含有磷酸酯模拟物的多聚核苷酸的利记博彩app

专利名称：含有磷酸酯模拟物的多聚核苷酸的利记博彩app

发明内容
本发明涉及核酸化学领域的新物质及其制备过程。这些物质是所谓的磷酸酯模拟物，其中羟基被相应的模拟物所取代。
具体而言本发明涉及新类型的修饰寡聚核苷酸及其制备方法。

背景技术：
之前已描述了各种方法以制备带有修饰磷酸残基的核苷酸或寡聚核苷酸。
通常利用亚磷酰胺化学在固相上制备合成(脱氧)寡聚核苷酸。具有规定尺寸的有孔玻璃珠通常用作所述固相(以下缩写为CPG＝可控孔度玻璃)。第一单体通过可切割基团与所述载体相连，从而在所述固相合成完成后切割下游离的寡聚核苷酸。此外，所述第一单体含有被保护的羟基，在此情况下通常采用二甲氧基三苯甲基(DMT)作为所述保护基团。所述保护基团可以通过酸处理除去。然后，在循环过程中，在5′端，也带有DMT保护基团的(脱氧)核糖核苷的3′亚磷酰胺衍生物继续与每次情况下都不含有DMT保护基团的反应性基团进行偶联。作为另外一种选择，3′二甲氧基三苯甲基保护的5′亚磷酰胺用于反向寡聚核苷酸合成。特别地，还可以采用H-膦酸酯策略以在所述磷酸骨架上引入修饰，例如来制备放射性标记的硫代磷酸酯。也已经公知用于制备经修饰的或者经标记的寡聚核苷酸的多种策略根据现有技术采用三官能载体材料制备在3′端进行标记的寡聚核苷酸(US 5,290,925，US 5,401,837)。其中所述标记基团通过C3～12连接子被连接到亚磷酰胺上的经标记的亚磷酰胺通常用于制备在5′端进行标记的寡聚核苷酸(US 4,997,928，US5,231,191)。此外，也可以在个别碱基上(US 5,241,060，US 5,260,433，US 5,668,266)或者通过引入内部非核苷连接子(US 5,656,744，US6,130,323)对寡聚核苷酸进行修饰。
作为另外一种选择，可以通过硫代磷酸酯的合成后标记(Hodges，R.R.，等Biochemistry 28(1989)261-7)或者通过对官能化亚磷酰胺进行后标记(Agrawal，S.，Methods in Mol.Biology 26(1993)，Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press，Totowa，NJ，Chapter 3)对核苷间磷酸酯进行标记。然而，由于所述亚磷酰胺和磷酸硫酯的不稳定性，这些方法尚未被接受。
从现有技术还已知可以在寡聚核苷酸的核苷间磷酸残基上引入修饰。在最主要的情况下为硫代磷酸酯(Burgers，P.M.，和Eckstein，F.，Biochemistry 18，(1979)592-6)，甲基膦酸酯(Miller，P.S.，等，Biochemistry 18(1979)5134-43)或硼烷磷酸酯(WO 91/08213)。为制备甲基膦酸酯寡聚核苷酸需要合成特别的单体。与之相比，可以用传统亚磷酰胺或H-膦酸酯来合成硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，在此情况下可以在寡聚核苷酸合成之中或者之后通过使用与三价H-膦酸酯或与膦酸三酯进行反应的特殊试剂直接将所述硼烷或硫修饰引入。尽管所有这些方法都形成经修饰的寡聚核苷酸，但为此所需要的合成化学并不允许在寡聚核苷酸合成时在所述寡聚核苷酸链的磷酸骨架上直接引入能以此方式被检测到的标记或官能团。
Baschang，G.，和Kvita，V.，Angewandte Chemie 85(1)(1973)43-44描述了核苷酸磷酸三酯与叠氮化物诸如甲基磺酰基叠氮化物进行反应制备三烷基(芳基)酰亚胺磷酸酯，然而其却是不稳定的和易分解的。
Nielsen，J.，和Caruthers，M.H.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)6275-6276描述了在烷基叠氮化物存在下带有2-氰基-1，1-二甲基乙基保护基的脱氧核苷亚磷酸酯的反应。此外，作者建议该原理适用于制备在磷酸残基上进行修饰的核苷酸而无需说明利用所公开的具有特别优势的方法制备了何种类型的修饰。特别地，作者建议了烷基残基的引入。
WO 89/091221公开了N-烷基亚磷酰胺或其他在至少一个磷酸残基上用N-烷基取代的寡聚核苷酸，它们是在合适的烷基胺的存在下通过用碘氧化核苷亚磷酸酯(带有保护基团)而制备的。
WO 03/02587公开了经修饰的寡聚核苷酸的制备，其中通过胺化将H-磷酸酯转变为氨基磷酸酯。
因此，所有这些公开描述了含有氨基磷酸酯替代磷酸残基的分子的制备。然而，由于胺基在酸性环境中质子化并随之被水取代，因此含有氨基磷酸酯的分子易水解。
此外，WO 01/14401提出了核苷酸结构单元或寡聚核苷酸，其中磷酸残基被N-ClO3、N-NO2或N-SO2R取代。根据WO 01/14401的教导，这些物质可以通过将脱氧核苷的游离羟基与氨基膦酰氯在嘧啶的存在下进行反应而制备。然而，该类型的制备复杂，耗时并且不适用于核苷酸或寡聚核苷酸的例行合成。
因此，形成本发明的基础的技术性目的是制备经改进的标记寡聚核苷酸和提供其制备的简单方法。


发明内容
因此本发明涉及化合物，其优选为至少含有一次以下结构的寡聚核苷酸
其中A表示核苷酸或核苷酸链的5′端，或者其表示与固相相连的连接子，以及 B表示核苷酸或核苷酸链的3′端或者其表示连接子 D是OH或CH3，以及 Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
所述电子受体Acc优选地选自包括以下的组 - -CN， - -SO2-R′，其中R′含有至少一个氨基取代的烷基，任选地取代的芳基或任选地取代的杂环， - 和缺电子六元N+-杂环，其中至少一个氮原子被烷基化并位于邻位或对位，并且其中这些杂环可以任选地以R取代。
特别优选的寡聚核苷酸，其中的R或R′单独或者与所述电子受体一起含有可检测单元或官能团。
这些寡聚核苷酸是根据本发明的方法制备的，该方法的特征在于具有以下化学结构的三价磷衍生物
其中E表示或者甲基或者受保护的羟基， 其中A表示核苷酸或核苷酸链的5′端或者表示与固相相连的连接子和 其中B表示核苷酸或核苷酸链的3′端或表示连接子， 与具有以下结构的叠氮化物反应， N＝N＝N-Acc 其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
所述电子受体Acc优选地选自包括以下基团的组 - -CN，-SO2-R - 和缺电子六元N+-杂环，其中至少一个氮原子被烷基化并位于邻位或对位，并且其中这些杂环可以任选地以R取代。
在制备本发明的寡聚核苷酸的具体实施方式
中 a)3′亚磷酰胺首先与新生成的寡聚核苷酸链的5′OH端进行反应并随后 b)与具有以下结构的叠氮化物反应 N＝N＝N-Acc 其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
其中R含有可检测单元或官能团的方法是特别优选的。
以此方式制备的本发明的寡聚核苷酸可用于其中需要任何形式的杂交对象尤其是衍生化的或者标记的杂交对象的所有应用。
特别地，这些寡聚核苷酸可用作检测某些标靶序列的杂交探针。
另一潜在用途涉及使用根据本发明进行修饰的寡聚核苷酸以反义寡聚核苷酸或siRNA的形式阻止基因表达。

具体实施例方式 本发明的基本思路 本发明的目的是以简单的方式制备其中含有经修饰的磷酸残基以及因此也优选含有可检测标记的核苷酸和寡聚核苷酸。
本发明的中心思路与如下相关，即由三价磷原子开始并使其与试剂按照形成稳定磷酸酯模拟物的方式进行反应。为此目的，根据本发明，含有至少一个带有保护基团的羟基的磷原子与具有结构N＝N＝N-Acc的叠氮化物反应，其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。这导致形成了五价磷原子，其中强吸电子性电子受体基团通过N原子与之共价键联。相对比于现有技术已知的氨基磷酸酯化合物，该基团确保了以此方式制备的化合物是共振稳定的并且不易被水解。
该本发明的根本思路可应用于其中形成三价磷作为中间体的所有方法。
在采用亚磷酰胺的传统的寡聚核苷酸合成中，含有三价磷原子的膦酸三酯形成为中间产物。第一和第二酯键表示核苷之间的键。所述磷原子通过第三酯键连接到受保护的羟基诸如例如β-氰基乙氧基。替代用碘进行氧化，根据本发明所述新生成的寡聚核苷酸随后能与适合的叠氮化物在以下过程中进行反应通过在切割氮的同时将-N-Acc共价键联至磷原子从而将所述三价磷原子氧化为五价原子。
寡聚核苷酸合成可继续按照现有技术已知的进行。获得稳定的寡聚核苷酸链作为最终产物，其在一个或多个核苷酸间磷酸残基上以几乎任意方式进行了修饰。
定义 在本发明的范围内，一些所使用的术语定义如下 反应性基团指能在合适的条件下与其他分子反应并同时形成共价键的分子基团。反应性基团的例子有羟基、氨基、巯基、肼基、羟氨基、二烯基、炔基和羧酸基团。
保护基团是指能与一个分子的一个或多个反应性基团反应使得，作为多步合成反应的部分，仅有一个特定的非保护的反应性基团能与所需的反应对象进行反应的分子。经常用于保护羟基的保护基团的例子是β-氰基乙基、三烷基硅基和烯丙基。用于保护氨基的保护基团有三氟乙酰基和芴甲氧羰基(Fmoc)。其他可能的保护基团总结在标准教科书中(Greene，T.W.，Protective groups in organic synthesis.Wiley IntersciencePublications John Wiley&Sons(1981)New York，Chichester，Brisbane，Toronto；Souveaux，E.，Methods in Mol.Biology，Vol.26，Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press，Totowa，NJ，1994，Chapter 1，ed.S.Agrawal)。
连接子是指长度为1～30个碳原子的碳链。这样的连接子链中也可以附加地含有一个或多个氮、氧、硫和/或磷原子。连接子也可以是支化的例如也可以是枝状的。连接子将核苷酸或核苷酸链与任选地被保护基团保护的可检测单元或反应性基团连接起来。
可检测单元可理解为是指利用分析方法所能检测到的物质。例如它们可以是能被质谱、免疫学或利用NMR检测到的单元。特别地，可检测单元也可以是能被光学方法诸如荧光和UV/VIS光谱检测到的物质，诸如荧光素、若丹明和金颗粒。它们也包括嵌入剂和小沟结合物(minorgroove binder)，其也对融化行为产生影响并且其荧光由于杂交而发生变化。
亚磷酰胺是指含有三价磷原子的分子，其能够与核苷或核苷衍生物的5′端进行偶联。因此亚磷酰胺可用在寡聚核苷酸合成中。除用于链延长的(脱氧)核苷酸亚磷酰胺之外，也有带有标记的亚磷酰胺衍生物以类似的方法在寡聚核苷酸合成中或者结束时用以标记所述寡聚核苷酸(Beaucage，S.L.，Methods in Molecular Biology 20(1993)33-61，ed.S.Agrawal；Wojczewski，C.，等，Synlett 10(1999)1667-1678)。
与本发明相关，术语“寡聚核苷酸”不仅仅包括(脱氧)寡聚核糖核苷酸也包括含有一个或多个核苷酸类似物的寡聚核苷酸，所述核苷酸衍生物具有在磷酸骨架(诸如例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯)、糖(诸如2′-O-烷基衍生物、3′和/或5′氨基核糖、LNA、HNA、TCA)上的修饰或者具有经修饰的碱基诸如7-氮杂嘌呤(7-deazapurine)。就此而言，本发明也包括含有非核苷类似物的共轭体和嵌合体诸如PNA或其他生物聚合物例如肽。此外，本发明的寡聚核苷酸还可以含有一个或多个非核苷单元，例如位于每个位置的间隔子例如六乙二醇或Cn(n＝3.6)间隔子。
术语“电子受体”包括倾向于结合孤电子对的原子结构。其一种测量为Hammett常数。本发明涉及其中Hammett常数σp超过特定值0.30，优选为0.45并特别优选为0.60的具体实施方式
。
此外所述电子受体必须相容于寡聚核苷酸合成中的所有化学反应，即 -其应当不被碘氧化 -其必须对二氯乙酸和三氯乙酸为惰性和 -其必须对碱尤其是氨为惰性和 -其应当不与三价氨基磷酸酯反应。
满足这些条件的电子受体的例子是 -NO2、SO2-R、-CN、-CO-R、pyrinidinyl、吡啶基、哒嗪基、六氟苯基、苯并三唑基(Hansch，C.，等，Chem.Reviews 91(1991)165-195)。此外，这些受体也可以以烯基方式或者苯基方式与所述氮原子相连。
术语“取代”指被称之为被取代的结构含有位于任意位置的其他残基，该位置并未详细指明。术语“任选地取代的”指以此方式指代的结构包括具有其他残基或者不具有其他残基的实施方式。
术语“氨基取代的烷基”包括含有至少一个氨基的C1-C30直链或支链烷基，其中该氨基受保护或者通过连接子与可检测单元相连。
术语“六元N+-杂环”包括在sp2氮上烷基化的N-杂环，从而使得所述杂环的总电荷为正。其例子是吡啶鎓盐、嘧啶鎓盐和喹啉鎓盐。这些杂环在本领域中已知为缺电子的。
术语“核苷酸链”理解为含有通过磷酸酯部分而5′-3′相连的至少两个核苷残基的分子或分子的一部分。
本发明的化合物 本发明包括至少含有一次以下结构的任何化合物
其中 A表示核苷酸或核苷酸链的5′端，或者其表示与固相相连的连接子，以及 B表示核苷酸或核苷酸链的3′端或者其表示连接子。Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。此外，此残基必须相容于核苷酸合成中发生的所有化学反应，即 -其应当不被碘氧化 -其必须对二氯乙酸和三氯乙酸为惰性和 -其必须对碱尤其是氨为惰性和 -其应当不与三价氨基磷酸酯反应。
然而，起初本身并不相容的残基可通过使用本领域技术人员已知的保护基团转变为在寡聚核苷酸合成的化学条件下表现为惰性的衍生物。
本领域技术人员也应当理解的是所述寡聚核苷酸的-OH基团通常以去质子状态存在。
此外，本发明还包括具有以下结构的甲基膦酸酯
其定义如上。
在第一优选实施方式中，本发明的化合物是寡聚核苷酸。在这样的寡聚核苷酸中，A表示核苷酸或核苷酸链的5′端，和/或B表示核苷酸和核苷酸链的3′端。因此，A和B一起含有至少两个核苷酸残基。
根据所述寡聚核苷酸的目的用途，如上所描述的结构可以出现一次、两次、许多次或者甚至在存在于所述寡聚核苷酸中的所有磷酸酯基上出现。所述寡聚核苷酸内的磷酸残基是所谓的核苷间磷酸酯，因此 A表示第一核苷的5′端和 B表示所述核苷酸链内第二核苷的3′端。
此外，本发明的结构可以位于寡聚核苷酸的3′端或5′端。如果它们位于所述寡聚核苷酸的5′端，则 A表示所述核苷酸链的5′端和 B或者是任选地受保护的羟基或者是连接子，所述连接子可任选地含有可检测基团或另一反应性基团，并且能用以将可检测基团引入所述寡聚核苷酸。
如果所述电子受体含有也表示可检测基团的取代基，根据本发明存在的寡聚核苷酸可以在5′端带有两个标记。
如果本发明的结构位于核苷酸链的3′端，则 B表示所述寡聚核苷酸链的3′端和 A或者是羟基或者是与固相连接的连接子，其中所述固相优选为可控孔度玻璃诸如在例行核苷酸合成中作为起始材料的那些。
在本发明的寡聚核苷酸内的单个核苷可以含有任何类型的核苷或经修饰的核苷或核苷衍生物。所述糖单元通常为对于DNA寡聚核苷酸而言是脱氧核糖或者对于RNA寡聚核苷酸而言是核糖。在本发明的寡聚核苷酸中含有的核碱基可以是天然碱基诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷及其衍生物或者所谓的通用碱基诸如硝基吲哚。本发明的寡聚核苷酸可含有任何通过酰胺键与各自的磷酸酯相连的电子受体。特别地，可以采用以下的电子受体基团 a)-CN， b)-SO2-R′，其中R′含有至少一个具有氨基取代的烷基，任选地取代的芳基或任选地取代的杂环， c)缺电子六元N+-杂环，其中至少一个氮原子被烷基化并位于邻位或对位，并且其中这些杂环可以任选地以R取代。
本发明还明确地包括SO2-R′的实施例，其中R′是氨基取代的烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂环。
在本发明的寡聚核苷酸中所有所述的电子受体的存在，导致形成可应用于各种广泛用途的经修饰的寡聚核苷酸。然而，含有任何有机基团R的所有电子受体是特别令人感兴趣的，这是因为，在本申请所描述的合成方法的范围内，它们使之能以简单的方式制备含有任何有机残基的经修饰的寡聚核苷酸。
因此本发明也特别涉及其中电子受体以残基R取代的寡聚核苷酸，所述以残基R取代的电子受体含有可检测单元作为R或者作为另外一种选择，含有官能团作为R，通过后标记在所述寡聚核苷酸合成之后可以将可检测基团与之偶联。作为另外一种选择，本发明还包括其中电子受体为可检测单元的一部分的实施方式。作为另外一种选择，所述残基R自身可以是可检测单元或官能团。
如此标记的寡聚核苷酸可有利地用于分子生物学中多种不同的应用，诸如在实时PCR中。所述可检测标记优选为荧光染料或荧光猝灭分子。相应的可以用作可检测单元的染料和分子对本领域技术人员而言是公知的。并不限制本发明的保护范围的这些染料和分子的例子是荧光素、若丹明、青色素、羰花青和偶氮和聚偶氮化合物。
本发明还涉及具有以上所述结构的实时PCR探针，其中至少一个荧光标记通过酰胺/电子受体基团的方式与所述寡聚核苷酸链的磷酸酯原子相连。这样的探针的例子是FRET杂交探针(WO 97/46707)或者所谓的单标记探针(WO 02/14555)。就此而论，特别优选其中在核苷间磷酸残基上具有根据本发明的内部修饰的寡聚核苷酸探针。
就此而论，本发明还特别涉及其中含有两个可检测单元的双标记寡聚核苷酸。这样的探针的例子是TaqMan探针(US 5,804,375)和分子信标(molecular beacons)(US 5,118,801)。就此而论，本发明涉及其中第一荧光标记通过酰胺/电子受体基团的方式与所述寡聚核苷酸链的核苷间磷酸酯原子相连，及第二检测单元存在于所述寡聚核苷酸的5′端或3′端的双标记寡聚核苷酸。具有这种标记的分子及它们的制备方法为本领域技术人员所公知。
在另一方面，本发明涉及具有以下结构的化合物
其中A表示与固相相连的连接子， B表示优选带有受保护的反应性基团或可检测单元的连接子 E或者是甲基或者是受保护的羟基， Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
至于B，所述优选的受保护的反应性基团是二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的羟基。至于E，所述优选的保护基是β-氰乙基。
这样的化合物可以用作寡聚核苷酸合成的起始材料，其中下一个氨基磷酸酯与所述化合物的剩余羟基反应。此外，在A表示具有额外臂的三官能连接子时，可能在其3′端制得具有双标记的寡聚核苷酸，其特征在于一个标记通过所述Acc取代基引入，而第二个标记通过与所述连接子相连的其他部分引入。
本发明的寡聚核苷酸的制备 本发明还涉及制备经修饰的寡聚核苷酸的方法，并且特别涉及制备如上描述的寡聚核苷酸的方法。
一般而言，本发明涉及制备经修饰的寡聚核苷酸的方法，所述经修饰的寡聚核苷酸的方法的特征在于具有以下化学结构的三价磷衍生物三价磷衍生物，
其中，E表示或者甲基或者受保护的羟基，优选为受β-氰乙基保护 A表示核苷酸或核苷酸链的5′端或者表示与固相相连的连接子和 B表示核苷酸或核苷酸链的3′端或表示连接子， 与具有以下化学结构的叠氮化物进行反应， N＝N＝N-Acc 其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
特别优选β-氰乙基、甲基、烯丙基或甲硅烷基作为保护基团。作为另外一种选择，根据本发明也可以制备甲基膦酸酯，其中E是CH3。
根据本发明，所述叠氮化物可含有任何电子接受基团。这些基团然后与相应的磷原子相连。特别地，可以使用以下电子接受基团 a)-CN， b)-SO2-R， c)缺电子六元N+-杂环，其中至少一个氮原子被烷基化并位于邻位或对位，并且其中这些杂环可以任选地以R取代。
本发明的方法也可以例行地特别用于传统寡聚核苷酸的合成中。因此，本发明也涉及具有以下步骤的方法 a)将3′亚磷酰胺与新生成的寡聚核苷酸链的5′OH端进行反应 b)与具有以下结构的叠氮化物反应 N＝N＝N-Acc 其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
在此情况下，所述新生成的寡聚核苷酸链的5′OH端可以是5′末端核苷酸的5′端或者是与CPG相连的连接子的游离OH基团。
传统寡聚核苷酸化学开始于反应性固相载体材料。固相载体材料是指聚合性物质，形成含有反应性基团的固相，其上可以固定其他分子。在寡聚核苷酸合成的情况下，所述载体材料通常是具有规定孔径的有孔玻璃珠，所谓的可控孔度玻璃颗粒(CPG)。作为另外一种选择，也可能采用聚苯乙烯残基和其他有机聚合物和共聚物(Ghosh，P.K.，等，J.Indian.Chem.Soc.75(1998)206-218)。如果所述寡聚核苷酸在合成后应当保持固定在所述基材上，玻璃以及半导体芯片也能用作所述固相载体材料。这样的固相载体材料是商售可获得的。
所述载体可以以所谓的含有可切割键的连接子基团的方式与受保护基团诸如DMT(二甲氧基三苯甲基)保护的末端反应性羟基残基相连。含有可切割键的连接子基团是指位于所述三官能间隔子和所述固相载体材料之间并通过简单化学反应能被切割的那些基团。它们可以是含有可切割酯键的琥珀酰基或草酰基或其他连接子基团。其他连接子基团为本领域技术人员已知(Ghosh，P.K.，等，J.Indian.Chem.Soc.75(1998)206-218)。
这些连接子基团对于采用所述载体材料从而合成在所述合成结束后将存在于水溶液中的寡聚核苷酸而言是必需的。相反，如果所述核苷酸在合成结束后应当保留在所述载体材料表面以制造核酸阵列(US5,624,711，Shchepinov，M.S.，等，Nucl.Acids.Res.25(1997)1155-1161)时，可切割连接子基团并非必须，更优选为不可切割的连接子基团。
为引入本发明的结构的寡聚核苷酸合成的详细内容如下 在通过酸处理脱掉所述DMT保护基之后形成反应性羟基，在其上可形成3′-5′方向的链延长。然后，带有DMT保护基和其他本领域已知的碱基保护基的(脱氧)核糖核苷的3′亚磷酰胺衍生物，在四唑的存在下，随后在所述5′端与每个不含有所述DMT保护基的反应性基团偶联。在该方法中形成含有三价磷原子的中间体作为中间产物，其通过反应与连接在一起的核苷中的每一个形成酯键，与在所使用的亚磷酰胺中已经存在的受保护的羟基形成第三酯键。例如可以由β-氰乙基、甲基、烯丙基或甲硅烷基形成的保护基随后在所述寡聚核苷酸合成结束之后用氨进行切割，在所述过程中碱基保护基和与所述CPG的连接子也被切割。
代替利用碘进行氧化，根据本发明，所述新生成的寡聚核苷酸与具有以下结构的叠氮化物在将磷酸酯模拟物引入所述核苷酸链的位置处进行反应 N＝N＝N-Acc 其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。所描述的合成化学使之能基本上引入任何残基R，特别是引入任何类型的荧光染料。
Acc叠氮化物诸如酰叠氮化物和磺酰叠氮化物的制备简单并且已长期被人所知(Review

，S.，等，Angewandte Chemie 117(2205)5320-5374，3.4 and 3.5.2)。它们优选为采用叠氮化钠由酰氯或磺酰氯或者采用亚硝酸由酰肼制得。
染料磺酰叠氮化物也例如用在染色方法中(例如DE 19650252)。通过使叠氮化钠与溴化氰在乙腈中反应可以简便地制得叠氮化氰(McMurry，J.E.，等，J.Organic Chemistry 38(16)(1973)2821-7)。通过用叠氮化物亲核取代卤素或者由杂芳基酰肼(heteroaryl hydrazine)可以制得杂芳基叠氮化物。前提条件为吸电子的氮相对于叠氮基处于对位或邻位，这是由于如此才能形成共振稳定的磷酸酯模拟物。就此而论，邻位或对位N-烷基吡啶叠氮化物是特别适合的。一些酰叠氮化物、磺酰叠氮化物和吡啶叠氮化物也是商售可得的。
另外，本发明还涉及其中所述残基R是可检测单元的如上所述的方法。R优选为荧光染料或荧光猝灭分子。
本发明的某些实施方式涉及双标记寡聚核苷酸探针的制备，其中一个标记优选为根据本发明的方法引入所述寡聚核苷酸内部，而另一标记根据现有技术已知的方法优选在5′或3′端引入所述寡聚核苷酸。
在5′末端核苷酸的核糖的5′位置的5′标记的情况下，根据传统方法采用染料标记的亚磷酰胺在所述寡聚核苷酸合成结束时进行所述引入(Beaucage，S.L.，Methods in Molecular Biology 20(1993)33-61，S.Agrawal Publishers)。
通过除所述三苯甲基化羟基之外已经含有可检测标记的商售可获得的CPG作为反应性固相载体实现所述3′端的标记。在切割所述DMT保护基之后，可以在目前处于游离的羟基开始标准寡聚核苷酸合成。
作为另外一种选择，对于更多5′或3′标记可以采用现有技术已知的用于后标记的方法(US 5,002,885，US 5,401,837)。
本发明也涉及在所述标准寡聚核苷酸合成之前制备的本发明的合成的中间体。在此情况下，优选依然连接于所述固相并且没有脱保护和可以含有碱性间隔子基团的中间体。优选本领域技术人员所熟悉的CPG作为磷酸酯CPG用于所述制备，这是由于3′磷酸化寡聚核苷酸在所述寡聚合成后形成。在去三苯甲基化之后，所述磷酸酯CPG与间隔子亚磷酰胺在活化剂存在下进行反应所述形成的三价磷中间体随之与含有可检测单元的Acc叠氮化物反应。这些合成中间体可被保存并用作通用3′标记的三官能CPG。
本发明还涉及亚磷酰胺的合成，所述亚磷酰胺含有受保护的N-Acc基团以替代例如β-氰乙基保护的氧从而使之能合成N-Acc-硫代磷酸酯或二-N-Acc-磷酸酯模拟物。这样的合成策略适用于个别情况，例如制备含有P＝N-CN的寡聚核苷酸。
在能与叠氮化物进行反应的甲基膦酸酯的合成中也形成了三价磷中间体。甲基亚磷酰胺也是商售可得的。
在用于标准寡聚核苷酸以及特别用于类似物的反向合成策略中，例如用于N3′-＞P5′寡聚核苷酸的合成中(EP 1 155 027)，也形成了能根据本发明与叠氮化物反应的含有三价磷的中间体。相应的亚磷酰胺是商售可得的。
应用范围 本发明的合成策略使之能制备各种在磷酸骨架上进行修饰的寡聚核苷酸。所述修饰的程度，所述修饰的多样性和电荷由其预期用途所决定。
例如，本发明的寡聚核苷酸可用于与天然DNA和RNA进行杂交以例如捕获或检测含有P-N＝Acc磷酸酯模拟物的寡聚核苷酸自身或者与普通磷酸酯形成的嵌合体也可成功地在扩增反应中用作引物。
这样的寡聚核苷酸探针是各种应用的基础，例如实时PCR、FISH、印迹技术、测序(Jung，P.M.，等，Nucleic Acid Amplification TechnologiesBioTechniques Books，Div.Eaton Publishing(1997)Editors H.H.Lee，S.A.Morse，O.Olsvik；Bustin，Stephen A.and Nolan，Tania.Chemistries.IULBiotechnology Series(2004)，5(A-Z of Quantitative PCR)，215-278)。
根据本发明标记的寡聚核苷酸特别适用作各种实时PCR形式的荧光标记探针 双标记探针通常用于所述分子信标形式(US 5,118,801)和TaqMan探针形式(US 5,210,015、US 5,538,848和US 5,487,972、US 5,804,375)，其中一个标记优选为内部引入，而第二标记位于所述探针的5′或3′端。特别有利的是基于亚磷酰胺化学采用本发明的方法作为寡聚核苷酸合成的部分进行所述探针的内部标记。在所述探针的5′或3′端的第二可检测单元也可以通过所描述的本发明方法中的一种或者利用现有技术已知的方法引入到相应的探针中。
5′-端标记的探针和3′-端标记的探针通常用于FRET杂交探针形式(Matthews，J.A.，and Kricka，L.J.，Analytical Biochemistry 169(1988)1-25)，(Bernard，P.S.，等，Analytical Biochemistry 255(1998)101-107)。在此情况下，特别有利的是基于亚磷酰胺化学采用本发明的方法作为寡聚核苷酸合成的部分实现所述探针的5′-标记。
本发明使之能以简单的方式制备官能化寡聚核苷酸，其中所述电子受体Acc用含有官能团的残基R进行修饰，所述官能团受到对于所述寡聚合成而言合适的保护。如果该残基是氨基或羟氨基，则它们能用于例如通过在环氧修饰的表面上定点制造寡聚核苷酸阵列(Seliger，H.，等，Current Pharmaceutical Biotechnology 4(2003)379-395)。相比而言，巯基能用于在金表面或者金颗粒上的固定。在此情况下，当以简便的方式引入数个巯基以实现捕获探针在所述金表面的稳定结合时，根据本发明是特别有利的。如果受保护的OH基团作为官能团引入，则也可以制备支化的或者枝化的聚核苷酸。
这些官能团尤其是氨基也可以通过将其与染料的活性酯在所述寡聚合成之后进行反应从而用以制备标记寡聚核苷酸。然而，更有利的是根据本发明的方法在寡聚核苷酸合成中直接引入可检测单元。
由于本发明的寡聚核苷酸能耐受核酸酶，因此它们适用于本领域技术人员已知的各种细胞培养试验以阻止基因表达，即本发明的寡聚核苷酸用作反义寡聚核苷酸或者用作siRNA活性成分的一部分。在此情况下，所述修饰可经过选择使得它们有助于细胞吸收和/或改善与目标核酸的结合。随后通过Northern印迹分析、单步或两步实时RT-PCR方法或通过杂交到合适的微阵列上的方法可以监测相应目标基因表达的阻断。
此外，本发明的寡聚核苷酸可用作可检测单元和蛋白质之间的亲水连接子或者作为明确质量的标记。此外，能建立起核酸适体物质库，在此情况下利用不同的磺酰叠氮化物和酰叠氮化物或杂芳基叠氮化物在所述合成中可以将不同的残基R引入到所述磷酸酯上。随后可以测试所述库与蛋白质或其他生物分子的结合。优于现有技术的核酸适体的一点是本发明的方法使之能制备大量的不同附加的修饰，并且能以简便的方式进行测试。
通过以下实施例、公开和序列方案更详细地阐述本发明，其保护范围源自于专利权利要求。所描述的方法应当理解为实施例，即使在进行修改之后其依然描述了本发明的目的。
提供以下实施例和序列表以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中阐明。应当理解可以在所阐述的过程中进行修改而不背离本发明的精神。
实施例 实施例1 经修饰的dT(P(＝NSO2PhNHAc)dT的合成 所述二聚体合成在ABI 394合成仪上以10μmol的规模进行。商售可得的dT CPG载体用作所述固体载体。所有用于标准合成的化学品均获得自Glen Research。
含有碘的传统氧化剂溶液被0.1M的在无水乙腈中的p-NAc苯基磺酰叠氮化物溶液所代替。所述氧化时间延长至16分钟。
在室温下，使用33％氨水耗时2小时将产物从所述载体上切割下来，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通过反相色谱进行分离。色谱缓冲液A0.1M在水中的乙酸三乙铵溶液，pH 6.8，缓冲液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙铵溶液，梯度2分钟0％B～100％B，在45分钟内。洗脱液的UV吸收在260nm处进行测量。在所需要的产品中含有主要色谱洗脱份。在真空离心机中除去溶剂。所述残留物溶解在再蒸馏水中并在真空中再次蒸发。该过程重复三次。所述残留物随后溶解在再蒸馏水中并冻干。
1H NMR(Bruker DPX 300)在D2O中7.82d[2H，aryl]，7.56d[2Haryl]，7.47s[1H，C6-H]，7.40[1H，C6-H]，6.21m[1H，H1′]，6.21m[1H，H1′]，6.07m[1H，H1′]，4.38m[1H，H3′]， 4.10[m，4H，H4′，H5′]2.38-2.24m[4H，H2′]，2.22[3H，CH3]，2.16[3H，CH3]，2.14[3H，CH3] 31P NMR(Bruker DPX 300)在D2O中2.14 质谱(ESI-MS)计算值742.66测量值[M-H]741.73 实施例2 T(P(＝NSO2PhNHAc)T9寡聚核苷酸的合成 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成仪上以1μmol的规模进行。商售可得的dT CPG载体用作所述固相。所有用于标准合成的化学品均获得自Glen Research。
在第一合成循环中，含有碘的氧化剂被0.1M的在无水乙腈中的p-NAc苯基磺酰叠氮化物溶液所代替。所述氧化时间延长至16分钟。其余dT亚磷酰胺的连接根据标准方案进行。
在室温下，使用33％氨水耗时2小时将产物从所述载体上切割下来，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通过反相色谱进行分离。色谱缓冲液A0.1M在水中的乙酸三乙铵溶液，pH 6.8，缓冲液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙铵溶液，梯度2分钟0％B～100％B，在45分钟内。洗脱液的UV吸收在260nm处进行测量。在所需要的产品中含有主要色谱洗脱份。在真空离心机中除去溶剂。所述残留物溶解在再蒸馏水中并在真空中再次蒸发。该过程重复三次。所述残留物随后溶解在再蒸馏水中并冻干。
质谱(ESI-MS)计算值3176.25测量值[M-H]3176.0 实施例3 荧光素标记的寡聚核苷酸的合成 5′AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC荧光素-3′，其中每个P＝O被P＝N-pPh-NAc取代(SEQ.ID.NO4) 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成仪上以1μmol的规模进行。商售可得的LightCycler荧光素CPG(Roche Applied Science)用作所述载体材料。所有用于标准合成的化学品均获得自Glen Research。使用来自Proligo的带有叔丁基苯氧基-乙酰保护基的亚磷酰胺(已知为“tac”或“Expedite”单体)。
标准方案用于所述合成，其中所述含有碘的氧化剂被0.1M的在无水乙腈中的p-NAc苯基磺酰叠氮化物溶液所代替。所述氧化时间延长至16分钟。
在室温下，使用33％氨水耗时2小时将产物从所述载体上切割下来，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通过反相色谱进行分离。色谱缓冲液A0.1M在水中的乙酸三乙铵溶液，pH 6.8，缓冲液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙铵溶液，梯度2分钟0％B～100％B，在45分钟内。洗脱液的UV吸收在260nm处进行测量。在所需要的产品中含有主要色谱洗脱份。在真空离心机中除去溶剂。所述残留物溶解在再蒸馏水中并在真空中再次蒸发。该过程重复三次。所述残留物随后溶解在再蒸馏水中并冻干。
质谱(ESI-MS)计算值11839测量值[M-H]11839.9 实施例4 嵌合寡聚核苷酸的合成，其中在特定的位置P＝O被P＝N-Acc取代 所述合成在ABI 394合成仪上以1μmol的规模进行。为了不必在合成中更换氧化剂，所述合成程序经修改使得N3-Acc溶液可以装在额外的碱基位置上。由于所述程序设定的限制，所述叠氮化物与所述活化剂一起反应。这对所述修饰没有影响。所述N3 Acc与所述三价磷中间体的反应时间为5分钟。
所有用于标准合成的化学品均获得自Glen Research。使用来自Proligo的带有叔丁基苯氧基-乙酰保护基的亚磷酰胺(已知为“tac”或“Expedite”单体)。如上所述进行纯化。
载体荧光素CPGN3-Accp-NAc苯基磺酰叠氮化物(SigmaAldrich)。
合成了以下各自具有相同的SEQ ID NO4的探针并随后用质谱进行分析 pl是P＝N-pPh-NAc模拟物 实施例5 本发明的3′-末端标记 a)二甲基氨基偶氮苯磺酰叠氮化物的制备 0.71g(2.19mmol)二甲基氨基偶氮苯磺酰氯溶解在10ml丙酮中。缓慢滴加142mg(2.19mmol)叠氮化钠在2ml水中的溶液，同时在冰上冷却并搅拌。在0℃下搅拌2小时并随后在室温下搅拌2小时。然后将32mg叠氮化钠(0.5mmol)在500μl水中的溶液加入并在室温下搅拌1小时。(TLC硅胶CH2Cl2)。然后将200ml二氯甲烷加入到所述悬浮液中并过滤。滤出物用水晃动两次，用5％碳酸氢钠溶液晃动一次，然后用水晃动两次。所分离出的有机相用硫酸钠干燥。在浴温＜20℃下，在旋转蒸发仪上蒸馏除去溶剂。残留物悬浮在2ml乙腈中并过滤。该残留物用乙醚洗涤。
粗产率为280mg。所述叠氮化物直接用在DNA合成仪上或者用以制备载体而无需进一步纯化。
b)用于寡聚核苷酸合成的二甲基氨基偶氮苯磺酰载体的制备 CPG-1caa-NHC(＝O)-CH2-CH2-C(＝O)-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-P(O-CH2-CH2-CN)(＝N-SO2-Ph-p-N＝N-Ph-p-NMe2)-O CH2-CH2-CH2-ODMTr 1.2g含磷连接CPG装样49μmol/g装在Schlenk frit上并在氩气下用无水乙腈进行洗涤。然后用0.1M在二氯甲烷中的二氯乙酸进行洗涤直至所述滤出物为无色。随后，用无水乙腈进行彻底的洗涤。随后，用2ml 0.25M在乙腈(活化剂)中的二氰基咪唑洗涤并立即加入2ml 0.1M所述间隔子C3亚磷酰胺溶液。然后将所述悬浮液放置3分钟。在氩气压力下进行过滤。然后，用2ml活化剂进行洗涤，并再次用2ml活化剂洗涤并立即加入2ml 0.1M所述间隔子C3亚磷酰胺溶液。然后，所述制备持续12分钟。在氩气压力下过滤除去溶剂，加入2ml 0.1M的在二氯甲烷中的二甲基氨基偶氮苯磺酰叠氮化物溶液，并将所述混合物放置15分钟。最终用100ml二氯甲烷洗涤经修饰的CPG，随后用100ml无水乙腈洗涤，并在真空下干燥。
c)采用所述二甲基氨基偶氮苯磺酰载体进行寡聚核苷酸合成 5′荧光素-GCA CCA GAT CCA CGC CCT TGA TGAGC-O-CH2-CH2-CH2-O(O2)P(＝N-SO2-Ph-p-N＝N-Ph-p-NMe2) 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成仪上以1μmol的规模进行。得自实施例5a的二甲基氨基偶氮苯磺酰-CPG用作载体材料。6-羧基荧光素亚磷酰胺(Glen Research，Report No.10(GR10-1)(1997)1-12)用于所述5′-标记。
所有其他用于标准合成的化学品获得自Glen Research。如实施例4所述，使用来自Proligo的带有叔丁基苯氧基-乙酰保护基的亚磷酰胺(已知为“tac”或“Expedite”单体)。根据标准方案进行合成。所述切割和纯化也如4中所述进行。
质谱(ESI-MS)计算值8973测量值[M-H]8973.1 实施例6 实时PCR和熔化曲线分析 在LightCycler

仪器(Roche Diagnostics GmbH)上进行因子VDNA的定量实时PCR以及随后的熔化曲线分析以分析磷酸酯模拟物对杂交的影响。引物与一对荧光素/LightCycler红640 FRET杂交探针联合使用。所述引物和5′LightCycler红640探针保持恒定。来自实施例4的在磷酸酯上进行修饰的各种3′荧光素探针和用作参照的未经修饰的荧光素探针被用作FRET供体探针。评估了对交叉点和对熔点的影响，所述交叉点为扩增效率的量度。
按如下制备用于因子V DNA片段的扩增的20μl的PCR反应混合物。
含有因子V野生型基因和突变体的106份拷贝的质粒(Gene BankAccession No.M_014335) 13mM MgCl2 500nM各自具有SEQ ID NO1和2的引物 200nM各自具有SEQ ID NO3和4的FRET杂交探针 依照制造商说明书，LightCycler DNA Master Hyb探针试剂盒(Roche Applied Science，Cat.No.2158825)用于所有其他PCR成分。
以下序列用作引物和探针 SEQ ID NO1 正向引物 5′GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A SEQ ID NO2 反向引物 5′TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA SEQ ID NO3 FRET受体探针 5′LC-红640 AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGTCCT ATT SEQ ID NO4 FRET供体探针 5′AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-荧光素 以下温度程序用于在所述LightCycler 1.2(Roche Applied Science)上的扩增。

采用二阶导数阈值法对超过45次循环进行实时检测，其中在专用于所述LigthCycler红640发射的检测通道(在640nm)测量荧光信号，并采用算术背景修正模式对初始信号进行归一化。
在所述扩增后，根据LightCycler手册(Roche Applied Sciences)的说明进行熔化曲线分析。采用以下温度程序
如上在640nm通道上对绝对荧光信号进行测量，并随后由此计算一阶导数。
在下表列出了交叉点作为采用不同经修饰的供体探针的扩增效率的量度。所述表也列出了用于所述因子V野生型序列和所述因子V突变序列的各种供体探针的测量熔点。
pl是P＝N-pPh-NAc模拟物 如表中所示，所述交叉点并未由于根据本发明引入修饰而受到明显影响，即所述PCR效率未变。
此外，在所述一倍或两倍修饰探针的情况下没有发现对所测量的熔点的影响。而且，多重修饰探针仅仅表现出不超过4℃的熔点的适度变化，因此保持了配对错误识别的能力。
实施例7 实时PCR和熔化曲线分析 a)丽丝胺叠氮化物(＝若丹明B)的制备 195mg(3.0mmol)叠氮化钠在5ml水中的溶液在0℃下滴加到577mg(1mmol)硫代若丹明B酸氯化物在20ml丙酮中的溶液中。所述混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌6小时。将所述混合物转移到分液漏斗中并加入300ml水和300ml二氯甲烷。分离有机相并用100ml水洗涤两次。所述有机相用硫酸钠干燥。在旋转蒸发仪上蒸馏除去溶剂。残留物(140mg)无需进一步纯化而用于寡聚核苷酸合成。
b)SEQ ID NO3 FRET受体探针Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAGATT AGA AGT AGT CCT ATT-p的合成，p*＝P＝NS(O)2-若丹明-B 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成仪上以1μmol的规模进行。商售可得的磷连接CPG(Glen Research)用作载体材料。所有用于标准合成的化学品获得自Glen Research。使用来自Proligo的带有叔丁基苯氧基-乙酰保护基的亚磷酰胺(已知为“tac”或“Expedite”单体)。
标准方案(三苯甲基脱掉)用于所述合成，其中在最后一个循环中所述氧化剂被0.1M在无水乙腈中的丽丝胺叠氮化物溶液所代替，并且氧化时间延长至16分钟。
在室温下，使用33％氨水耗时2小时将产物从所述载体上切割下来，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通过反相色谱进行分离。色谱缓冲液A0.1M在水中的乙酸三乙铵溶液，pH 6.8，缓冲液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙铵溶液，梯度2分钟0％B～100％B，在45分钟内。洗脱液的UV吸收在260nm处进行测量。在所需要的产品中含有主要色谱洗脱份。在真空离心机中除去溶剂。所述残留物溶解在再蒸馏水中并在真空中再次蒸发。该过程重复三次。所述残留物随后溶解在再蒸馏水中并冻干。质谱(ESI-MS)计算值11710测量值[M-H]11710.5。
c)实时PCR 为描述在实时PCR中的适用性，在LightCycler 2.0进行因子V DNA的实时PCR。引物与一对荧光素/丽丝胺FRET杂交探针联合使用，其中丽丝胺(若丹明B)用作FRET受体。记录定量曲线，并且cp值作为所述目标核酸的浓度的函数进行测定。
根据实施例6进行了对因子V DNA片段的104份拷贝扩增和106份拷贝扩增的实时PCR和熔化曲线分析。为此使用了未经进一步修饰的实施例6(SEQ ID NO4)的荧光素供体探针和实施例7b(SEQ ID NO3)的FRET受体探针。

在所述610nm检测通道对荧光信号进行测量。采用610/530背景修正模式对原始信号进行归一化。对于106份拷贝测得cp值为22，对于104份拷贝测得cp值为26。
所述野生型的熔点测定为64.69℃，而所述突变体的熔点测定为56.24℃(106份拷贝)。
实施例8 带有经修饰的引物的实时PCR 在LightCycler

仪器(Roche Diagnostics GmbH)上进行人类因子V DNA的定量实时PCR以分析磷酸酯模拟物对引物延长的影响。将P＝N-pPh-NAc模拟物引入用于人类因子V DNA扩增的引物对的不同位置。所述经修饰的引入根据实施例4进行制备。通过实施例3的反相色谱在带有三苯甲基的模式下完成纯化。通过用80％乙酸处理20分钟进行去三苯甲基化。
根据实施例6该引物与一对荧光素/LightCycler红640 FRET杂交探针联合使用。所述荧光素探针和5′LightCycler红640探针(Seq.Id.No3和4)保持恒定。测试了经修饰的或未经修饰的引物的各种组合。未经修饰的引物用作参照。评估了对交叉点的影响，所述交叉点为扩增效率的量度。
采用二阶导数阈值法对超过45次循环进行实时检测，其中在专用于所述LigthCycler红640发射的检测通道(在640nm)测量荧光信号，并采用算术背景修正模式对初始信号进行归一化。
如上在640nm通道上对绝对荧光信号进行测量，并随后由此计算一阶导数。在下表中列出交叉点作为使用不同经修饰的引物时扩增效率的量度。
pl是P＝N-pPh-NAc模拟物 如表中所示，所述交叉点并未由于在所述引物中根据本发明引入修饰而受到明显影响，这显示出即所述PCR效率几乎未变。
实施例9 含有吡啶鎓盐磷酸酯模拟物(pyridinium phosphatmimetikum)的荧光素标记的寡聚核苷酸的合成 根据SEQ.ID.NO4的寡聚核苷酸的合成在ABI 394合成仪上以1μmol的规模进行。商售可得的LightCycler荧光素CPG(Roche AppliedScience)用作所述载体材料。所有用于标准合成的化学品均获得自GlenResearch。使用来自Proligo的带有叔丁基苯氧基-乙酰保护基的亚磷酰胺(已知为“tac”或“Expedite”单体)。
所述合成使用实施例4的方案，其中在第二次循环中，0.1M的1，2，6-三甲基吡啶鎓盐4-叠氮化物(RareChem AQ N6 1054)在无水乙腈中的溶液用作氧化剂，并且所述氧化时间延长至16分钟。这形成含有以下结构的中间体
在室温下，使用33％氨水耗时2小时将产物从所述载体上切割下来，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通过反相色谱进行分离。色谱缓冲液A0.1M在水中的乙酸三乙铵溶液，pH 6.8，缓冲液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙铵溶液，梯度2分钟0％B～100％B，在45分钟内。洗脱液的UV吸收在260nm处进行测量。在所需要的产品中含有主要色谱洗脱份。在真空离心机中除去溶剂。所述残留物溶解在再蒸馏水中并在真空中再次蒸发。该过程重复三次。所述残留物随后溶解在再蒸馏水中并冻干。
质谱(Maldi-MS Applied Biosystems Voyager System 6327)计算值7641.32测量值[M-H]7639.59 实施例10 dA(P(＝NSO2PhNHAc)dT二核苷酸相比未经修饰的dAdT在不同温度和pH下的稳定性 根据实施例1合成并纯化dA(P(＝NSO2PhNHAc)dT。dAdT也根据实施例1进行合成，但使用标准氧化剂(在THF中的0.02 M碘)。
所述二聚体在不同pH值7.0、8.0和9.0的10mM Tris缓冲液中暴露于不同时间和温度下。样品在室温(大约24℃)下放置24小时，或者在95℃分别放置60分钟和16小时，在实验前后分别取出150μl的等分试样并将100μl体积注入HPLC中。
用Waters 2690分离模块在X-Bridge分析柱(2.5μm，4.6×50mm i.d.)通过反相HPLC对分解进行监测。使用Waters 2690检测器进行检测(260nm)。用95％梯度的乙腈以流速1.0ml/min泵入0.1M乙酸三乙铵(pH6.8)作为流动相。通过监测所述二聚体信号的保留时间(rt)(软件Millenium，Waters)并确定其是否有不同于所述核苷酸二聚体的保留时间的其他峰出现，来判定所述二聚体的分解率。结果列在下表中

这些未经修饰的二聚体在pH 7.0、8.0和9.0下，在室温下24小时稳定，在95℃下1小时稳定，在pH 7.0和pH8.0下，在95℃下16小时之后开始分解。所述经修饰的二聚体在pH 7.0、8.0和9.0下，在室温下24小时稳定，在95℃下1小时稳定，在pH 7.0下，在95℃下16小时之后开始分解。
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
F.Hoffmann-La Roche AG
<120>含有磷酸酯模拟物的多聚核苷酸
<130>23428 WO
<150>EP 05025499
<151>2005-11-23
<160>4
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>引物
<400>1
gagagacatc gcctctgggc ta22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>引物
<400>2
tgttatcaca ctggtgctaa 20
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>探针
<400>3
agggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt36
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>探针
<400>4
aatacctgta ttcctcgcct gtc 2权利要求
1.含有至少一次以下结构的化合物
其中A表示核苷酸或核苷酸链的5′端，或者其表示与固相相连的连接子，以及
B表示核苷酸或核苷酸链的3′端或者其表示连接子
D是OH或CH3，以及
Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基，并且，Acc选自由以下组成的组
(i)-CN，
(ii)-SO2-R′，其中R′含有至少一个氨基取代的烷基，任选地取代的芳基或任选地取代的杂环，
(iii)具有至少一个位于邻位或对位的烷基化N-原子的六元N+-杂环，所述杂环选自由吡啶鎓、嘧啶鎓和Chinolinium组成的组。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于R或R′单独或者与所述电子受体一起含有可检测单元或官能团。
3.如权利要求1～2所述的寡聚核苷酸，其特征在于A和B一起含有至少两个核苷酸残基。
4.制备经修饰的寡聚核苷酸的方法，其特征在于具有以下化学结构的三价磷衍生物
其中，E表示或者甲基或者受保护的羟基，
其中A表示核苷酸或核苷酸链的5′端或者表示与固相相连的连接子和
其中B表示核苷酸或核苷酸链的3′端或表示连接子，
与具有以下结构的叠氮化物进行反应，
N＝N＝N-Acc
其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基，并且Acc选自由以下组成的组
(i)-CN，
(ii)-SO2-R′，其中R′含有至少一个氨基取代的烷基，任选地取代的芳基或任选地取代的杂环，
(iii)具有至少一个位于邻位或对位的烷基化N-原子的六元N+-杂环，所述杂环选自由吡啶鎓、嘧啶鎓和Chinolinium组成的组。
5.如权利要求4所述的方法，包括以下步骤
a)将3′亚磷酰胺与新生成的寡聚核苷酸链的5′OH端进行反应
b)与具有以下结构的叠氮化物反应
N＝N＝N-Acc
其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基，并且Acc选自由以下构成的组
(i)-CN，
(ii)-SO2-R′，其中R′含有至少一个氨基取代的烷基，任选地取代的芳基或任选地取代的杂环，
(iii)具有至少一个位于邻位或对位的烷基化N-原子的六元N+-杂环，所述杂环选自由吡啶鎓、嘧啶鎓和Chinolinium组成的组。
6.如权利要求4～5所述的方法，其中R或R′是可检测单元。
7.如权利要求1～3所述的寡聚核苷酸作为杂交对象的用途。
8.如权利要求7所述作为杂交探针的用途。
9.如权利要求7所述在细胞培养实验中阻止基因表达的用途。
全文摘要
本发明涉及经修饰的寡聚核苷酸及其制备方法，其中所述寡聚核苷酸含有至少一次结构P＝N-Acc，其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体且R是任何有机取代基。
文档编号C07H21/00GK101312985SQ200680043667
公开日2008年11月26日 申请日期2006年9月12日 优先权日2005年11月23日
发明者D·海因德尔, D·克斯勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司