专利名称：一种大白菜特异蛋白质/同工酶的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于植物蛋白质组学和发育生物学技术领域，具体涉及一种从白 菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶的方法。
背景技术：
生物功能的主要执行者是蛋白质，蛋白质组能够反映出生物系统所处的 状态，如细胞周期的特定时期、分化的不同阶段，不同的生长和营养状况， 温度、应激和病理状态等都有其特异蛋白质组，因此蛋白质组学的研究可望 提供精确、详细的有关细胞或组织状况的分子描述。科学界预言21世纪 生命科学的热点将从基因组学转入蛋白质组学，后者将成为新的研究前沿。
蛋白质组学的研究中亟待解决的问题是如何才能分离纯化出自己感兴 趣的特异酶或蛋白。
分离纯化某一特定蛋白质或酶没有特定的方法， 一般程序可以分为前处 理、粗分级、细分级三步。前处理指把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解 的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 一般粗分级这一 步的分离多用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。细分级一般使 用较多的是层析法，层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲 和层析等。层析法的操作过程多是在室温下进行，不稳定的蛋白尤其是酶很 容易被降解，对纯化很是不利。另外值得注意的是一般的酶蛋白量都比较低， 用层析法进行分离有时会遇到不出现峰的现象，所以目的酶常被当成废液而 被丢弃，没办法回收，因此聚集和纯化低含量具有生命活性功能的蛋白质， 尤其是同工酶，成为蛋白质组学研究的瓶颈。
双向电泳由于其具有高分辨能力使之成为蛋白质组学研究中蛋白质分
离最有力的技术平台。其实验过程一般包括样品制备、等电聚焦(Isoelectric Focusing IEF)、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、染色和图像分析 等步骤。第一向等电聚焦电泳目前多采用进口的商品干胶条进行，需要专门 的设备，价格昂贵；操作时间长， 一般都需要20小时以上；聚焦完毕不进 行染色，直接进入下步的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，整个过程相当于黑箱 操作，聚焦好坏不能及时获知，必需待到第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 染色完毕才可知。第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳每板凝胶只能上一根 胶条即一个样品，要想分析比对多个样品需进行多板凝胶的配制及电泳，无 形间增加了比对结果的误差。第一向等电聚焦电泳凝胶上不仅包括了目的酶 或蛋白，还包含有其它杂质蛋白，这些杂质蛋白会随同目的蛋白一起转到第 二向进行再分离，结果使得第二向出现众多的蛋白点，为寻找目的蛋白增添 了一定的难度，这些问题的存在成为蛋白质快速分离纯化研究的难点。
总之，蛋白质组学的发展需求快速、准确、低成本的蛋白质分离纯化技术。
发明内容
本发明的目的在于通过解决聚集和纯化低含量具有生命活性功能的蛋 白质的问题、在等电聚焦电泳同时分析多个样品、SDS聚丙烯酰胺凝胶同时 上多个目的条带、全程检测、提高目的性等问题，提供一种从白菜花蕾中提 取分离特异蛋白质/同工酶的方法，该方法为进一步蛋白质测序、蛋白质组 学研究奠定基础。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案得以实现
一种从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶多肽的方法，其特征在 于，该方法首先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定目标性状的特异蛋白质/
同工酶带，接着回收特异带区，浓縮成特异带干粉(聚集)，再通过IEF电 泳系统鉴定区分特异带的等电点差异，最后通过SDS凝胶电泳分离目标多
肽，使组成特异蛋白质/同工酶的多肽完全分离纯化，具体包括下列步骤 步骤一，特异蛋白质/同工酶的鉴定分析
采用普通不连续聚丙烯酰胺活性凝胶系统分析比较对照与处理间蛋白 质/同工酶图谱的差异，确定特异蛋白质/同工酶带，采用的分离胶浓度为7%， 浓縮胶浓度为4%，浓縮胶电泳电压100V，分离胶电泳电压260V;
步骤二，特异蛋白质/同工酶带回收
采用单向活性凝胶制备系统，不制点样孔，直接于浓縮胶上上样分离(聚
集)，电泳完毕后切取凝胶板两侧5-10mm宽的凝胶条染色，染色后放回原 凝胶板两侧指示特异蛋白质/同工酶，如果目的带有多条，而且相互间距离 较近，单条回收有困难时，可将这些目的带作为一个区进行回收；根据实验 所需，确定凝胶回收量；
步骤三，特异蛋白质/同工酶干粉制备
根据染色胶条指示的位置，切取未染色的目的条带凝胶或带区凝胶，放 入事先准备好的透析袋中，向透析袋中加入适量电极缓冲液，封住透析袋口 并置于水平电泳槽中，用20mA的恒流过夜电洗脱，电洗脱完毕后用镊子取 出凝胶，收集蛋白质/同工酶粗液，粗液再经透析除盐、真空冷冻干燥后得 到粗蛋白质/同工酶干粉(聚集)；
步骤四，特异蛋白质/同工酶的IEF电泳分离的纯化
用制备的粗蛋白质/同工酶干粉进行IEF凝胶电泳，考马斯亮兰染色， 验证特异性、检测区分等电点；
步骤五，特异蛋白质/同工酶的SDS凝胶电泳分离
挖去IEF凝胶中的目的蛋白质带，进行SDS凝胶电泳，采用15%的凝 胶浓度，在20X20cm的垂直凝胶板上进行，先用5mA恒流预电泳2小时， 然后将切取IEF目的凝胶条带放入点样孔，用8mA恒流电泳2小时进行浓 縮后，再用18mA恒流电泳9.5小时进行分离；最后用考马斯亮兰染色。
本发明的从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶的方法表现出以下 技术特点
1) 采用在冰箱中进行电泳，很好的解决了蛋白质的降解的问题。
2) 采用单向活性凝胶制备系统整体点样(不制点样孔，直接于浓縮胶 上上样)分离，很好的解决了聚集和纯化低含量具有生命活性功能的蛋白质 的问题。
3) 自制IEF凝胶宽度可因需要变化， 一次等电聚焦电泳可根据不同宽 度的梳齿同时分析多个样品，每次电泳只需5 — 6小时，而且采用最常见的 国产竖直板电泳槽，省时高效、成本低；
4) 第一向IEF电泳完毕通过染色，可直接比较各样品间的差异，使结 果直观明了；
5) 等电聚焦电泳染色后，根据差异切下目的条带，有针对性的将目的 条带进行第二向的再分离，减少了非目的条带的干扰，目的性强，并减少了 二向电泳背景，使图谱一幕了然；
6) 第二向SDS凝胶电泳时可根据实验所需调整第一向胶条的用量，有 利于测序或蛋白质其它特性分析。另外，同一板第二向SDS聚丙烯酰胺凝 胶可同时上多个目的条带，极有利于样品间的比对。
图1是B系P-EST同功酶区带回收图；图中两黑线间的凝胶即是待回 收的目的凝胶区带；
图2是回收的B、 A、 AT系P -EST同功酶粗酯酶的第一向正F电泳图
谱；
图3是第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1、 2、 3、 4分别 是图2中1、 2、 3、 4条带的二向电泳图。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
本发明的大白菜特异蛋白质/同工酶多肽的分离纯化方法，具体实验方 法如下
1. 普通不连续聚丙烯酰胺活性凝胶电泳图谱分析
采用普通不连续聚丙烯酰胺活性凝胶分析系统比较对照与处理材料间 同工酶或蛋白图谱的差异，确定特异的同工酶或蛋白带。采用分离胶浓度为
7%，浓縮胶浓度为4%，浓縮胶电泳电压100V，分离胶电泳电压260V。
2. 特异同工酶或蛋白带的回收富集
采用单向活性凝胶制备系统(不制点样孔，直接于浓縮胶上上样)分离，
电泳完毕后切取凝胶板两侧5-10mm宽的凝胶条染色，染色后放回原凝胶板 两侧指示特异蛋白质(同工酶)(图l)。如果目的带有多条，而且相互间距 离比较近，逐条回收有一定困难，可以将这些目的带作为一个区进行统一切 取回收。根据实验所需，确定凝胶回收量。
3. 特异同工酶或蛋白干粉制备
将切取的目的条带(或带区)凝胶放入事先准备好的透析袋中，向透析 袋中加入适量电极缓冲液，封住透析袋口并置于水平电泳槽中，用20mA的 恒流过夜电洗脱。电洗脱完毕用镊子取出凝胶，收集粗酶液，粗酶液经透析 除盐、真空冷冻干燥后得到粗同工酶或蛋白干粉。
4. 特异同工酶或蛋白的IEF分离纯化
采用自制IEF凝胶电泳系统对特异3 -酯酶进行分离纯化，具体操作如
下
1 )样品裂解以30ul裂解液/lmg粗酶干粉进行样品裂解。裂解液组成 尿素8M， CHAPS4%， DTT65mM， Ampholyte (pH3.5-10) 0.2%。
2)IEF胶配制尿素6g， Ampholyte(pH3.5-10) 48ul， Ampholyte(pH4-7) 240ul， ddH20 2ml， APS40ul， TEMED 12ul。(不同pH范围的两性电介质
间的比例需根据不同蛋白质的等电点来确定)
3) 垂直板IEF电泳参数200V预电泳lh， 250V电泳30min， 280V电
泳至电流接近O。
4) 胶条平衡IEF电泳完毕，用10X的TCA固定10min，然后经考马 斯亮兰染色至显带，蒸馏水冲洗，挖下目的条带并将其放入平衡液(0.125 mol/LTris-HCl (pH6.8)， 0.1%SDS)中平衡25min，直接用于二向凝胶 电泳或一2(TC保存备用。
5.第二向SDS凝胶电泳分离
采用15%的凝胶浓度，在20X20cm的垂直凝胶板上进行。先用5mA 恒流预电泳2小时，然后将切取的第一向IEF凝胶中的目的条带放入点样孔 (注意排净气泡)，在8mA恒流条件下电泳2小时进行浓縮，再用18mA恒 流电泳进行分离(具体电泳时间根据目的蛋白分子量的大小来确定，在确保 目的蛋白跑不出凝胶的前提下尽可能的延长电泳时间，以达到充分分离的目 的)。
以下是发明人给出的具体实施例。 实施例l:
大白菜雄性不育温度敏感相关特异同功酶多肽分离纯化方法 1、特异3-酯酶同功酶的鉴定分析
采用普通不连续单向活性凝胶分析系统比较A系、B系小花蕾3 -酯酶 同功酶酶谱。分离胶浓度7%，浓縮胶浓度4%，浓縮胶电泳电压100V，分 离胶电泳电压260V。
聚丙烯酰胺凝胶系统如下
a. 分离胶贮液(100ml): Acr28.0g， Bis0.735g，重蒸水定容。
b. 分离胶缓冲液PH8.9 (100ml): lMHC148ml， Tris36.8g，重蒸水定容。
c. 浓縮胶缓冲液PH6.7 (100ml): lMHC148ml， Tris 5.98g，重蒸水定容。
d. 10%的过硫酸铵过硫酸铵0.5g溶于5ml重蒸水中。
e. 电极缓冲液母液PH8.3 (1000ml): Tris 6.0g，廿氨酸28.8g，重蒸水定容。
分离胶制备(7%): 2.52ml a+1.4ml b+重蒸水7.0ml+56pl d+14pl TEMED;
浓縮胶制备(4%): 0.57ml a+0.57ml c+重蒸水3.8ml+50pl d+7.5|Ld TEMED;
2. 特异e-酯酶同功酶酶带回收
由于B系小花蕾中P-酯酶酶谱中迁移率为0.683， 0.718， 0.742的特异
酶带以及迁移率为0.778的共同酶带间隔太近，无法逐条进行回收，因此将 这几条带作为一个区进行回收。回收方法是，先用单向活性凝胶制备系统(不 制点样孔，直接于浓縮胶上上样)分离，电泳完毕后切取凝胶两边各5 — 10mm宽的胶条进行酯酶染色，染色完毕将着色胶条放回原处以指示目的条 带的位置和范围(图2)，然后根据染色胶条特异P-酯酶酶带指示的位置切 取目的条带区段。A系相应带区的回收方法是，采用与B系完全相同的电 泳系统及参数，以迁移率为0.778的共同酶带为底线，向上切取与B系回收 区带相同宽度的凝胶(宽约2.5cm)。
3. 特异P -酯酶同功酶粗酶干粉制备将切取的目的条带区凝胶放入事 先准备好的透析袋中，向透析袋中加入适量电极缓冲液，封住透析袋口并置 于水平电泳槽中，用20mA的恒流过夜电洗脱。电洗脱完毕用镊子取出凝胶， 收集粗酶液，粗酶液经透析除盐、真空冷冻干燥后得到粗酶干粉。
4. 特异P -酯酶同功酶的正F电泳分离
采用自制的IEF凝胶电泳系统对特异P -酯酶进行分离纯化，具体方法
是
(1) 样品裂解以30ul裂解液/lmg粗酶干粉进行样品裂解。裂解液组 成尿素8M， CHAPS4%， DTT65mM， Ampholyte (pH3.5-10) 0.2%。
(2) IEF胶配制尿素6g， Ampholyte (pH3.5-10) 48ul， Ampholyte (pH4陽7) 240ul， ddH20 2ml， APS40ul， TEMED 12ul。
(3) 垂直板IEF电泳参数200V预电泳lh， 250V电泳30min， 280V 电泳至电流接近0。
(4) 胶条平衡正F电泳完毕，用10X的TCA固定10min，然后经考 马斯亮兰染色至显带，蒸馏水冲洗，切下目的条带并将其放入平衡液0.125 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)， 0.1 % SDS中平衡25min，直接用于二向凝胶 电泳或一2(TC保存备用。
5.特异P -酯酶同功酶的SDS凝胶电泳分离
采用15%的凝胶浓度，在20X20cm的垂直凝胶板上进行。先用5mA 恒流预电泳2小时，然后将切取的第一向IEF目的条带放入点样孔(注意排 净气泡)，先用8mA恒流电泳2小时进行浓縮，再用18mA恒流电泳9.5小 时进行分离(图3)。
权利要求
1.一种从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶多肽的方法，其特征在于，该方法首先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定目标性状的特异蛋白质/同工酶带，接着回收特异带区，浓缩成特异带干粉，再通过IEF电泳系统鉴定、区分特异带的等电点差异，最后通过SDS凝胶电泳分离目标多肽，使组成特异蛋白质/同工酶的多肽完全分离纯化，具体包括下列步骤步骤一，特异蛋白质/同工酶的鉴定分析采用普通不连续聚丙烯酰胺活性凝胶系统分析比较对照与处理间蛋白质/同工酶图谱的差异，确定特异蛋白质/同工酶带，采用的分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为4％，浓缩胶电泳电压100V，分离胶电泳电压260V；步骤二，特异蛋白质/同工酶带回收采用单向活性凝胶制备系统，不制点样孔，直接于浓缩胶上上样分离，电泳完毕后切取凝胶板两侧5-10mm宽的凝胶条染色，染色后放回原凝胶板两侧指示特异蛋白质/同工酶，如果目的带有多条，而且相互间距离较近，单条回收有困难时，可将这些目的带作为一个区进行回收；根据实验所需，确定凝胶回收量；步骤三，特异蛋白质/同工酶干粉制备根据染色胶条指示的位置，切取未染色的目的条带所在位置的凝胶或带区凝胶，放入事先准备好的透析袋中，向透析袋中加入适量电极缓冲液，封住透析袋口并置于水平电泳槽中，用20mA的恒流过夜电洗脱，电洗脱完毕后用镊子取出凝胶，收集蛋白质/同工酶粗液，粗液再经透析除盐、真空冷冻干燥后得到粗蛋白质/同工酶干粉；步骤四，特异蛋白质/同工酶的IEF电泳分离的纯化用制备的粗蛋白质/同工酶干粉进行IEF凝胶电泳，考马斯亮兰染色，验证特异性、检测区分等电点；步骤五，特异蛋白质/同工酶的SDS凝胶电泳分离挖去IEF凝胶中的目的蛋白质带，进行SDS凝胶电泳。采用15％的凝胶浓度，在20×20cm的垂直凝胶板上进行，先用5mA恒流预电泳2小时，然后将切取IEF目的凝胶条带放入点样孔，先用8mA恒流电泳2小时进行浓缩，再用18mA恒流电泳9.5小时进行分离；最后用考马斯亮兰染色。
2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的特异蛋白质/同工酶 多肽的IEF凝胶电泳，包括(1) 样品裂解以lmg粗蛋白质/同工酶干粉，在30ul裂解液进行样 品裂解，该裂解液组成尿素8M， CHAPS4%， DTT65mM， pH为3.5 10 的Ampholyte 0.2%;(2) 正F胶配制:尿素6g， pH为3.5 pH10的Ampholyte 48ul， pH 为3.5 7的Ampholyte 240ul， ddH20 2ml， APS40ul， TEMED 12ul;(3) 垂直板正F电泳参数200V预电泳lh， 250V电泳30min， 280V 电泳至电流接近0;(4) 胶条平衡IEF电泳完毕，用10X的TCA固定10min，然后经考 马斯亮兰染色至显带，蒸馏水冲洗，切下目的条带并将其放入平衡液中平衡 25min，直接用于二向凝胶电泳或一2(TC保存备用；所述的平衡液为0.125 mol/L Tris-HCl， 0.1% SDS。
全文摘要
本发明公开了一种大白菜特异蛋白质/同工酶的分离纯化方法，该方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定目的特异蛋白质/同工酶带，回收特异带区后，通过自制的IEF电泳系统鉴定特异蛋白质/同工酶带的等电点差异，最后通过SDS凝胶电泳分离目的特异蛋白质/同工酶，使组成特异蛋白质/同工酶的多肽完全分离纯化，为进一步蛋白质测序奠定基础。该方法程序适合于各种植物组织特异蛋白质/同工酶的分离纯化，具有技术简单，成本低，目的性强的优点。
文档编号C07K1/00GK101168559SQ20071001876
公开日2008年4月30日 申请日期2007年9月28日 优先权日2007年9月28日
发明者张少丽, 张明科, 张鲁刚, 惠麦侠 申请人:西北农林科技大学