对细胞表面靶具有结合特异性的双特异性配体及其使用方法

专利名称：对细胞表面靶具有结合特异性的双特异性配体及其使用方法
技术领域：
本发明涉及结合存在于细胞上的两个细胞表面靶的配体。例如，配体可含有第一多肽域和第二多肽域，所述第一多肽域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽域具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位点。优选地，第一多肽域(例如免疫球蛋白单可变区)以低亲和力结合所述第一细胞表面靶，所述第二多肽域(免疫球蛋白单可变区)以低亲和力结合所述第二细胞表面靶。
如本文所述和例举的，这些配体可选择性地结合含有第一细胞表面靶和第二细胞表面靶这二者的双阳性细胞。因此，以低亲和力结合期望的细胞表面抗原的多肽，例如抗体和抗原的抗原结合片段，可被制成如本文所述的配体，以提供可选择性结合双阳性细胞的物质。
本发明的配体提供一些优势。例如，如本文所述，结合两种不同细胞表面靶的配体可在结合细胞表面上的两个靶时内化进入细胞中。因此，所述配体可用于将治疗剂如毒素递送到表达第一细胞表面靶和第二细胞表面靶的双阳性细胞如癌细胞中。因为所述配体可选择性结合双阳性细胞，所以可能由将治疗剂递送到单阳性细胞引起的可能不需要的作用(例如副作用，如免疫抑制)可使用本发明的配体来避免。
本发明的配体可结合同时存在于正常细胞和病原细胞上但以较高水平存在于病原细胞上的细胞表面靶。在这些情况下，配体可用于优先将治疗剂(例如毒素)递送到病原细胞。例如，由于病原细胞上的较高水平的细胞表面靶，所以与结合并内化进入正常细胞中的配体相比，更多的配体将结合病原细胞并内化。因此，有效量的毒素可优先被递送到病原细胞。
此外，如本文所述，可修饰配体使之具有期望的体内血清半衰期。因此，所述配体可用于控制、减少或消除治疗药的一般毒性，所述治疗药例如为用于治疗癌症的细胞毒素。
一般而言，配体结合的两个细胞表面靶都存在于病原细胞上，但不同时存在于正常细胞上。如本文所示，在这些情况下，配体可以以导致选择性结合含有两个细胞表面靶的病原细胞的浓度(以其中配体基本不结合单阳性正常细胞的浓度)使用。
某些正常细胞可具有在它们的细胞表面上存在的、由本发明配体结合的两个细胞表面靶，但所述靶以较高水平存在于病原细胞(例如癌细胞)表面。优选地，两个细胞表面靶基本上不存在于正常细胞表面上。在这些情况下，配体可以导致选择性结合含有两个细胞表面靶的病原细胞的浓度(以其中配体基本不结合含低水平的细胞表面靶的正常细胞的浓度)使用。
优选的配体含有对第一细胞表面靶具有结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区和对第二细胞表面靶具有结合特异性的第二免疫球蛋白单可变区。在优选的实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD138、癌胚抗原(CEA)、CD56、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)和HER2。在特别优选的实施方案中，第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2，前提条件是所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区不结合同一细胞表面靶。
本发明的配体可如本文所述配制。例如，可配制本发明的配体，以改变体内血清半衰期。如有需要，配体还可以包含如本文所述的毒素或毒素部分。在某些实施方案中，配体包含表面活性毒素，例如自由基产生物(例如含硒的毒素)或放射性核素。在其它实施方案中，毒素或毒素部分是具有对胞内靶具有结合特异性的结合位点的多肽域(例如dAb)。
表1:配体的靶特异性 本领域技术人员将意识到，在表1中提供的靶组合和在实施例中提供的靶组合只不过代表了按照本发明使用的适宜组合的范例。
表2 配体形式 本发明的配体可以制成本文描述的双特异性配体。配体还可以制成例如在WO 03/002609中描述的多特异性配体，该文献的全部公开内容都通过引用结合到本文中。此双特异性配体包含具有不同结合特异性的免疫球蛋白单可变区。此双特异性配体可包含重链区和轻链区的组合。例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，这两区可以连接在一起呈scFv的形式(例如使用合适的接头，例如Gly4Ser)，或者制成双特异性抗体或其抗原结合片段(例如F(ab’)2片段)。双特异性配体不包含形成常规的双链抗体抗原结合位点的互补VH/VL对，所述双链抗体抗原结合位点协同结合抗原或表位。相比之下，双型配体包含VH/VL互补对，其中V区具有不同的结合特异性。
另外，如有需要，双特异性配体可包含一个或多个CH区或CL区。如有需要也可包含铰链区。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。也考虑了其它结构，例如包含VH、VL、CH1和CL区的IgG分子的单臂。优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样的配体也能掺入同一蛋白质，例如两个这样的配体可以掺入IgG或多聚体形式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一个实施方案中，多个双特异性配体结合在一起形成多聚体。例如，两个不同双特异性配体结合在一起，产生四特异性分子。本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的双特异性配体的轻链可变区和重链可变区可以在同一多肽链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、通常是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团连接，或者通过本领域已知的任何其它方法连接。
配体可以制成双特异性或多特异性抗体或抗体片段，或者制成双特异性或多特异性非抗体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其中可以掺入抗体可变区或其一个或多个CDR，以便在结构上赋予对抗原的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域已知的，例如双特异性IgG样形式(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的异型二聚体、任何前述的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单可变区(例如VH、VL、VHH)、dAb和任何前述的修饰形式(例如通过共价连接聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合适的聚合物)而修饰)，或其它合适的聚合物)。参见2003年6月30日申请的指定国为美国的PCT/GB03/002804(WO2004/081026)有关PEG化的单可变区和dAb、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的流体动力学尺寸的PEG和优选的流体动力学尺寸的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。
配体可使用合适的接头如(Gly4Ser)n制成，其中n＝1-8，例如2、3、4、5、6或7。如有需要，包括dAb单体、二聚体和三聚体在内的配体，可以连接抗体Fc区(包含CH2和CH3区中的一个或两者都包含)，以及任选的铰链区。例如，编码以单核苷酸序列连接至Fc区的配体的载体，可用于制备所述多肽。
配体和dAb单体还可以结合和/或制成非抗体多配体结构的形式，以形成多价复合物，其结合具有相同表位的靶分子，因而提供较高亲合力。例如天然细菌受体(例如SpA)已可以用作移植CDR的支架，以产生特异性结合一个或多个表位的配体。在US 5,831,012中描述了该方法的细节。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合适方法的细节描述于WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白和CTLA4，如在van den Beuken等，J.Mol.Biol.310，591-601(2001)中所述，以及例如描述于WO 00/69907(Medical Research Council)的支架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它伴侣分子多肽。蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且与免疫球蛋白VH区或VL区一起使用，以构成配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。
用于制备任何需要形式的多种合适方法是本领域已知的。例如，抗体链和抗体形式(例如双特异性IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体)可通过表达合适的表达构建体和/或合适的细胞培养物(例如杂交瘤、异型杂交瘤、含有编码所述形式的重组构建体的重组宿主细胞)制备。此外，可通过表达合适的表达构建体，和/或通过抗体的酶促消化(例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)，制备诸如抗体或抗体链的抗原结合片段(例如双特异性结合片段，例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)的形式。
配体可制成多特异性配体的形式，如在WO 03/002609中所述，该文献的全部公开内容通过引用结合到本文中。此多特异性配体具有1个以上的表位结合特异性。一般而言，多特异性配体含有两个或更多个表位结合域，例如含有针对表位的结合位点的dAb或非抗体蛋白质区，例如亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性多聚体(avimer)。多特异性配体可如本文所述进一步制备。
在某些实施方案中，配体是IgG样形式。这类形式具有IgG分子的常规4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(VH和/或VL)已经被所需特异性的dAb或单可变区置换。优选各可变区(2个VH区和2个VL区)被dAb或单可变区置换。包括在IgG样形式中的dAb或单可变区可具有相同特异性或不同特异性。在某些实施方案中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4种特异性。例如，IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有相同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特异性的dAb和另一具有不同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含2个具有相同特异性的dAb和2个具有相同特异性但该特异性与上述的不同的dAb；可以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第二dAb，具有不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三dAb的特异性的第四dAb；或者可以是四特异性的，并且包含4个各自具有不同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、scFv)。
本发明的配体可精制成含有第一免疫球蛋白单可变区直接与第二免疫球蛋白单可变区融合的融合蛋白。如有需要，此形式还可以包含半衰期延长部分。例如，配体可包含第一免疫球蛋白单可变区、第二免疫球蛋白单可变区和能结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变区，其中第一免疫球蛋白单可变区直接与第二免疫球蛋白单可变区融合，而第二免疫球蛋白单可变区又直接与能结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变区融合。
一般而言，具有对细胞表面靶具有结合特异性的结合位点且不管配体是否含有接头的多肽域的方向是设计选择的问题。但是，有或没有接头情况下的某些方向可提供比其它方向更好的结合特征。本发明包含所有方向(例如dAb1-接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)，所含方向提供期望的结合特征的配体可通过筛选容易地鉴别。
延长半衰期的形式 可制备本文公开的配体和dAb单体，以延长其体内血清半衰期。增加的体内半衰期对免疫球蛋白的体内应用有用，尤其是抗体，最特别地是小尺寸的抗体片段，例如dAb。这类片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、dAb)被快速地从体内清除掉，这极大地限制了临床应用。
配体可以制成抗体的较大抗原结合片段或具有较大流体动力学尺寸的抗体(例如制成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。配体还可以被制备得具有较大流体动力学尺寸，例如通过连接聚亚烷基二醇基团(例如聚乙二醇(PEG)基团、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或者通过与抗体区缀合。在某些实施方案中，配体被PEG化。优选地，PEG化配体以和未PEG化的同一配体基本相同的亲合力结合双阳性细胞。例如，配体可以是含有结合CD38的dAb和结合CD138的第二dAb的PEG化配体，其中PEG化配体与CD38+CD138+细胞结合的亲合力与非PEG化形式的配体的亲合力之间的差异不超过约1000倍、优选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或者前者的亲合力相对于未PEG化形式基本不变。参见2003年6月30日申请的指定国为美国的PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)有关PEG化的单可变区和dAb、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的流体动力学尺寸的PEG和优选的流体动力学尺寸的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及的部分，都通过引用结合到本文中。
本发明配体(例如dAb单体或多聚体)的流体动力学尺寸可使用本领域众所周知的方法进行测定。例如，可使用凝胶过滤层析来测定配体的流体动力学尺寸。适于测定配体的流体动力学尺寸的凝胶过滤基质，例如交联琼脂糖基质，是众所周知并容易获得的。
配体形式的大小(例如连接dAb单体的PEG部分的大小)可根据需要的应用而变化。例如，在希望配体离开循环并进入外周组织的情况下，最好保持配体的流体动力学尺寸较小，以便从血流中外渗。或者，在期望使配体保留在系统循环中达较长的时间段的情况下，可增加配体的尺寸，例如通过制成为Ig样蛋白质或通过加入30-60kDa PEG部分(例如线性或分支的30-40kDa PEG，例如加入两个20kDa PEG部分)。可改变配体形式的尺寸，以达到需要的体内血清半衰期、例如控制与毒素的接触和/或减少毒素物质的副作用。
配体的流体动力学尺寸及其血清半衰期还可以通过将配体与结合域缀合或连接而增加，所述结合域结合如本文所述增加体内半衰期的抗原或表位。例如，配体(例如dAb单体)可缀合或连接至抗血清白蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体片段，(例如抗SA或抗新生动物Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)，或者缀合或连接至抗SA亲和体或抗新生动物Fc受体亲和体。
用于本发明配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实例描述于WO 2005/077042A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明: ·公开于WO 2005/077042A2的SEQ ID NO:1，该序列通过引用明确地结合到本文公开内容中； ·白蛋白片段或变异体，其包含WO 2005/077042A2中SEQ IDNO:1的氨基酸1-387或由其组成； ·白蛋白或其片段或变体，其包含选自以下的氨基酸序列: (a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸54-61； (b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸76-89； (c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸92-100； (d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸170-176； (e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸247-252； (f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸266-277； (g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸280-288； (h)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸362-368； (i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸439-447； (j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸462-475； (k)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸478-486；和 (1)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸560-566。
用于本发明配体的合适白蛋白、片段和类似物的其它实例描述于WO 03/076567A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明: ·人血清白蛋白，如WO 03/076567A2所述，例如在图3中(该序列信息通过引用明确地结合到本文公开内容中)； ·人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多肽链组成，分子量为66,500(参见Meloun等，FEBS Letters 58:136(1975)；Behrens等，Fed.Proc.34:591(1975)；Lawn等，NucleicAcids Research 9:6102-6114(1981)；Minghetti等，J.Biol.Chem.261:6747(1986))； ·白蛋白多态变异体或其类似物或片段，如Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.37:219(1973)所述； ·如在EP 322094中所述的白蛋白片段或变异体，例如HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419间的片段； ·如在EP 399666中所述的白蛋白片段或变异体，例如HA(1-177)和HA(1-200)以及HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199间的任意数字。
当(一个或多个)半衰期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于本发明的配体时，可以用任何合适方法将其与配体缀合，例如通过与靶结合部分(例如dAb或抗体片段)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中融合蛋白作为具有半衰期延长部分(位于细胞表面靶结合部分的N端或C端)的单一多肽链被编码。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如WO 03/076567A2或WO 2004/003019所述的肽接头(这些接头的公开内容通过引用结合到本文公开内容中，以提供用于本发明的实例))，来实现缀合。
通常，增强体内血清半衰期的多肽为体内天然存在并抵抗降解或由生物体(例如人)中去除不需要的物质的内源机制去除的多肽。例如，可从以下蛋白质中选出延长体内血清半衰期的多肽:来自胞外基质的蛋白质，存在于血液中的蛋白质，在血脑屏障或神经组织中发现的蛋白质，局限于肾脏、肝脏、肺、心脏、皮肤或骨的蛋白质，应激蛋白，疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋白。
增强体内血清半衰期的合适多肽包括例如转铁蛋白受体特异性配体-神经药物(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(参见美国专利第5,977,307号，该专利公开的内容通过引用结合到本文中)、脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如可溶性转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF2)受体、胰岛素受体、血液凝固X因子、α1抗胰蛋白酶和HNF 1α。增强血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白(Orosomucoid)；AAG)、α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋白HC；AIM)、抗凝血酶III(AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂蛋白B(Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4(C4)、C1酯酶抑制剂(C1INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白(Transthyretin)；PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。
来自胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是胞外基质的主要蛋白质。目前已经知道约15种胶原蛋白分子，在身体的不同部位发现，例如在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原蛋白(占身体总胶原蛋白的90％)，或者在软骨、椎间盘(vertebral disc)、脊索和眼睛的玻璃体中发现的II型胶原蛋白。
来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白(例如血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原(例如血纤蛋白原A、血纤蛋白原B)、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白)；酶和酶抑制剂(例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)；免疫系统蛋白质，例如免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ))；转运蛋白(例如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)；防卫素(例如β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素2和嗜中性粒细胞防卫素3)等。
在血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白等。
增强体内血清半衰期的合适多肽还包括局限于肾脏中的蛋白质(例如多囊蛋白、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann抗原)；局限于肝脏中的蛋白质(例如醇脱氢酶、G250)；局限于肺部的蛋白质(例如结合IgA的分泌成分))；局限于心脏中的蛋白质(例如与扩张型心肌病相关的HSP 27)；局限于皮肤的蛋白质(例如角蛋白)；骨特异性蛋白质(例如骨形态发生蛋白(BMP)，它们是表现出成骨活性的转化生长因子β蛋白超家族亚类，例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8)；肿瘤特异性蛋白(例如滋养层抗原、赫赛汀(herceptin)受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如可存在于肝脏和脾脏中的组织蛋白酶B))。
合适的疾病特异性蛋白包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(OPGL，参见Nature 402，304-309(1999))、OX40(TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达，在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)生产细胞中被特异性上调；参见Immunol.165(1):263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；以及血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)和CXXXC趋化因子(fractalkine)。
增强体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白，例如热激蛋白(HSP)。HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞已经死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅在胞外HSP由于创伤、疾病或损伤而触发免疫系统的反应时才发生。结合胞外HSP可以使本发明的组合物定位于疾病部位。
参与Fc转运的合适蛋白质包括例如Brambell受体(也称为FcRB)。该Fc受体具有两个功能，这两个功能都可以潜在用于递送。所述功能是:(1)穿过胎盘将IgG从母亲转运给孩子，(2)保护IgG免遭降解，因而延长IgG的血清半衰期。有人认为受体从核内体中再利用IgG(参见Holliger等，Nat Biotechnol 15(7):632-6(1997))。
药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人员熟知的。有关细节可参见Kenneth，A等:Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists和Peters等，Pharmacokinetc analysis:A Practical Approach(1996)。参考文献也可参见“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，Marcel Dekker出版，2ndRev.ex edition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如tα和tβ半衰期以及曲线下面积(AUC)。
包含毒素部分或毒素的配体 本发明还涉及含有毒素部分或毒素的配体。合适的毒素部分包括毒素(例如表面活性毒素、细胞毒素)。可使用任何合适的方法使毒素部分或毒素与配体连接或缀合。例如，毒素部分或毒素可直接地或通过合适的接头共价连接至配体。合适的接头可包括不可切割的或可切割的接头，例如含有细胞酶(例如细胞酯酶、细胞蛋白酶，例如组织蛋白酶B)的切割位点的pH可切割的接头。这样的可切割接头可用于制备在配体被内化后可释放毒素部分或毒素的配体。
缀合 可使用多种将毒素部分或毒素连接或缀合至配体的方法。选定的具体方法取决于毒素部分或毒素以及要连接或缀合的配体。如有需要，可使用含有末端官能团的接头连接配体与毒素部分或毒素。一般而言，通过使含有活性官能团(或经修饰而含有活性官能团)的毒素部分或毒素与接头反应或与配体直接反应实现缀合。可如下形成共价键:使含有(或经修饰而含有)化学部分或官能团(所述化学部分或官能团可在合适的条件下与第二个化学基团反应)的毒素部分或毒素反应，由此形成共价键。
许多合适的活性化学基团组合是本领域已知的，例如胺基团可与亲电子基团反应，所述亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。硫醇可与马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶二硫物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可与含有胺或酰肼的分子偶联，叠氮基可与三价磷基团反应而形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键(phosphorimide linkage)。将活化基团引入分子中的合适方法是本领域已知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPress:San Diego，CA(1996))。
可如本文所述，通过使合适的配体与含有反应性化学基团或官能团的毒素反应，产生本发明的缀合毒素的配体。例如，缀合可经由伯胺残基、羧基和半胱氨酸残基实现。工程改造过的半胱氨酸残基作为用于毒素缀合的位点提供了某些优势，因为毒素经由未配对的半胱氨酸残基(例如经工程改造而进入配体的半胱氨酸残基)缀合提供了实现位点特异性缀合的方法，并降低了缀合干扰抗原结合功能的可能性。例如，未配对的半胱氨酸可在dAb的羧基末端掺入，以提供用于位点特异性硫醇缀合的残基。另外，在双特异性配体中为非天然存在的半胱氨酸残基的特异性溶剂可及位点可突变为用于连接毒素的半胱氨酸。双特异性配体中的溶剂可及位点可使用本领域已知的方法确定，例如配体的晶体结构分析。例如，使用Vk对照dAb(SEQ ID NO:679)的已解析晶体结构，残基Val-15、Pro-40、Gly-41、Ser-56、Gly-57、Ser-60、Pro-80、Glu-81、Gln-100、Lys-107和Arg-108已被鉴定为溶剂可及的，因此在本文所述的双特异性配体上的相应位置的残基为用于突变为缀合毒素的半胱氨酸残基的潜在候选物。
硫醇缀合物可使用任何合适的方法制备，例如用于形成二硫键的众所周知的方法或通过与硫醇反应基反应，所述硫醇反应基例如为马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶二硫物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。
在某些实施方案中，可通过使用胺反应性化学基团或官能团，例如使配体与毒素的NHS酯反应，使毒素或毒素部分以非位点特异性方式与配体键合。
优选的缀合是位点特异性缀合，例如在半胱氨酸、氨基末端或羧基末端缀合。氨基末端缀合可使用任何合适的方法实现，例如描述于EP 0 822 199 B1的方法。例如，配体可与胺反应性毒素或毒素部分在还原性烷基化条件下(例如在硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼酸二甲胺、硼酸三甲胺或硼酸吡啶存在下)于适于选择性活化配体氨基末端上的α氨基的pH(例如4.0-6.0)反应，使得毒素连接至α氨基，由此获得配体毒素缀合物。
合适的毒素部分和毒素包括例如美登木素生物碱(maytansinoid)(例如美登木醇，例如DM1、DM4)、紫杉烷(taxane)、加利车霉素、倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。美登木素生物碱可以是例如美登木醇或美登木醇类似物。美登木醇类似物的实例包括那些具有修饰芳环的美登木醇(例如C-19-脱氯、C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基)和那些在其它位置具有修饰的美登木醇(例如C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基(aceloxymethyl)、C-15-羟基/酰氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-脱甲基、4，5-脱氧)。美登木醇和美登木醇类似物描述于例如美国专利第5,208,020和6,333,410号，所述专利的内容通过引用结合到本文中。可以使用例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(也称为4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯或SPP)、4-琥珀酰亚胺基-氧羰基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SDPB)、2-亚氨基硫杂环戊烷(2iminothiolane)或S-乙酰基琥珀酸酐，使美登木醇与抗体和抗体片段偶联。紫杉醇可以是例如泰素、泰索帝或新的紫杉烷(参见例如WO01/38318)。加利车霉素可以是例如溴-加利车霉素络合物(例如α、β或γ溴络合物)、碘-加利车霉素络合物(例如α、β或γ碘络合物)或者其类似物和模拟物。溴-加利车霉素络合物包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR和K1-BR。碘-加利车霉素络合物包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。加利车霉素及其突变体、类似物和模拟物描述于例如美国专利第4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374和5,714,586号，所述每个专利的内容都通过引用结合到本文中。倍癌霉素(Duocarmycin)类似物(例如KW-2189、DC88、DC89 CBI-TMI)及其衍生物描述于例如美国专利第5,070,092号、美国专利第5,187,186号、美国专利第5,641,780号、美国专利第5,641,780号、美国专利第4,923,990号和美国专利第5,101,038号，所述每个专利的内容都通过引用结合到本文中。
其它毒素的实例包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、CC-1065(参见美国专利第5,475,092、5,585,499、5,846,545号)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲星(streptozotocin)、丝裂霉素C以及顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、丝裂霉素、嘌罗霉素、安曲霉素(AMC))、倍癌霉素(duocarmycin)及其类似物或衍生物，以及抗有丝分裂药(例如长春新碱、长春碱、泰素、auristatin(例如auristatin E)和美登木素生物碱及其类似物或同系物。
毒素也可以是表面活性毒素，例如作为自由基产生物(例如含硒毒素部分)的毒素或含有放射性核素的部分的毒素。合适的含有放射性核素的部分包括例如含有放射性碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)的部分。
毒素可以是蛋白质、多肽或肽，来源于细菌蛋白质(例如白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE))和植物蛋白质(例如篦麻毒蛋白A链(RTA))，而多花白树毒蛋白(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒蛋白和商陆毒蛋白(dodecandron)等核糖体失活蛋白(RIP)，也可考虑用作毒素。
设计用于结合、废止和促进降解、或防止产生导致产生特定靶蛋白的mRNA的核酸的反义化合物也可以用作毒素。反义化合物包括单链或双链的反义RNA或DNA、寡核苷酸或它们的类似物，它们可与单独的mRNA物质特异性杂交，并阻止mRNA物质的转录和/或RNA加工和/或所编码多肽的翻译，由此实现对应的编码多肽的数量减少。Ching等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10006-10010(1989)；Broder等，Ann.Int.Med.113:604-618(1990)；Loreau等，FEBS Letters 274:53-56(1990)；有用的反义治疗剂包括例如:VeglinTM(VasGene)和OGX-011(Oncogenix)。
毒素还可以是光敏剂。合适的光敏剂包括基于卟啉的物质，例如卟吩姆钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、其血卟啉衍生物、酞菁、初红紫素(etiopurpurin)、德卟啉(texaphrin)等。
毒素可以是结合胞内靶的抗体或抗体片段(例如胞内抗体)，例如结合胞内靶的dAb。这样的抗体或抗体片段(dAb)可针对限定的亚细胞区室或靶。例如，抗体或抗体片段(dAb)可结合选自以下的胞内靶:erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21Ras、半胱天冬酶3、半胱天冬酶7、Bcl-2、p53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV型胶原酶、组织蛋白酶L以及在Kontermann，R.E.，Methods，34:163-170(2004)中描述的其它靶，该文献整体通过引用结合到本文中。
结合CD38的多肽域 本发明提供具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域(例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域(例如dAb)以低亲和力结合CD38。优选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10nM之间的Kd结合CD38。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或约10μM至约400nM的亲和力结合CD38。在某些实施方案中，多肽域以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合CD38。
在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD38:DOM11-14(SEQ IDNO:39)、DOM11-22(SEQ ID NO:40)、DOM11-23(SEQ ID NO:32)、DOM11-25(SEQ ID NO:41)、DOM11-26(SEQ ID NO:42)、DOM11-27(SEQ ID NO:43)、DOM11-29(SEQ ID NO:44)、DOM11-3(SEQ IDNO:30)、DOM11-30(SEQ ID NO:31)、DOM11-31(SEQ ID NO:45)、DOM11-32(SEQ ID NO:36)、DOM11-36(SEQ ID NO:46)、DOM11-4(SEQ ID NO:47)、DOM11-43(SEQ ID NO:48)、DOM11-44(SEQ IDNO:49)、DOM11-45(SEQ ID NO:50)、DOM11-5(SEQ ID NO:51)、DOM11-7(SEQ ID NO:33)、DOM11-1(SEQ ID NO:52)、DOM11-10(SEQ ID NO:53)、DOM11-16(SEQ ID NO:54)、DOM11-2(SEQ IDNO:55)、DOM11-20(SEQ ID NO:56)、DOM11-21(SEQ ID NO:57)、DOM11-24(SEQ ID NO:38)、DOM11-28(SEQ ID NO:58)、DOM11-33(SEQ ID NO:59)、DOM11-34(SEQ ID NO:60)、DOM11-35(SEQ IDNO:61)、DOM11-37(SEQ ID NO:37)、DOM11-38(SEQ ID NO:34)、DOM11-39(SEQ ID NO:35)、DOM11-41(SEQ ID NO:62)、DOM11-42(SEQ ID NO:63)、DOM11-6(SEQ ID NO:64)、DOM11-8(SEQ IDNO:65)和DOM11-9(SEQ ID NO:66)。
在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD38:DOM11-3-1(SEQ IDNO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ IDNO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ IDNO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ IDNO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ IDNO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ IDNO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ IDNO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ IDNO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ IDNO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ IDNO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ IDNO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ IDNO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ IDNO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ IDNO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ IDNO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ IDNO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ IDNO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ IDNO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ IDNO:305)。
在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM11-14(SEQ IDNO:261)、DOM11-22(SEQ ID NO:262)、DOM11-23(SEQ ID NO:9)、DOM11-25(SEQ ID NO:263)、DOM11-26(SEQ ID NO:264)、DOM11-27(SEQ ID NO:265)、DOM11-29(SEQ ID NO:266)、DOM11-3(SEQ ID NO:1)、DOM11-30(SEQ ID NO:2)、DOM11-31(SEQ IDNO:267)、DOM11-32(SEQ ID NO:7)、DOM11-36(SEQ ID NO:268)、DOM11-4(SEQ ID NO:269)、DOM11-43(SEQ ID NO:270)、DOM11-44(SEQ ID NO:271)、DOM11-45(SEQ ID NO:272)、DOM11-5(SEQ IDNO:273)、DOM11-7(SEQ ID NO:3)、DOM11-1(SEQ ID NO:274)、DOM11-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-16(SEQ ID NO:276)、DOM11-2(SEQ ID NO:277)、DOM11-20(SEQ ID NO:278)、DOM11-21(SEQ IDNO:279)、DOM11-24(SEQ ID NO:6)、DOM11-28(SEQ ID NO:280)、DOM11-33(SEQ ID NO:281)、DOM11-34(SEQ ID NO:282)、DOM11-35(SEQ ID NO:283)、DOM11-37(SEQ ID NO:8)、DOM11-38(SEQ ID NO:4)、DOM11-39(SEQ ID NO:5)、DOM11-41(SEQ IDNO:284)、DOM11-42(SEQ ID NO:285)、DOM11-6(SEQ ID NO:286)、DOM11-8(SEQ ID NO:287)和DOM11-9(SEQ ID NO:288)。
在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM11-3-1(SEQ IDNO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ IDNO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ IDNO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ IDNO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ IDNO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ IDNO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ IDNO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ IDNO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ IDNO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ IDNO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ IDNO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ IDNO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ IDNO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ IDNO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ IDNO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ IDNO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ IDNO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ IDNO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ IDNO:305)。
在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CD38。
在优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域选自DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30(SEQ IDNO:254)、DOM11-7(SEQ ID NO:238)、DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:263)、DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)和DOM11-23(SEQ ID NO:247)。
在其它优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域选自DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQID NO:270)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-10(SEQ IDNO:275)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-20(SEQ IDNO:281)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)和DOM11-3-26(SEQ IDNO:287)。
在其它优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域选自DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQID NO:291)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-3-15(SEQ IDNO:303)和DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)。
具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变区。在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域含有如本文所述的通用构架。
通用构架可以是VL构架(Vλ或Vκ)，例如包含由人种系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有需要，VL构架还可以包含由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有需要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域包含一个或多个构架区，所述架构区包含的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述构架区的氨基酸序列相对于人种系抗体基因区段所编码的所述相应构架区的氨基酸序列总共包含最多5个氨基酸差异。
在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列相对于所述人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列总共包含最多10个氨基酸差异。
在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域包含FW1、FW2和FW3区，所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同。
在具体的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域包含DPK9 VL构架或选自DP47、DP45和DP38的VH构架。具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含普通配体(例如蛋白A、蛋白L和蛋白G)的结合位点。
在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域基本上能抵抗聚集。例如，在某些实施方案中，当将1-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml配体或dAb于药物配制常用溶剂(例如盐水、缓冲盐水、柠檬酸缓冲盐水、水、乳化剂和任何这些含有可接受的赋形剂的溶剂，所述赋形剂例如为由FDA批准的赋形剂)中的溶液在约22℃、22-25℃、25-30℃、30-37℃、37-40℃、40-50℃、50-60℃、60-70℃、70-80℃、15-20℃、10-15℃、5-10℃、2-5℃、0-2℃、-10℃至0℃、-20℃至-10℃、-40℃至-20℃、-60℃至-40℃或-80℃至-60℃的温度下保持一段时间(例如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年或2年)时，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域有小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％聚集。
可采用诸如显微镜检、通过目测或分光镜或任何其它合适的方法评价溶液浊度的任何合适方法，对聚集进行评价。优选通过动态光散射来评价聚集。抗聚集的、具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域具有若干优势。例如，通过采用合适的生物生产系统(例如大肠杆菌)进行表达，容易以可溶性蛋白质的形式以高收率产生这类具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域，并可以比常规多肽更高的浓度来配制和/或贮存，几乎没有聚集和活性损失。
另外，可以比其它抗原或表位结合多肽(例如常规抗体)更经济地生产抗聚集的、具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域。例如，一般来说，预期用于体内应用的抗原或表位结合多肽的制备包括除去聚集多肽的过程(例如凝胶过滤)。不能除去这样的聚集物会使制剂不适用于体内应用，因为例如希望起到拮抗剂作用的抗原结合多肽聚集可通过诱导靶抗原的交联或成簇而起到激动剂的作用。蛋白聚集还可以通过在它们所给予的患者体内诱导免疫应答而降低治疗性多肽的功效。
相比之下，可以制备本发明的抗聚集的、具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域，用于体内应用，而无需包括除去聚集物的过程，并且可用于体内应用，而没有聚集多肽所引起的上述缺点。
在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域当加热到温度(Ts)和冷却到温度(Tc)时能可逆地解折叠，其中Ts高于具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度(Tm)，而Tc低于具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度。例如，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域当加热到80℃和冷却到约室温时能可逆地解折叠。可逆地解折叠的多肽在解折叠时会丧失功能，而一旦重折叠后又会恢复功能。这类多肽不同于在解折叠时聚集的多肽或不适当重折叠(即不能恢复功能)的多肽(错误折叠的多肽)。
可以采用任何合适方法，通过直接或间接测定多肽结构来评价多肽解折叠和重折叠。例如，可以通过圆二色性(CD)(例如远UV CD、近UV CD)、荧光(例如色氨酸侧链的荧光)、对蛋白酶解的敏感性、核磁共振(NMR)，或者通过检测或测定依赖于正确折叠的多肽功能(例如与靶配体的结合、与通用配体的结合)，来测定多肽结构。在一个实例中，采用功能测定评价多肽解折叠，其中结合功能(例如结合通用配体和/或靶配体、结合底物)的丧失表明该多肽是解折叠的。
可以采用解折叠或变性曲线，测定具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解折叠和重折叠的程度。可通过纵坐标为温度与横坐标为折叠多肽相对浓度作图，绘制解折叠曲线。可以采用任何合适的方法(例如CD、荧光、结合测定)，直接或间接测定具有对CD38具有结合特异性的结合位点的折叠多肽域的相对浓度。例如，可以制备具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶液，并通过CD测定溶液的椭圆率。所得椭圆率值表示折叠配体或dAb单体的相对浓度为100％。再通过逐渐升高溶液温度，使溶液中具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域解折叠，然后以合适增量(例如温度每升高一度后)测定椭圆率。然后通过逐渐降低溶液温度，使溶液中具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域重折叠，再以合适增量测定椭圆率。可以对数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线。解折叠曲线和重折叠曲线具有特征性的S形曲线，它包括其中具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域分子折叠的部分，其中具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域分子解折叠到不同程度的解折叠/重折叠转换部分，以及其中具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的部分。重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠的具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的相对数量。至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的恢复，表明配体或dAb单体可逆地解折叠。
在一个优选实施方案中，通过制备具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶液并绘制加热解折叠和重折叠曲线，测定具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的可逆性。可以在任何合适溶剂中制备具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶液，所述溶剂例如为含水缓冲液，其pH适于让具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶解(例如pH比等电点(pI)高或低约3个单位)。具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶液足够浓，以便可检测出解折叠/折叠。例如，配体或dAb单体溶液可以为约0.1μM至约100μM、或优选约1μM至约10μM。
如果具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度(Tm)是已知的，则可将溶液加热至比Tm低约10度(Tm-10)，然后通过椭圆率或荧光(例如从200nm至250nm的远UV CD扫描，于235nm或225nm的固定波长CD；于300-450nm的色氨酸荧光发射光谱和298nm的激发)评价折叠，以提供100％的相对折叠配体或dAb单体。再按预定增量(例如约0.1度至约1度的增加)，将溶液加热至比Tm高至少10度(Tm+10)，以每个增量测定椭圆率或荧光。然后，通过以预定增量冷却到至少Tm-10，使具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域重折叠，并以每个增量测定椭圆率或荧光。如果不知道具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度，则可以通过从约25℃至约100℃递增加热，使溶液解折叠，再递增冷却到至少约25℃使其重折叠，以每个加热和冷却增量测定椭圆率或荧光。可以对所得数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线，其中重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠蛋白质的相对数量。在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域不含骆驼科动物免疫球蛋白可变区，或者不含骆驼科动物种系抗体基因区段所编码的免疫球蛋白可变区所特有的一个或多个构架氨基酸。
优选地，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域当在大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母(Pichia sp.)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中表达时，其分泌量为至少约0.5mg/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约0.75mg/L、至少约1mg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约10mg/L、至少约15mg/L、至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、至少约45mg/L、或至少约50mg/L、或至少约100mg/L、或至少约200mg/L、或至少约300mg/L、或至少约400mg/L、或至少约500mg/L、或至少约600mg/L、或至少约700mg/L、或至少约800mg/L、至少约900mg/L、或至少约1g/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约1mg/L到至少约1g/L、至少约1mg/L到至少约750mg/L、至少约100mg/L到至少约1g/L、至少约200mg/L到至少约1g/L、至少约300mg/L到至少约1g/L、至少约400mg/L到至少约1g/L、至少约500mg/L到至少约1g/L、至少约600mg/L到至少约1g/L、至少约700mg/L到至少约1g/L、至少约800mg/L到至少约1g/L、或至少约900mg/L到至少约1g/L。尽管在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述的具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域可为可分泌的，但是它们也可以采用任何合适方法来制备，例如不需要用大肠杆菌或毕赤酵母的合成化学方法或生物学制备方法。
结合CD138的多肽域 本发明提供具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域(例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域以低亲和力结合CD138。优选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10nM之间的Kd结合CEA。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或约10μM至约400nM的亲和力结合CD138。在某些实施方案中，多肽域以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合CD138。
在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD138:DOM12-1(SEQ IDNO:70)、DOM12-15(SEQ ID NO:71)、DOM12-17(SEQ ID NO:68)、DOM12-19(SEQ ID NO:72)、DOM12-2(SEQ ID NO:73)、DOM12-20(SEQ ID NO:74)、DOM12-21(SEQ ID NO:75)、DOM12-22(SEQ IDNO:76)、DOM12-3(SEQ ID NO:77)、DOM12-33(SEQ ID NO:78)、DOM12-39(SEQ ID NO:79)、DOM12-4(SEQ ID NO:80)、DOM12-40(SEQ ID NO:81)、DOM12-41(SEQ ID NO:82)、DOM12-42(SEQ IDNO:83)、DOM12-44(SEQ ID NO:84)、DOM12-46(SEQ ID NO:85)、DOM12-6(SEQ ID NO:86)、DOM12-7(SEQ ID NO:87)、DOM12-10(SEQ ID NO:88)、DOM12-11(SEQ ID NO:89)、DOM12-18(SEQ IDNO:90)、DOM12-23(SEQ ID NO:91)、DOM12-24(SEQ ID NO:92)、DOM12-25(SEQ ID NO:93)、DOM12-26(SEQ ID NO:69)、DOM12-27(SEQ ID NO:94)、DOM12-28(SEQ ID NO:95)、DOM12-29(SEQ IDNO:96)、DOM12-30(SEQ ID NO:97)、DOM12-31(SEQ ID NO:98)、DOM12-32(SEQ ID NO:99)、DOM12-34(SEQ ID NO:100)、DOM12-35(SEQ ID NO:101)、DOM12-36(SEQ ID NO:102)、DOM12-37(SEQ IDNO:103)、DOM12-38(SEQ ID NO:104)、DOM12-43(SEQ ID NO:105)、DOM12-45(SEQ ID NO:67)、DOM12-5(SEQ ID NO:106)、DOM12-8(SEQ ID NO:107)和DOM12-9(SEQ ID NO:108)。
在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD138:DOM12-45-1(SEQ IDNO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ IDNO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ IDNO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ IDNO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ IDNO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ IDNO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ IDNO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ IDNO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ IDNO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ IDNO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ IDNO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ IDNO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ IDNO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ IDNO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ IDNO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ IDNO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ IDNO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ IDNO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ IDNO:384)。
在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM12-1(SEQ ID NO:289)、DOM12-15(SEQ ID NO:290)、DOM12-17(SEQ ID NO:11)、DOM12-19(SEQ ID NO:291)、DOM12-2(SEQ ID NO:292)、DOM12-20(SEQ IDNO:293)、DOM12-21(SEQ ID NO:294)、DOM12-22(SEQ ID NO:295)、DOM12-3(SEQ ID NO:296)、DOM12-33(SEQ ID NO:297)、DOM12-39(SEQ ID NO:298)、DOM12-4(SEQ ID NO:299)、DOM12-40(SEQ IDNO:300)、DOM12-41(SEQ ID NO:301)、DOM12-42(SEQ ID NO:302)、DOM12-44(SEQ ID NO:303)、DOM12-46(SEQ ID NO:304)、DOM12-6(SEQ ID NO:305)、DOM12-7(SEQ ID NO:306)、DOM12-10(SEQ IDNO:307)、DOM12-11(SEQ ID NO:308)、DOM12-18(SEQ ID NO:309)、DOM12-23(SEQ ID NO:310)、DOM12-24(SEQ ID NO:311)、DOM12-25(SEQ ID NO:312)、DOM12-26(SEQ ID NO:12)、DOM12-27(SEQ ID NO:313)、DOM12-28(SEQ ID NO:314)、DOM12-29(SEQ IDNO:315)、DOM12-30(SEQ ID NO:316)、DOM12-31(SEQ ID NO:317)、DOM12-32(SEQ ID NO:318)、DOM12-34(SEQ ID NO:319)、DOM12-35(SEQ ID NO:320)、DOM12-36(SEQ ID NO:321)、DOM12-37(SEQ ID NO:322)、DOM12-38(SEQ ID NO:323)、DOM12-43(SEQ ID NO:324)、DOM12-45(SEQ ID NO:310)、DOM12-5(SEQ ID NO:325)、DOM12-8(SEQ ID NO:326)和DOM12-9(SEQ IDNO:327)。
在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM12-45-1(SEQ IDNO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ IDNO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ IDNO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ IDNO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ IDNO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ IDNO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ IDNO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ IDNO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ IDNO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ IDNO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ IDNO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ IDNO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ IDNO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ IDNO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ IDNO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ IDNO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ IDNO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ IDNO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ IDNO:384)。
在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CD138。
在优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域选自DOM12-45(SEQ ID NO:346)、DOM12-17(SEQ IDNO:318)和DOM12-26(SEQ ID NO:327)。
在其它优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域选自DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQID NO:349)和DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)。
具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变区。在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域含有如本文所述的通用构架。
在某些实施方案中，如以上对具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的描述，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或含有构架区并被分泌。
结合CEA的多肽域 本发明提供具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域(例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域以低亲和力结合CEA。优选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10nM之间的Kd结合CEA。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或约10μM至约400nM的亲和力结合CEA。在某些实施方案中，多肽域以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合CEA。
在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CEA:DOM13-1(SEQ ID NO:385)、DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、DOM13-14(SEQ ID NO:395)、DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2(SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ IDNO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3(SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ IDNO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、DOM-13-34(SEQ ID NO:415)、DOM13-35(SEQ ID NO:416)、DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4(SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ IDNO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5(SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ IDNO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、DOM13-54(SEQ ID NO:431)、DOM13-55(SEQ ID NO:432)、DOM13-56(SEQ ID NO:433)、DOM13-57(SEQ ID NO:434)、DOM13-58(SEQ ID NO:435)、DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6(SEQ ID NO:390)、DOM13-60(SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ IDNO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、DOM13-64(SEQ ID NO:441)、DOM13-65(SEQ ID NO:442)、DOM13-66(SEQ ID NO:443)、DOM13-67(SEQ ID NO:444)、DOM13-68(SEQ ID NO:445)、DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7(SEQ ID NO:391)、DOM13-70(SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ IDNO:3448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ IDNO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、DOM13-75(SEQ ID NO:452)、DOM13-76(SEQ ID NO:453)、DOM13-77(SEQ ID NO:454)、DOM13-78(SEQ ID NO:455)、DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ IDNO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、DOM13-84(SEQ ID NO:461)、DOM13-85(SEQ ID NO:462)、DOM13-86(SEQ ID NO:463)、DOM13-87(SEQ ID NO:464)、DOM13-88(SEQ ID NO:465)、DOM13-89(SEQ ID NO:466)、DOM13-90(SEQ ID NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、DOM13-94(SEQ ID NO:471)和DOM13-95(SEQ ID NO:472)。
在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CEA:DOM13-25-3(SEQ IDNO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ IDNO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。
在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM13-1(SEQ ID NO:385)、DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、DOM13-14(SEQ ID NO:395)、DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2(SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ IDNO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3(SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ IDNO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、DOM-13-34(SEQ ID NO:415).DOM13-35(SEQ ID NO:416)、DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4(SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ IDNO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5(SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ IDNO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、DOM13-54(SEQ ID NO:431)、DOM13-55(SEQ ID NO:432)、DOM13-56(SEQ ID NO:433)、DOM13-57(SEQ ID NO:434)、DOM13-58(SEQ ID NO:435)、DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6(SEQ ID NO:390)、DOM13-60(SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ IDNO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、DOM13-64(SEQ ID NO:441)、DOM13-65(SEQ ID NO:442)、DOM13-66(SEQ ID NO:443)、DOM13-67(SEQ ID NO:444)、DOM13-68(SEQ ID NO:445)、DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7(SEQ ID NO:391)、DOM13-70(SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ IDNO:3448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ IDNO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、DOM13-75(SEQ ID NO:452)、DOM13-76(SEQ ID NO:453)、DOM13-77(SEQ ID NO:454)、DOM13-78(SEQ ID NO:455)、DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ IDNO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、DOM13-84(SEQ ID NO:461)、DOM13-85(SEQ ID NO:462)、DOM13-86(SEQ ID NO:463)、DOM13-87(SEQ ID NO:464)、DOM13-88(SEQ ID NO:465)、DOM13-89(SEQ ID NO:466)、DOM13-90(SEQ ID NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、DOM13-94(SEQ ID NO:471)和DOM13-95(SEQ ID NO:472)。
在其它实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM13-25-3(SEQ IDNO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ IDNO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。
在优选的实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域选自:DOM13-25(SEQ ID NO:80)、DOM13-57(SEQ IDNO:81)、DOM13-58(SEQ ID NO:82)、DOM13-59(SEQ ID NO:83)、DOM13-64(SEQ ID NO:84)、DOM13-65(SEQ ID NO:85)、DOM13-74(SEQ ID NO:86)、DOM13-93(SEQ ID NO:87)和DOM13-95(SEQ IDNO:88)。在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CEA。
具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变区。在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域含有如本文所述的通用构架。
在某些实施方案中，如以上对具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的描述，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或含有构架区并被分泌。
结合CD56的多肽域 本发明提供具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域(例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域以低亲和力结合CD56。优选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10nM之间的Kd结合CD56。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或约10μM至约400nM的亲和力结合CD56。在某些实施方案中，多肽域以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合CD56。
在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD56:DOM14-1(SEQ IDNO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ IDNO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ IDNO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ IDNO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ IDNO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ IDNO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ IDNO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ IDNO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
在优选的实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域选自:DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-48(SEQ IDNO:517)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-70(SEQ ID NO:539)。在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CD56。
具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变区。在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域含有如本文所述的通用构架。
在某些实施方案中，如以上对具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的描述，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或含有构架区并被分泌。
具有结合血清白蛋白的dAb单体的配体 本发明的配体还可以含有dAb单体，其以1nM-500μM(即1×10-9至5×10-4)、优选100nM至10μM的Kd结合血清白蛋白(SA)。优选地，对于含有抗SA dAb的配体来说，配体与其靶标的结合(例如通过表面等离子共振(例如使用BiaCore)测定的Kd和/或K解离)比SA强1-100000倍(优选100-100000倍、更优选1000-100000倍、或10000-100000倍)。优选地，血清白蛋白为人血清白蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)与SA(例如HSA)结合的Kd约为50nM、优选70nM、更优选100nM、150nM或200nM。
在某些实施方案中，如以上对结合CD38的dAb单体的描述，结合SA的dAb单体能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或包含构架区。
在具体的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白的dAb。在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并且与选自以下的dAb竞争结合白蛋白:DOM7m-16(SEQ IDNO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ IDNO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ ID NO:548)、DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ IDNO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ IDNO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ IDNO:565)、DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ IDNO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ IDNO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ IDNO:585)。
在某些实施方案中，所述dAb结合人血清白蛋白，其含有的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM7m-16(SEQ IDNO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ IDNO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ ID NO:548)、DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ IDNO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ IDNO:565)、DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ IDNO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ IDNO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ IDNO:585)。
例如，结合人血清白蛋白的dAb可含有与以下的序列具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列:DOM7h-2(SEQ IDNO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:554)、DOM7h-7(SEQ ID NO:555)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ IDNO:565)、DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)和DOM7h-27(SEQ ID NO:563)。
氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6):2264-2268(1990))。
在更具体的实施方案中，dAb为结合人血清白蛋白并具有选自以下的氨基酸序列的Vκ dAb:DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ IDNO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:554)、DOM7h-7(SEQ ID NO:555)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ ID NO:566)，或者为具有选自以下的氨基酸序列的VH dAb:DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)。在其它实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白并含有任一种前述氨基酸序列的CDR的dAb。
结合血清白蛋白的合适的骆驼科动物VHH包括公开于WO2004/041862(AblynxN.V.)的那些和本文的序列A(SEQ ID NO:586)、序列B(SEQ ID NO:587)、序列C(SEQ ID NO:588)、序列D(SEQ IDNO:589)、序列E(SEQ ID NO:590)、序列F(SEQ ID NO:591)、序列G(SEQ ID NO:592)、序列H(SEQ ID NO:593)、序列I(SEQ ID NO:594)、序列J(SEQ ID NO:595)、序列K(SEQ ID NO:596)、序列L(SEQ IDNO:597)、序列M(SEQ ID NO:598)、序列N(SEQ ID NO:599)、序列O(SEQ ID NO:600)、序列P(SEQ ID NO:601)、序列Q(SEQ IDNO:602)。在某些实施方案中，骆驼科动物VHH结合人血清白蛋白，并含有与SEQ ID NO:586-602中的任一种具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6):2264-2268(1990))。
在某些实施方案中，配体含有的抗血清白蛋白dAb与本文公开的任何抗血清白蛋白dAb竞争结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)。
核酸分子、载体和宿主细胞 本发明还提供编码如本文所述的配体(双特异性配体和多特异性配体)的分离和/或重组核酸分子。
在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列编码如本文所述的配体，所述配体包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性:DOM11-14(SEQ ID NO:242)、DOM11-22(SEQ ID NO:246)、DOM11-23(SEQ ID NO:247)、DOM11-25(SEQ ID NO:249)、DOM11-26(SEQ ID NO:250)、DOM11-27(SEQ ID NO:251)、DOM11-29(SEQ ID NO:253)、DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30(SEQ ID NO:254)、DOM11-31(SEQ IDNO:255)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-36(SEQ ID NO:260)、DOM11-4(SEQ ID NO:235)、DOM11-43(SEQ ID NO:266)、DOM11-44(SEQ ID NO:267)、DOM11-45(SEQ ID NO:268)、DOM11-5(SEQ IDNO:236)、DOM11-7(SEQ ID NO:238)、DOM11-1(SEQ ID NO:232)、DOM11-10(SEQ ID NO:241)、DOM11-16(SEQ ID NO:243)、DOM11-2(SEQ ID NO:233)、DOM11-20(SEQ ID NO:244)、DOM11-21(SEQ IDNO:245)、DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-28(SEQ ID NO:252)、DOM11-33(SEQ ID NO:257)、DOM11-34(SEQ ID NO:258)、DOM11-35(SEQ ID NO:259)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)、DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:293)、DOM11-41(SEQ ID NO:264)、DOM11-42(SEQ ID NO:265)、DOM11-6(SEQ ID NO:237)、DOM11-8(SEQ ID 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NO:313)、DOM12-9(SEQ IDNO:314)、DOM13-1(SEQ ID NO:385)、DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、DOM13-14(SEQ ID NO:395)、DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2(SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ ID NO:402)、DOM13-22(SEQ IDNO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、DOM13-24(SEQ IDNO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、DOM13-26(SEQ IDNO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3(SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ ID NO:412)、DOM13-32(SEQ IDNO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、DOM-13-34(SEQ ID NO:415)、DOM13-35(SEQ ID NO:416)、DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4(SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ ID NO:420)、DOM13-44(SEQ IDNO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5(SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ ID 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NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、DOM13-94(SEQ ID NO:471)、DOM13-95(SEQ ID NO:472)、DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ IDNO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ IDNO:492)、DOM14-22(SEQ ID NO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ ID NO:501)、DOM14-33(SEQ IDNO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ IDNO:510)、DOM14-42(SEQ ID NO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列编码如本文所述的配体，其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的核苷酸序列同一性:DOM11-14(SEQ IDNO:10)、DOM11-22(SEQ ID NO:11)、DOM11-23(SEQ ID NO:3)、DOM11-25(SEQ ID NO:12)、DOM11-26(SEQ ID NO:13)、DOM11-27(SEQ ID NO:14)、DOM11-29(SEQ ID NO:15)、DOM11-3(SEQ IDNO:1)、DOM11-30(SEQ ID NO:2)、DOM11-31(SEQ ID NO:16)、DOM11-32(SEQ ID NO:7)、DOM11-36(SEQ ID NO:17)、DOM11-4(SEQ ID NO:18)、DOM11-43(SEQ ID NO:19)、DOM11-44(SEQ IDNO:20)、DOM11-45(SEQ ID NO:21)、DOM11-5(SEQ ID NO:22)、DOM11-7(SEQ ID NO:4)、DOM11-1(SEQ ID NO:23)、DOM11-10(SEQ ID NO:24)、DOM11-16(SEQ ID NO:25)、DOM11-2(SEQ IDNO:26)、DOM11-20(SEQ ID NO:27)、DOM11-21(SEQ ID NO:28)、DOM11-24(SEQ ID NO:9)、DOM11-28(SEQ ID NO:29)、DOM11-33(SEQ ID NO:30)、DOM11-34(SEQ ID NO:31)、DOM11-35(SEQ IDNO:32)、DOM11-37(SEQ ID NO:8)、DOM11-38(SEQ ID NO:5)、DOM11-39(SEQ ID NO:6)、DOM11-41(SEQ ID NO:33)、DOM11-42(SEQ ID NO:34)、DOM11-6(SEQ ID NO:35)、DOM11-8(SEQ IDNO:36)、DOM11-9(SEQ ID NO:37)、DOM12-1(SEQ ID NO:41)、DOM12-15(SEQ ID NO:42)、DOM12-17(SEQ ID NO:39)、DOM12-19(SEQ ID NO:43)、DOM12-2(SEQ ID NO:44)、DOM12-20(SEQ IDNO:45)、DOM12-21(SEQ ID NO:46)、DOM12-22(SEQ ID NO:47)、DOM12-3(SEQ ID NO:48)、DOM12-33(SEQ ID NO:49)、DOM12-39(SEQ ID NO:50)、DOM12-4(SEQ ID NO:51)、DOM12-40(SEQ IDNO:52)、DOM12-41(SEQ ID NO:53)、DOM12-42(SEQ ID NO:54)、DOM12-44(SEQ ID NO:55)、DOM12-46(SEQ ID NO:56)、DOM12-6(SEQ ID NO:57)、DOM12-7(SEQ ID NO:58)、DOM12-10(SEQ IDNO:59)、DOM12-11(SEQ ID NO:60)、DOM12-18(SEQ ID NO:61)、DOM12-23(SEQ ID NO:62)、DOM12-24(SEQ ID NO:63)、DOM12-25(SEQ ID NO:64)、DOM12-26(SEQ ID NO:40)、DOM12-27(SEQ IDNO:65)、DOM12-28(SEQ ID NO:66)、DOM12-29(SEQ ID NO:67)、DOM12-30(SEQ ID NO:68)、DOM12-31(SEQ ID NO:69)、DOM12-32(SEQ ID NO:70)、DOM12-34(SEQ ID NO:71)、DOM12-35(SEQ IDNO:72)、DOM12-36(SEQ ID NO:73)、DOM12-37(SEQ ID NO:74)、DOM12-38(SEQ ID NO:75)、DOM12-43(SEQ ID NO:76)、DOM12-45(SEQ ID NO:38)、DOM12-5(SEQ ID NO:77)、DOM12-8(SEQ IDNO:78)、DOM12-9(SEQ ID NO:79)、DOM13-1(SEQ ID NO:89)、DOM13-12(SEQ ID NO:90)、DOM13-13(SEQ ID NO:91)、DOM13-14(SEQ ID NO:92)、DOM13-15(SEQ ID NO:93)、DOM13-16(SEQ IDNO:94)、DOM13-17(SEQ ID NO:95)、DOM13-18(SEQ ID NO:96)、DOM13-19(SEQ ID NO:97)、DOM13-2(SEQ ID NO:98)、DOM13-20(SEQ ID NO:99)、DOM13-21(SEQ ID NO:100)、DOM13-22(SEQ IDNO:101)、DOM13-23(SEQ ID NO:102)、DOM13-24(SEQ ID NO:103)、DOM13-25(SEQ ID NO:80)、DOM13-26(SEQ ID NO:104)、DOM13-27(SEQ ID NO:105)、DOM13-28(SEQ ID NO:106)、DOM13-29(SEQ IDNO:104)、DOM13-3(SEQ ID NO:108)、DOM13-30(SEQ ID NO:109)、DOM13-31(SEQ ID NO:110)、DOM13-32(SEQ ID NO:111)、DOM13-33(SEQ ID NO:112)、DOM-13-34(SEQ ID NO:113)、DOM13-35(SEQ ID NO:114)、DOM13-36(SEQ ID NO:115)、DOM13-37(SEQ ID NO:116)、DOM13-4(SEQ ID NO:117)、DOM13-42(SEQ ID NO:118)、DOM13-43(SEQ ID NO:119)、DOM13-44(SEQ IDNO:120)、DOM13-45(SEQ ID NO:121)、DOM13-46(SEQ ID NO:122)、DOM13-47(SEQ ID NO:123)、DOM13-48(SEQ ID NO:124)、DOM13-49(SEQ ID NO:125)、DOM13-5(SEQ ID NO:126)、DOM13-50(SEQ ID NO:127)、DOM13-51(SEQ ID NO:128)、DOM13-52(SEQ IDNO:129)、DOM13-53(SEQ ID NO:130)、DOM13-54(SEQ ID NO:131)、DOM13-55(SEQ ID 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本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，所述载体为含有一个或多个与本发明的重组核酸有效连接的表达控制元件或序列的表达载体。本发明还提供包含本发明的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)、表达控制元件、宿主细胞和生产本发明的重组宿主细胞的方法在本领域众所周知，本文进一步描述了实例。
合适的表达载体可包含许多元件，例如复制起点、选择标记基因、一个或多个表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子))和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控制元件和信号序列如果存在的话，则可由载体或其它来源提供。例如，编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于指导表达。
可提供用于在期望的宿主细胞中表达的启动子。启动子可以是组成型的或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的核酸有效连接，使得其指导核酸的转录。可获得多种适于原核宿主的启动子(例如大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和适于真核宿主的启动子(例如猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)。
另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记，就复制型表达载体而言，还包含复制起点。赋予抗生素或药物抗性的基因编码产物是常用的选择标记，可用于原核细胞(例如内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许用甲氨蝶呤在多种宿主中进行选择。编码宿主的营养缺陷型标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、HIS3)经常在酵母中用作选择标记。还考虑了病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体以及能够整合入宿主细胞基因组中的载体(例如逆转录病毒载体)的应用。适于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的表达载体在本领域众所周知。
合适的宿主细胞可以是原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞，例如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉(Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其它低等真核生物的细胞，以及高等真核生物的细胞，例如昆虫细胞(例如果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O’Connor))、哺乳动物细胞(例如COS细胞，例如COS-1(ATCC保藏号CRL-1650)和COS-7(ATCC保藏号CRL-1651)、CHO(例如ATCC保藏号CRL-9096，CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，77(7):4216-4220(1980)))、293(ATCC保藏号No.CRL-1573)、HeLa(ATCC保藏号CCL-2)、CV1(ATCC保藏号CCL-70)、WOP(Dailey，L.等，J.Virol，54:739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90:8392-8396(1993))、NS0细胞、SP2/0、HuT 78细胞等，或植物细胞(例如烟草细胞)。(参见例如Ausubel，F.M.等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and John Wiley & Sons Inc.(1993))。在某些实施方案中，宿主细胞为分离的宿主细胞，不是多细胞生物(例如植物或动物)的组成部分。在优选的实施方案中，宿主细胞为非人宿主细胞。
本发明还提供生产本发明配体(例如双特异性配体、多特异性配体)的方法，该方法包括将包含本发明重组核酸的重组宿主细胞在适于表达重组核酸的条件下进行培养，由此表达重组核酸并产生配体。在某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。
基于免疫球蛋白的配体的制备 本发明的配体(例如双特异性配体、多特异性配体)可按照抗体工程领域中用于制备scFv、“噬菌体”抗体和其它的工程抗体分子的先前建立的技术来制备。抗体的制备技术例如描述于以下综述及其中所引用的参考文献:Winter和Milstein，(1991)Nature 349:293-299；Pluckthun(1992)Immunological Reviews 130:151-188；Wright等(1992)Crti.Rev.Immunol.，12:125-168；Holliger，P.和Winter，G.(1993)Curr.Op.Biotechn.，4，446-449；Carter等(1995)J.Hematother.，4，463-470；Chester，K.A.和Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.，13，294-300；Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.，15，125-126；Fearon，D.(1997)Nature Biotechnol.，15，618-619；Plückthun，A.和Pack，P.(1997)Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.和Merchant，A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.，8，449-454；Holliger，P.和Winter，G.(1997)CancerImmunol.Immunother.，45，128-130。
适用于选择具有所需特异性的抗体可变区的技术采用本领域已知的文库和选择程序。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581；Vaughan等(1996)NatureBiotech.，14:309)是本领域技术人员众所周知的。合成文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13:692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13:3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248:97)通常采用PCR通过克隆免疫球蛋白V基因制备。PCR过程中的错误可导致高度随机化。可单独地(在此情况下直接选择单域结合)或一起选择针对靶抗原或表位的VH和/或VL文库。
文库载体系统 适用于本发明的各种选择系统是本领域已知的。这些系统的实例如下所述。
可以直接筛选噬菌体λ表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两者先前都有描述(Huse等(1989)Science，246:1275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87:8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88:2432)，可用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选多达106个不同文库成员，但是它们确实不适合筛选更大数量(大于106个成员)。文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使所连接的核酸能够表达为多肽。本文所用的选择展示系统是允许通过合适展示方法选择结合通用配体和/或靶配体的各个文库成员的系统。
从大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌体展示技术为代表。这些将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面的系统(Scott和Smith(1990)Science，249:386)，已经证明可用于产生抗体片段(及编码它们的核苷酸序列)的文库，用于体外选择和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段(McCafferty等，WO 92/01047)。编码可变区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，所述前导信号可指导它们到达大肠杆菌的壁膜间隙，结果所得抗体片段展示在噬菌体表面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合。或者，抗体片段向外展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的优势在于:因为它们是生物系统，所以可以仅通过将含有所选文库成员的噬菌体在细菌细胞中培养来扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和其后的遗传操作相对直接。
噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法在本领域众所周知(McCafferty等(1990)Nature，348:552；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88:4363；Clackson等(1991)Nature，352:624；Lowman等(1991)Biochemistry，30:10832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88:10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19:4133；Chang等(1991)J.Immunol.，147:3610；Breitling等(1991)Gene，104:147；Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同上；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22:867；Marks等，1992，J.Biol.Chem.，267:16007；Lerner等(1992)Science，258:1313，所述文献通过引用结合到本文中)。
一个特别具有优势的方法是使用scFv噬菌体文库(Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85:5879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87:1066-1070；McCafferty等(1990)，出处同上；Clackson等(1991)Nature，352:624；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581；Chiswell等(1992)Trends Biotech.，10:80；Marks等(1992)J.Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)以及WO97/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。
产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机制，用于体外合成文库成员。在一个方法中，通过交替多轮的针对靶的选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249:505；Ellington和Szostak(1990)Nature，346:818)。一项类似技术可用于鉴定结合预定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic Acids Res.，18:3203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257:635；WO92/05258和WO92/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步描述于WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统，例如那些公开于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的系统，采用多核糖体来展示多肽，用于选择。
还有一类技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与其基因产物联系起来。例如，其中可在由油包水乳剂形成的微囊中选择编码所需基因产物的核酸的选择系统描述于WO99/02671、WO00/40712以及Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微囊中区室化，然后在微囊内转录和/或翻译，以产生它们相应的基因产物(RNA或蛋白质)。随后分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该方法通过多种手段检测所需活性而选择目标基因产物。
文库构建 用于选择的文库可以采用例如以上提出的本领域已知技术构建，或者可以从商业来源购买。可用于本发明的文库描述于例如WO99/20749。一旦选定载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸序列克隆到文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子内产生多样性；或者，可以在诱变和另外的多轮选择进行之前如上所述表达并选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化多肽的核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR(Mullis和Faloona(1987)Methods Enzymol，155:335，所述文献通过引用结合到本文中)。PCR是本领域众所周知的，它采用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，来扩增目标靶序列。各种抗体文库的构建已论述于Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology，12，433-55及其中引用的参考文献。
用模板DNA(至少1fg；更有用的为1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR；当引物库(primer pool)非常不均一时，最好采用较大量引物，因为各序列仅由少量引物库分子作为代表，而且数量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括:2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)、0.4μl1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水，至总体积为25μl。覆盖矿物油，用可编程热循环仪进行PCR。PCR循环中各步骤的长度和温度以及循环次数，按照实际所需的严格性来调整。退火温度和时间由预计引物与模板退火的效率和可耐受的错配程度这二者而定；显然，当核酸分子同时扩增和诱变时，错配是必需的，至少在合成的第一轮。优化引物退火条件的严格性的能力完全属于本领域中等技术人员的知识范围。采用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子开始变性通常发生在92℃和99℃之间达4分钟，再是20-40次循环，循环由变性(94-99℃ 15秒至1分钟)、退火(如上所述确定的温度；1-2分钟)和延伸(72℃ 1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常72℃4分钟，可后接于4℃的不确定(0-24小时)步骤。
组合单可变区 本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种方法组合，包括共价和非共价方法。优选的方法包括采用如上所述的多肽接头，例如连接scFv分子(Bird等(1988)Science 242:423-426)。有关合适接头的讨论参见Bird等，Science 242，423-426；Hudson等，Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc.Nat.Acad Sci.USA，85，5879-5883。接头优选是柔性的，允许两个单域相互作用。一个接头的实例是(Gly4Ser)n接头，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。也可采用双链抗体中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)90:6444-6448)。在一个实施方案中，所用的接头不是免疫球蛋白铰链区。
可变区可采用不用接头的方法而组合。例如，可以开发二硫桥的用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供的)，以便稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter等(1994)ProteinEng.，7:697-704)，或者通过可变区之间界面的重构以改善“适合性(fit)”，因而改善相互作用的稳定性(Ridgeway等(1996)Protein Eng.7:617-621；Zhu等(1997)Protein Science 6:781-788)。如果适当的话，可以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、尤其是抗体VH区的其它技术。
配体特征 双特异性配体与细胞的结合或者每个结合域与每个特异性靶的结合可以用本领域技术人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。在本发明的一个优选的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定结合。可以按照任何合适方法进行噬菌体ELISA:示例性方案如下。
可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结合的噬菌体群体，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可通过ELISA筛选来自这些群体中单个受感染细菌菌落的噬菌体，以鉴定“单克隆”噬菌体抗体。还需要筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可通过ELISA、采用例如针对C-端或N-端标记的试剂来进行(参见例如Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的参考文献。
可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。
配体结构 在例如采用本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出每个可变区的情况下，这些可变区包含通用构架区，使得它们可以被本文定义的特异性通用双特异性配体所识别。通用构架、通用配体等的用途描述于WO 99/20749。
当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的，参见例如Stemmer，1994，Nature 370:389-391和美国专利第6,297,053号，所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法也是本领域技术人员众所周知的。
一般而言，可以按照标准实验室手册(例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA)的陈述，构建并操作用于选择、制备和形成双特异性配体所需的核酸分子和载体构建体。
本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。本文所用的载体是指这样的分离元件:所述元件用于将异源DNA引入用于其表达和/或复制的细胞中。选择或构建以及随后使用所述载体的方法是本领域普通技术人员众所周知的。大量载体是公众可得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。这类载体可用于简单的克隆和诱变；或者采用基因表达载体。可以选择本发明所用的载体，以适应所需大小的多肽编码序列，长度通常为0.25千碱基对(kb)至40kb或更大。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。各载体含有不同的功能性组件，通常包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还可具有一个或多个以下元件:增强子元件、启动子、转录终止序列和信号序列，每个都位于克隆位点附近，使得它们与编码本发明的双特异性配体的基因有效连接。
克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立于宿主染色体DNA而复制，并且包含复制起点或自主复制序列。这类序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非这些起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如COS细胞。
最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码在选择培养基中培养的转化宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质赋予抗生素抗性和其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性，补充营养缺陷，或提供生长培养基中所没有的关键营养物。
因为编码本发明的双特异性配体的载体的复制在大肠杆菌中最便利进行，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。这些选择标记可以得自大肠杆菌质粒，例如pBR322或pUC质粒，例如pUC18或pUC19。
表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与目标编码序列有效连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。术语“有效连接”是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既定方式起作用。控制序列与编码序列“有效连接”是指连接方式使得在与控制序列相容的条件下可实现编码序列的表达。
适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列有效连接的SD序列(Shine-Delgarno sequence)。
优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单个克隆的单独增殖和表达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进行选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链DNA)的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的(Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同上)。简而言之，该载体含有β-内酰胺酶基因(以便赋予噬菌粒选择性)和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端→C端):pelB前导序列(将表达多肽引导到壁膜间隙)、多克隆位点(用于克隆核苷酸形式的文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的不同抑制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS M13)，载体能够作为质粒进行复制，但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它们中的一些在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。
编码本发明的双特异性配体的载体的构建采用常规连接技术。分离的载体或DNA片段被切割、修饰并重新连接成产生所需载体需要的形式。如有需要，可以用已知方式进行分析，以证实所构建的载体中存在正确序列。适于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细胞以及进行评价表达和功能的分析的方法是本领域技术人员已知的。通过常规方法，例如DNA或RNA印迹分析、蛋白质印迹、DNA、RNA或蛋白质的斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白质分子的测序分析，检测样品中存在的基因序列，或定量其扩增和/或表达。如有需要，本领域技术人员会容易地知道如何改进这些方法。
骨架 骨架可以基于免疫球蛋白分子，或者可以是如上所述来源的非免疫球蛋白。双特异性配体的每个区都可以为不同骨架。如本文定义的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架:至少包含以下部分的免疫球蛋白分子:(i)抗体的CL(κ或λ亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。也可以包含铰链区域。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。
蛋白质支架 各结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结构域与一个或多个表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合域包含3个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架:基于免疫球蛋白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的支架、基于CTLA4的支架、基于伴侣分子例如GroEL的支架、基于脂质运载蛋白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领域技术人员可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。
用于构建配体的支架 主链构象的选择 免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽管抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体学结构已揭示，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196:901；Chothia等(1989)Nature，342:877)。因此，分析环长度和关键残基能够预测在大多数人抗体中存在的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227:799；Tomlinson等(1995)EMBO J.，14:4628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264:220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否或残基种类(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263:800；Shirai等(1996)FEBS Letters，399:1)。
可设计配体和/或结构域文库，其中已选择出某些环长度和关键残基，以保证各成员的主链构象是已知的。如上所述，最好这些是天然存在的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机会降至最低。种系V基因区段用作一个合适的基本构架，用于构建抗体或T细胞受体文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使得少量功能性成员可具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功能。
正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目，以预测基于双特异性配体序列的主链构象并选择不影响正则结构的用于多样化的残基。已经知道，在人Vκ区中，L1环可采用4种正则结构之一，L2环具有一种正则结构，而且90％的人Vκ区的L3环采用4或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在Vκ区，不同正则结构就可组合产生一系列不同的主链构象。假定Vλ区为L1、L2和L3环编码不同系列的正则结构，且Vκ区和Vλ区可与任何VH区(其可为H1和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所观察到的正则结构组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的产生对产生广泛范围的结合特异性来说可能是必不可少的。然而，通过构建基于一种已知主链构象的抗体文库，已经发现，与预期相反，主链构象的多样性并非是产生足以靶向几乎所有抗原的多样性所必需的。甚至更令人吃惊的是，该单一主链构象不一定是共有结构，共有结构是可以用作整个文库基础的一种天然构象。因此，在优选方面，本发明的配体具有一种已知主链构象。
所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用某种构象时，该构象是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构域的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环的主链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，则可选择最接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选种系基因区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区段在自然界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最频繁表达的。
在设计配体(例如ds-dAb)或其文库时，可以单独考虑6个抗原结合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和L3，选择被20％至100％的天然分子抗原结合环所采用的给定构象。通常观察到发生率在35％以上(即介于35％和100％之间)、理想地在50％以上乃至65％以上。因为绝大多数H3环没有正则结构，所以优先选择在确实展示正则结构的环中常见的主链构象。因此，对于每个环来说，选择天然库中最常观察到的构象。在人抗体中，各环最常见的正则结构(CS)如下:H1-CS 1(表达库的79％)、H2-CS 3(46％)、L1-Vκ的CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、L3-Vκ的CS 1(36％)(计算假定κ:λ的比例为70:30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48:133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991)Sequences of proteins of immunological interest，美国健康和人类服务部)看来是最常见的。EMBL数据文库中至少有16个人类抗体序列具有构成该构象所需的H3长度和关键残基，并且在蛋白质数据库中至少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和ltet)。最常表达的种系基因区段的正则结构组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、Vκ区段O2/O12(DPK9)和Jκ区段Jκ1。VH区段DP45和DP38也是合适的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。
或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率来选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选所选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中最常观察到的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、L1、L2和L3五个抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后结合最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。
正则序列的多样化 如果具有所选几种已知的主链构象或者优选单一已知主链构象，可以通过改变分子的每个结合位点，构建本发明的双特异性配体(例如ds-dAb)或本发明所用的文库，以便产生具有结构和/或功能多样性的库。这表明，产生变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的多样性，使得它们能够提供一系列活性。
所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产生的。可以随机或优选选择要改变的位置。然后，可以如下达到变异:通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物(天然或合成的)所取代)，产生数量非常大的变异体；或者通过用一个或多个氨基酸的限定亚类来取代残余氨基酸，产生数目更有限的变异体。
已经报道了多种用于引入这样的多样性的方法。易错PCR(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226:889)、化学诱变(Deng等(1994)J.Biol.Chem.，269:9533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260:359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变的方法也是本领域众所周知的，包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变，已经产生了一些合成抗体文库。使结合人破伤风类毒素的Fab的H3区随机化，以便产生一系列新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种系V基因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13:692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13:3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248:97)。这样的多样化已延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996)Nature Med.，2:100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13:475；Morphosys，WO97/08320，出处同上)。
因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通过使用现有的转化技术乃至使用无细胞系统来产生代表所有可能组合的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生6×1010个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等(1994)，出处同上)。
优选地，只有直接参与产生或修饰双特异性配体分子的每个结构域所需功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，每个结构域的功能是要结合靶标的，因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避免改变对分子总体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。
正则序列在用于抗体域时的多样化 就基于抗体的配体(例如ds-dAb)而言，每个靶的结合位点都是最常见的抗原结合位点。因此，优选只有在抗原结合位点的那些残基才改变。在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率抗体/抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的抗体中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法应当已经使相应互补决定区(CDR1)(如Kabat等(1991，出处同上)定义)中的所有残基多样化，与本发明所用的文库中多样化的两个相比有约七个残基。这显示了产生一系列抗原结合特异性所需的功能多样性的显著改善。
在自然界，抗体多样性是两个过程的结果:种系V、D和J基因区段的体细胞重组，产生幼稚(naive)初级库(所谓的种系和连接多样性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。人类抗体序列的分析已表明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心，而体细胞高变则将多样性扩散到抗原结合位点周围的区域，而这些区域在初级库中是高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256:813)。此互补性可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽管显然是抗体所特有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变的残基是构成靶的结合位点的残基的亚类。如有需要，在选择期间的不同时期，改变靶结合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。
就抗体库而言，可产生起始“幼稚”库(initial“naive”repertoire)，其中抗原结合位点的某些而不是全部的残基出现多样化。在这种情况下，本文所用的术语“幼稚(naive)”是指没有预定靶标的抗体分子。这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体(胎儿和新生儿个体就是这种情况)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统尚未受到各种抗原性刺激的攻击。然后，针对一系列抗原或表位来选择该库。如有需要，还可在起始库中被多样化的区域之外引入其它多样性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。
用于构建其中抗原结合位点中的某些或所有残基都已改变的双特异性配体的结合域幼稚库是本领域已知的。(参见WO 2004/058821、WO 2004/003019和WO03/002609)。“初级”文库模拟天然初级库，其多样性限于抗原结合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具有多样性(种系多样性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样性)。这些多样化的残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性局限于重组过程中多样化的残基(连接多样性)或者是高度体细胞突变的。这些多样化的残基包括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知适于这些文库多样性的以上列出的所有残基都接触一个或多个抗体-抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位点中并非所有残基都改变，在选择当中，通过改变剩余残基而掺入另外的多样性，如果需要这样做的话。对本领域技术人员显而易见的是，任何这些残基(或者包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以用于抗原结合位点的起始和/或后来的多样化。
在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸水平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能的氨基酸(所有20种或其亚类)可以在该位置掺入。采用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。优选使用NNK密码子，以便引入所需多样性。也可以使用达到相同末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生额外的终止密码子TGA和TAA。
人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸残基有偏倚。如果统计每个VH、Vκ和Vλ区中的10个最多变的位置的氨基酸组成，则超过76％的侧链多样性来自仅7个不同残基，它们是丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种针对可提供主链柔性的亲水性残基和小残基的偏倚可能反映了倾向于结合广泛范围的抗原或表位的表面进化，并且可能有助于解释初级库中所需的抗体混杂。
因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨基酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许针对一系列靶抗原选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的偏倚，易于用于任何多肽库。有多种方法用于在有待改变的位置上使氨基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见WO97/08320)，其中优选的方法因易于合成而采用常规简并密码子。通过比较由简并密码子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的单、双、三和四重简并性)与天然氨基酸的使用，可以计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，即使用IUPAC命名法分别为DVT、DVC和DVY，就是最接近所需氨基酸分布型的密码子:它们编码22％的丝氨酸以及11％的酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选的文库是在各多样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。
治疗和诊断组合物及其用途 本发明提供包含本发明的配体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物，以及使用本发明配体或组合物的治疗和诊断方法。本发明方法的配体可用于体内治疗和预防用途、体内诊断用途等。
本发明配体的治疗和预防用途包括将本发明配体给予受体哺乳动物，例如人。这样的配体以高亲合力结合靶。在某些实施方案中，配体可使两个靶交联，例如在募集的细胞毒T细胞中，从而介导肿瘤细胞系的杀伤。
优选将至少90-95％同质性(homogeneity)的大致纯的配体(例如ds-dAb)给予哺乳动物，最优选98-99％以上同质性供药用，尤其是当哺乳动物是人时。一旦部分纯化或纯化至所需同质性，配体就可用于诊断或治疗(包括离体)或用于开发和实施测定方法、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I和II卷，Academic Press，NY)。
例如，本发明的配体通常可用于预防、抑制或治疗疾病状态。例如，可以给予配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病、变应性超敏反应、癌症、细菌性或病毒性感染、自身免疫性疾病(包括但不限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节病(spondylarthropathy)(例如强直性脊柱炎)、系统性红斑狼疮、炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎)、重症肌无力和贝赫切特综合征(Behcet’s syndrome))、银屑病、子宫内膜异位症和腹部粘连(例如腹部手术后)。
配体尤其可用于治疗这样的感染性疾病:其中被感染因子感染的细胞包含的细胞表面靶水平要比未感染细胞的高，或者包含的一个或多个细胞表面靶标在未感染细胞上并不存在，例如由感染因子(例如细菌、病毒)编码的蛋白质。
能够结合胞外靶的本发明配体可被胞吞，并可在胞内递送治疗剂(例如毒素)(例如递送结合胞内靶的dAb)。另外，配体提供了每个能够特异性结合胞内靶的结合域(例如dAb单体)可递送到胞内环境的手段。该策略需要例如具有能使其保留在细胞内的功能的物理性质的结合域。或者，如果最终目的地胞内区室正在氧化，则良好折叠的配体可能不一定是无二硫化物的。
在本申请中，术语“预防”包括在诱发疾病之前给予保护性组合物。“抑制”是指在诱发事件后但在疾病有临床表现前给予组合物。“治疗”包括在疾病症状出现后给予保护性组合物。治疗包括改善与疾病相关的症状，还预防或延迟疾病的发作，以及减轻疾病症状的严重性或减少频率。
术语“癌症”是指或描述了哺乳动物中通常以不受调节的细胞增殖或存活为特征的病理状态。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病以及淋巴系统恶性肿瘤。更具体地说，癌症的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、头颈部癌等。
可用于评价本发明配体预防、治疗或抑制疾病(例如癌症)的功效的动物模型系统是可获得的。合适的癌症模型包括例如人类癌症在动物模型中的异种移植和原位移植模型，例如SCID-hu骨髓瘤模型(Epstein J..和Yaccoby，S.，Methods Mol.Med.113:183-90(2005)，Tassone P等，Clin Cancer Res.11(11):4251-8(2005))、人肺癌的小鼠模型(例如Meuwissen R和Berns A，Genes Dev.19(6):643-64(2005))，以及转移癌的小鼠模型(例如Kubota T.，J Cell Biochem.56(1):4-8(1994))。
通常，纯化形式的本发明配体可与药理上合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化林格液。如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的话，则可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，这些增稠剂例如为羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington’s PharmaceuticalSciences，第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延长释放的制剂。
可以单独给予的组合物形式或者与其它药物一起使用本发明的配体。配体可与一种或多种其它治疗药或活性剂一起给予和/或配制。当配体与其它治疗药一起给予时，配体可以在给予其它药物之前、同时或之后给予。通常，配体和其它药物的给予方式能提供重叠疗效。可给予本发明配体或与本发明配体一起配制的其它药物包括例如各种免疫治疗药物，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、抗生素、抗真菌药、抗病毒药和免疫毒素。例如，当给予拮抗剂以预防、抑制或治疗肺部炎症或呼吸疾病时，其可协同给予磷酸二酯酶抑制剂(例如磷酸二酯酶4抑制剂)、支气管扩张药(例如β2-激动剂、抗胆碱能药、茶碱)、短效β-激动剂(例如舒喘灵(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、班布特罗、非诺特罗、异他林(isoetherine)、异丙肾上腺素、左沙丁胺醇、奥西那林、吡布特罗、特布他林和甲磺酸比托特罗吸入剂(tornlate))、长效β-激动剂(例如福莫特罗和沙美特罗)、短效抗胆碱能药(例如异丙托溴铵和氧托溴铵)、长效抗胆碱能药(例如噻托品)、茶碱(例如短效剂型、长效剂型)、吸入类固醇(例如倍可松(beclomethasone)、倍氯米松(beclometasone)、布地奈德、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和曲安西龙)、口服类固醇(例如甲泼尼龙、泼尼松龙(prednisolone)、强的松龙(prednisolon)和泼尼松)、短效β-激动剂和抗胆碱能药的组合(例如舒喘灵/沙丁胺醇/异丙阿托品(ipratopium)和非诺特罗/异丙阿托品)、长效β-激动剂和吸入类固醇的组合(例如沙美特罗/氟替卡松和福莫特罗/布地奈德)以及粘液溶解药(例如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新(bromheksin)、羧甲司坦、愈创甘油醚(guiafenesin)和碘化甘油)一起给予。
本发明的配体可与各种各样合适的共治疗剂一起给予(例如治疗癌症)，所述共治疗剂包括细胞因子、止痛药/退热药、止吐药和化疗药。
合适的共治疗剂包括细胞因子，包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、生长因子(包括但不限于例如生长激素、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板衍生生长因子(PGDF)、表皮生长因子(EGF))，和用于刺激红细胞生成的药物，例如重组人促红细胞生成素(Epoetinα)、EPO、激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺、他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON))和类固醇药(例如地塞米松、类视色素、倍他米松、氢化可的松、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)。
镇痛药/退热药可包括但不限于阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生钠、盐酸丁丙诺啡、盐酸丙氧芬、萘磺酸丙氧芬、盐酸度冷丁、氢吗啡酮、硫酸吗啡、盐酸羟考酮、磷酸可待因、双氢可待因酒石酸氢盐、盐酸喷他佐辛、氢可酮酒石酸氢盐、酒石酸左啡诺、双氟尼柳、水杨酸三乙醇胺、盐酸纳布啡、甲芬那酸、酒石酸布托啡诺、水杨酸胆碱、布他比妥、柠檬酸苯托沙敏、柠檬酸苯海拉明、左美丙嗪、盐酸桂美君、甲丙氨酯等。
还可以共给予止吐药，以预防或治疗恶心和呕吐，例如合适的止吐药包括盐酸美克洛嗪、大麻隆、丙氯拉嗪、茶苯海明、盐酸异丙嗪、硫乙拉嗪、东莨菪碱等。
化疗药在本文中作为术语使用时包括但不限于例如抗微管药物，例如泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)；烷化剂，例如环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀和苯丁酸氮芥；细胞毒性类抗生素，例如放线菌素D、多柔比星、丝裂霉素C和博来霉素；抗代谢药，例如阿糖胞苷、吉西他滨、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶；抗有丝分裂药，例如长春花属生物碱，例如依托泊苷、长春碱和长春新碱；以及其它化疗药，例如顺铂、达卡巴嗪、丙卡巴肼和羟基脲，以及它们的组合。
本发明的配体可连同其它治疗剂一起用于治疗癌症。例如，本发明的配体可连同化疗药一起给予。在这样的治疗方案中，最好可以减少为达到有效而必需给予的化疗药的量。因此，本发明提供治疗癌症的方法，包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明配体和化疗药，其中化疗药以低剂量给予。一般来说，与本发明配体合用的化疗药的量是正常给予患者的化疗药单用剂量的约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％以下。因此，在化疗药引起有害的或不需要的副作用(在较低剂量时可被降低或消除)时联合疗法尤其有用。
药物组合物可包括多种细胞毒性剂或其它药物连同本发明配体乃至具有不同特异性的本发明配体组合(例如使用不同靶抗原或表位选择的配体)的“合剂”，无论它们是否在给予前混合。
本发明药物组合物的给药途径可以为任何合适途径，例如本领域普通技术人员公知的任何途径。对于治疗(包括但不限于免疫治疗)来说，可以采用标准技术，将本发明配体给予任何患者。可通过任何合适方式给予，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、鞘内、关节内、通过肺部途径，或者还合适地直接输注(例如用导管)。给药剂量和频次将取决于患者年龄、性别和状况、同时给予的其它药物、禁忌和临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药(例如通过肺部给药(例如鼻内给药)局部给予至肺部，或者局部直接注射入肿瘤中)或系统给药。
可将本发明配体冻干后贮存备用，使用前重配在合适载体中。已表明该技术对常规免疫球蛋白来说是有效的，可以采用本领域已知的冻干和重配技术。本领域技术人员可以理解，冻干和重配可导致不同程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体要比IgG抗体活性损失更高)，可能必须要调高使用水平以便补偿。
可以给予含有配体的组合物，用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，足以达到至少部分抑制、遏制、调节、杀伤或某些其它可检测参数的所选细胞群体的用量，定义为“治疗有效量”。尽管达到该剂量所需的用量将取决于疾病严重程度和患者的一般健康状况，但是通常范围为0.005-5.0mg配体/kg体重，更常用的剂量为0.05-2.0mg/kg/剂。对于预防应用而言，也可以类似或稍低剂量给予含有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作(例如维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔，以便治疗、抑制或预防疾病。当给予配体治疗、抑制或预防疾病时，可以例如约10μg/kg至约80mg/kg、约100μg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约70mg/kg、约1mg/kg至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的剂量最多给予每天4次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次。在具体的实施方案中，以约10μg/kg至约10mg/kg(例如约10μg/kg、约100μg/kg、约1 mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)的剂量每两周一次或每月一次给予双特异性配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病。
在具体的实施方案中，本发明的配体以提供体内选择性结合双阳性细胞的剂量给药。如本文所述的选择性结合双阳性细胞可在配体于约1pM至约150nM的浓度使用时实现。可给予足以实现约1pM至约150nM的配体血清浓度的剂量。熟练医师可确定获得此血清浓度的合适给药，例如通过滴定配体和监测配体血清浓度。包括给予治疗剂以实现所需的药物血清浓度的治疗方案是本领域常见的，尤其是在肿瘤学领域。
用本文所述的组合物进行的治疗被视为“有效”的条件是:一种或多种症状相对于治疗前存在的所述症状或者相对于未用所述组合物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)中的所述症状被减轻(例如达至少10％或在临床评价量表中达至少一个点)。尽管症状随所针对的疾病或障碍而明显不同，但是可以由一般熟练的临床医生或技术人员进行测定。这些症状例如可如下测定:监测疾病或障碍的一种或多种生化指标水平(例如与疾病相关的酶或代谢物水平，受累细胞数量等)、监测身体表现(例如炎症、肿瘤大小等)或者可接受的临床评价量表，例如扩展残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale)(用于多发性硬化)、Irvine炎性肠病问卷调查表(32点评价表，评价有关肠功能、全身症状、社交功能和情感状态的生活质量—评分范围为32-224，评分越高表明生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量量表或本领域已知的其它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例如一天以上，优选超过一天)下降达至少10％或者在给定临床量表上下降达一个点或多个点，就表明是“有效”治疗。同样，如果一种或多种症状的发作或严重程度相对于未经本文所述的组合物治疗的类似个体(人或动物模型)的所述症状被延迟、减少或消除，则用所述组合物进行预防就是“有效”的。
含有本发明配体的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、失活、杀伤或去除哺乳动物体内的所选靶细胞群体。另外，本文所述的配体和所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、耗尽靶细胞群体或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术，将来自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回输到哺乳动物体内。
实施例 在本文所述的实施例中，CD38也被称为DOM11，CD138也被称为DOM12，CEA也被称为DOM13，CD56也被称为DOM14。
与CD38、CD138、CEA或CD56结合的dAb的选择和筛选 使用在哺乳动物细胞中作为Fc融合蛋白表达的抗原选择dAb。使用针对交替捕获在G蛋白(Dynal)和抗人Fc(Novagen)磁珠上的CD38、CD138、CEA和CD56的dAb文库进行3轮选择。以ELISA检验在第2轮和第3轮作为噬菌体和可溶性dAb对关联抗原而不是非关联抗原具有特异性的选择输出。对于可溶性ELISA，所有Vk dAb都与蛋白L交联。对于每种抗原，测序可溶性ELISA阳性克隆，表明选择具有不同输出。
测定dAb阳性克隆的结合测定 ELISA阳性克隆在50ml培养物中表达，并且在适当的时候，在蛋白A(VH克隆)或蛋白L(Vk克隆)上进行纯化。简而言之，将编码dAb的噬菌体表达质粒(pDOM5)转化到HB2151大肠杆菌中，并将细胞铺板在含50μg/ml羧苄青霉素和5％葡萄糖的TYE板上，于37℃孵育过夜。使用依照以下方法的自动诱导使dAb在培养上清液中表达:向250ml挡板瓶中加入以下组分:50ml TB、100μg/ml羧苄青霉素、1滴消泡剂A204(Sigma)、来自Novagen过夜表达自动诱导试剂盒的1ml溶液1、2.5ml溶液2和0.05ml溶液3，以及来自转化的大肠杆菌细胞的单个菌落。培养瓶用Milliwrap PTFE膜封口，以250rpm、30℃使培养物生长和表达蛋白质达48小时。蛋白质使用蛋白A或L由培养物上清液直接纯化。
所有dAb都使用以下方法通过针对抗原阳性和阴性细胞系的FACS分析。
通过FACS确定细胞结合如下进行:细胞以250g离心5分钟，取出生长培养基。于4℃以2×106个细胞/ml的密度将细胞重悬浮在FACS温育缓冲液中。通过于4℃在FACS温育缓冲液中温育15分钟封闭细胞。加入50μl 2x一抗母液(抗CD38 FITC、抗CD138 FITC或缀合mIgG1 FITC的同种型对照(全部都得自BD Biosciences))；或者将dAb加入到含该细胞的FACS温育缓冲液中，于4℃温育30-60分钟。然后，细胞用FACS温育缓冲液洗涤1次。将100μl二抗(兔抗Vk)加入到含该细胞的FACS温育缓冲液中，于4℃温育30-60分钟。细胞用FACS温育缓冲液洗涤1次。然后将100μl 1×三抗加入到含该细胞的FACS温育缓冲液中，于4℃温育30-60分钟(对于dAb，三抗为抗兔FITC(Sigma))。细胞用FACS温育缓冲液洗涤2次。将细胞沉淀重悬浮在200μl FACS温育缓冲液+活细胞标记(BD Viaprobe)中。然后通过流式细胞术分析细胞。
描述于表3的细胞系用于FACS分析。细胞系的表型通过FACS确定。具有适于评价配体的结合特异性的表型的合适细胞可得自细胞保藏机构，例如美国典型培养物保藏中心(例如保藏号CCL-155、CRL9068、CCL-86、CRL1929、TIB 196、CRL 1730、CRL2408、HTB 173、HTB 119、CRL 5834)和德国菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(例如保藏号ACC50、ACC31)。
表3:在FACS分析中使用的细胞系表型 结果 在本研究中，dAb DOM11-3、DOM11-30、DOM12-45、DOM13-25和DOM14-23通过FACS分析被鉴定为分别对CD36、CD38、CD138、CEA和CD56具有良好结合特征。参见

图1A-1H。
表4:通过FACS分析的抗CD38和抗CD138dAb的特性 √＝dAb结合 ×＝dAb不结合 BIACORE分析 被鉴定为FACS阳性克隆的抗CD38、抗CEA和抗CD56 dAb另外使用以下程序通过Biacore分析。CM5芯片表面通过1:1 EDC/NHS(0.4M 1-乙基-3-(3-二薄荷基氨基丙基)-碳二亚胺的水溶液；0.1M N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液)以流速5μL/分钟冲洗10分钟接触时间而活化。CD38以500nM的乙酸盐缓冲液pH4以5μL/分钟固定，重复此步骤，直至RU达到500-1000(低密度)。CEA和CD56在乙酸盐缓冲液pH4.5中偶联。任何过量的反应基团都通过使1M盐酸乙醇胺流经CM5芯片(再以5μL/分钟达7分钟)而钝化。如上所述，以biacore检测抗CD38、抗CEA和抗CD56 dAb的亲和力。对于每个靶，都发现dAb以100-200nM范围的亲和力结合。图2显示了检测Biacore亲和力的两个抗CD38 dAb(DOM11-30和DOM11-3)的结果。DOM11-30的亲和力(KD)为150nM，DOM11-2的亲和力为250nM。
表位作图抗CD38 dAb 进行表位作图，以确定抗CD38 dAb是否结合CD38上的不同表位。测定如上所述使用以中等密度包被的芯片(约2000RU)在BIAcore上进行。CD38以如上所述的中等密度包被在CM5芯片上。使用共注射功能，以500nM的浓度注射第一抗CD38 dAb。第一和第二抗CD38dAb均以相同浓度(500nM)共注射。由于两种dAb结合不同表位，所以在第二次注射过程中的RU增加，超过第一dAb的结合水平。
结果表明，抗CD38 dAb DOM113、DOM11-30和DOM11-23结合CD38上的不同表位。参见图3A-3D。
表5 抗CEA dAb的特性 ++强结合 +结合 -不结合 NT未测 表6:抗CD 56 dAb的特性 ++强结合 +结合 -不结合 含有抗CD38 dAb和抗CD138 dAb的配体 已鉴定出结合CD38或CD 138的低亲和力dAb。这些dAb已通过线性融合(in line fusion)连接，产生通过FACS特异性结合抗原表达细胞的双特异性dAb(配体)。所有的dAb都在大肠杆菌中表达，在需要时依次使用蛋白L琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。
业已表明，所有dAb都作为单体结合抗原表达细胞系，但不结合抗原阴性细胞系。抗CD38 dAb和抗CD138 dAb已作为线性融合体配对，并如上所述通过FACS对双阳性和阴性细胞系进行结合检验。最佳双特异性dAb配对是DOM11-3/DOM12-45和DOM11-30/DOM12-45。在最佳浓度(25-50nM)，这些配对强结合双阳性细胞系(CD38+/CD138+)，但不结合单阳性或阴性细胞系。参见图4A-4D。
内化 方法 细胞用RPMI 1640+10％ FCS(内化缓冲液)洗涤1次。细胞沉淀重悬浮在所需体积的内化缓冲液中，并在合适的管数之间分配(50μl/管)。细胞在内化缓冲液中温育15分钟以封闭。然后将50μl预混合的一抗和二抗的2×母液(dAb+兔抗Vk)加入到含该细胞的内化缓冲液中，并于4℃温育60分钟。细胞用内化缓冲液洗涤1次。将100μl的1×三抗(抗兔FITC)加入含该细胞的内化缓冲液中，于4℃温育30-60分钟。
细胞用内化缓冲液洗涤1次。相关样品于37℃温育1.5小时，以允许内化。2组双份样品于4℃保持多肽。
为区分表面结合和内化的dAb，用酸洗涤仅于4℃温育的细胞样品和于37℃温育的细胞，仅去除细胞表面dAb。然后，细胞用酸性洗涤缓冲液洗涤2次，然后用PBS洗涤2次。细胞重悬浮在200μl PBS+10μl BD Viaprobe中，并通过流式细胞术进行分析。通过FACS评价标记细胞和仅于4℃酸洗(细胞表面结合)相比于37℃用酸洗处理(内化)的比例。或者，对于共焦显微镜，细胞固定在4％低聚甲醛溶液中，并在盖玻片上封片。
结果 通过FACS和共焦显微镜表明，抗CD38/抗CD138双特异性配体(DOM11-3/DOM12-45和DOM11-30/DOM12-45)于CD38+细胞系Raji上内化。图5A-5C显示了CD38阳性细胞系用DOM11-3/DOM12-45(500nM，用FITC染色在Zeiss LSM510 META共焦显微镜上显现)标记。内化作为37℃的抗酸荧光显示。
也已表明，抗CD38/抗CD138双特异性配体DOM11-3/DOM12-45和DOM11-30/DOM12-45在双重表达的多发性骨髓瘤细胞系OPM2(DSMZ ACC50)上内化。参见图6A和6B。
表7.内化双特异性dAb比例的确定 胞内定位 在本研究中，对内化双特异性dAb的胞内定位进行了研究。
方法 简而言之，对内化双特异性dAb(ds-dAb)的胞内定位进行了研究。如上所述Raji(CD38+)细胞内化的dAb已按照生产商的说明(serotec)用魔力红(magic red)复染色。魔力红是一种用于定位于溶酶体区室的组织蛋白酶B的标记。DOM11-30/DOM12-45和DOM11-3/DOM12-45均已显示与该标记共定位。
结果 图7表明，通过共焦显微镜检，CD38/CD138与Raji细胞上的溶酶体标记组织蛋白酶B共定位。DOM11-30/DOM12-45和DOM11-3/DOM12-45均已显示与该标记共定位。
这些结果表明，配体可被内化至溶酶体区室，在该区室中，配体可被加工，例如通过蛋白酶剪切(组织蛋白酶B剪切)，以例如释放毒素。
双特异性配体-聚乙二醇(PEG)缀合物 方法 使用5K、20K、30K或40K PEG经c端半胱氨酸残基使抗CD38/抗CD138双特异性配体DOM11-3/DOM12-45和DOM11-30/DOM12-45进行PEG化。位于dAb的C端的工程半胱氨酸残基允许MAL-PEG的位点特异性连接。
向dAb蛋白溶液加入甘油至终浓度为20％(体积/体积)，加入二硫苏糖醇至5mM。溶液于室温温育20分钟，以使表面硫醇减少。通过使用离心式浓缩器(Vivascience)(4,500rpm)使样品体积减小至2.5ml。使用PD-10柱(Amersham)对蛋白溶液进行缓冲交换，以去除还原剂。PD-10柱用25ml偶联缓冲液(20mM BIS-Tris pH6.5、5mM EDTA和10％甘油[体积/体积])平衡，之后加入2.5ml还原的蛋白样品。使蛋白溶液完全进入树脂床，然后通过加入另3.5ml偶联缓冲液洗脱dAb。然后蛋白立即发生偶联。蛋白浓度(mg/ml)通过检测280nm的吸光度确定。将蛋白量从mg/ml换算成摩尔浓度。加入3摩尔过量的MAL-PEG。使反应在室温下过夜。样品使用PD-10脱盐柱进行缓冲交换，以去除未偶联的MAL-PEG。如上所述对PEG化样品的dAb结合和内化进行FACS分析。
结果 结果表明，在PEG化时，双特异性配体以类似于非PEG化双特异性配体的程度结合其靶。观察到结合有些下降，尤其是抗CD38/抗CD138双特异性配体DOM11-30/DOM12-45的较大PEG。另外，PEG化形式的抗CD38(DOM11)被OPM2多发性骨髓瘤细胞内化，其程度类似于非PEG化配体(参见图8A-8E)。
抗CD38/抗CD138双特异性配体-毒素缀合物 抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)双特异性配体的制备 抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)双特异性配体在大肠杆菌中表达，并依次使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。还表达并纯化Vk对照/Vk对照同二聚体，用作阴性对照。
毒素-硒与抗CD38/抗CD138(DOM11-3/12-45)的缀合 使用3碳酸或3碳胺接头将硒缀合至抗CD38/抗CD138双特异性配体。(参见美国专利第5,783,454号，其公开内容通过引用结合到本文中)。每个抗CD38/抗CD138双特异性配体平均偶联2个硒分子。
缀合Se的双特异性配体的内化 如上所述，通过FACS检验OPM2细胞对缀合Se的dAb的内化。缀合Se的抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)双特异性配体以和未缀合的dAb相同的程度内化，而未缀合或缀合硒的Vk对照dAb未被内化。参见图9A-9D。
抗CD38/抗CD138细胞杀伤测定 为确定双特异性配体-Se缀合物对凋亡和细胞死亡的作用，用膜联蛋白V alexa-fluor 488和碘化丙锭(PI)进行双重染色(Vybrant凋亡测定试剂盒#2，Molecular Probes)。将1×105个OPM2 CD38/CD138阳性多发性骨髓瘤细胞(ATCC)或CD138/CD38抗原阴性细胞与有或没有缀合硒的双特异性dAb或Vk-对照温育24小时。作为阳性对照，细胞与μM喜树碱(Sigma)温育6小时。在治疗后，按照生产商的说明，细胞用FACS缓冲液洗涤，并在含膜联蛋白V和碘化丙锭的结合缓冲液中重悬浮。在温育15分钟后，通过FACS测定细胞的凋亡和死亡细胞群体的存在情况。(如在图10中所示)。
示于图10的结果表明，硒与双特异性抗CD38/抗CD138 dAb的缀合提供了对双阳性(CD38+/CD138+)细胞的选择性细胞杀伤作用。与没有硒缀合的双特异性dAb相比，观察到表达CD38和CD138这二者的多发性骨髓瘤细胞的凋亡增加。而且，这种凋亡增加对表达CD38和CD138这二者的多发性骨髓瘤细胞是特异性的。对于CD38/CD138阳性或阴性细胞系用缀合硒的阴性对照dAb没有观察到凋亡增加。
关于配体-Se缀合物对细胞存活力的作用，分析了1×105个OPM2(CD38+/CD138+)多发性骨髓瘤细胞。如上所述，将Raji细胞(CD38阳性/CD138阴性)或CD138-/CD38-阴性细胞与有或没有缀合硒的双特异性配体或Vk-对照温育24小时。洗涤细胞，并用碘化丙锭染色，通过FACS测定细胞存活力。结果表明，硒与双特异性配体的缀合导致双阳性多发性骨髓瘤细胞的细胞存活力降低，而单阳性和双阴性细胞系不受影响。参见图11。
在某些研究中，有和没有缀合的双特异性配体或Vk-对照与细胞温育24-96小时。
含有抗CD138 dAb和抗CD56 dAb的配体 已鉴定出结合CD138或CD56的低亲和力dAb。然后连接dAbDOM12-45和DOM14-23，产生特异性结合表达靶的细胞的双特异性dAb(通过FACS)。所有的dAb都在大肠杆菌中表达，在需要时依次使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。
抗CD138/抗CD56双特异性配体(DOM12-45/DOM14-23)已按照线性融合形式制备。这是治疗多发性骨髓瘤的抗CD38/抗CD138配体的替代配对。通过FACS已表明其强结合双阳性细胞系(CD138+/CD56+)，但不结合单阳性或阴性细胞系。已表明DOM14-23/DOM12-45于双阳性多发性骨髓瘤细胞系OPM2上内化(参见表7)。
含有抗CEA dAb和抗CD56 dAb的配体 已鉴定出结合CEA或CD56的低亲和力dAb。然后连接dAb(DOM13-25和DOM14-23)，产生特异性结合表达靶的细胞的双特异性dAb(通过FACS)。所有的dAb都在大肠杆菌中表达，在需要时依次使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。
抗CEA/抗CD56双特异性配体(DOM13-25/DOM14-23)已按照线性融合形式制备。该配体可用于治疗小细胞肺癌。通过FACS已表明其强结合双阳性细胞系(H69小细胞肺癌，其为CEA+/CD56+)，但不结合单阳性或阴性细胞系。另外，DOM13-25和DOM14-23已与Vk对照配对(包含种系氨基酸序列的dAb，其不结合CD38、CD 138、CEA或CD56)。当与Vk对照配对时，没有dAb显示出与H69细胞的显著结合，只有在作为双特异性dAb一起配对时，它们才有效结合H69细胞。
含有抗CEA dAb和抗CD56的配体(DOM13/DOM14) 方法 按照线性融合形式制备抗CEA dAb DOM13-25和抗CD56 dAbDOM14-23。该配体适用于小细胞肺癌。通过FACS已表明其强结合双抗原阳性细胞系(H69小细胞肺癌，ATCC)，但不结合单抗原阳性或阴性细胞系。另外，DOM13-25和DOM14-23已与Vk对照配对。当与Vk对照配对时，没有dAb显示出与H69细胞显著结合，只有在作为双靶向dAb一起配对时，它们才有效结合H69细胞。
亲和力成熟的抗CD38(DOM11)dAb 通过易错PCR产生针对抗CD38 dAb DOM11-3和DOM11-30的亲和力成熟文库。对CD38-Fc抗原进行3轮选择。通过噬菌体ELISA，随后通过可溶性ELISA(如上所述)，表明第2轮和第3轮的dAb特异性结合。通过BIAcore(如前所述)，随后通过FACS，进行初始筛选。
通过BIAcore和FACS鉴别出某些显示出抗原结合改善的克隆。表8和表9显示了对亲代dAb和几种亲和力成熟的抗CD38 dAb(DOM11-3-1、DOM11-3-2、DOM11-30-1、DOM11-30-2、DOM11-30-3和DOM11-30-4)观察到的亲和力(KD)。来自DOM11-30的亲和力成熟的dAb显示出结合亲和力改善达到约10倍。 表8 表9 亲和力成熟的抗CD138 dAb 通过易错PCR产生针对抗CD138 dAb DOM12-45的亲和力成熟文库。对CD38-Fc抗原进行3轮选择。通过噬菌体ELISA，随后通过可溶性ELISA，表明第2轮和第3轮的dAb特异性结合。通过FACS进行初始筛选。在FACS中鉴定出显示抗原结合改善的主要克隆(leadclone)。亲和力成熟的dAb显示出结合亲和力改善达到约10倍。亲和力成熟的抗CD38/抗CD138双特异性配体 通过将抗CD38 dAb和抗CD138 dAb克隆到双表达载体中使抗CD38和抗CD138亲和力成熟的dAb配对，以产生双特异性配体。为确定单体亲和力增加是否反映双特异性配体的结合亲和力增加，使一系列亲和力成熟的抗CD38 dAb与抗CD138d Ab DOM12-45配对，使一系列亲和力成熟的抗CD138 dAb与抗CD38 dAb配对，并使一系列亲和力成熟的抗CD38 dAb和亲和力成熟的抗CD138 dAb配对。所有的双特异性配体都在大肠杆菌中表达，在需要时依次使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。双特异性配体的结合亲和力如前所述通过FACS评价。在本研究中，使用一系列浓度，以允许测定EC50。某些配对的结果见图25。
尽管参考本发明的优选实施方案具体说明和描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不偏离所附权利要求限定的本发明范围的情况下，可以对本发明在形式和细节上实施各种修改。
序列表
<110>杜门蒂斯有限公司(Domantis Limited)
Elena de Angelis
Steve Holmes
Ian M.Tomlinson
Eric Yi-Chun Huang
Lucy J.Holt
Claire E.Everett
<120>对细胞表面靶具有结合特异性的双特异性配体及其使用方法
<130>3440.1006002
<150>60/742,992
<151>2005-12-06
<160>711
<170>FastSEQ for Windows Version4.0
<210>1
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<213>人(Homo sapiens)
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<211>324
<212>DNA
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<210>675
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<213>人(Homo sapiens)
<400>675
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<220>
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<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变异体
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<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变异体
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<213>人(Homo sapiens)
<220>
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<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变异体
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<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变异体
<222>108
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>695
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<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变异体
<222>108
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<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
<400>710
<210>711
<211>324
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>71权利要求
1.含有第一多肽域和第二多肽域的配体，所述第一多肽域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽域具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，
其中所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶是不同的，所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶存在于病原细胞上；
其中所述配体结合所述病原细胞上的所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶；和
其中所述配体被所述病原细胞内化。
2.权利要求1的配体，其中所述配体优先被所述病原细胞内化。
3.权利要求1或2的配体，其中所述配体基本上没有被单阳性细胞或正常细胞内化。
4.权利要求1-3中任一项的配体，其中所述配体选择性地结合所述病原细胞。
5.权利要求1-4中任一项的配体，其中所述第一多肽域以低亲和力结合所述第一细胞表面靶，所述第二多肽域以低亲和力结合所述第二细胞表面靶。
6.权利要求5的配体，其中根据表面等离子共振测定，所述第一多肽域和所述第二多肽域各自以介于约10μM至约10nM之间的亲和力(KD)结合它们相应的细胞表面靶。
7.权利要求4的配体，其中当所述配体以介于1pM至约150nM之间的浓度存在时，所述配体选择性地结合所述病原细胞。
8.权利要求1-7中任一项的配体，其中所述具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点的第一多肽域和所述具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位点的第二多肽域分别是第一免疫球蛋白单可变区和第二免疫球蛋白单可变区。
9.权利要求8的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区和/或所述第二免疫球蛋白单可变区是VHH。
10.权利要求8的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区独立地选自人VH、人VL。
11.权利要求8或10的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区具有对细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述细胞表面靶选自CD38、CD138、癌胚抗原(CEA)、CD56、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)和HER2。
12.权利要求11的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述细胞表面靶选自CD38、CD138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2，前提条件是所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区不结合同一细胞表面靶。
13.权利要求11或12的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD38，并且与选自以下的抗CD38域抗体(dAb)竞争结合CD38DOM11-14(SEQ ID NO:242)、DOM11-22(SEQ ID NO:246)、DOM11-23(SEQ ID NO:247)、DOM11-25(SEQ ID NO:249)、DOM11-26(SEQ ID NO:250)、DOM11-27(SEQ ID NO:251)、DOM11-29(SEQ ID NO:253)、DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30(SEQ ID NO:254)、DOM11-31(SEQ IDNO:255)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-36(SEQ ID NO:260)、DOM11-4(SEQ ID NO:235)、DOM11-43(SEQ ID NO:266)、DOM11-44(SEQ ID NO:267)、DOM11-45(SEQ ID NO:268)、DOM11-5(SEQ IDNO:236)、DOM11-7(SEQ ID NO:238)、DOM11-1(SEQ ID NO:232)、DOM11-10(SEQ ID NO:241)、DOM11-16(SEQ ID NO:243)、DOM11-2(SEQ ID NO:233)、DOM11-20(SEQ ID NO:244)、DOM11-21(SEQ IDNO:245)、DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-28(SEQ ID NO:252)、DOM11-33(SEQ ID NO:257)、DOM11-34(SEQ ID NO:258)、DOM11-35(SEQ ID NO:259)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)、DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:293)、DOM11-41(SEQ ID NO:264)、DOM11-42(SEQ ID NO:265)、DOM11-6(SEQ ID NO:237)、DOM11-8(SEQ ID NO:239)和DOM11-9(SEQ IDNO:240)。
14.权利要求11或12的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD38，并且与选自以下的抗CD38域抗体(dAb)竞争结合CD38:DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ ID NO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ ID NO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ ID NO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ ID NO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ ID NO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ ID NO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ ID NO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ ID NO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ ID NO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ ID NO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ ID NO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ ID NO:305)。
15.权利要求13的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM11-14(SEQ IDNO:242)、DOM11-22(SEQ ID NO:246)、DOM11-23(SEQ ID NO:247)、DOM11-25(SEQ ID NO:249)、DOM11-26(SEQ ID NO:250)、DOM11-27(SEQ ID NO:251)、DOM11-29(SEQ ID NO:253)、DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30(SEQ ID NO:254)、DOM11-31(SEQ IDNO:255)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-36(SEQ ID NO:260)、DOM11-4(SEQ ID NO:235)、DOM11-43(SEQ ID NO:266)、DOM11-44(SEQ ID NO:267)、DOM11-45(SEQ ID NO:268)、DOM11-5(SEQ IDNO:236)、DOM11-7(SEQ ID NO:238)、DOM11-1(SEQ ID NO:232)、DOM11-10(SEQ ID NO:241)、DOM11-16(SEQ ID NO:243)、DOM11-2(SEQ ID NO:233)、DOM11-20(SEQ ID NO:244)、DOM11-21(SEQ IDNO:245)、DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-28(SEQ ID NO:252)、DOM11-33(SEQ ID NO:257)、DOM11-34(SEQ ID NO:258)、DOM11-35(SEQ ID NO:259)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)、DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:293)、DOM11-41(SEQ ID NO:264)、DOM11-42(SEQ ID NO:265)、DOM11-6(SEQ ID NO:237)、DOM11-8(SEQ ID NO:239)和DOM11-9(SEQ IDNO:240)。
16.权利要求13的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM11-3-1(SEQ IDNO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ IDNO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ IDNO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ IDNO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ IDNO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ IDNO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ IDNO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ IDNO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ IDNO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ IDNO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ IDNO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ IDNO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ IDNO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ IDNO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ IDNO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ IDNO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ IDNO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ IDNO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ IDNO:305)。
17.权利要求11或12的配体，其中所述第一种免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD138，并且与选自以下的抗CD138域抗体(dAb)竞争结合CD138:DOM12-1(SEQ ID NO:306)、DOM12-15(SEQ ID NO:317)、DOM12-17(SEQ ID NO:318)、DOM12-19(SEQ ID NO:320)、DOM12-2(SEQ ID NO:307)、DOM12-20(SEQ ID NO:321)、DOM12-21(SEQ ID NO:322)、DOM12-22(SEQ IDNO:323)、DOM12-3(SEQ ID NO:308)、DOM12-33(SEQ ID NO:334)、DOM12-39(SEQ ID NO:340)、DOM12-4(SEQ ID NO:309)、DOM12-40(SEQ ID NO:341)、DOM12-41(SEQ ID NO:342)、DOM12-42(SEQ IDNO:343)、DOM12-44(SEQ ID NO:345)、DOM12-46(SEQ ID NO:347)、DOM12-6(SEQ ID NO:311)、DOM12-7(SEQ ID NO:312)、DOM12-10(SEQ ID NO:315)、DOM12-11(SEQ ID NO:316)、DOM12-18(SEQ IDNO:319)、DOM12-23(SEQ ID NO:324)、DOM12-24(SEQ ID NO:325)、DOM12-25(SEQ ID NO:326)、DOM12-26(SEQ ID NO:327)、DOM12-27(SEQ ID NO:328)、DOM12-28(SEQ ID.NO:329)、DOM12-29(SEQ ID NO:330)、DOM12-30(SEQ ID NO:331)、DOM12-31(SEQ ID NO:332)、DOM12-32(SEQ ID NO:333)、DOM12-34(SEQ ID NO:335)、DOM12-35(SEQ ID NO:336)、DOM12-36(SEQ ID NO:337)、DOM12-37(SEQ ID NO:338)、DOM12-38(SEQ ID NO:339)、DOM12-43(SEQ ID NO:344)、DOM12-45(SEQ ID NO:346)、DOM12-5(SEQ ID NO:310)、DOM12-8(SEQ ID NO:313)和DOM12-9(SEQ ID NO:314)。
18.权利要求11或12的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD138，并且与选自以下的抗CD138域抗体(dAb)竞争结合CD138:DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ ID NO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ ID NO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ ID NO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ ID NO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ ID NO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ ID NO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ ID NO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ ID NO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ ID NO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ ID NO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ ID NO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ ID NO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ ID NO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ ID NO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ ID NO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ ID NO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ ID NO:384)。
19.权利要求17的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM12-1(SEQ IDNO:306)、DOM12-15(SEQ ID NO:317)、DOM12-17(SEQ ID NO:318)、DOM12-19(SEQ ID NO:320)、DOM12-2(SEQ ID NO:307)、DOM12-20(SEQ ID NO:321)、DOM12-21(SEQ ID NO:322)、DOM12-22(SEQ IDNO:323)、DOM12-3(SEQ ID NO:308)、DOM12-33(SEQ ID NO:334)、DOM12-39(SEQ ID NO:340)、DOM12-4(SEQ ID NO:309)、DOM12-40(SEQ ID NO:341)、DOM12-41(SEQ ID NO:342)、DOM12-42(SEQ IDNO:343)、DOM12-44(SEQ ID NO:345)、DOM12-46(SEQ ID NO:347)、DOM12-6(SEQ ID NO:311)、DOM12-7(SEQ ID NO:312)、DOM12-10(SEQ ID NO:315)、DOM12-11(SEQ ID NO:316)、DOM12-18(SEQ IDNO:319)、DOM12-23(SEQ ID NO:324)、DOM12-24(SEQ ID NO:325)、DOM12-25(SEQ ID NO:326)、DOM12-26(SEQ ID NO:327)、DOM12-27(SEQ ID NO:328)、DOM12-28(SEQ ID NO:329)、DOM12-29(SEQ ID NO:330)、DOM12-30(SEQ ID NO:331)、DOM12-31(SEQ ID NO:332)、DOM12-32(SEQ ID NO:333)、DOM12-34(SEQ ID NO:335)、DOM12-35(SEQ ID NO:336)、DOM12-36(SEQ ID NO:337)、DOM12-37(SEQ ID NO:338)、DOM12-38(SEQ ID NO:339)、DOM12-43(SEQ ID NO:344)、DOM12-45(SEQ ID NO:346)、DOM12-5(SEQ ID NO:310)、DOM12-8(SEQ ID NO:313)和DOM12-9(SEQ ID NO:314)。
20.权利要求17的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM12-45-1(SEQ IDNO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ IDNO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ IDNO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ IDNO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ IDNO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ IDNO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ IDNO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ IDNO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ IDNO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ IDNO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ IDNO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ IDNO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ IDNO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ IDNO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ IDNO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ IDNO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ IDNO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ IDNO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ IDNO:384)。
21.权利要求11或12的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CEA，并且与选自以下的抗CEA域抗体(dAb)竞争结合CEA:DOM13-1(SEQ ID NO:385)、DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、DOM13-14(SEQ ID NO:395)；DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2(SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ IDNO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3(SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ IDNO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、DOM-13-34(SEQ ID NO:415)、DOM13-35(SEQ ID NO:416)、DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4(SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ IDNO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5(SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ IDNO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、DOM13-54(SEQ ID NO:431)、DOM13-55(SEQ ID NO:432)、DOM13-56(SEQ ID NO:433)、DOM13-57(SEQ ID NO:434)、DOM13-58(SEQ ID NO:435)、DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6(SEQ ID NO:390)、DOM13-60(SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ IDNO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、DOM13-64(SEQ ID NO:441)、DOM13-65(SEQ ID NO:442)、DOM13-66(SEQ ID NO:443)、DOM13-67(SEQ ID NO:444)、DOM13-68(SEQ ID NO:445)、DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7(SEQ ID NO:391)、DOM13-70(SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ IDNO:3448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ IDNO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、DOM13-75(SEQ ID NO:452)、DOM13-76(SEQ ID NO:453)、DOM13-77(SEQ ID NO:454)、DOM13-78(SEQ ID NO:455)、DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ IDNO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、DOM13-84(SEQ ID NO:461)、DOM13-85(SE QID NO:462)、DOM13-86(SEQ ID NO:463)、DOM13-87(SEQ ID NO:464)、DOM13-88(SEQ ID NO:465)、DOM13-89(SEQ ID NO:466)、DOM13-90(SEQ ID NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、DOM13-94(SEQ ID NO:471)和DOM13-95(SEQ ID NO:472)。
22.权利要求11或12的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CEA，并且与选自以下的抗CEA域抗体(dAb)竞争结合CEA:DOM13-25-3(SEQ ID NO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ ID NO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。
23.权利要求21的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM13-1(SEQ IDNO:385)、DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、DOM13-14(SEQ ID NO:395)、DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2(SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ IDNO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3(SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ IDNO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、DOM-13-34(SEQ ID NO:415)、DOM13-35(SEQ ID NO:416)、DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4(SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ IDNO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5(SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ IDNO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、DOM13-54(SEQ ID NO:431)、DOM13-55(SEQ ID NO:432)、DOM13-56(SEQ ID NO:433)、DOM13-57(SEQ ID NO:434)、DOM13-58(SEQ ID NO:435)、DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6(SEQ ID NO:390)、DOM13-60(SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ IDNO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、DOM13-64(SEQ ID NO:441)、DOM13-65(SEQ ID NO:442)、DOM13-66(SEQ ID NO:443)、DOM13-67(SEQ ID NO:444)、DOM13-68(SEQ ID NO:445)、DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7(SEQ ID NO:391)、DOM13-70(SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ IDNO:3448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ IDNO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、DOM13-75(SEQ ID NO:452)、DOM13-76(SEQ ID NO:453)、DOM13-77(SEQ ID NO:454)、DOM13-78(SEQ ID NO:455)、DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ IDNO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、DOM13-84(SEQ ID NO:461)、DOM13-85(SEQ ID NO:462)、DOM13-86(SEQ ID NO:463)、DOM13-87(SEQ ID NO:464)、DOM13-88(SEQ ID NO:465)、DOM13-89(SEQ ID NO:466)、DOM13-90(SEQ ID NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、DOM13-94(SEQ ID NO:471)和DOM13-95(SEQ ID NO:472)。
24.权利要求21的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM13-25-3(SEQ IDNO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ IDNO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。
25.权利要求11或12的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD56，并且与选自以下的抗CD56域抗体(dAb)竞争结合CD56:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)；DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ IDNO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ IDNO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ IDNO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
26.权利要求25的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM14-1(SEQ IDNO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ IDNO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ IDNO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ IDNO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ IDNO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
27.权利要求8-26中任一项的配体，其中第一免疫球蛋白单可变区具有对CD38具有结合特异性的结合位点；所述第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD
138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2。
28.权利要求27的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对CD138具有结合特异性的结合位点。
29.权利要求8-26中任一项的配体，其中第一免疫球蛋白单可变区具有对CD138具有结合特异性的结合位点；所述第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2。
30.权利要求29的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对CEA具有结合特异性的结合位点。
31.权利要求8-26中任一项的配体，其中第一免疫球蛋白单可变区具有对CEA具有结合特异性的结合位点；所述第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD38、CEA、VEGF、EGFR和HER2。
32.权利要求31的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对CD56具有结合特异性的结合位点。
33.权利要求1-32中任一项的配体，其中所述配体还含有毒素。
34.权利要求33的配体，其中所述毒素是表面活性毒素。
35.权利要求34的配体，其中所述表面活性毒素包括自由基产生物或放射性核素。
36.权利要求35的配体，其中所述毒素是细胞毒素、表面活性毒素、自由基产生物、抗代谢药、蛋白质、多肽、肽、光敏剂、反义化合物、化疗药、放射性核素或胞内抗体。
37.权利要求1-36中任一项的配体，其中所述配体还包含半衰期延长部分。
38.权利要求37的配体，其中所述半衰期延长部分是聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段，转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分，或者包含针对增强体内半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。
39.权利要求38的配体，其中所述半衰期延长部分是聚乙二醇部分。
40.权利要求39的配体，其中所述半衰期延长部分是包含针对血清白蛋白或新生动物Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。
41.权利要求38的配体，其中所述抗体或抗体片段是抗体片段，所述抗体片段是免疫球蛋白单可变区。
42.权利要求41的配体，其中所述免疫球蛋白单可变区与选自以下的dAb竞争结合人血清白蛋白:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ IDNO:548)和DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ IDNO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ IDNO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ IDNO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ IDNO:585)。
43.权利要求42的配体，其中所述免疫球蛋白单可变区结合人血清白蛋白，其包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ IDNO:548)和DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ IDNO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ IDNO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ IDNO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ IDNO:585)。
44.包含第一多肽域、第二多肽域和至少一种毒素部分的配体，所述第一多肽域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽域具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位点；其中所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶是不同的，所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶存在于病原细胞上；其中所述配体以介于约10-6M至约10-12M之间的亲合力结合所述病原细胞上的所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶；而且，其中所述配体被所述病原细胞内化。
45.权利要求44的配体，其中所述配体优先被所述病原细胞内化。
46.权利要求44或45的配体，其中所述配体基本上没有被单阳性细胞或正常细胞内化。
47.权利要求44-46中任一项的配体，其中所述配体选择性地结合所述病原细胞。
48.权利要求44-47中任一项的配体，其中所述毒素部分包括细胞毒素、表面活性毒素、自由基产生物、抗代谢药、蛋白质、多肽、肽、光敏剂、反义化合物、化疗药、放射性核素或胞内抗体。
49.权利要求44-47中任一项的配体，其中所述毒素部分包括表面活性毒素。
50.权利要求49的配体，其中所述表面活性毒素包括自由基产生物或放射性核素。
51.权利要求44-50中任一项的配体，其中所述第一多肽域以低亲和力结合所述第一细胞表面靶，所述第二多肽域以低亲和力结合所述第二细胞表面靶。
52.权利要求51的配体，其中根据表面等离子共振测定，所述第一多肽域和所述第二多肽域各自以介于约10μM至约10nM之间的亲和力(KD)结合它们相应的细胞表面靶。
53.权利要求47的配体，其中当所述配体以介于1pM至约150nM之间的浓度存在时，所述配体选择性地结合所述病原细胞。
54.权利要求44-53中任一项的配体，其中所述具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点的第一多肽域和所述具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位点的第二多肽域分别是第一免疫球蛋白单可变区和第二免疫球蛋白单可变区。
55.权利要求54的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区和/或所述第二免疫球蛋白单可变区是VHH。
56.权利要求54的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区独立地选自人VH和人VL。
57.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD138、癌胚抗原(CEA)、CD56、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)和HER2。
58.权利要求57的配体，其中第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2，前提条件是所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区不结合同一细胞表面靶。
59.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD38，并且与选自以下的抗CD38域抗体(dAb)竞争结合CD38:DOM11-14(SEQ ID NO:261)、DOM11-22(SEQ ID NO:262)、DOM11-23(SEQ ID NO:9)、DOM11-25(SEQ ID NO:263)、DOM11-26(SEQ ID NO:264)、DOM11-27(SEQ IDNO:265)、DOM11-29(SEQ ID NO:266)、DOM11-3(SEQ ID NO:1)、DOM11-30(SEQ ID NO:2)、DOM11-31(SEQ ID NO:267)、DOM11-32(SEQ ID NO:7)、DOM11-36(SEQ ID NO:268)、DOM11-4(SEQ IDNO:269)、DOM11-43(SEQ ID NO:270)、DOM11-44(SEQ ID NO:271)、DOM11-45(SEQ ID NO:272)、DOM11-5(SEQ ID NO:273)、DOM11-7(SEQ ID NO:3)、DOM11-1(SEQ ID NO:274)、DOM11-10(SEQ IDNO:275)、DOM11-16(SEQ ID NO:276)、DOM11-2(SEQ ID NO:277)、DOM11-20(SEQ ID NO:278)、DOM11-21(SEQ ID NO:279)、DOM11-24(SEQ ID NO:6)、DOM11-28(SEQ ID NO:280)、DOM11-33(SEQ ID NO:281)、DOM11-34(SEQ ID NO:282)、DOM11-35(SEQ IDNO:283)、DOM11-37(SEQ ID NO:8)、DOM11-38(SEQ ID NO:4)、DOM11-39(SEQ ID NO:5)、DOM11-41(SEQ ID NO:284)、DOM11-42(SEQ ID NO:285)、DOM11-6(SEQ ID NO:286)、DOM11-8(SEQ IDNO:287)和DOM11-9(SEQ ID NO:288)。
60.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD38，并且与选自以下的抗CD38域抗体(dAb)竞争结合CD38:DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ ID NO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ ID NO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ ID NO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ ID NO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ ID NO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ ID NO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ ID NO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ ID NO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ ID NO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ ID NO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ ID NO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ ID NO:305)。
61.权利要求59的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM11-14(SEQ IDNO:261)、DOM11-22(SEQ ID NO:262)、DOM11-23(SEQ ID NO:9)、DOM11-25(SEQ ID NO:263)、DOM11-26(SEQ ID NO:264)、DOM11-27(SEQ ID NO:265)、DOM11-29(SEQ ID NO:266)、DOM11-3(SEQ ID NO:1)、DOM11-30(SEQ ID NO:2)、DOM11-31(SEQ IDNO:267)、DOM11-32(SEQ ID NO:7)、DOM11-36(SEQ ID NO:268)、DOM11-4(SEQ ID NO:269)、DOM11-43(SEQ ID NO:270)、DOM11-44(SEQ ID NO:271)、DOM11-45(SEQ ID NO:272)、DOM11-5(SEQ IDNO:273)、DOM11-7(SEQ ID NO:3)、DOM11-1(SEQ ID NO:274)、DOM11-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-16(SEQ ID NO:276)、DOM11-2(SEQ ID NO:277)、DOM11-20(SEQ ID NO:278)、DOM11-21(SEQ IDNO:279)、DOM11-24(SEQ ID NO:6)、DOM11-28(SEQ ID NO:280)、DOM11-33(SEQ ID NO:281)、DOM11-34(SEQ ID NO:282)、DOM11-35(SEQ ID NO:283)、DOM11-37(SEQ ID NO:8)、DOM11-38(SEQ ID NO:4)、DOM11-39(SEQ ID NO:5)、DOM11-41(SEQ IDNO:284)、DOM11-42(SEQ ID NO:285)、DOM11-6(SEQ ID NO:286)、DOM11-8(SEQ ID NO:287)和DOM11-9(SEQ ID NO:288)。
62.权利要求59的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM11-3-1(SEQ IDNO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ IDNO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ IDNO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ IDNO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ IDNO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ IDNO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ IDNO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ IDNO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ IDNO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ IDNO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ IDNO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ IDNO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ IDNO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ IDNO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ IDNO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ IDNO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ IDNO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ IDNO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ IDNO:305)。
63.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD138，并且与选自以下的抗CD138域抗体(dAb)竞争结合CD138:DOM12-1(SEQ ID NO:289)、DOM12-15(SEQ ID NO:290)、DOM12-17(SEQ ID NO:11)、DOM12-19(SEQ ID NO:291)、DOM12-2(SEQ ID NO:292)、DOM12-20(SEQ IDNO:293)、DOM12-21(SEQ ID NO:294)、DOM12-22(SEQ ID NO:295)、DOM12-3(SEQ ID NO:296)、DOM12-33(SEQ ID NO:297)、DOM12-39(SEQ ID NO:298)、DOM12-4(SEQ ID NO:299)、DOM12-40(SEQ IDNO:300)、DOM12-41(SEQ ID NO:301)、DOM12-42(SEQ ID NO:302)、DOM12-44(SEQ ID NO:303)、DOM12-46(SEQ ID NO:304)、DOM12-6(SEQ ID NO:305)、DOM12-7(SEQ ID NO:306)、DOM12-10(SEQ IDNO:307)、DOM12-11(SEQ ID NO:308)、DOM12-18(SEQ ID NO:309)、DOM12-23(SEQ ID NO:310)、DOM12-24(SEQ ID NO:311)、DOM12-25(SEQ ID NO:312)、DOM12-26(SEQ ID NO:12)、DOM12-27(SEQ ID NO:313)、DOM12-28(SEQ ID NO:314)、DOM12-29(SEQ IDNO:315)、DOM12-30(SEQ ID NO:316)、DOM12-31(SEQ ID NO:317)、DOM12-32(SEQ ID NO:318)、DOM12-34(SEQ ID NO:319)、DOM12-35(SEQ ID NO:320)、DOM12-36(SEQ ID NO:321)、DOM12-37(SEQ ID NO:322)、DOM12-38(SEQ ID NO:323)、DOM12-43(SEQ ID NO:324)、DOM12-45(SEQ ID NO:310)、DOM12-5(SEQ ID NO:325)、DOM12-8(SEQ ID NO:326)和DOM12-9(SEQ IDNO:327)。
64.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD138，并且与选自以下的抗CD138域抗体(dAb)竞争结合CD138:DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ ID NO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ ID NO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ ID NO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ ID NO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ ID NO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ ID NO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ ID NO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ ID NO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ ID NO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ ID NO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ ID NO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ ID NO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ ID NO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ ID NO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ ID NO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ ID NO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ ID NO:384)。
65.权利要求63的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM12-1(SEQ IDNO:289)、DOM12-15(SEQ ID NO:290)、DOM12-17(SEQ ID NO:11)、DOM12-19(SEQ ID NO:291)、DOM12-2(SEQ ID NO:292)、DOM12-20(SEQ ID NO:293)、DOM12-21(SEQ ID NO:294)、DOM12-22(SEQ IDNO:295)、DOM12-3(SEQ ID NO:296)、DOM12-33(SEQ ID NO:297)、DOM12-39(SEQ ID NO:298)、DOM12-4(SEQ ID NO:299)、DOM12-40(SEQ ID NO:300)、DOM12-41(SEQ ID NO:301)、DOM12-42(SEQ IDNO:302)、DOM12-44(SEQ ID NO:303)、DOM12-46(SEQ ID NO:304)、DOM12-6(SEQ ID NO:305)、DOM12-7(SEQ ID NO:306)、DOM12-10(SEQ ID NO:307)、DOM12-11(SEQ ID NO:308)、DOM12-18(SEQ IDNO:309)、DOM12-23(SEQ ID NO:310)、DOM12-24(SEQ ID NO:311)、DOM12-25(SEQ ID NO:312)、DOM12-26(SEQ ID NO:12)、DOM12-27(SEQ ID NO:313)、DOM12-28(SEQ ID NO:314)、DOM12-29(SEQ IDNO:315)、DOM12-30(SEQ ID NO:316)、DOM12-31(SEQ ID NO:317)、DOM12-32(SEQ ID NO:318)、DOM12-34(SEQ ID NO:319)、DOM12-35(SEQ ID NO:320)、DOM12-36(SEQ ID NO:321)、DOM12-37(SEQ ID NO:322)、DOM12-38(SEQ ID NO:323)、DOM12-43(SEQ ID NO:324)、DOM12-45(SEQ ID NO:310)、DOM12-5(SEQ ID NO:325)、DOM12-8(SEQ ID NO:326)和DOM12-9(SEQ IDNO:327)。
66.权利要求63的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM12-45-1(SEQ IDNO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ IDNO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ IDNO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ IDNO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ IDNO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ IDNO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ IDNO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ IDNO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ IDNO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ IDNO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ IDNO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ IDNO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ IDNO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ IDNO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ IDNO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ IDNO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ IDNO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ IDNO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ IDNO:384)。
67.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CEA，并且与选自以下的抗CEA域抗体(dAb)竞争结合CEA:DOM13-1(SEQ ID NO:328)、DOM13-12(SEQ ID NO:329)、DOM13-13(SEQ ID NO:330)、DOM13-14(SEQ ID NO:331)、DOM13-15(SEQ ID NO:332)、DOM13-16(SEQ ID NO:333)、DOM13-17(SEQ ID NO:334)、DOM13-18(SEQ ID NO:335)、DOM13-19(SEQ ID NO:336)、DOM13-2(SEQ ID NO:337)、DOM13-20(SEQ ID NO:338)、DOM13-21(SEQ IDNO:339)、DOM13-22(SEQ ID NO:340)、DOM13-23(SEQ ID NO:341)、DOM13-24(SEQ ID NO:342)、DOM13-25(SEQ ID NO:13)、DOM13-26(SEQ ID NO:343)、DOM13-27(SEQ ID NO:344)、DOM13-28(SEQ IDNO:345)、DOM13-29(SEQ ID NO:346)、DOM13-3(SEQ ID NO:347)、DOM13-30(SEQ ID NO:348)、DOM13-31(SEQ ID NO:349)、DOM13-32(SEQ ID NO:350)、DOM13-33(SEQ ID NO:351)、DOM-13-34(SEQ ID NO:352)、DOM13-35(SEQ ID NO:353)、DOM13-36(SEQ ID NO:354)、DOM13-37(SEQ ID NO:355)、DOM13-4(SEQ ID NO:356)、DOM13-42(SEQ ID NO:357)、DOM13-43(SEQ IDNO:358)、DOM13-44(SEQ ID NO:359)、DOM13-45(SEQ ID NO:360)、DOM13-46(SEQ ID NO:361)、DOM13-47(SEQ ID NO:362)、DOM13-48(SEQ ID NO:363)、DOM13-49(SEQ ID NO:364)、DOM13-5(SEQ ID NO:365)、DOM13-50(SEQ ID NO:366)、DOM13-51(SEQ IDNO:367)、DOM13-52(SEQ ID NO:368)、DOM13-53(SEQ ID NO:369)、DOM13-54(SEQ ID NO:370)、DOM13-55(SEQ ID NO:371)、DOM13-56(SEQ ID NO:372)、DOM13-57(SEQ ID NO:14)、DOM13-58(SEQ ID NO:15)、DOM13-59(SEQ ID NO:16)、DOM13-6(SEQ IDNO:373)、DOM13-60(SEQ ID NO:374)、DOM13-61(SEQ ID NO:375)、DOM13-62(SEQ ID NO:376)、DOM13-63(SEQ ID NO:377)、DOM13-64(SEQ ID NO:17)、DOM13-65(SEQ ID NO:18)、DOM13-66(SEQ ID NO:378)、DOM13-67(SEQ ID NO:379)、DOM13-68(SEQ IDNO:380)、DOM13-69(SEQ ID NO:381)、DOM13-7(SEQ ID NO:382)、DOM13-70(SEQ ID NO:383)、DOM13-71(SEQ ID NO:384)、DOM13-72(SEQ ID NO:385)、DOM13-73(SEQ ID NO:386)、DOM13-74(SEQ ID NO:19)、DOM13-75(SEQ ID NO:387)、DOM13-76(SEQ ID NO:388)、DOM13-77(SEQ ID NO:389)、DOM13-78(SEQ IDNO:390)、DOM13-79(SEQ ID NO:391)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:393)、DOM13-81(SEQ ID NO:394)、DOM13-82(SEQ ID NO:395)、DOM13-83(SEQ ID NO:396)、DOM13-84(SEQ ID NO:397)、DOM13-85(SEQ ID NO:398)、DOM13-86(SEQ ID NO:399)、DOM13-87(SEQ ID NO:400)、DOM13-88(SEQ ID NO:401)、DOM13-89(SEQ ID NO:402)、DOM13-90(SEQ ID NO:403)、DOM13-91(SEQ ID NO:404)、DOM13-92(SEQ ID NO:405)、DOM13-93(SEQ ID NO:20)、DOM13-94(SEQ ID NO:406)和DOM13-95(SEQ ID NO:21)。
68.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CEA，并且与选自以下的抗CEA域抗体(dAb)竞争结合CEA:DOM13-25-3(SEQ ID NO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ ID NO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。
69.权利要求67的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM13-1(SEQ IDNO:328)、DOM13-12(SEQ ID NO:329)、DOM13-13(SEQ ID NO:330)、DOM13-14(SEQ ID NO:331)、DOM13-15(SEQ ID NO:332)、DOM13-16(SEQ ID NO:333)、DOM13-17(SEQ ID NO:334)、DOM13-18(SEQ ID NO:335)、DOM13-19(SEQ ID NO:336)、DOM13-2(SEQ ID NO:337)、DOM13-20(SEQ ID NO:338)、DOM13-21(SEQ IDNO:339)、DOM13-22(SEQ ID NO:340)、DOM13-23(SEQ ID NO:341)、DOM13-24(SEQ ID NO:342)、DOM13-25(SEQ ID NO:13)、DOM13-26(SEQ ID NO:343)、DOM13-27(SEQ ID NO:344)、DOM13-28(SEQ IDNO:345)、DOM13-29(SEQ ID NO:346)、DOM13-3(SEQ ID NO:347)、DOM13-30(SEQ ID NO:348)、DOM13-31(SEQ ID NO:349)、DOM13-32(SEQ ID NO:350)、DOM13-33(SEQ ID NO:351)、DOM-13-34(SEQ ID NO:352)、DOM13-35(SEQ ID NO:353)、DOM13-36(SEQ ID NO:354)、DOM13-37(SEQ ID NO:355)、DOM13-4(SEQ ID NO:356)、DOM13-42(SEQ ID NO:357)、DOM13-43(SEQ IDNO:358)、DOM13-44(SEQ ID NO:359)、DOM13-45(SEQ ID NO:360)、DOM13-46(SEQ ID NO:361)、DOM13-47(SEQ ID NO:362)、DOM13-48(SEQ ID NO:363)、DOM13-49(SEQ ID NO:364)、DOM13-5(SEQ ID NO:365)、DOM13-50(SEQ ID NO:366)、DOM13-51(SEQ IDNO:367)、DOM13-52(SEQ ID NO:368)、DOM13-53(SEQ ID NO:369)、DOM13-54(SEQ ID NO:370)、DOM13-55(SEQ ID NO:371)、DOM13-56(SEQ ID NO:372)、DOM13-57(SEQ ID NO:14)、DOM13-58(SEQ ID NO:15)、DOM13-59(SEQ ID NO:16)、DOM13-6(SEQ IDNO:373)、DOM13-60(SEQ ID NO:374)、DOM13-61(SEQ ID NO:375)、DOM13-62(SEQ ID NO:376)、DOM13-63(SEQ ID NO:377)、DOM13-64(SEQ ID NO:17)、DOM13-65(SEQ ID NO:18)、DOM13-66(SEQ ID NO:378)、DOM13-67(SEQ ID NO:379)、DOM13-68(SEQ IDNO:380)、DOM13-69(SEQ ID NO:381)、DOM13-7(SEQ ID NO:382)、DOM13-70(SEQ ID NO:383)、DOM13-71(SEQ ID NO:384)、DOM13-72(SEQ ID NO:385)、DOM13-73(SEQ ID NO:386)、DOM13-74(SEQ ID NO:19)、DOM13-75(SEQ ID NO:387)、DOM13-76(SEQ ID NO:388)、DOM13-77(SEQ ID NO:389)、DOM13-78(SEQ IDNO:390)、DOM13-79(SEQ ID NO:391)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:393)、DOM13-81(SEQ ID NO:394)、DOM13-82(SEQ ID NO:395)、DOM13-83(SEQ ID NO:396)、DOM13-84(SEQ ID NO:397)、DOM13-85(SEQ ID NO:398)、DOM13-86(SEQ ID NO:399)、DOM13-87(SEQ ID NO:400)、DOM13-88(SEQ ID NO:401)、DOM13-89(SEQ ID NO:402)、DOM13-90(SEQ ID NO:403)、DOM13-91(SEQ ID NO:404)、DOM13-92(SEQ ID NO:405)、DOM13-93(SEQ ID NO:20)、DOM13-94(SEQ ID NO:406)和DOM13-95(SEQ ID NO:21)。
70.权利要求67的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM13-25-3(SEQ IDNO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ IDNO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。
71.权利要求54或56的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区结合CD56，并且与选自以下的抗CD56域抗体(dAb)竞争结合CD56:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ IDNO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ IDNO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ IDNO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
72.权利要求71的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区或所述第二免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列相似性:DOM14-1(SEQ IDNO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ IDNO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ IDNO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24.(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ IDNO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ IDNO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。
73.权利要求54-72中任一项的配体，其中第一免疫球蛋白单可变区具有对CD38具有结合特异性的结合位点；所述第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点CD138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2。
74.权利要求73的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对CD138具有结合特异性的结合位点。
75.权利要求54-72中任一项的配体，其中第一免疫球蛋白单可变区具有对CD138具有结合特异性的结合位点；所述第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点CD38、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2。
76.权利要求75的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对CEA具有结合特异性的结合位点。
77.权利要求54-72中任一项的配体，其中第一免疫球蛋白单可变区具有对CEA具有结合特异性的结合位点；所述第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点CD38、CD38、CEA、VEGF、EGFR和HER2。
78.权利要求77的配体，其中所述第二免疫球蛋白单可变区具有对CD56具有结合特异性的结合位点。
79.权利要求44-78中任一项的配体，其中所述配体还包含半衰期延长部分。
80.权利要求79的配体，其中所述半衰期延长部分是聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段，转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分，或包含针对增强体内半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。
81.权利要求80的配体，其中所述半衰期延长部分是聚乙二醇部分。
82.权利要求80的配体，其中所述半衰期延长部分是包含针对血清白蛋白或新生动物Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。
83.权利要求80的配体，其中所述抗体或抗体片段是抗体片段，所述抗体片段是免疫球蛋白单可变区。
84.权利要求83的配体，其中所述免疫球蛋白单可变区与选自以下的dAb竞争结合人血清白蛋白DOM7m-16.(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ IDNO:548)和DOM7r-8.(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ IDNO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ IDNO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ IDNO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ IDNO:585)。
85.权利要求84的配体，其中所述免疫球蛋白单可变区结合人血清白蛋白，其包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ IDNO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ ID NO:548)和DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ IDNO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ IDNO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ IDNO:570)、DOM7r-19(SEQ ID NO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ IDNO:577)、DOM7r-26(SEQ ID NO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM[7r-28(SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ IDNO:584)和DOM7r-33(SEQ ID NO:585)。
86.用于治疗或诊断的权利要求1-85中任一项的配体。
87.用于治疗癌症的权利要求1-85中任一项的配体。
88.权利要求1-85中任一项的配体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
89.一种将毒素在内部递送到细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求44-85中任一项的配体接触，其中配体被内化，毒素在内部被递送。
90.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1-85中任一项的配体。
91.权利要求90的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
92.权利要求91的方法，其中所述癌症是肺癌。
93.一种组合物，所述组合物含有权利要求1-85中任一项的配体和生理上可接受的载体。
94.权利要求93的组合物，其中所述组合物包含用于静脉内、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内或皮下给药的溶媒。
95.权利要求93的组合物，其中所述组合物包含用于肺、鼻内、阴道或直肠给药的溶媒。
96.一种递药装置，所述装置含有权利要求93的组合物。
97.权利要求96的递药装置，其中所述递药装置选自胃肠外递药装置、静脉内递药装置、肌内递药装置、腹膜内递药装置、经皮递药装置、肺递药装置、动脉内递药装置、鞘内递药装置、关节内递药装置、皮下递药装置、鼻内递药装置、阴道递药装置和直肠递药装置。
98.权利要求96的递药装置，其中所述装置选自注射器、经皮递药装置、胶囊剂、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、气雾器、干粉吸入器、计量吸入器、计量喷雾器、计量气雾器、计量雾化器、导管。
99.权利要求1-85中任一项的配体在制备用于选择性杀伤癌细胞、而不是正常细胞的药物中的用途。
100.权利要求1-85中任一项的配体在制备用于在细胞内递送治疗剂的药物中的用途。
权利要求1-85中任一项的配体在制备用于在细胞中将治疗剂递送到组织蛋白酶B区室的药物中的用途。
权利要求1-85中任一项的配体在制备用于在细胞中将所述配体定位于组织蛋白酶B区室的药物中的用途。
一种分离或重组核酸，所述核酸编码权利要求1-85中任一项的配体。
包含权利要求103的重组核酸的载体。
包含权利要求103的重组核酸或权利要求104的载体的宿主细胞。
一种生产配体的方法，所述方法包括将权利要求105的宿主细胞在适于表达所述核酸或载体的条件下进行培养，由此产生配体。
权利要求106的方法，所述方法还包括分离出所述配体。
一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的权利要求1-85中任一项的配体和化疗药，其中所述化疗药以低剂量给予。
全文摘要
公开了含有第一多肽域和第二多肽域的配体，所述第一多肽域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽域具有针对第二细胞表面靶的结合位点，其中每个靶都是不同的，但却位于同一细胞上。在某些实施方案中，所述配体还含有毒素。在其它实施方案中，所述配体还含有半衰期延长部分。还公开了使用这些配体的方法。具体地说，描述了这些配体在癌症治疗中的用途。
文档编号C07K16/28GK101379088SQ200680052377
公开日2009年3月4日 申请日期2006年12月5日 优先权日2005年12月6日
发明者E·德安格利斯, S·霍尔姆斯, I·M·汤姆林森, E·Y·-C·黄, L·J·霍尔特, C·E·埃弗里特 申请人:杜门蒂斯有限公司