专利名称：：基于变异应答调制Toll样受体的免疫调节寡核苷酸(IRO)化合物的利记博彩app
技术领域：
：本发明概括地涉及免疫和免疫治疗领域，更具体地涉及免疫调节寡核苷酸(IRO)组合物和它们用于抑制和/或阻抑Toll样受体介导的免疫应答的用途。相关领域一既述Toll样受体(TLR)存在于免疫系统的许多细胞中，并且已经被证明涉及先天性免疫应答(Hornung,V.eta.l,(2002)J.Immunol.168:4531-4537)。在脊推动物中，此家族由称为TLR1至TLR10的十种蛋白质组成，已知它们识别来自细菌、真菌、寄生物和病毒的病原体相关性分子图式(Poltorak,a.etal.(1998)Science282:2085-2088;Underhill，D.M.，etal.(1999)Nature401:811-815;Hayashi,F.et.al(2001)Nature410:1099-1103;Zhang,D.etal.(2004)Science303:1522-1526;Meier,A.etal.(2003)Cell.Microbiol.5:561-570;Campos，M.A.etal.(2001)J.Immunol.167:416-423;Hoebe,K.etal.(2003)Nature424:743-748;Lund，J.(2003)J.Exp.Med.198:513-520;Heil,Retal.(2004)Science303:1526-1529;Diebold,S.S.,etal.(2004)Science303:1529-1531;Hornung,V.etal.(2004)J.Immunol.173:5935-5943)。TLR是哺乳动物识别和起始(mount)对于外源分子的免疫应答的关键手段，并且还提供将先天性和适应性免疫应答相关联的手段(Akira，S.etal.(2001)NatureImmunol.2:675-680;Medzhitov,R.(2001)NatureRev.Immunol.1:135-145)。还已经显示TLR在许多疾病(包括自身免疫病、传染病和炎症)的发病机理中发挥作用(Cook,D.N.etal.(2004)NatureImmunol.5:975-979)，并且使用适当的药物调节TLR介导的活化可提供用于疾病干涉(diseaseintervention)的方法。某些TLR位于细胞表面，探测胞外病原体并引发针对它们的应答；而其它TLR定位于细胞内部，探测胞内病原体并引发针对它们的应答。表l提供对TLR及其已知的激动剂的描述(Diebold，S.S.etal.(2004)Science303:1529-1531;Liew,F.etal.(2005)Nature5:446画458;HemmiHetal.(2002)NatImmunol3:196-200;JurkMetal.，(2002)NatImmunol3:499;LeeJetal.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:6646-6651);(Alexopoulou,L.(2001)Nature413:732-738)。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>已经显示在细菌DNA和合成DNA中存在特定的非曱基化CpG基序，其活化免疫系统并且诱导抗肿瘤活性(TokunagaTetal.，J.Natl.CancerInst.(1984)72:955-962;ShimadaS，etal"Jpn.HcancerRes,1986,77,808-816;YamamotoS,etal.,Jpn.J.CancerRes.,1986，79,866-73)。其它研究中显示4吏用含有CpG二核苷酸的反义寡核苷酸激活免疫应答(ZhaoQ，etal.(1996)Biochem.Pharmacol.26:173-182)。接下来的研究说明TLR9识别存在于细菌DNA和合成DNA中的非甲基化CpG基序(Hemmi,H.etal.(2000)Nature408:740-745)。对含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修饰也能够影响它们通过TLR9调制免疫应答的能力(参见，例如，Zhaoetal.,Biochem.Pharmacol.(1996)51:173-182;Zhaoetal.(1996)BiochemPharmacol.52:1537-1544;Zhaoetal.(1997)AntisenseNucleicAcidDrugDev.7:495-502;Zhaoetal(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:3453-3458;Zhaoetal.(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett,10:1051-1054;Yu，D.etal.(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10:2585-2588;Yu，D.etal,(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2263-2267;和Kandimalla,E.etal.(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813)。另夕卜，人们通过结构活性关系研究已经鉴定了多种合成基序和新的基于DNA的化合物，它们诱导的特异性免疫应答模式(profile)与非曱基化CpG二核苷酸产生的应答模式截然不同(Kandimalla,E.etal.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:6925-6930.Kandimalla,E.etal.(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.USA100:14303-14308;Cong,Y.etal.(2003)BiochemBiophysRes.Commun.310:1133-1139;Kandimalla,E.etal.(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.306:948-953;Kandimalla,E.etal.(2003)NucleicAcidsRes.31:2393-2400;Yu，D.etal.(2003)Bioorg.Med.Chem.11:459-464;Bhagat，L.etal.(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300:853誦861;Yu,D.etal.(2002)NucleicAcidsRes.30:4460-4469;Yu,D.etal.(2002)J.Med.Chem.45:4540-4548.Yu，D,etal.(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.297:83-90;Kandimalla.E.etal.(2002)Bioconjug.Chem.13:966-974;Yu,D.etal.(2002)NucleicAcidsRes.30:1613-1619;Yu,D.etal.(2001)Bioorg.Med.Chem.9:2803-2808;Yu,D.etal.(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2263-2267;Kandimalla,E.etal.(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813;Yu,D.etal.(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10:2585-2588;Putta，M.etal.(2006)NucleicAcidsRes.34:3231-3238)。TLR的选择性定位和由此产生的信号传导为它们在免疫应答中的功能提供了某些启示。根据应答中涉及的细胞的亚群不同，免疫应答包括先天性和适应性应答。例如，经典的细胞介导的功能，例如迟发型超敏反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化中涉及的T辅助(Th)细胞是Thl细胞。这种应答是身体对抗原(例如病毒感染、胞内病原体和肿瘤细胞)的先天性应答，并且导致IFN-gamma的分泌和伴随的CTL的活化。或者，参与充当B细胞活化辅助细胞的Th细胞是Th2细胞。已经显示Th2细胞响应于细菌和寄生虫而被活化，并且可通过IL-4和IL-5的分泌来介导身体的适应性免疫应答(例如IgE产生和嗜酸性粒细胞活化)。免疫应答的类型受到响应于抗原暴露而产生的细胞因子的影响，并且由Thl和Th2细胞分泌的细胞因子的差异可能是这两种亚群不同的生物功能导致的结果。免疫应答的起始涉及TLR的活化，但是在免疫妥协(immunecompromised)的受试者中，不受控制地通过TLR刺激免疫系统可加重特定的疾病。在近几年中，几个小组显示了合成性寡脱氧寡核苷酸(ODN)作为炎症细胞因子抑制剂的用途(Lenert,Retal.(2003)DNACellBiol.22(10):621-631)。P.etal.(2003)DNACellBiol.22(10):621-631)。这些抑制性ODN需要两个三联体序列，近端的"CCT"三联体和远端的"GGG，，三联体。除这些含有三联体的抑制性ODN之外，几个小组报道了其它特异性DNA序列，它们能够抑制含CpG的ODN导致的TLR-9介导的活化。这些"抑制性"或"阻抑性"的基序富含多聚"G"(例如"GGGG")或"GC，，序列多被曱基化，存在于哺乳动物和特定病毒的DNA中(参见例如；Chen,Y.，etal.，GeneTher.8:1024-1032(2001);Stunz,L丄.，Eur.J.Immunol.32:1212-1222(2002)。Duramad,O.,etal"J.Immunol.,174:5193-5200(2005)和Jurk等人(US2005/0239733)描述了在序列内含有GGGG基序的抑制性DNA寡核香酸结构。Patole等人证明含有GGGG的ODN将抑制全身性狼裔(systemiclupus)(Patole,P.etal.(2005)J.Am.Soc.Nephrol.16:3273-3280)。另夕卜，Gursel，I"etal.,J.Immunol.，171:1393-1400(2003)记载，高频出现于哺乳动物端粒中的重复TTAGGG元件可下调CpG诱导的免疫活化。Shirota，H.,etal.,J.Immunol.,173:5002-5007(2004)证明，含有TTAGGG元件的合成寡核苷酸模仿这种活性，并且可能能够有效预防/治疗特定的Thl依赖性自身免疫疾病。与此相反，近来的研究使人们对含有多聚G的ODN起TLR拮抗剂作用的观点产生了怀疑。例如，US6,426,334，Agrawal等人证明，施用含有GGGG串(string)的CpG寡核苷酸具有强力的抗病毒和抗癌活性，并且这些化合物的施用将引起血清IL-12浓度的增加。另外，已知含有多聚G序列的CpG寡聚体(oligo)通过TLR9活化诱导免疫应答(VerthelyiDetal,JImmunol.166，2372,2001;GurselMetal，JLeukocBiol,71,813,2001，KrugAetal,EurJImmunol,31，2154,2001)并且显示抗肺瘤、抗病毒活性(BallasGKetal，JImmunol,167,4878,2001;VerthelyiDetal,JImmunol,170,4717，2003)。另外，还已知多聚G寡核香酸抑制HIV和RelA(McShanWM,etal，JBiolChem.,267(8):5712-21,1992;Rando,RFetal"JBiolChem，270(4):1754-60,1995;BenimetskayaL，etal.，NucleicAcidsRes"25(13):2648-56,1997)。另夕卜，含有免疫刺激性CpG基序和4个连续G核苷酸的ODN(A类ODN)诱导干扰素y产生和免疫应答中的Thl转变(Thlshift)。此外，在临床前病变才莫型(preclinicaldiseasemodel)中，已经证明A类ODN诱导TLR介导的免疫应答。另外，已经证明含有鸟苦串的寡核苷酸形成四链结构，充当适体，且抑制凝血酶活性(BockLCetal.,Nature,355:564-6，1992;Padmanabhan，Ketal.,JBiolChem.，268(24):17651-4,1993)。从而，人们不清楚是单链结构还是多链结构可有效抑制TLR9活化。因此，无需考虑其形成二级结构的有效TLR拮抗剂是人们所需要的。发明简述本发明提供作为TLR拮抗剂的新免疫调节性寡核苷酸(IRO)化合物及它们的使用方法。这些IRO在免疫调节性基序的旁侧序列中和/或在如果没有所述修饰则原本具有免疫刺激性的寡核苷酸基序中具有一种或多种化学修饰。本发明进一步提供新的IRO组合物，所述组合物具有结构5-Nm-N3N2NiCGNi^N3—Nm-3，，其中CG是寡核苷酸基序，并且C是胞嘧啶或嘧p定核香酸衍生物或非核香酸连接，而G是鸟苷或噤呤核苦酸衍生物或非核苷酸连接；Nl-N3每次出现时独立地是核香酸、核香酸衍生物或非核苷酸连接；Nm每次出现时独立地是核香酸、核香酸衍生物或非核苷酸连接；条件是G和/或C和/或Nl至N3中至少一个是核苷酸衍生物或非核苷酸连接；进一步的条件是化合物含有少于4个连续的鸟苷核苷酸，其中若没有所述核苷酸衍生物或非核苷酸连接，该寡核苷酸基序本具有免疫刺激性；并且其中m是O至大约30的数字。本发明进一步提供药物组合物，其包含任何IRO和药用载体。本发明提供用于修饰包含免疫刺激寡核苷酸基序的TLR刺激性寡核苷酸的方法，包括将化学修饰引入所述免疫刺激寡核苷酸基序和/或免疫刺激寡核苷酸基序的旁侧序列，其中所述免疫刺激寡核苷酸基序的免疫刺激活性受所述化学修饰的阻抑。所述方法包括向脊推动物以药学有效量施用IRO化合物，其中所述施用的途径是非消化道、黏膜递送、口服、舌下、经皮、局部(topical)、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采取滴眼剂或漱口剂的形式。在某些优选的实施方式中，抑制TLR刺激包括施用才艮据本发明的IRO化合物，其中所述TLR选自TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9。本发明进一步提供用于抑制TLR激动剂活性的方法，其包括施用IRO化合物，其中将所述IRO在施用TLR激动剂的同时、之前或之后施用。在优选的实施方式中，TLR激动剂选自TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。本发明进一步提供用于治疗性处理患有由TLR介导的疾病的脊推动物的方法，所述方法包括以药学有效量向所述脊推动物施用根据本发明的IRO化合物。在优选的实施方式中，所述疾病是癌症、自身免疫病症、气道炎症(airwayinflammation)、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应(allergy)、哞喘或由病原体引发的疾病。在某些优选的实施方式中，将IRO化合物与一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、TLR激动剂、TLR拮抗剂、肽、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗、佐剂或共刺激分子组合施用。在某些优选的实施方式中，施用的途径是非消化道、黏膜递送、口服、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶、目艮内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采取滴眼剂或漱口剂的形式。本发明进一步提供用于预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、译喘或由病原体引发的疾病的方法，所述方法包括以药学有效量向脊推动物施用根据本发明的IRO化合物。在某些优选的实施方式中，将所述IRO化合物与一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、TLR激动剂、TLR拮抗剂、肽、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗、佐剂或共刺激分子组合施用。在某些优选的实施方式中，施用的途径是非消化道、黏膜递送、口服、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采取滴眼剂或漱口剂的形式。附图简述图1表示IRO抑制IMO的TLR9激动剂活性。图2表示一种IRO化合物作为TLR9的拮抗剂相对于TLR3的特异性。图3表示IRO的剂量依赖性抑制。图4A-4D表示预施用和同时施用IRO能够抑制TLR9的激动剂。图5A和5B表示在其5'端连接的两个CpG寡核苷酸显示TLR抑制特性。图6表示在人细胞培养中IRO抑制TLR9激动剂活性。图7表示IRO对OVA诱导的Th2和Thl免疫应答的影响。图8表示IRO逆转Th2抑制特性并且抑制IMO诱导的Thl免疫应答。图9表示抗体对IMO和IRO的应答。图IO描述用以鉴定和表征体内IRO活性的施用方案。图11表示选择的IRO对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5TLR9的体内早期抑制活性。图12表示选择的IRO对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5TLR9的体内早期抑制活性。图13表示选择的IRO对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5TLR9的体内早期抑制活性。图14表示选择的IRO对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5TLR9的体内长期拮抗活性。图15表示选择的IRO对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5TLR9的体内长期拮抗活性。图16表示选择的IRO对TLR2、TLR3、TLR4、TLR5TLR9的体内长期拮抗活性。图17表示IRO体外抑制野生型(BALB/c)的增殖和狼疮易发性(lupusprone)(MRL-lpr)小鼠B'淋巴细l包增殖。图18A至18C表示IRO体外抑制野生型(BALB/c)和狼疮易发性(MRL-lpr)小鼠B淋巴细胞及狼痴易发性(NZBW)小鼠脾细胞的IL-6和IL-12产生。图19A至19E表示注射IRO的MRL-lpr小鼠血清和尿中蛋白质中的抗DNAIgGl和IgG2a抗体的水平降4氐。图20表示在NZBW小鼠中IRO抑制血清抗-DNAIgG2a。优选实施方式详述ii、TLR7、TLR8和、TLR7、TLR8和、TLR7、TLR8和、TLR7、TLR8和、TLR7、TLR8和、TLR7、TLR8和本发明涉及新的寡核芬酸作为免疫调制剂(immunemodulatoryagents)用于免疫治疗应用的治疗用途。具体地，本发明提供免疫调节性寡核苷酸(ImmuneRegulatoryOligonucleotide(IRO》化合物作为toll样受体(TLR)的拮抗剂来抑制和/或阻抑TLR介导的免疫应答。这些IRO具有独特的序列，所述序列抑制或阻抑响应于内源和/或外源TLR配体或激动剂的TLR介导的信号传导。本文引用的参考文献反映了本领域的知识水平，本文引证并入它们的全部内容。在引用的参考文件的教导和本说明书之间的任何矛盾，均应以有利于本说明书的方式来解决。本发明提供用于阻抑TLR引发的免疫应答的方法，并且能够用于免疫治疗应用，例如但不限于在成年和幼年的(pediatric)人类和兽医应用中治疗癌症、自身免疫病症、哞喘、呼吸性变态反应、食物过敏、皮肤过敏、全身性红斑狼疮(SLE)、关节炎、胸膜炎、慢性感染、炎性疾病、炎性肠综合征(inflammatorybowlsyndrome)、脓毒病和细菌、寄生虫和病毒感染。因此，本发明进一步提供对于免疫治疗具有最佳水平的免疫调制效果的IRO化合物，和制造和使用这些化合物的方法。此外，本发明的IRO化合物与例如DNA疫苗、抗原、抗体和变应原组合；和与化疗剂(传统化疗和现代定向治疗)和/或反义寡核普酸组合用于疾病的预防和治疗是有用的。定义术语"寡核苷酸"泛指包含多个相连的核苷单位的多聚核苷。所述寡核苦酸能够从现存的核酸来源，包括基因组或cDNA来源获得，但是优选通过合成方法产生。在优选的实施方式中，与野生型寡核苷酸相比，每个核苷单位可包含多种化学修饰和取代，包括但不限于修饰的核芬碱基和/或修饰的糖单位。化学修饰的实例是本领域技术人员已知的，并且在例如UhlmannEetal.(1990)Chem.Rev.90:543;"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs"SynthesisandProperties&SynthesisandAnalyticalTechniques,S.Agrawal,Ed,HumanaPress,Totowa,USA1993;和Hunziker，J.etal.(1995)Mod.Syn.Methods7:331-417;和Crooke,S.etal.(1996)Ann.Rev.Pharm.Tox.36:107-129中有记载。核苷残基能够通过许多已知的核苷间连接(internucleosidelinkage)中的任一种而相互偶联。这些核香间连接包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基曱酸酯、吗啉代、borano、硫醚、桥连(bridged)氨基磷酸酯、桥连亚曱基膦酸酯、桥连硫代磷酸酯和砜核香间连接。术语"寡核苷酸"还包含具有一个或多个立体特异性核苷间连接(例如，(i》-或(5V)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯连接)的多聚核苷。如用于本文，术语"寡核苷酸，，和"二核苦酸"明确地意图包括具有任何此类核香间连接的多聚核普和二核苷，无论该连接是否包含磷酸基团。在特定的优选实施方式中，这些核苷间连接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接，或它们的组合。术语"2'-取代的核糖核苷"或"2'-取代的阿拉伯糖苷"一般性地包括如下所述的核糖核香或阿糖核香(arabinonucleoside):其中戊糖部分2'位置上的羟基被取代而产生2，-取代的或2'-0-取代的核糖核苦。在特定实施方式中，这种取代是用含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烃基的取代，用卣素原子的取代，或用具有6-10个碳原子的芳基的取代；其中这种烃基或芳基可以是非取代的或可以是取代的，例如用卣素、羟基、三氟曱基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代。2'-0-取代的核糖核苷或2，-0-取代的阿拉伯糖苷的实例包括但不限于2，-氨基、2，-氟、2，-烯丙基、2，-0-烷基和2，-炔丙基核糖核芬或阿拉伯糖苷，2'-0-曱基核糖核苦或2'-0-曱基阿拉伯糖苷和2'-0-曱氧基乙氧基核糖核苷或2，-0-曱氧基乙氧基阿拉伯糖苷。术语"3'"在用来指方向时，通常指在相同的多核香酸或寡核苷酸中位于某一区域或位置的3'(下游)的区域或位置。术语"5'"在用来指方向时，通常指在相同的多核苷酸或寡核苷酸中位于某一区域或位置的5'(上游)的区域或位置。术语"大约"通常的意思是精确的数目不是关键的。因此，寡核苷酸中核苷残基的数目不是关键的，少一个或两个核芬残基或具有一个至几个额外的核苷残基的寡核苷酸看作是上述各种实施方式的等同物。术语"激动剂"通常指结合至细胞的受体并且诱导应答的物质。激动剂通常模仿天然存在的物质例如配体的作用。术语"拮抗剂"通常指减弱激动剂的效应的物质。术语"佐剂"通常指下述物质当将该物质添加至免疫原性作用物例如疫苗或抗原时，该物质使暴露于该混合物的受体宿主体内对所述作用物的免疫应答提高或增强。术语"气道炎症"通常包括但不限于哮喘。术语"变应原"通常指如下所述的抗原或分子(通常是蛋白质)的抗原性部分其在暴露于受试者时引起变应性应答。典型地，通过例如风团和潮红测试(whealandflaretest)或任何本领域已知的方法，来指示所述受试者对变应原是变应性的。即使只有一小部分受试者在暴露于所述分子时呈现变应性免疫应答，也将该分子称为变应原。术语"变态反应，，通常指以炎症为特征的不适当免疫应答，包括但不限于食物过*1和呼吸性变态反应。术语"抗体"通常指被抗体或T细胞抗原受体识别并且选择性结合，导致免疫应答的诱导的物质。抗原可以包括但不限于肽、蛋白质、核苷、核苷酸和它们的组合。抗原可以是天然的或合成的，并且通常诱导对该抗原有特异性的免疫应答。术语"自身免疫病症"通常指"自身"组分遭受免疫系统攻击的病症。术语"TLR介导的疾病"或"TLR介导的病症"通常的意思是其中一种或多种TLR的活化是促成性因素的任何病理状况。这些状况包括但不限于癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哞喘或由病原体引起的疾病。术语"生理上可接受的，，通常指不干扰IRO化合物的效力，并且与生物系统例如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的材料。优选地，所述生物系统是活体，例如脊推动物。术语"载体"通常包含任何赋形剂、稀释剂、填充剂(filler)、盐、緩沖剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含有脂质的小泡、微球、脂质体包嚢(liposomalencapsulation)或本领域公知用于药物制剂的其它材料。应理解所述载体、赋形剂、稀释剂的特性将取决于具体应用的施用途径。含有这些材料的可药物制剂的制备在例^口iew/"gto"》尸/zarmaceM〃ca/5We"ces，18thEdition,ed.A.Gennaro，MackPublishingCo.,Easton,PA，19卯中描述。术语"共同施用(co-administration)"通常指在充分接近的时间内施用至少两种不同的物质来调制免疫应答。共同施用指以任何顺序，在单一剂量或分开的剂量中，同时施用以及以相距多至几天的时间间隔顺序施用至少两种不同的物质。术语"互补的"通常的意思是具有与核酸杂交的能力。这种杂交通常是互补链之间氢4建结合的结果，优选形成Watson-Crick或Hoogsteen石威基对，尽管其它形式的氢键结合以及碱基堆积也可导致杂交。术语"有效量，，或"充分量"通常指足以影响期望的生物学效应如有益结果的量。因此，"有效量"或"充分量"将依赖于其施用的背景。就施用调制针对与其共同施用之抗原的免疫应答的组合物而言，IRO化合物和抗原的有效量是足以达到与单独施用所述抗原所获得的免疫应答相比的期望调制的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。术语"与……组合"通常的意思是在治疗患者的疾病或病症的过程中，施用IRO化合物和对于治疗所述疾病或病症有用的、不减少该IRO化合物免疫调节效应的作用物。这种组合治疗还可以包括施用IRO化合物和/或独立地施用作用物多于一次。IRO化合物和/或作用物的施用可以通过相同或不同的途径。术语"个体，，或"受试者"或"脊推动物"通常指哺乳动物，例如人。哺乳动物通常包括但不限于人、非人的灵长类动物、大鼠、小鼠、猫、犬、马、牛(cattle)、牛(cows)、猪、绵羊和兔。术语"核普"通常指由糖(通常是核糖或脱氧核糖)和。票呤或嘧咬碱基组成的化合物。术语"核苦酸"通常指包含附接于糖的磷酸基的核苷。如用于本文，术语"嘧啶核苷"指所述核苷的碱基组分是嘧咬碱基(例如胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))的核苷。类似地，术语"。票呤核苷"指所述核苷的碱基组分是噪呤碱基(例如腺噪呤(A)或鸟噪呤(G))的核苷。术语"类似物，，或"衍生物"可以互换使用，通常指具有修饰的碱基和/或糖的任何嘌呤和/或嘧咬核苷酸或核苷。修饰的碱基是指不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的碱基。修饰的糖是指任何不是核糖或2，脱氧核糖并且其能够用在寡核苷酸主链中的糖。术语"抑制"或"阻抑"通常指应答的减少或应答的定性差异，所述应答原本可通过引发和/或刺激应答而发生。术语"非核苷S吏接头"通常指能够通过不同于含磷连接的方式连接或被连接至寡核苦酸的任何连接或部分。优选这种接头的长度是大约2埃至大约200埃。术语"核香酸连接"通常指通过含磷连接直接将两个核苷的3'和5'羟基相连的直接3'-5'连接。术语"寡核苷酸基序"的意思是寡核香s交序列，包括二核苷酸。"寡核苷酸基序如果没有一种或多种修饰则原本具有免疫刺激性"意思是寡核苷酸基序在亲本寡核苷酸中具有免疫刺激性，但在衍生寡核苷酸中不具有免疫刺激性，其中所述衍生寡核苷酸基于亲本寡核香酸，但具有一种或多种修饰。术语CpG、C*pG、C^pG》和CpG+指具有免疫刺激性的寡核苷酸基序，其包含胞嘧啶或胞嘧啶类似物，并且包含鸟。票呤或鸟。票呤类似物。术语"处理/治疗(treatment)"通常指意在获得有益的或期望的结果的手段，所述结果可包括症状的减轻或疾病进展的延迟或改善。在第一方面，本发明提供免疫调节性寡核普酸(IRO)化合物。术语"IRO"指免疫调节性寡核苷酸化合物，其是一种或多种TLR的拮抗剂，其中所述化合物包含寡核苷酸基序和至少一种修饰，其中所述寡核苷酸基序如果没有阻抑寡核苷酸基序活性的所述一种或多种修饰则原本具有免疫刺激性(例如，非曱基化的CpG)，条件是所述化合物含有少于4个连续的鸟苷核苷酸，优选少于3个连续的鸟苷核苷酸。这些修饰可发生在寡核苷酸5，末端中，在寡核苷酸基序的旁侧序列中，和/或在寡核苷酸基序内。这些修饰导致IRO化合物阻抑TLR调制的免疫刺激。这些修饰可以是对寡核香酸基序旁侧的或内部的核苷酸/核苷的碱基、糖残基和/或磷酸骨架的修饰。在优选的实施方式中，当修饰是2'烷基化或烷氧基化时，则所述修饰不发生在寡核苷S臾基序的5'邻近；当修饰是不带电荷的核苷间连接时，则所述修饰不发生在寡核苷酸基序的5'邻近；并且当修饰是3，烷基化或烷氧基化时，则所述修饰不发生在寡核苷酸基序的5，或3，邻近。在优选的实施方式中，IRO化合物不是反义寡核苷酸。IRO化合物的一般结构可表示为5，-Nm-N3N2N!CGN^Sn3-Nm-3，，其中CG是免疫刺激性基序，C是胞嘧啶或嘧啶核苷酸衍生物或非核苷酸接头，G是鸟苷、嘌呤核苷酸衍生物或非核苷酸接头；Nl-N3每次出现时独立地是核苷酸、核苷S交衍生物或非核苷酸接头；Nm每次出现时独立地是核苷酸、核苷酸衍生物或非核苷S吏接头；条件是G和/或C和/或Nl至N3中至少一个是核香酸衍生物或非核芬酸接头；进一步的条件是化合物含有少于4个连续的鸟苷核苷酸，优选少于3个连续的鸟苷，其中CG的免疫刺激活性被所述核苷酸衍生物或非核芬酸接头所阻抑；并且其中m是0至大约30的数字。在本发明特定的实施方式中，IRO化合物可包含至少两个寡核苷酸，它们通过核芬酸连接或非核香酸接头在它们的5，-、3'-或2，-端共价相连，或通过官能化糖或官能化核碱基经由非核苦酸接头或核芬酸连接共价相连。这样的IRO化合物可以是线性的或分支的。作为非限定性实例，接头可以附接于3'-羟基。在这样的实施方式中，接头包含官能团，所述官能团通过基于磷酸酯的连接或不基于磷酸酯的连接附接于3'-羟基，所述基于磷酸酯的连接例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、曱基膦酸酯。可能用于偶联核糖核苷酸的位点在以下通式I中标示，其中B代表杂环碱基，其中指向P的箭头表示对磷的任何附接物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在某些实施方式中，非核苷酸接头是小分子、大分子或生物分子，包括但不限于多肽、抗体、脂质、抗原、变应原和寡糖。在某些其它实施方式中，非核苷酸接头是小分子。就本发明而言，小分子是分子量少于1,000Da的有机部分。在某些实施方式中，小分子具有少于750Da的分子量。在某些实施方式中，小分子是脂族烃或芳族烃，它们均可任选地包括一种或多种官能团，这些官能团或者位于连接寡核糖核苷酸的直链中或者附接于其上，包括但不限于羟基、氨基、巯基、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、面旨、脲或硫脲。小分子可以是环状或非环状的。小分子接头的实例包括但不限于氨基酸、糖、环糊精、金刚烷、胆固醇、半抗原和抗生素。然而，为了描述非核苷酸接头的目的，术语"小分子"意图不包括核香。在某些实施方式中，非核香酸接头是烷基接头或氨基接头。烷基接头可以是分支或非分支、环状或非环状、取代或未取代、饱和或不饱和、手性、非手性或消旋混合物。烷基接头可具有大约2至大约18个碳原子。在某些实施方式中，这些烷基接头具有大约3至大约9个碳原子。某些烷基接头包括一种或多种官能团，包括但不限于羟基、氨基、巯基、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、g旨、脲和硫脲。这些烷基接头可包括但不限于1,2-丙二醇、1,2,3-丙三醇、1,3-丙二醇、三乙二醇、六乙二醇、聚乙二醇接头(例如[-0-CH2-CH2-]n(n=l-9))、曱基接头、乙基接头、丙基接头、丁基接头或己基接头。在某些实施方式中，这些烷基接头可包括肽或氨基酸。在某些实施方式中，非核苷酸接头可包括但不限于表2所列。表2:代表性非核香S臾接头<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2:续<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2:续<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>1，6-脱水-(3-d-葡萄糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>4,6-硝基邻苯三酚<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>1,3,5-三(2-羟乙基)-三聚氰酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>3,5,7-三羟基黄酮表2:续<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>表2:续<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>1，7-庚二2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>1，8-辛二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>2-(l-氨基丙基)-l,3-丙二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>1,2-辛二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>1，9-壬二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>1,12-十二烷二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>1，2-二脱氧核糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>三乙二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>六乙二醇在某些实施方式中，小分子接头是甘油或通式为HO-(CH2)。-CH(OH)-(CH2)p-OH的甘油同系物，其中o和p独立地是1至大约6,1至大约4或1至大约3的整数。在某些其它实施方式中，小分子接头是1,3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。某些这样的衍生物具有通式HO-(CH2)m-C(0)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(0)-(CH2、-OH,其中m是0至大约10，0至大约6，2至大约6或2至大约4的整数。根据本发明的某些非核苷酸接头允许附接多于两个寡核香酸。例如，小分子接头甘油具有可共价附接寡核苷酸的三个羟基。因此，根据本发明的某些IRO包含两个或多个连接于核芬酸或非核苦酸接头的寡核苷酸。这些IRO称作"分支的"。IRO化合物可包含至少两个非共价连接的寡核普酸，例如通过静电作用、疏水相互作用、71-堆积相互作用(7t-stackinginteraction)、氢4建和它们的组合连接的寡核苷酸。这些非共价连接的非限定性实例包括Watson-Crick碱基配对、Hoogsteen》威基配对和》成基堆积。某些能够连接两个或多个寡核苦酸的方式示于表3。表3:寡聚核糖核香酸通式IV-XI通式iv通式v<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在特定的实施方式中，在根据本发明的组合物和方法中使用的免疫调节寡核香酸中的嘧啶核苷具有结构(//):s'W其中D是氢键供体；D'选自下组氢、氢键供体、氢键受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和给电子基团；A是氢键受体或亲水基；A，选自下组氬键受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和给电子基团；X是碳或氮；和S'是戊糖或己糖糖环，或糖类似物。在某些实施方式中，糖环被磷酸部分、修饰的磷酸部分或适合于将嘧啶核苷连接于其它核苷或核苷类似物其它接头部分衍生化。在某些实施方式中，氢键供体包括但不限于-NH-、-NH2、-SH和-OH。优选的氬^:受体包括但不限于c二o、C二S和芳族杂环的环氮原子，例如胞嘧咬的N3。在某些实施方式中，(//)是嘧啶核苷衍生物。嘧咬核苷衍生物的实例包括但不限于5-羟基胞嘧咬、5-羟曱基胞嘧咬、N4-烷基胞嘧啶或N4-乙基胞嘧咬、阿糖胞香(araC)、5-OH-dC、N3-Me-dC和4-硫尿嘧啶。化学修饰的衍生物还包括但不限于胸腺嘧啶或尿嗜啶类似物。在某些实施方式中，(//)中的糖部分S'是糖衍生物。合适的糖衍生物包括但不限于海藻糖或海藻糖衍生物、己糖或己糖书f生物、阿拉伯糖或阿^立伯糖书1"生物。在某些实施方式中，根据本发明的组合物和方法中使用的免疫调节寡核苷酸中的噤呤核苷具有结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中D是氢键供体；D，选自下组氢、氢键供体和亲水基；A是氢键受体或亲水基；X是碳或氮；每个L各自独立地选自下组C、O、N和S;和S'是戊糖或己糖糖环，或糖类似物。在特定的实施方式中，糖环被磷酸部分、修饰的磷酸部分或适合于将嘧啶核苷连接于其它核苷或核苷类似物的其它接头部分所衍生化。在特定的实施方式中，氢键供体包括但不限于-NH-、-NH2、-SH和-OH。在特定的实施方式中，氬键受体包括但不限于OO、C=S、->^02和芳族杂环的环氮原子，例如鸟嘌呤的N1。在某些实施方式中，(//7)是噪呤核苷衍生物。嘌呤核苷衍生物的实例包括但不限于鸟噤呤类似物例如7-脱氮-G、7-脱氮-dG、阿糖鸟苷(ara-G)、6-疏代-G、肌苷(Inosine)、异鸟苷(Iso-G)、洛索立宾(loxoribine)、丁00(7-硫代-8-氧代)-G、8-溴代-G、8-羟基-G、5-氨基间型霉素B(5-aminoformycinB)、氧代间型霉素(Oxoformycin)、7-曱基-G、9-对-氯苯基-8-氮杂-G、9-苯基-G、9-己基-鸟嘌呤、7-脱氮-9-千基-G、6-氯-7-脱氮鸟嘌呤、6-曱氧基-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-G(PPG)、2-(二曱基氨基)鸟苷、7-曱基-6-硫代鸟苷、8-苄氧基鸟苷、9-脱氮鸟苷、l-(B-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-曱基-嘌呤、1-(2，-脱氧-P-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-曱基-噤呤。化学修饰的衍生物还包括但不限于腺噤呤类似物例如9-千基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺。票呤、2-氨基-N2-0-,曱基腺香、8-氮杂-7-脱氮-A、7-脱氮-A、阿糖腺苦(Vidambine)、2-氨基腺苷、Nl-曱基腺苷、8-氮杂腺苷、5-碘代杀结核菌素(5-Iodotubercidin)和Nl-Me-dG。在某些实施方式中，(//7)中的糖部分S'是如通式n中定义的糖衍生物。在本发明的特定实施方式中，免疫调节核酸包含含有至少一个B-L-脱氧核苷或3，-脱氧核苦的核酸序列。在本发明的特定实施方式中，免疫调节寡核苷酸包含含有至少一个二核苷酸的核酸序列，所述二核苷酸选自下组CpG、C*pG、C^pG4和CpG*，其中C是胞嘧啶或2，-脱氧胞苷，G是乌苷或2，-脱氧鸟香，(3*是2'-脱氧胸苷、l-(2'-脱氧-13-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-曱基-。票呤、2，-双脱氧-5-卣代胞嘧啶、2，-双脱氧-5-硝基胞嘧啶、阿拉伯糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代阿糖胞苷、2'-0-取代阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2'-脱氧-N4-烷基-胞苷、2'-脱氧-4-硫代尿苷或其它嘧啶核苷类似物，G+是2'-脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代-阿糖鸟苷、2'-0-取代阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷或其它。票呤核苷类似物，并且p是选自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯的核苷间连接，并且其中所述至少一个二核苷酸的活性受旁侧序列的调节。在这些本研究中使用的通用结构内特异性IRO的序列包括但不限于表4所列。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>疫阻抑的脊推动物施用IRO化合物。才艮据本发明的这个方面，IRO化合物能够阻抑针对其它TLR配体或TLR激动剂的基于TLR的免疫应答。如在下文实施例中进一步讨论的，TLR激动剂或TLR配体(例如免疫调制性寡核苷酸)所活化的基于TLR的免疫应答能够被同时、预先或随后施用IRO化合物所阻抑/抑制，并且这种阻抑/抑制可以在施用之后保持一段时间(例如几天)。本发明这种有益的性质对于预防和/或治疗疾病或病症具有独特的优势。例如，在疾病治疗期间特定TLR激动剂的投与可能引起不希望的免疫刺激，IRO化合物能够阻抑/抑制该免疫刺激。在施用TLR激动剂的同时、之前和/或之后施用IRO,可在从TLR激动剂获得治疗益处的同时阻抑/抑制不希望的副作用。另外，预先施用IRO能够预防对接下来或后来由TLR-激动剂的激发(challenge)引起的免疫应答(例如，变应性反应)。在根据本发明这个方面的方法中，IRO化合物的施用可以通过任何合适的途径，包括但不限于非消化道、黏膜递送、口服、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采取滴眼剂或漱口剂的形式。可使用已知方法，以有效减少疾病的症状或替代标志的剂量和时间段进行IRO化合物的治疗组合物的施用。在全身施用时，优选以足够实现IRO化合物的血液水平为大约0.0001微摩尔至大约10微摩尔的剂量施用治疗组合物。对于局部施用，与上述浓度相比低得多的浓度可能是有效的，而高得多的浓度可能得以耐受。优选地，IRO化合物的总剂量范围在大约0.001mg每个患者每日至大约200mg每kg体重每日。同时或连续向个体施用有效量的一种或多种本发明的治疗组合物作为单一治疗段落(singletreatmentepisode)可能是理想的。IRO化合物可任选地连接一个或多个变应原和/或抗原(自身或外源)，免疫原性蛋白质，例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、霍乱毒素B亚基，或任何其它免疫原性载体蛋白质。IRO还能够与其它化合物(例如佐剂)组合使用，所述化合物包括但不限于TLR激动剂(例如TLR2激动剂和TLR9激动剂)、弗氏不完全佐剂、KLH、单磷酰类脂A(MPL)、明矾和皂苦，包括QS-21和咪喹莫特(imiquimod)，或它们的组合。根据本发明这个方面的方法对于免疫系统的模式研究是有用的。所述方法对于预防性或治疗性处理人或动物疾病也是有用的。例如，所述方法对于儿科用和兽用疫苗应用是有用的。在第四个方面，本发明提供用于治疗性处理具有疾病或病症的患者的方法，这些方法包括向患者施用根据本发明的IRO化合物。在多种实施方式中，待处理的疾病或病症是癌症、自身免疫病症、传染病、气道炎症、炎性病症、变态反应、哞喘或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。如本发明的第三个方面所述进行施用。在第五个方面，本发明提供用于预防疾病或病症的方法，这些方法包括向患者施用根据本发明的IRO化合物。在多种实施方式中，待预防的疾病或病症是癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、变态反应、哞喘或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。如本发明的第三个方面所述进行施用。在根据本发明这个方面的任何方法中，可将IRO化合物与对于治疗所述疾病或症候有用、且不减少IRO化合物免疫调制作用的任何其它作用物组合使用。在根据本发明的任何方法中，对于治疗疾病或症候有用的作用物包括但不限于一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、TLR激动剂、TLR拮抗剂、肽、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗和/或佐剂，以增强免疫应答的特异性或幅度；或共同刺激分子例如细胞因子、趋化因子、蛋白配体、反式激活因子、肽和包含修饰的氨基酸的肽。例如，在癌症的治疗中，设想IRO化合物可以与一种或多种化疗化合物、靶向治疗剂和/或单克隆抗体组合施用。或者，所述作用物可以包括编码抗原或变应原的DNA载体。在这些实施方式中，本发明的IRO化合物能够发挥不同的作为佐剂的作用和/或产生直接的免疫调制效果。以下实施例旨在进一步说明本发明的特定示例性实施方式，并不意在限定本发明的范围。例如，在以下实施例中显示代表性的TLR配体，但是不限定本发明的IRO对其发挥拮抗剂作用的配体的范围。实施例1合成含有寡核苷酸的免疫调节部分才艮据标准方法合成全部IRO(参见例如美国专利公开No.20040097719)。使用自动DNA合成仪(Expedite8909;PerSeptiveBiosystems,Framingham,Mass.),才艮据标准线性合成或平行合成方法(参见例如美国专利7>开No.20040097719的图5和6),以1pM规模合成寡核苷酸。脱氧核糖核苷亚磷酰胺从(Aldrich-Sigma,StLouis,Mo)获得。l',2'-双脱氧核糖亚磷酰胺、丙基-l-亚磷酰胺、2-脱氧尿苷亚磷酰胺、1，3-双-[5-(4,4'-二甲氧三苯曱基)戊酰胺基]-2-丙醇亚磷酰胺(1,3-bis-[5-(4,4'-dimethoxytrityl)pentylamidyl]-2陽propano1phosphoramidite)和曱基亚石粦酰胺(methylphosponamidite)从GlenResearch(Sterling,Va.)获得。.(3,L-2'-脱氧核糖核芬亚磷酰胺、.a.-2'-脱氧核糖核芬亚磷酰胺、单-DMT-甘油亚磷酰胺和二-DMT-甘油亚磷酰胺从ChemGenes(Willmington,Mass.)获得。(4-氨基丁基)-l,3-丙二醇亚磷酰胺从Clontech(PaloAlto,Calif.)获得。阿糖胞苦亚磷酰胺、阿糖鸟苷、阿糖胸香和阿糖尿苷从ReliablePharmaceutical(St.Louis，Mo.)获得。阿糖鸟苷亚磷酰胺、阿糖胸苦亚磷酰胺和阿糖尿普亚磷酰胺在IderaPharmaceuticals,Inc.(Cambridge,Mass.)合成(Noronhaetal.(2000)Biochem.,39:7050-7062)。全部核苷亚磷酰胺通过31P和&NMR谱表征。使用普通偶联循环将修饰的核苷掺入特异性位点。在合成之后，将寡核苷酸使用浓氢氧化铵脱保护，并通过反相HPLC随后透析来纯化。将纯化的钠盐形式的寡核苷酸在使用之前冻干。用CGE和MALDI-TOFMS测试纯度。实施例2抑制TLR9活化将稳定表达TLR9的HEK293细胞(Invivogen)用报道基因Seap(Invivogen)瞬时转染6小时。用单独的0.5吗/ml5，-CTATCTGACGTTCTCTGT-3，(小鼠CpG序列；IMO/SEQIDNO1;0剂量)和各种浓度的IRO5或6处理细胞18小时。根据制造商的方案(Invivogen)测定TLR9依赖性报道基因表达，将结果表示为丁019刺激性寡核香酸(100%)的％活性。结果示于图1。这些结果说明IRO5抑制了IMO的TLR9激动活性。实施例3IRO特异性抑制TLR9刺激将稳定表达TLR9或TLR3的HEK293细胞(Invivogen)用报道基因Seap(Invivogen)瞬时转染6小时。用0.5mg/mlIMOl(0.5吗/ml)、IRO5(2.0吗/ml)、R848(5.0吗/ml)或poly(I).poly(C)(0.5|ag/ml),和组合IMO+IRO、R848+IRO或poly(I).poly(C)+IRO处理细胞18小时。根据制造商的方案(Invivogen)测定TLR9或TLR3依赖性报道基因表达，将结果表示为NF-kB活性的变化倍数。结果示于图2。这些结果证明IRO抑制TLR9激动剂的活性，但是不抑制TLR3的激动剂，更概括地说，IRO能够选择性地抑制TLR活性。实施例4IRO的剂量依赖性抑制在C57BL/6小鼠的左腋下皮下注射(s.c.)0.25mg/kg的刺激性5'-TCTGACGiTTCT-X-TCTTG!CAGTCT陽5，(IMO/SEQIDNO3;G产7-脱氮G,乂=甘油)，并且在右腋下皮下注射不同剂量的IR05。在刺激性IM03注射之后2小时取得血清样品，并且通过ELISA测定IL-12水平。结果示于表3。这些结果说明IRO的剂量依赖性抑制。实施例5IRO的时间依赖性抑制在C57BL/6小鼠的左腋下皮下注射0.25mg/kg刺激性IMO3,并且在施用刺激性IMO(0h)—小时前(-lh)或与之同时在右腋下皮下注射1mg/kgIRO5或5，-CTATCTCACCTTCTCTGT-5，(非-CpG非刺激对照；寡聚物/SEQIDNO4)。在刺激性IMO注射之后2小时取得血清样品，并且通过ELISA测定IL-12水平。图4A中的结果说明，在施用刺激性IMO(0h)的1小时之前(-lh)或与之同时施用IRO5或(寡聚物4)之后，血清IL-12水平减少。在C57BL/6小鼠的左腋下皮下注射0.25mg/kg的刺激性IMO3，并且在施用刺激性IMO(0h)的同时鼻内施用10mg/kgIRO102。在刺激性IMO注射之后2小时取得血清样品，通过ELISA测定IL-12水平。图4B中的结果说明在皮下注射IMO的同时鼻内施用IRO102之后，血清IL-12水平减少。在C57BL/6小鼠的左腋下皮下注射0.25mg/kg的刺激性IMO3,并且在施用刺激性IMO(0h)的1小时之前(-lh)、24小时之前(-24)或72小时之前(-72)在右腋下皮下注射2mg/kg或10mg/kg的IRO17、99、102。在刺激性IMO注射2小时之后取血清样品，并且通过ELISA测定IL-12水平。结果示于图4C-D。这些结果说明预施用和同时施用IRO能够抑制TLR9的激动剂，更概括地说，IRO能够抑制TLR活化。实施例6抑制TLR9刺激在C57BL/6小鼠的左腋下皮下注射0.25mg/kg刺激性IMO3，并且在施用刺激性IMO(0h)的1小时之前(-lh)或同时在右腋下皮下注射1mg/kgIRO21或对照寡聚物4。在刺激性IMO注射之后2小时取得血清样品，并且通过ELISA测定IL-12水平。结果示于图5A和5B。这些结果说明在其5'端相连接的CpG寡核苷酸显示抑制特性，更概括的说，在它们的5'端相连接的免疫刺激性CpG寡核苷酸能够抑制TLR活化。实施例7人细胞培养物中TLR9的抑制将人pDC和PBMC与10ug5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3，(人CpG序列；IMO/SEQIDNO2)和40uglRO10温育24小时。结果示于图6。这些结果说明IRO在人细胞培养物中抑制了TLR9激动剂活性，更概括地说，IRO能够抑制人细胞中的TLR。实施例8IRO对OVA诱导的Th2免疫应答的影响结果示于图7。这些结果说明IRO对卵清蛋白("OVA")诱导的Th2免疫应答没有影响，而IMO化合物减少OVA诱导的Th2应答并且引起Thl细胞因子的产生。实施例9IRO抑制IMO对Thl和Th2免疫应答的影响结果示于图8。这些结果说明IRO能够逆转Th2抑制性质并且能够抑制IMOi秀导的Thl免疫应答。实施例10抗体对IMO和IRO的应答在第0周和第2周，在有和没有IMOl和IRO5或6及其组合存在之条件下用HBsAg免疫小鼠，并且在第4周测量抗体应答。结果示于图9，说明IRO降低了IMO所诱导的IgG2A免疫应答。实施例11抑制免疫刺激性寡核苷酸将稳定表达TLR9的HEK293细胞(Invivogen)用报道基因Seap(Invivogen)瞬时转染6小时。用单独的0.25吗/mlIMO(IMOl;0剂量)和多种浓度的IRO处理细胞18小时。根据制造商的方案(Invivogen)测定TLR9依赖性报道基因表达，将结果表示为免疫刺激性寡核苷酸活性的％抑制。结果示于以下表5和6。这些结果说明IRO抑制了IMO的活性。表5,免疫刺激性寡核苷酸1的百分比抑制。1IMOl浓度是0.25昭/ml，IRO浓度是2pg/mlIRO#序列%抑制55，.隱CTATCTGACGTTCTCTGT-3'52.5%255，-CTATCTGAC2GTTCTCTGT-3'17.5%265,-CTATCTGACG2TTCTCTGT-3'15.3%335，-CTATCTGAC3GTTCTCTGT-3'38.1%395，-CTATCTGAC4GTTCTCTGT-3'52.8%415,-CTATCTGAC5GTTCTCTGT-3'42.6%435，,-CTATCTGAC6GTTCTCTGT-3'23.6%含有各种修饰的IRO抑制表达TLR9的HEK293细胞中IMO的NP-kB活化，更概括地说，含有各种修饰的IRO能够抑制IMO的NF-kB活化。表6.免疫刺激性寡核苷酸1的百分比抑制。IMOl浓度是0.25吗/ml，IRO浓度是3pg/ml。IRO#序列％抑制55，-CTATCTGACGTTCTCTGT-3'76.5%175'-CTATCTGACGiTTCTCTGT画3，76.4%345，-CTATCTGACG3TTCTCTGT-3'32.2%37.5，-CTATCTGACG4TTCTCTGT-3'78.3%含有各种修饰的IRO抑制表达TLR9的HEK293细胞中IMO的NF-kB活化，更概括而言，含有各种修饰的IRO能够抑制IMO的NF-kb活化。实施例12IRO的时间依赖性抑制在C57BL/6小鼠的左腋下用0.25mg/kg至10mg/kg的TLR激动剂皮下注射，并且在施用TLR激动剂(0h)的1小时之前(-lh)或多至48小时之前(-lh)或与之同时，在右腋下用1mg/kg至20mg/kg的IRO5、17或37或5'-TCCTGGCGGGGAAGT-3，(多聚dG对照；寡聚物/SEQIDNO49)皮下注射。在刺激性IMO注射之后2小时取得血清样品，并且通过ELISA测定IL-12水平。结果示于以下表7-22。这些结果说明预施用和同时施用IRO二者均抑制TLR9的激动剂，并且即使在IMO施用之前48小时施用的情况下，IRO的抑制活性也有效。更概括而言，这些结果说明预施用和同时施用IRO都能够抑制TLR激动剂，并且即使在施用TLR激动剂之前数小时施用，也可见IRO的抑制活性。表7.IRO5体内抑制IM03诱导的IL-12(ng/ml±SD),C57BL/6小鼠(n-3)仅IMO仅IRO_IRO+IMO_(0.25mg/kg)(2mg/kg)_施用IRO之后施用IMO的时间__0小时l小时3小时6小时21.1土1.840.81±00.59±0.481.54土0.176.53土0.8110.41土0.48IR05抑制了IRO施用后长达6小时内注射的IMO所诱导的IL-12产生。更4既括而言，这些结果"i兌明，在IRO施用之后数小时施用IMO或开始存在IMO的情况下，IRO能够抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表8.IRO5体内抑制IMO3诱导的IL-12(ng/ml土SD)，C57BL/6小鼠(11=3)仅IMO仅IRO_IRO+IMO_(0.25mg/kg)(20mg/kg)_施用IRO之后施用IMO的时间__0小时l小时3小时6小时33.8±3.80.73±0.70.87±1.191.52±2.012.2±2.41.84±3.18IRO5强力抑制了IRO施用后长达6小时内注射的IMO所^秀导的IL-12产生。更概括而言，这些结果说明，在IRO施用之后数小时施用IMO或开始存在IMO的情况下，IRO能够显著抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表9.IRO5体内抑制IMO3诱导的IL-12(ng/ml±SD)，C57BL/6小鼠(>1=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>IRO5强力抑制了IRO施用后长达48小时内注射的IMO所诱导的IL-12产生。更概括而言，这些结果说明，在IRO施用之后数小时施用IMO或开始存在IMO的情况下，IRO能够显著抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表10.IRO17体内抑制IMO3诱导的IL-12(ng/ml土SD)，C57BL/6小鼠(n二3)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>IRO17抑制了IRO施用后长达6小时或更长时间内注射的IMO所诱导的IL-12产生。更概括而言，这些结果说明，在施用IRO之后数小时施用IMO或开始存在IMO的情况下，IRO能够抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表11.IRO37体内抑制IMO3诱导的IL-12(ng/ml±SD),C57BL/6小鼠(>1=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>IRO37抑制了IRO施用后长达3小时内注射的IMO所诱导的IL-12产生。更概括而言，这些结果说明，在施用IRO之后数小时施用IMO或开始存在IMO的情况下，IRO能够抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表12.对照多聚dG(5，陽TCCTGGAGGGGAAGT画3，(SEQIDNO73))体内抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>一种已知显示TLR9拮抗剂活性的多聚dG化合物抑制了在施用IRO后长达6小时内注射的IMO所诱导的IL-12产生。与IRO的数据比较(例如表7中的IR05),对照多聚dG寡聚物拮抗效果是短期而瞬时的。表13.对照多聚dG(5，-TCCTGGCGGGGAAGT-3，(SEQIDNO49》体内抑制IMO3诱导的IL-12(ng/ml土SD)，C57BL/6小鼠(n二3)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>一种已知显示TLR9拮抗剂活性的多聚dG化合物抑制了在施用IRO长达6小时后注射的所IMO诱导的IL-12产生。与IRO的数据比较(例如表7中的IR05),对照多聚dG寡聚物拮抗效应是短期而瞬时的。表14.IRO5体内抑制R848(—种TLR7及TLR8激动剂)诱导的IL-12(ng/ml±SD)，C57BL/6小鼠(11=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>IR05对IRO施用后长达1小时内注射的所R848诱导的IL-12产生显示出低度的瞬时抑制作用。更概括而言，这些数据说明IRO能够抑制胞内TLR的活性。表15.IRO5体内抑制PolyI:PolyC(—种TLR3激动剂)诱导的IL-12(ng/ml±SD),C57BL/6小鼠(11=3)仅PolyI:PolyC仅IROIRO+Polyl:PolyC(10mg/kg)(2mg/kg)施用IRO之后施用PolyI:PolyC的时间l小时8.7+0.61.48+0.172.1+0.07—IRO5对施用IRO后长达1小时内注射的PolyI.PolyC所诱导的IL-12产生显示出低度的瞬时抑制作用。更概括而言，这些数据说明IRO能够抑制TLR活化和Polyl.PolyC诱导的IL-12产生。表16.IRO5体内抑制IMO诱导的MCP-1(ng/ml±SD)，C57BL/6小鼠(n二3)仅IMO仅IROIRO+IMO(0.25mg/kg)(2mg/kg)施用IRO之后施用R848的时间l小时2.2±0.25NT0.28土0.73IRO5对IRO施用后长达1小时内注射的IMO所i秀导的MCP-1产生显示出强力的抑制作用。更概括而言，这些数据说明IRO能够抑制TLR活化和IMO诱导的MCP-1产生。表17.IRO5体内抑制R848(—-种TLR7和TLR8激动剂)诱导的MCP-1(ng/ml±SD),C57BL/6小鼠(]1=3)仅R848仅IROIRO+R848(0.5mg/kg)(2mg/kg)施用IRO之后施用R848的时间l小时11±1.4_7.2±1.7_IRO5对IRO施用后长达1小时内注射的R848所诱导的MCP-1产生显示出低度的瞬时抑制作用。更概括而言，这些数据说明IRO能够抑制TLR活化和经由胞内TLR的MCP-1产生。表18.IRO5体内抑制PolyI:PolyC(—种TLR3激动剂)诱导的MCP-1(ng/ml±SD),C57BL/6小鼠(n二3)_仅仅IROIRO+Polyl:PolyC_PolyI:PolyC(2mg/kg)施用IRO之后施用PolyI:PolyC的时间(10mg/kg)l小时4.6土0.61.8.0±0.57IRO5对施用IRO后长达1小时内注射的PolyI.PolyC所诱导的MCP-1产生显示出低度的瞬时抑制作用。更概括而言，这些数据说明IRO能够抑制PolyI.PolyC的TLR活化和MCP-1产生。表19.IRO5体内抑制IMO3诱导的IL-12(ng/ml±SD)，C57BL/6小鼠(『3)仅IMO仅IRO_IRO+IMO_(0.25mg/kg)(20mg/kg)_施用IRO之后施用IMO的时间__^__7天33.2±8.7NT_14.5±5.17_17.19±11.228.0±7.75IRO5对IRO施用后长达7天内注射的IMO所诱导的IL-12产生显示出强力的抑制作用。更概括而言，这些数据说明IRO能够在哺乳动物体内抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表20.IRO5体内抑制IMO诱导的IL-12(ng/ml±SD)，C57BL/6小鼠(>1=3)仅IMO仅IRO_IRO+IMO_(0.25mg/kg)(10mg/kg)_施用IRO之后施用IMO的时间__72小时_53.39±2.712.03±2.03_28.72±0.79_IRO5对IRO施用后长达72小时内注射的IMO所-誇导的IL-12产生显示出强力的抑制作用。更概括而言，这些数据说明在施用IRO数小时后，IRO能够在哺乳动物体内抑制TLR活化和IMO诱导的IL-12产生。表21.IRO5体内抑制R848(—种TLR7和TLR8激动剂)诱导的IL-12(ng/ml±SD)，C57BL/6小鼠(11=3)仅R848仅IRO_IRO+R848_(0.125mg/kg)(10mg/kg)_施用IRO之后施用R848的时间__72小时_96.5±3.42.03±2.03_13.64±0.47_IRO5对IRO施用后长达72小时内注射的R848所诱导的IL-12产生显示出抑制作用。更概括而言，这些数据说明在施用IRO数小时后，IRO能够在哺乳动物体内抑制胞内TLR的激动剂的活性和TLR激动剂诱导的IL-12产生。表22.IRO5体内抑制PolyI.PolyC(—种TLR3激动剂)诱导的IL-12(ng/ml±SD),C57BL/6小鼠(11=3)_仅仅IROIRO+PolyI:PolyCPolyI:PolyC(10mg/kg)施用IRO之后施用PolyI:PolyC的时间(10mg/kg)72小时28.42土1.22.03±2.0326.61±5.97IRO5对IRO施用后72小时注射的Polyl.PolyC所诱导的IL-12产生没有显示抑制作用。实施例13IRO针对TLR激动剂的短期和长期阻断活性为了评估IRO化合物的短期活性和选择性，在小鼠左胁皮下施用TLR激动剂之前1小时(-lh)，在小鼠右胁皮下注射2mg/kgIRO。在TLR激动剂施用之后2小时取得血清样品，并且使用从Biosource(Camarillo,CA)获得的多细胞因子/趋化因子检测Luminex试剂盒分析。遵循制造商建议的方案。根据j直。4吏用STarStation库欠4牛(AppliedCytometrySystems,Sacramento,CA)进4亍Luminex分析。以所示的剂量使用以下代表性激动剂5，-TCTGACGiTTCT-X-TCTTG!CAGTCT-5，(TLR9;敫动剂；0.25mg/kg，G产7-脱氮-dG)，R848(TLR7/8激动剂，0,1mg/kg)，洛索立宾(Loxoribine)(TLR7激动剂，100mg/kg),鞭毛蛋白(TLR5激动剂，0.25mg/kg),LPS(TLR4激动剂，0.25mg/kg)，Polyl.PolyC(TLR3激动剂，20mg/kg)和MALP画2(TLR2激动剂，0.5mg/kg)。结果示于图10-12。这些结果说明IRO能够抑制响应于TLR激动剂的细胞因子/趋化因子产生。与胞外TLR相比(例如TLR2、TLR4和TLR5),对于胞内TLR(例如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)效果更强。为了评估IRO化合物的长期活性和选择性，在小鼠左胁皮下施用TLR激动剂(如上所述)之前72小时(-72h),在小鼠右胁皮下注射10mg/kg的IRO。在TLR激动剂施用之后2小时取得血清样品，并且如上所述分析。结果示于图13-15。这些结果说明预施用IRO能够抑制TLR激动剂，并且即使在施用激动剂之前72小时施用的情况下，IRO的抑制活性也是有效的。实施例14狼疮小鼠模型中IRO化合物的活性将来自野生型(BALB/c)和狼疮易发性(MRL-lpr)小鼠的纯化小鼠脾B细胞与1吗/mlIRO-17在存在或不存在0.3|ug/mlIMO或0.3pg/mlIMO或仅培养基的条件下培养72小时。结果示于图16。这些结果说明IRO的施用能够抑制B淋巴细胞增殖。将来自野生型(BALB/c)和狼痴易发性(MRL-lpr)小鼠的纯化小鼠脾B细胞与1fig/mlIRO-17在存在或不存在0.3|xg/mlIMO或0.3|dg/mlIMO或仅培养基的条件下培养72小时。结果示于图17A。这些结果说明IRO的施用能够抑制小鼠B淋巴细胞产生IL-6。将来自野生型(BALB/c)和狼疮易发性(NZBW)小鼠的纯化小鼠脾B细胞在1吗/mlIMO存在下与0.01至10吗/mlIRO-17，或者仅与10|ng/mlIRO-17、1吗/mlIMO或培养基培养72小时。结果示于图17B和17C。这些结果说明IRO的施用能够抑制小鼠脾细胞产生IL-6和IL-12。向狼疮易发性MRL-lpr小鼠皮下注射IRO-5,从第9至第18周和第21至23周每周一次100吗剂量；或者皮下注射IRO-17,从第10至15周每周一次100吗剂量，第18-21周每周100吗三次，第22-24周每周40mg三次。每周在IRO注射之前收集血和尿。在第24周处死小鼠。用ELISA测定血清抗DNAIgGl水平。结果示于图18A至18E。这些结果说明IR05和IR017能够抑制狼疮易发性小鼠中的IgGl和IgG2A产生和尿蛋白。从第6周开始每两周一次用300jigIRO-5的剂量对狼疮易发性NZBW小鼠定量给药。在第16和20周测定血清抗DNAIgG2a水平。结果示于图19。这些结果说明IRO的施用抑制NZBW小鼠中的血清抗DNAIgG2a。权利要求1.TLR拮抗剂，其包含免疫调节性寡核苷酸(IRO)化合物。2.根据权利要求l的拮抗剂，其在免疫调节基序的旁侧序列中具有一种或多种化学修饰。3.根据权利要求l的拮抗剂，其在寡核苷酸基序中具有一种或多种化学修饰，所述寡核苷酸基序如果没有所述修饰则原本具有免疫刺激性。4.根据权利要求l的拮抗剂，其在寡核苷酸基序中具有一种或多种化学修饰，所述寡核苷酸基序如果没有该寡核苷酸基序旁侧序列中的修饰则原本具有免疫刺激性。5.具有结构5-Nm-N3N2N!CGN'N2N3-Nm-3，的IRO化合物，其中CG是寡核苷酸基序，C是胞嘧啶或嘧啶核苷酸衍生物或非核苷酸连接，G是鸟苷、嘌呤核苷酸衍生物或非核苷酸连接；Nl-N3在每次出现时独立地是核香酸、核苷酸衍生物或非核香酸连接；Nm在每次出现时独立地是核苦酸、核香酸衍生物或非核香酸连接；条件是G和/或C和/或Nl至N3中至少一个是核苷酸衍生物或非核苷酸连接；进一步的条件是该化合物含有少于4个连续的鸟苷核苷酸，其中该寡核苷酸基序如果没有所述核苷酸衍生物或非核苷酸连接则原本具有免疫刺激性；并且其中m是0至大约30的数字。6.药物组合物，其包含权利要求1-5的组合物中的任一种和药用载体。7.包含免疫刺激性寡核苷酸基序的TLR刺激性寡核苷酸的修饰方法，包括向免疫刺激性寡核苷酸基序和/或免疫刺激性寡核苷酸基序的旁侧序列中引入化学修饰，其中所述化学修饰阻抑所述免疫刺激性寡核苷酸基序的免疫刺激活性。8.用于抑制脊推动物中TLR介导的免疫应答的方法，所述方法包括向脊推动物以药学有效量施用根据权利要求1-5中任一项的IRO化合物。9.根据权利要求8的方法，其中所述施用的途径是非消化道、翁膜递送、口服、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶、目艮内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采取滴眼剂或漱口剂的形式。10.抑制TLR刺激的方法，包括施用IRO化合物。11.权利要求18的方法，其中所述TLR选自TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9。12.抑制TLR激动剂的活性的方法，其包括施用IRO化合物。13.根据权利要求20的方法，其包括与施用TLR激动剂同时施用IRO。14.根据权利要求20的方法，其包括在施用TLR激动剂之前施用IRO。15.权利要求16的方法，其中所述TLR激动剂选自TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。16.用于治疗性处理患有TLR介导的疾病的脊推动物的方法，该方法包括向所述脊推动物以药学有效量施用根据权利要求1-5的IRO化合物。17.根据权利要求16的方法，其中所述疾病是癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引发的疾病。18.根据权利要求16的方法，其中将所述IRO化合物与一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、TLR激动剂、TLR拮抗剂、肽、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗、佐剂或共刺激分子组合施用。19.根据权利要求16的方法，其中所述施用的途径是非消化道、黏膜递送、口服、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶、目艮内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采取滴眼剂或漱口剂的形式。20.用于预防脊推动物中癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哞喘或由病原体引发的疾病的方法，所述方法包括向所述脊推动物以药用有效量施用根据权利要求1-5中任一项的IRO化合物。21.根据权利要求20的方法，其中将所述IRO化合物与一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核香酸、TLR激动剂、TLR拮抗剂、肽、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗、佐剂或共刺激分子组合来施用。22.根据权利要求20的方法，其中所述施用的途径是非消化道、黏膜递送、口服、舌下、经皮、局部、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或采^U离眼剂或漱口剂的形式。全文摘要本发明提供新的作为TLR拮抗剂的免疫调节寡核苷酸(IRO)和它们的使用方法。这些IRO具有独特的序列，所述序列抑制或阻抑响应于TLR配体或TLR激动剂的TLR介导的信号传导。所述方法可以用于预防和治疗癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引发的疾病。文档编号C07H21/00GK101287742SQ200680038283公开日2008年10月15日申请日期2006年10月12日优先权日2005年10月12日发明者埃卡姆巴·R·坎迪马拉,巴加特·莱克施米,朱富刚,李玉魁,王大庆,东郁,阿格拉瓦尔·萨德尔申请人:艾德拉药物股份有限公司