外，也能与Fos和Jun作用而与DNA上的AP-1位点结合影响转录，同时Era-Spl复合物也可结合富含GC的启动子序歹寸[Paech， K., Webb, P" Kuiper, GG" Differential ligand activation ofestrogen receptor ERa and ERp at API sites. Science 277: 1508-1510(1997) ]。 ERa和ERp在AP-1位点处与雌激素结合后，表现为相反的作用；与ERa结合时，雌激素活化转录；而与ER卩结合时，雌激素抑制转录。另外，拮抗剂他莫昔芬、雷洛昔芬在AP-1位点处与ER(3结合，则成为强有力的转录兴奋剂。
雌激素受体的分布。ERa和ERP的序列在不同的区域都有一定的同源性。在分布和功能上，ERa和ER卩也有着相当大的差别。在不同的器官中，使用原位杂交的方法发现，ERa的mRNA主要在子宫、睾丸、脑，下垂体、肾、附睾和肾上腺中高度表达，ERp的mRNA主要在前列腺、卵巢、肺、膀胱、脑、子宫和睾丸中高度表达[Marino, M., Acconcia, R，Ascenzi, P., Estrogen receptor signaling: bases for drug actions. Curr DrugTargets Immune Endocr Metabol Disord 5: 305-314 (2005)]。在心血管系统和骨骼中，血管平滑肌主要表达ERJ3， ERa的表达很少或者没有。在成骨细胞中，ERa和ER(3均有表达，但是以ER(3为主。在肿瘤组织中，ER的表达可能与相应的正常组织不同，例如正常卵巢以表达ER卩为主，而卵巢癌中ERP表达明显降低甚至失去。即使在同一个器官中，ERa和ERp的分布也有很大的差别。在大鼠的子宫中，子宫内膜腔的上皮细胞和间质细胞中，均有ERa和ER|3的表达，但是在腺上皮细胞中主要表达ERa;在大鼠卵巢中，ERa与ER卩的mRNA均有表达，但ER(3的表达占优势[Gustafsson, J., Estrogen receptor (32, a new dimension in estrogen mechanismof action. J Endocrinol 163: 379-383 (1999) ]。 ER|3在卵泡生长及排卵前在成熟卵泡的小颗粒细胞中高表达，但在退化黄体细胞中弱表达。而ERa在胚胎上皮细胞、间质细胞、鞘膜细胞中均有表达，唯独在颗粒细胞中无表达，说明在卵泡生长和成熟的调节过程中主要是ERP介导了雌激素的活性。在乳腺中，ERa在人类乳腺小叶和导管的上皮细胞有表达，而ER卩不仅在乳腺小叶和导管的上皮细胞有表达，还在乳腺肌上皮细胞有高表达，偶尔也可在周围基质细胞和内皮细胞及淋巴管等有表达。在男性生殖系统中，ERa在不同生殖道的上皮细胞、睾丸细胞均有较高表达，但在前列腺中表达较低。ER卩在男性生殖系统如输精管上皮细胞、附睾、前列腺的上皮细胞和睾丸的支持细胞均有表达[Pare, G., Krust， A., Karas， R.H.，Estrogen receptor-alpha mediates the protective effects of estrogen againstvascular injury. Circ Res 90: 1087-1092 (2002)]。
不同的ER对雌激素类物质的亲和力以及对ERE的结合能力各不相同。对于雌二醇，ERa和ER卩与之的亲和力相似，但对于植物性雌激素和一些雌激素拮抗剂来说，其对ERa和ERp的亲和力却不尽相同。 一般来说，植物性雌激素对ERj3的亲和力更高，而不同的雌激素拮抗剂，它们对ERa和ER卩的结合能力各不相同。大多数情况下，在人类的细胞中，ERa的转录活性要高于ERp,在雌激素刺激下，ERa的mRNA的基础转录活性也要高于ER卩的mRNA。
环境激素雌性化的作用机制。环境激素分子作为配体(ligand)与雌激素受体结合，引起一系列的雌激素刺激或抑制雌激素的生理效应。ERa主要是作为基因转录的激动剂，而ERP主要是作为基因转录的抑制剂。环境激素结合这两个不同作用点，从而导致了两种不同的作用雌性化作用和抑制雌性化作用。
环境激素分子干扰动物和人类内分泌系统的过程主要为环境激素分子与雌激素受体结合，导致原结合于受体上的热休克蛋白90 (hsp90)从受体上解离下来；结合了配体的雌激素受体发生构象改变并同型二聚体化，这种同型二聚体复合物和DNA上雌激素反应元件具有高度亲和能力(雌激素反应元件为位于5'端雌激素诱导基因调节区域的特异DNA序列)。ERP也可与ERa形成异源二聚体，它也可以与ERE结合。当这种亲和发生时，同型或者异型二聚体复合物将使转录子聚集到草巴基因启动子上，并M基因转录的增强，转录出mRNA并翻译成蛋白质，从而表现出各种生理效应，最终导致了诸多的生物现象雌激素与受体结合、基因的转录和细胞的增殖、以及短期内的子宫增重。己烯雌酚、DDT等都是靠这种机制来干扰生物体的生殖和发育[Danzo, B丄，Environmentalxenobiotics may disrupt normal endocrine fimction by interfering with bindingof physiological ligands to steroid receptors and binding proteins. EnvironHealth Perspect 105: 294-301 (1997)]。
雌激素分子也可以与ERp结合，并以与ERa相反的介导模式，通过DNA上的AP-1反应元件影响ER介导的基因转录活性。如17|3-雌二醇和ERa结合后通过DNA上的AP-1反应元件激活并提高报告基因的转录，然而与ER卩结合则抑制转录。选择性雌激素受体调节剂(selective estrogenreceptor modulator, SERMs)是环境激素中的一类，三苯氧胺、植物雌激素中各种异黄酮就是其代表物。它们在不同靶组织可以表现为雌激素激动剂和/或拮抗剂的作用，并与体内激素水平有关。某些SERMs在雌激素受体反应(ERE)路径上转录调节作用与雌激素不同，不能通过ERE路径激活转录，而是完全阻断雌激素在ERE路径上的作用。SERMs与ERa和ER卩具有高度的亲和性，且SERMs也可致伴侣蛋白的游离、ERs二聚体的形成以及ERs与ERE的结合。SERMs的拮抗作用是在雌激素受体与启动子区域结合的最后一步发生，阻断配体结合区域的移动和功能性AF-2表面的出现，从而抑制转录。研究ERa和ER^的配体结合区域结晶化发 现其拮抗作用的分子机制是由于SERMs包含一个estradiol缺乏的大侧 链，不能使ERs形成功能性AF-2表面，阻止了 ER与辅调节蛋白的结合， 因而激活途径突然被终止，从而达到抑制的效果[Mitlak, B.H., Cohen, F丄, Selective estrogen receptor modulation look ahead. Drug 57: 653-663 (1999)]。 稀有鮑鲫(Go6/oc_y;7n;s rams)属担尼亚科，鮑鲫属，是中国特有的 稀有鱼类，分布于四川省汉源县、石棉县、双流县、都江堰市和彭县等地。 其具有繁殖力强，温度适应范围广，二氧化碳和溶氧耐受力高，性成熟周 期短等作为实验鱼类的优良特征，而且在水生化学品毒性测试上有极高的 敏感性[Ma, T. W., Wang， Z. J.和Liu, J. K. Endocrine disrupting effects on Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) fed with field collected Limnodrilus sp. J Environ Sci 16: 784-787 (2004); Zhong, X.， Xu, Y., Liang, Y., Liao, T.和 Wang, J. The Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) as an in vivo model for endocrine disruption in freshwater teleosts: a fUll life-cycle test with diethylstilbestrol. Aquat Toxicol 71: 85-95 (2005)]。因此，检测、分离和鉴 定稀有鮑鲫的13型雌激素受体，并将其作为基因转录抑制因子应用于对环 境内分泌干扰物作用机制的研究中，具有分子生物学和毒理学水平上的深 远意义。
发明内容
本发明的目的是基于P型雌激素受体是基因转录抑制因子的发现，将 其作为环境内分泌干扰物的预警分子标记物，从而提供一种用于检测水生 环境化学毒性的方法或用于诊断水生动植物疾病的试剂盒。 为实现上述发明目的，本发明提供了下列技术方案 一种稀有齣鲫P型雌激素受体(以下简称为GrER|3 ),所述受体具有 SEDIDNo,2所示的氨基酸序列。 一种编码上述雌激素受体的基因，所述 基因具有SEDIDNo.l所示的核苷^列，以及一种包含上述基因的表达 载体。
本发明还提供了一种检测水生环境化学毒性的方法，所述方法包括检 测水生环境中上述受体的表达水平。其中，所述化学毒性是雌激素效应或 基因转录抑制。
本发明还提供了一种用于诊断水生动植物疾病的试剂盒，所述试剂盒包含检测水生环境中上述受体的表达水平的工具。其中，所述水生动才直物 具体为鱼类。所述疾病可以为生殖系统疾病，具体为性腺发育不完全、雌 雄同体和/或性别逆转。
本发明以实验室祠养并驯化的稀有鉤鲫为来源，从雌、雄鱼肝脏中扩
增GrER卩基因并进行克隆和测序，其cDNA序列长901bp,编码297个 氨基酸。GrER(3基因的cDNA序列具体为SEDIDNo.l所示的DNA序列， GrER(3基因编码的雌激素受体氨基酸序列具体为SED ID No.2所示的氨基
酸序列。
本发明通过运用RT-PCR技术，检测了 GrER(3基因在各组织中和各 幼鱼时期的表达，结果表明GrER卩基因在雌、雄鱼的大脑、性腺、肌肉 和肝脏中均有表达，但是在肝脏和性腺中表达水平较高。而未成熟的幼鱼 体内从孵出后就可以检测到该基因的转录产物， 一直持续到成鱼中，表明 该基因在雌、雄鱼的生长，发育和繁殖调控中具有重要的功能。
本发明通过设计特异性引物，建立了稀有鉤鲫GrERp基因的实时定 量PCR-SYBR Green荧光染料方法，以p-actin基因作为内参基因和卵黄 蛋白原基因作为对照基因。运用荧光定量PCR方法检测了暴露在环境雌 激素作用下的幼鱼和成年鱼的表达变化，发现在雌激素作用下幼鱼和成年 雄鱼在诱导GrERp基因表达谱上具有不同的效应。
本发明不仅检测到(3型雌激素受体在稀有齣鲫的各组织中均有表达， 而且证明其表达水平是可以被检测的。在内分泌干扰物暴露下，GrERJ3基 因表达水平会发生显著的变化，而且与常规检测指标卵黄蛋白原(VTG) 基因表达水平的变化相一致。在对幼鱼的检测中，p型雌激素受体也具有 高水平的表达，其表达早于VTG基因的表达，更容易被检测，而且比VTG 基因更敏感。由于VTG基因的表达及卵黄蛋白原的生成需要经过一个长 的反馈途径，检测P型雌激素受体更有利于进行早期环境内分泌干扰物的 预警指示。
本发明适用于检测水生环境化学毒性，以及诊断水生动植物疾病，尤 其是诊断鱼类的生殖系统疾病，从而实现调控鱼类生殖能力的目的。本发 明试验结果表明，GrER卩基因的表达与雌激素效应具有剂量-效应关系， 使得本发明的方法具有操作简便、快捷、准确的优点。
下面结合附图对本发明作进一步的说明，其中 图1显示了经RT-PCR检测到的GrER(3基因在稀有齣鲫雌、雄鱼的 不同器官中的表达。其中p-actin基因作为对照基因。
图2显示了经RT-PCR检测到的GrER(3基因在稀有齣鲫幼鱼中的表达。
图3显示了稀有鮑鲫GrERp基因的重组质粒的筛选结果。
图4显示了稀有齣鲫GrER卩和(3-actin基因的荧光定量PCR的扩增效应。
图5显示了荧光定量PCR检测稀有鉤鲫幼鱼暴露在100ng/L的E2 (17-|3雌二醇)中GrER卩基因表达的改变。
图6显示了荧光定量PCR检测到的稀有鉤鲫在环境内分泌干扰物2， 4-二氯酚暴露后的GrER卩基因的表达谱变化。*号表示有显著差异的组， 尸<0.5。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
进一步阐述本发明，下述实施例仅用于说明本 发明，而不对本发明的范围进行限制。下列实施例中的实验方法中未注明 的具体实验条件即按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。
1. 化学试剂
雌二醇(17卩-estradiol，E2)、 2，4-二氯酚(2,4-dichlorophenol)和二曱基 亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO )购于Sigma公司(St. Louis, MO，美国)。 所述雌二醇(17卩-estradio1, E2)和2,4-二氯酚分别配制成DMSO溶液，然后 按照DMSO溶液水为0.005% (体积比)配制实验暴露用水。
2. 实^^动物驯化
实验中采用的稀有鮑鲫已经驯化4年以上，其养殖和暴露条件控制 为水温25-28。C, K硬度8.0 mg/L, pH值7.5-7.8，溶氧8.0-9.0 mg/L。 光周期控制为昼夜=16: 8。饲料为新孵化的活体卣虫和颗粒状饲料。
3. 实-验方法
(1)不同组织样品的采集从孵化后9月龄的成熟个体(n = 6-9) 中得到鱼肝、脑、性腺、肌肉组织，采集后的样品立即用液氮冻存，直至 提取总RNA时。(2) 不同内分泌干扰物质的暴露实验将酵化后9月龄的雌、雄成 鱼分别暴露于不同浓度的化合物中。每组20L水中30尾，采用流水暴露 系统，水流速度为4 1/h,药流速度为lml/min, 0.005% (v/v) DMSO作为 对照组。暴露3周后采集性腺样品，采集后的样品立即用液氮冻存，直至 提取总RNA时。
(3) 合成cDNA第一条链采用Trizol试剂(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MA,美国)才是取组织总RNA,然后对l是取 的总RNA进行DNAaseI (大连宝生物公司)处理和纯化。在液氮中研磨 的肝脏中加入1 ml Trizol试剂和DNA酶，加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧 烈振荡15s,室温放置3min。 4。C下12,000 rpm离心10min，转移7JC相至 新管，緩慢加入1倍体积的70%乙醇，混匀。离心，去废液，干燥，用 TE (Tris EDTA緩冲液)溶解总RNA。所得总RNA的紫外光吸收 A260/A280大于1.8, 0.8%曱醛变性凝胶电泳证实无降解。采用MMLV反 转录酶(Invitrogen， Paisley, UK)合成cDNA第一条链。
4. GrER卩基因序列克隆
根据NCBI GenBank (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)发布的有关ER 基因序列，利用Primer Premier 5设计兼并引物，PCR反应扩增目标基因。 先进行第一链的合成，分别取稀有鮑鲫雌、雄个体RNAlOiil,加入2pl 随机引物，70。C反应5min,在冰上冷却。加入M-MLV ( Promega, 美国)反转录酶，ljxlRNA酶抑制剂，5pl反应緩沖液，5jildNTP(脱氧 核苦三磷酸)，加水至25^1，轻轻混合，37。C下保持lh;在70。C下保持 10min,冰浴冷却。PCR扩增反应体系为25 其中含模板100 ngDNA， 每个引物取0.5 pmol/L, 1.5mmol/LMg2+， 0.2 jimol/L dNTP, 1UTaqDNA 聚合酶，加水补至25 pl。纯化PCR产物连接到pUC 19-T质粒(大连宝 生物公司)上，转入感受态大肠杆菌扩培。
5. GrERp基因片段的筛选和测序分析
转化菌涂布于涂有X-gal( 5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-吡喃半乳糖)和IPTG (异丙基-P - D -硫代半乳糖苷)的含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上 培养，37 。C下培养过夜。随机挑取24个白色菌落，接种于2ml含Amp 的液体培养基中。用PCR方法检测质粒的插入片段，引物为通用引物SP6 和T7, PCR反应条件为94 。C预变性6min , 94 。C 40 s， 55 。C 50 s, 72 。C80s, 35个循环，72。C延伸8min， 4 。C保存。筛选出有差异的阳性克隆委托北京诺赛基因公司进行测序。通过M13引物测序获得901 bp的序 列。采用Clustal X软件将推算的GrERp氨基酸序列和Genbank公布的氨 基酸序列进行了比对，采用MEGA3软件Identity Matrix计算相同序列的 比例。基于氨基酸序列比对文件，采用邻接法(Neighbor joining method, NJ)分析系统发生关系，构建NJ树。
图3显示了稀有鉤鲫GrER卩基因的重组质粒的筛选结果。从平板上 随机挑选白斑进行菌落PCR,再挑选条带与GrER(3 —致的菌落(15和18 号泳道)进行过夜培养，进行测序鉴定。
6. RT-PCR对GrER(3基因的检测
用p-actin作为内参基因，取总RNA进行反转录，然后进行扩增，PCR 反应条件为94°C， 10min; 94°C， 30s; 55°C, 30s; 72°C， 45s; 35个循 环。
图1显示了 RT-PCR检测到的GrERp基因在稀有鉤鲫雌雄鱼不同器 官中的表达，其中以(3-actin基因作为对照基因，在雌雄鱼精巢、卵巢、 大脑、肝脏和肌肉中都有表达，其中性腺和肝脏的表达较其它组织更丰富。
图2显示了 RT-PCR检测到的GrER(3基因在稀有齣鲫幼鱼中的表达， 其中从孵出后1天到15天，GrER(3基因都有明显的表达。
7. 实时定量PCR方法分析基因表达差异
定量PCR 1物采用软件Primer Express 2.0设计，每对引物至少跨越 一个内含子以减少基因组DNA的影响。cDNA标准品为纯化的普通PCR 产物。从大肠杆菌中提取含有GrER(3基因片段的重组质粒，在分光光度 计上测定其DNA浓度和纯度。以IO倍稀释的质粒作为模版，进行PCR, 做出标准曲线，确定模板的最佳浓度。
以反转录的DNA作为模板，在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，在Bio-Rad iCycler iQTM5 Multicolor实时定量PCR检测 系统进行PCR扩增，每次反应液包含11.25pL的Quant 2X iQTM SYBR Green PCR master mix (Bio-Rad, USA), 100 nM上游和下游引物和1 pi cDNA模板。反应^f牛为95°C, 4min; 60°C， 30s; 72°C, 30s，循环次 数为35-40。随后进行溶解曲线分析和表达分析。每次扩增重复3次以 上。20jiL体系PCR反应液包括SYBR⑧Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,美国)10 pL, 25 |umol/L正义和反义引物各0.4 |iL，及cDNA 和双蒸馏水。PCR反应程序为50°C， 2min; 95°C， lOmin; 40个循环 95°C, 15 s， 60°C， 60s。在最后一个循环结束后做熔解曲线，确定PCR 反应质量。96孔光学PCR板和光学透明塑料盖膜购自Applied Biosystems 公司。仪器采用ABI 7000型荧光定量PCR仪(ABI Prism 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, 美国)。
图4显示了稀有鮑鲫GrER(3, VTG和p-actin基因的荧光定量PCR的 扩增效应(三个基因的扩增效率相差在5%的范围内说明其扩增是有效扩 增)。
图5显示了荧光定量PCIU全测稀有鮑鲫幼鱼暴露在100ng/L的E2( 17-|3雌二醇)中GrER (3基因表达水平的改变。由于内分泌干扰物的重要特 征之一是影响生殖腺的发育和生长，幼鱼的发育在孵化后1到15天是性 别分化的关键时期，在24h暴露后，ERbeta基因的影响没有显著性差异 (a)。 72h暴露后，从第四天开始就可以检测到E2对GrERl3基因表达具 有显著影响(B)，表明GrERP基因具有很高的敏感性，而且其影响一直 持续到第十五天，是可以用来进行环境内分泌干扰物的早期预警指示。
图6显示了荧光定量PCR检测到的稀有鮑鲫在环境内分泌干扰物2, 4-二氯酚暴露后的GrER卩基因的表达谱变化。以VTG基因作为阳性对照 基因，2, 4-二氯酚暴露后VTG基因在雌鱼中被显著诱导，而雄鱼中没有 被诱导。在GrERp基因表达变化中，雌鱼被显著抑制，雄鱼被显著诱导。 由于GrERp基因作为基因转录抑制剂，其表达的下调，导致VTG基因的 上调，而在雄鱼中由于GrER卩基因的上调，VTG基因不能被诱导。
8.统计分析
采用SPSS软件(Ver 11.5; Chicago, IL, USA )的单向方差分析( one-way ANOVA)和Tukey多重比较来检验相关数据的差异。当p < 0.05时认为差 异显著。所有数据和图表均以平均值土标准偏差表示。表l:所用的引物
For5'-TGCCGTCTTAGGAAGTGTTACG-3'
ER
Rev5'-CCAGCAGCAGGTCGTACAG誦3'
(3-actinFor5'-CAGGGCGTGATGGTGGGGAT-3'
DQ539421Rev5'-GGTTGGCTTTGGGGTTGAG-3'
GrER卩For5'-AACAGACCGCCACATTAG-3'
EF190319Rev5'画GAGCCACCTGAGATTTACC-3'
VTGF25'-AAATTCATGGTGCTGCTGAAG-3'
EF095728R25'画CCTTTCATCCAGTCTGCAAC-3'
15序列表
SEDID No.l
〈110〉 中国科学院生态环境中心 〈120〉稀有鮑鲫(3型雌激素受体及其应用 〈130〉 D薩110129 <160〉 2
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 1 〈211> 901 〈212> DNA
〈213> 稀有鮑鲫(Gobiocypris rarus ) 〈400> 1
tgccgtctta ggaagtgtta cgaagttgga atgatgaaat gtgggttacg gcgagatcg1
60
ggcagctacc aacaaagagg agcacagcag aagagactgg cacgattatc tggcaggatg 120
agaaccagtg gcccgatatc tcaagagatg aaaagtgccc cacgtcccat aagtggaaac 180
gaggtggtta acatggggtt gagccctgag gaactaatcg ctcgcctcat ggatgcagag 240
ccacctgaga tttacctcat gaaagatgtg aagaagccat ttactgaagc caacgtcatg 300
atgccactga ccaacctggc tgacaaagag ctcgttcaca tgatcggctg ggccaagaag 360
atccccggtt ttgtggagct cagtcttttt gaccaggtcc atttgctaga gtgctgctgg 420<formula>formula see original document page 17</formula>Leu Ala Arg Leu Ser Gly Arg Met Arg Thr Ser Gly Pro lie Ser Gin 35 40 45
Glu Met Lys Ser Ala Pro Arg Pro lie Ser Gly Asn Glu Val Val Asn 50 55 60
Met Gly Leu Ser Pro Glu Glu Leu lie Ala Arg Leu Met Asp Ala Glu 65 70 75 80
Pro Pro Glu lie Tyr Leu Met Lys Asp Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu 85 90 95
Ala Asn Val Met Met Pro Leu Thr Asn Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val 100 105 110
His Met lie Gly Trp Ala Lys Lys lie Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser 115 120 125
Leu Phe Asp Gin Val His Leu Leu Glu Cys Cys Trp Leu Glu Val Leu 130 135 140
Met Leu Gly Leu Met Trp Arg Ser Val Asn His Pro Gly Lys Leu lie 145 150 155 160
Phe Ser Pro Asp Leu Ser Leu Ser Arg Asp Glu Gly Ser Cys Val Gin 165 170 175
Gly Phe Val Glu lie Phe Asp Met Leu Leu Ala Ala Thr Ser Arg Phe 180 185 190
Arg Glu Leu Lys Uu Gin Arg Glu Glu Tyr Val Cys Leu Lys Ala Met195 200 205
lie Leu Leu Asn Ser Asn Met Cys Leu Ser Ser Ser Glu Gly Gly Glu 210 215 220
Asp Leu Gin Arg Arg Ser Lys Leu Leu Ser Leu Leu Asp Ser Val Thr 225 230 235 240
Asp Ala Leu Val Trp Ala lie Ser Lys Thr Gly Pro Glu Leu Ser Ala 245 250 255
Ala Leu His Gin Thr Ser Pro Ser Ala His Ala Ala Leu Pro His Lys 260 265 270
Ala Pro Gin Arg His Gly Pro Pro Ala Leu His Glu Asp Glu Arg Trp 275 280 285
Phe Leu Cys Thr Thr Cys Cys Ser Leu 290 29权利要求
1. 一种稀有鮈鲫β型雌激素受体，其特征在于，所述受体具有SED IDNo.2所示的氨基酸序列。
2. —种编码权利要求1所述的雌激素受体的基因，其特征在于，所述 基因具有SEDIDNo.l所示的核苷^列。
3. —种包含权利要求2所述基因的表达载体。
4. 一种检测水生环境化学毒性的方法，其特征在于，所述方法包括 检测水生环境中如权利要求1所述受体的表达水平。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学毒性是雌激 素效应。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学毒性为基因转 录抑制。
7. —种用于诊断水生动植物疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒包含检测水生环境中如权利要求1所述的受体的表达水平的工具。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述水生动植物为鱼类。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述疾病为生殖 系统疾病。
10. 根据权利要求7至9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述 生殖系统疾病为性腺发育不完全、雌雄同体和/或性别逆转。
全文摘要
本发明提供一种稀有鲫β型雌激素受体和编码所述的雌激素受体的基因。本发明还提供了一种检测水生环境化学毒性的方法和用于诊断水生动植物疾病的试剂盒，上述方法或试剂盒均涉及检测水生环境中上述受体的表达水平。本发明适用于检测水生环境化学毒性，以及诊断水生动植物疾病，尤其是诊断鱼类的生殖系统疾病，从而实现调控鱼类生殖能力的目的。本发明试验结果表明，GrERβ基因的表达与雌激素效应具有剂量-效应关系，使得本发明的方法具有操作简便、快捷、准确的优点。
文档编号C07K14/72GK101469020SQ200710308510
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者张小艳, 查金苗, 王子健, 饶凯锋 申请人:中国科学院生态环境研究中心