胞苷二磷酸胆碱的纯化方法

专利名称：胞苷二磷酸胆碱的纯化方法
技术领域：
本发明涉及可用作药物原料、营养食品原料的胞苷二磷酸胆碱的
纯4b方法。
背景技术：
胞苷二磷酸胆碱(以下简称为CDP-胆碱)的制备方法已知有化学 合成方法(专利文献1、专利文献2)，使用微生物培养物或酶的方法(专 利文献3、专利文献4)。已知通过化学合成方法制备的CDP-胆碱的纯 化方法有使用阴离子交换树脂的方法(专利文献1)、将强酸性离子 交换树脂和弱碱性离子交换树脂组合使用的纯化方法(专利文献2), 后者的方法中使用两种离子交换树脂，虽然可以分离CDP-胆碱溶液 中所含的磷酸胆碱、胞苷-5，-一磷酸(以下简称为CMP),但是并不是 可有效分离尿嘧啶或尿苷-5，-三磷酸(以下简称为UTP)的方法。
专利文献1:日本特公昭63-6558号
专利文献2:日本特公平6-31306号
专利文献3:日本特许第3369236号
专利文献4:国际公开第99/49073号手册

发明内容
本发明的目的在于提供可以简便地分离CDP-胆碱和核酸类似物 的CDP-胆;威的纯化方法。 本发明涉及以下(1)-(6)。
(1) CDP-胆碱的纯化方法，其特征在于使含有核酸类似物且pH 为0.5或以上、5.0或以下的CDP-胆碱溶液与H型强酸性阳离子交换 树脂接触，将吸附在该树脂上的CDP-胆碱用水或离子浓度为0.1 mol/L或以下的水溶液洗脱，分离纯化CDP-月旦石咸。
(2) 上述(l)的CDP-胆碱的纯化方法，其中，该CDP-胆碱溶液是 由如下得到的介质制备的溶液使具有由UTP的前体和胆碱或磷酸胆 碱生成CDP-胆碱的活性的生物催化剂与UTP前体、以及胆碱或磷酸胆碱或它们的盐在水性介质中共存，在该介质中生成并累积CDP-胆减。
(3) 上述(2)的CDP-胆碱的纯化方法，其中，生物催化剂含有具有 由UTP的前体生成UTP的能力的微生物培养物或该培养物的处理物、 以及具有由UTP和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的能力的微生物培 养物或该培养物的处理物。
(4) 上述(2)的CDP-胆碱的纯化方法，其中，生物催化剂含有催化 由UTP的前体和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的反应的酶。
(5) 上述(4)的CDP-胆碱的纯化方法，其中，催化生成CDP-胆碱 的反应的酶选自乳清酸磷酸核糖基转移酶、乳清苷-5，-磷酸脱羧酶、 尿苦磷酸化酶、尿嘧咬磷酸核糖基转移酶、尿普激酶、尿苷酸/胞苷酸 激酶、核苷二磷酸激酶、胞苷-5，-三磷酸合成酶、磷酸胆碱转胞苷酰 酶、以及胆碱激酶。
(6) 上述(l)-(5)的CDP-胆碱的纯化方法，其中，核酸类似物是选 自尿嘧啶和UTP的物质。
本发明可以提供CDP-胆碱及其盐。
实施发明的最佳方式
本发明中使用的CDP-胆碱溶液只要是含有核酸类似物且pH为 0.5或以上、5.0或以下的溶液即可，可以是以任何方法制备的溶液， 所制备的CDP-胆碱溶液的pH为0.5-5.0则可以直接使用，如果比5.0 大，则可以添加盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等酸，如果pH比0.5小， 则可以添加氢氧化钠、氢氧化钾等^<，将pH调节为0.5或以上、5.0 或以下，优选1.0或以上、3.5或以下4吏用。
H型强酸性阳离子交换树脂只要是H型强酸性阳离子交换树脂即 可，可以是凝胶型也可以是多孔型，具体有Dow Chemical Company />司制备的Dowex系歹'J(例如HCR國S、 HCR画W2、 Marathon C、 MONOSPHERE 650C、 MSC-1、 MONOSPHERE 88、 50Wx2、 50Wx4、 50Wx8等)、三菱化学制备的Diaion SK系歹'J(例如SK1B、SK104、 SK110、 SK112等)、三菱化学制备的Diaion PK系歹寸(例如PK208、 PK212、 PK220， PK228等)、Rohm and Haas制备的AMBERLITE系歹'J (例如IR120B、 IR124等)等。
H型强酸性阳离子交换树脂的交联度只要是可以分离CDP-胆石成 和核酸类似物的交联度即可，没有特别限定，优选2-10%,进一步优 选4-6%。
H型强酸性阳离子交换树脂优选以填充到柱子中的形式在本发明 中使用，本发明中使用的柱可以是任何柱。
通过将含有核酸类似物且pH为0.5或以上、5.0或以下的CDP-胆碱溶液通入填充了 H型强酸性阳离子交换树脂的柱中等，与该树脂 接触，使CDP-胆碱吸附于该树脂上，例如在过填充了交联度为2-10% 的H型强酸性阳离子交换树脂的柱时，过柱速度为SV=0.1-5.0,优选 SV=0.2-3.0。
通过上述吸附处理，可以将CDP-胆石威与溶液中所含的核酸类似 物例如乳清苷-5，-一磷酸(以下简称OMP)、尿苷-5，-一磷酸(以下简称 UMP)、尿苷-5，-二磷酸(以下简称UDP)、 UTP、 CMP、胞苷-5，-二磷酸 (以下简称CDP)、胞苦-5，-三磷酸(以下简称CTP)等嘧啶系核酸物质分 离并除去。即使在pH为0.5或以上、5.0或以下使含有核酸类似物中 的尿嘧啶或UTP的CDP-胆碱溶液与该树脂接触，它们也几乎或者完 全不吸附在该树脂上，因此特别适合分离除去尿嘧啶或UTP。
吸附于H型强酸性阳离子交换树脂的CDP-胆碱通过将离子浓度 为0.1mL/L或以下、优选0.03mL/L或以下的水溶液、进一步优选水 过柱等进行洗脱，由此，CDP-胆碱可从树脂中洗脱，可分离纯化CDP-胆碱。
通过上述洗脱步骤，所收集的含有CDP-胆碱的液体可以根据需 要，使用活性碳处理或者是使用非极性多孔质合成吸附剂例如三菱化 学制备的Diaion HP系列(例如HP20、 HP21等)、三菱化学制备的Diaion SP800系列(例如SP825、SP850等)、三菱化学制备的Diamond ionSP200 系列(例如SP207等)、Rohm and Haas制备的AMBERLITEXAD系列(例 如XAD4、 XAD7HP、 XAD16HP、 XAD1180、 XAD2000等)等进行脱 色处理。
上述含有CDP-胆碱的液体或脱色液可用酸或碱调节至pH 2.0-4.0，根据需要浓缩后，将CDP-胆碱的浓度调节至50-800 g/L,优 选100-700 g/L,使用有机溶剂、优选丙酮、乙醇、曱醇、丙醇等亲水性的有机溶剂获得CDP-胆碱晶体。
将上述含有CDP-胆碱的液体或脱色液可用氢氧化钠调节至pH 5.0-9.5，根据需要浓缩后，将CDP-胆碱浓度调节至50-800 g/L,优选 100-700 g/L，使用有机溶剂、优选丙酮、乙醇、曱醇、丙醇等亲水性 的有机溶剂获得CDP-胆碱钠盐晶体。
使用有机溶剂获得CDP-胆碱晶体的方法例如有向CDP-胆碱溶 液中添加有机溶剂，使晶体析出的方法；或者是向大量的有机溶剂中 滴加CDP-胆石威溶液，^f吏晶体析出的方法。
本发明中，含有核酸类似物的CDP-胆碱溶液只要是含有CDP-胆 碱和核酸类似物的溶液即可，可以是任何溶液，可以是通过化学合成 法，以及使用具有由UTP的前体和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的 活性(以下简称为C D P -胆碱生成活性)的生物催化剂的方法制备的溶
液o
该生物催化剂可以是具有CDP-胆碱生成活性的微生物的培养物、 该培养物的处理物、催化生成CDP-胆碱的反应的酶等。
该微生物只要是具有CDP-胆碱生成活性的微生物即可，可以是 任何微生物，原本具有CDP-胆碱生成活性的微生物可以直接用于 CDP-胆碱的生产，原本不具有CDP-胆碱生成活性的微生物可以通过 导入编码催化由UTP的前体和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的反应 的酶的DNA来用于CDP-胆碱的生产。该微生物优选为属于埃希氏杆 菌属(五sc/^n'c/ /a)、沙雷氏菌属0Sem3"a)、芽孢杆菌属CSa"7/w)、短 杆菌属(5reW^"en'wm)、 棒状杆菌属(Coo^eZ ""en'M附)、孩t杆菌属 (M/cTo6a"er/謂)、假单胞菌属(尸膽(/o,薩)、链球菌属 (S/re/^ococc^s)、才艮瘤菌属(iSz7zor/H'zo6&w)、嗜血4干菌属(//aemo/7/^7"s)、 节杆菌属04W/^o^"er)、金杆菌属04MMO^"en'wm)、纤维单胞菌属 (Ce〃w/cwoww)、 棍状杆菌属(C7av/^c化r)、 短小杆菌属 (Cwr/o6a"en'MW2)、月旨肪4干菌属(尸/附eroZ)a"er)、酵母属(Sacc/ aromyces)、 裂殖糖酵母属(Sc/^osacc/iaraw^c^)、 克鲁维氏酵母属 (A7^yveromyc^)、 丝孢酵母属(7Wc/zo印on w)、 许旺氏酵母属 0Sc^mm"!'omj;c^)、毕赤氏酵母属(尸z'c/n力)、和假丝酵母属(Om^^)的 微生物等。
属于埃希氏杆菌属的微生物有大肠杆菌MM294 (Escherichia coli
6MM294)、大肠杆菌XL1-Blue (&c/^hc/^ co// XL1-Blue)、大肠杆菌 XL2-Blue (五scAen,c&,a co//XL2-Blue)、大肠牙干菌DH1 (E^c/^n'c力/a co/7 DH1)、大肠杆菌MC1000 (Escherichia coli MC1000)、大肠杆菌KY3276 (^sc/^n'c/^ KY3276)、大肠杆菌W1485 C^c/^Wc/^ W1485)、 大肠杆菌 JM109 (五"/^n'c/n'a JM109)、 大肠杆菌HB101
C^c/^n'c/^Vz co" HBIOI)、大肠杆菌No.49 (Esc/^hc/n力co" No.49)、大 肠杆菌W3110 C^c/^n'c/ 'fl co//W3110)、大肠杆菌NY49 CE^/^n'c/n'a co//NY49)、大肠杆菌GI698 (&c/^n'c/^ co"GI698)、和大肠杆菌TBI (」&c/^hc/ 'a co// TB1 )等属于埃希氏杆菌属的微生物。属于沙雷氏菌属 的微生物例如有无花果沙雷氏菌CS^ra"a ,can'a)、居泉沙雷氏菌 (iSemz",a/oWco/a)、 解凝沙雷氏菌/—、 以及粘质沙 雷氏菌0S^7yz"am『c^ce""等。属于芽孢杆菌属的孩i生物有枯草芽 孑包4干菌(5ac"/ws wZ "7&)、 巨大芽孑包4干菌CSac/〃m meg"/en'mw)、解淀#分 芽孢杆菌(5ac/〃ws amy/o/^^e/flc/e""等。属于短杆菌属的孩t生物有 5rev/Z ac"n'ww /mman'o/ A//ww 、 解#唐#豆才干菌 (5rev/Z a"en.ww mcc力(3to/3^c"w)、 黄色短4干菌(5rev7'Z a"en,ww 、乳发酵短菌
(5reWZ a"en'w附/a"o/enwewm附)等。属于才奉一犬斥干菌属的樣i生净勿有谷 氛酸棒状軒菌 ATCC13032 (Co，efta"erZ簡 g/齒m/c簡 ATCC13032)、 谷氨酸4奉状杆菌 ATCC13869 (Coo^"eZ^"ehwm g/wtom/cwm ATCC13869)等属于谷氨酸棒状杆菌的微生物，产氨棒状 杆菌ATCC6872 (Co，e6a"en'謂認歸m.agewes ATCC6872)、 产氛棒 讶犬4干菌ATCC21170 (Corywe6a"en'wm awzwom.agewes ATCC21170)等属 于产氨棒状杆菌的微生物，嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870 (Co^7"eZ a"en'wm acWoac^/o/ / 7wm ATCC13870)等属于卩耆乙酰乙酸才奉 状杆菌的微生物等。属于微杆菌属的微生物有嗜氨微杆菌 ATCC15354 (Af/croZjacfen'w附am附ow/a/ Az./i/m ATCC15354)等属于p者氛 微杆菌的微生物、乳酸微杆菌(MZcn Zja"en'wm /ac"w附)、和蛾微杆菌 (MZcra^"en'wm fm; en'a/e)等。属于假单胞菌属的微生物有恶臭假单 胞菌(尸"wJowo"w; t/^/a)等。属于链球菌属的微生物有肺炎链球菌 0S"印Mcoccw ; wew附om'ae)等。属于中华根瘤菌属的微生物有苜蓿 中华根瘤菌(57woW/zoWMm me"/o")等。属于嗜血杆菌属的孩i生物有 流感嗜血杆菌(i/aemo/7/n7ws /"/7we"zae)等。属于节杆菌属的孩i生物有er g/o^/orm的等。属于金杆菌属的微生物有浅黄金杆菌(JwreoZ^c"n'ww y7"vMce似)、天牛金杆菌(^4wreo^ac^n'MW2 sape/^/ae)、石争红色金4干菌 (Jwreo6a"ehMm ^^acewm)等。属于纤维单胞菌属的微生物有产黄 纤维单胞菌(Cd/w/omowas //cm'gewa)、卡氏纤维单胞菌(Ce〃w/omowas carm)等。属于棍状杆菌属的微生物有密执安棍状杆菌(C/aW^"er mZc/H-gawew^X)、 4i氏才昆^犬牙干菌(C7av/6a"er ra"ay0等。属于4豆小^干菌 属的微生物有(Cwr/oZ^"er/"w a/Z7WM附)、柠檬色短小杆菌 (CwWo6ac化n'ww c"rewm)、 ,口膝黄少豆'J、才干菌(CwWo6ac化n'"m /w化w附)等。 属于脂肪杆菌属的微生物有简单脂肪杆菌(巧wera^"w Wm; /e;c)等。
属于酵母属的;f效生物有卩卑酒并唐酵母(5V cc/ an9mj^es cerew'Wae) 等。属于裂殖糖酵母属的微生物有粟酒裂殖糖酵母 (5W^oy"cc力araw3^ey/7om6e)等。属于克鲁维氏酵母属的微生物有乳 克鲁维氏酵母(《/w"^w^c^/ac^)等。属于丝孢酵母属的微生物有 茁芽丝孢酵母(7Wc/20^ ora";w〃w/fl/w)等。属于许旺氏酵母属的微生物 有河岸许旺氏酵母(5^/^朋"/0附>^^"//"诃1 )等。属于毕赤氏酵母属 的微生物有巴斯德毕赤氏酵母(巧c/n'fl;^Wor!X)等。属于^f艮丝酵母属 的微生物有产朊假丝酵母(CawAV/" ""7的等。
该微生物更优选属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒 状杆菌属和酵母属的微生物，进一步优选属于埃希氏杆菌属、短杆菌 属、棒状杆菌属的微生物。
上述微生物中，即使是原本具有CDP-胆碱生成活性的微生物， 其CDP-胆碱生成活性如果不够强，也可以按照常规方法向该微生物 中导入具有编码催化由UTP的前体和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-月旦石咸 的反应的酶的DNA的重组DNA、或者将与具有该活性的其它微生物 的细胞融合，制备该活性得到强化的微生物。
该活性得到强化的微生物和具有该活性的微生物优选按照以下 所示方法，将编码催化该反应的酶的DNA导入^f效生物中，使用所得 到的转化体。
编码催化由UTP的前体和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的反应 的酶(以下简称为CDP-胆碱生成酶)的DNA例如有编码具有由乳清 酸生成OMP的活性的乳清酸磷酸核糖基转移酶[EC 2.4.2.10]、具有由
8OMP生成UMP的活性的乳清苷-5，-磷酸脱羧酶[EC 4.1.1.23]、具有 由尿嘧啶生成尿苷活性的尿苷磷酸化酶[EC 2.4.2.3]、具有由尿嘧，定生 成UMP的活性的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶[EC 2.4.2.9]、具有由尿苷 生成UMP的活性的尿苷激酶[EC 2.7.1.48]、具有由UM P生成UDP 的活性的尿普酸/胞苷酸激酶[EC 2.7.1.48]、具有由UDP生成UTP的 活性的核香二磷酸激酶[EC 2.7.4.6]、具有由UTP生成CTP的活性的 胞苷-5，-三磷酸合成酶[EC 6.3.4.2](以下简称PyrG)、具有由胆碱生成 磷酸胆^5威的活性的胆〃喊激酶[EC 2.7.1.32](以下简称CKI)的DNA,以
胞苷酰酶[EC 2.7.7.15](以下简称为CCT)。
编码CDP-胆碱生成酶的DNA优选编码PyrG、 CKI和CCT的 DNA。
编码PyrG的DNA是从大肠杆菌的染色体中克隆的，其全部石成基 序列已经确定[J. Biol. Chem. , 261, 5568(1986)]。具有编码PyrG的 DNA的重组体可以是将来自大肠杆菌的、含有编码PyrG的DNA的 2426 bp的Nrul-Pstl片段插入到大肠杆菌的载体pCU8 [Gene, 19, 259(1982)]的多克隆位点Smal-Pstl位点所得的质粒pMW6 [ Biosci. Biotechnol. Biochem.， 61， 956 (1997)]等。
编码CCT的DNA其全部》威基序列已得到确定[Eur. J. Biochem.， 169,477(1987)]。具有编码CCT的DNA的重组体DNA有向来自 大肠杆菌的载体pUC18 [Gene, 19, 259(1982)]的多克隆位点Smal 位点插入来自酵母的含有编码CCT的DNA的1296 bp的Dral片段所 得的质粒pCC41 [生化学，60, 701(1988)]等。
编码CKI的DNA也同样是由酵母染色体克隆，其全部碱基序列 已确定[J. Biol. Chem" 264， 2053(1989)]。具有编码CKI的DNA的 重组体DNA有向酵母和大肠杆菌的穿梭载体YEpM4 [ Mol. Cell. Biol.， 7, 29(1987)]中插入来自酵母的、含有编码CKI的DNA的2692 bp的PstI-HindIII片段所得的质粒pCKID [J. Biol. Chem., 264， 2053(1989)]等。
上述质粒可按照公知的方法[Nuc. Acids Res., 7, 1513(1979)],从保
有这些质粒的大肠杆菌中分离纯化。
例如可按照Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition,Sambrook等人编著、Cold Spring Harbor Laboratory (2001),从上述所 得的质粒中获得编码CDP-胆碱生成酶的DNA,将该DNA掺入到表 达载体中，制备重组体DNA,将上述微生物作为宿主细胞进行转化， 由此可以获得具有CDP-胆碱生成活性的生物催化剂。
首先，由上述质粒pMW6、质粒pCC41或质粒pCKlD获得编码 PyrG、 CCT或CKI的DNA,以所得DNA为基础，根据需要制备含 有编码该多肽的部分的适当长度的DNA片段。
还可根据需要将编码CDP-胆碱生成酶的部分的碱基序列进行石威 基置换，制成DNA,形成最适合宿主细胞表达的密码子。该DNA可 在CDP-胆碱生成酶的高效制备中有用。
通过将该DNA片段或全长DNA插入到适当的表达载体的启动子 下游，可以制备重组载体。此时，可以将编码CDP-胆碱生成酶的DNA 分别插入到表达载体中，还可以将多个DNA插入到同 一表达载体中。
将该重组载体导入到适合该表达载体的宿主细胞中。
宿主细胞可以是上述微生物。
表达载体可以在该宿主细胞中自主复制、以及可掺入到染色体 中，并在可转录编码CDP-胆碱生成酶的DNA的位置上含有启动子使 用。
宿主细胞使用细菌等原核生物时，优选含有编码CDP-胆碱生成 酶的DNA的重组载体在原核生物中可自主复制，同时是由启动子、 核糖体结合序列、该DNA、转录终止序列构成的载体。还可以包括控 制启动子的基因。
表达载体例如有BTrp2、pBTacl 、pBTac2 (BERINGAMANHAIMU 公司销售)、pKK233-2 [Pharmacia制备]、pSE280 [Invitrogen制备]、 pGEMEX-1 [Promega制备]、pQE-8 [QIAGEN制备]、pKYP10 (日本特 开昭58-110600号)、pKYP200 [Agric. Biol. Chem.， 48， 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescript II SK(-) [Stratagene制备]、 pTrs30 [由大肠杆菌JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制备]、pTrs32 [由 大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2 [由大肠杆菌 IGHA2(FERM BP-400)制备、日本特开昭60-221091号]、pGKA2 [由 大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备、日本特开昭60-221091号]、pTerm2 (美国专利4686191号、美国专利4939094号、美国专利5160735 号)、pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、 pGEX [Pharmacia制备]、pET系统[Novagen制备]等。
启动子只要可在宿主细胞中发挥功能即可，可以是任何启动子。 例如可以是trp启动子(Ptrp)、 lac启动子、Pt启动子、PR启动子、T7
启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。还可以使用如将2个Ptrp
串联连接的启动子(PtrpX2)、 tac启动子、lacT7启动子、letl启动子那 样人为设计改变的启动子等。
优选使用将核糖体结合序列——Shine-Dalgarno序列与起始密码 子之间调节成适当的距离的(例如6-18个碱基)的质粒。
本发明的重组载体中，编码CDP-胆碱生成酶的DNA的表达不一 定要有转录终止序列，不过优选在结构基因的紧下方配置转录终止序 列。
重组载体的导入方法只要是可以向上述宿主细胞导入DNA的方 法即可使用，例如有使用钙离子的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号)、或Gene, 17, 107 (1982)或Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)的方法等。
使用酵母作为宿主细胞时，表达载体例如有YEpl3 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等。
启动子只要是可在酵母菌抹中表达的启动子均可使用，例如有己 糖激酶等糖酵解系统的基因的启动子、PH05启动子、PGK启动子、 GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal IO启动子、热休克多 肽启动子、MFal启动子、CUP1启动子等。
重組载体的导入方法只要是可以向酵母中导入DNA的方法均可 使用，例如有电穿孔法[MethodsEnzymol.,iM， 182 (1990)]、原生质球 法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, H， 1929 (1978)]、醋酸锂法[J. Bacteriology, ill, 163 (1983)]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 21, 1929 (1978)中记载的方法等。
微生物只具有CDP-胆碱生成活性的一部分时，为了获得CDP-胆 碱生成活性，可以适当将2种或以上微生物组合，作为具有CDP-月旦 碱生成活性的生物催化剂使用。微生物具有CDP-胆碱生成活性时也可以将两种或以上纟效生物组合使用。
2种或以上微生物的组合可以选自上述微生物的任意一种，例如 有选自属于埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒 状杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属、链球菌属、中华根瘤菌属、嗜血 杆菌属、节杆菌属、金杆菌属、纤维单胞菌属、棍状杆菌、短小杆菌 属、脂肪杆菌属、酵母属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、丝孢酵 母属、许旺氏酵母属、毕赤氏酵母属、和假丝酵母属的微生物等的属 于同 一 个属的微生物或者不同属的微生物的组合。
例如可以是属于棒状杆菌属的微生物与属于埃希氏杆菌属的微 生物组合等，具体有产氨棒状杆菌ATCC21170和大肠杆菌 MM294/pCKG55林(FERM BP-3717)的组合(日本专利第3369236号、 美国专利第6387667号)等。
具有CDP-胆碱生成活性的生物催化剂之一的、具有CDP-胆碱生
的微生物的培养物。
该微生物为细菌等原核生物或酵母等真核生物时，培养该微生物 的培养基只要是含有该微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等，可 有效地进行该微生物的培养的培养基即可，可以是天然培养基、合成 培养基的任意一种。
碳源只要是该微生物可同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果糖、 蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，乙酸、丙 酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类等。
氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或 有机酸的铵盐，其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、 玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各种发酵菌体及其 消化产物等。
无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化 钠、磷酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钓等。
培养是在振荡培养或通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度 可以是15-5(TC,培养时间通常为16小时-7天。培养中的pH优选保 持3-9。 pH的调节可使用无机或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、 氨等进行。该微生物为转化体、且用于转化该微生物的重组体DNA保有抗 生素抗性基因时，可以在培养该微生物的培养基中添加与该重组体 DNA所保有的抗生素抗性基因对应的抗生素。
使用两种或以上微生物培养物或该培养物的处理物作为生物催
化剂时，可使用可按照上述方法将各微生物在分别的或同一培养基中 培养所得的生物催化剂。
将两种或以上微生物在同一培养基中培养时，可以将这些微生物 同时培养，也可以在培养一种微生物的过程中、或培养结束后将其余 的微生物在该培养基中培养。
微生物的培养物的处理物有用表面活性剂、有机溶剂或溶菌酶 等细胞溶解酶对上述方法得到的微生物的培养物进行处理得到的表 面活性剂、有机溶剂或细胞溶解酶处理培养物。可分别单独使用表面 活性剂、有机溶剂或细胞溶解酶对该微生物的培养物进行处理，也可 以将它们组合处理该微生物的培养物。还有通过浓缩机或干燥机等 对由上述方法得到的微生物的培养物进行浓缩或干燥处理，将得到的 该微生物的培养物的浓缩物或干燥物；以及通过过滤或离心等将该微 生物的培养物进行固液分离得到的菌体；将该菌体用干燥机等进行干 燥处理得到的该菌体的干燥物。还有将该菌体用表面活性剂、有机 溶剂或溶菌酶等细胞溶解酶、或者它们组合进行处理得到的该菌体的 表面活性剂处理物或有机溶剂处理物、细胞溶解酶处理物等。
使用两种或以上微生物时，可以将两种或以上培养物的处理物分 别用作具有CDP-胆碱生成活性的生物催化剂，也可以将这些培养物 的处理物混合，将所得混合物用作具有CDP-胆碱生成活性的生物催 化剂。
CDP-胆碱可如下制备将上述生物催化剂与UTP的前体、以及 胆碱或磷酸胆碱或者它们的盐在介质中接触，生成CDP-胆碱并使其 在该介质中积累，从该介质中获取CDP-胆碱。
UTP的前体有乳清酸、OMP、尿嘧啶、尿苷、UMP和UDP等， 优选乳清酸和尿嘧啶。
具体的生成CDP-胆碱并积累的方法是将上述生物催化剂和UTP 的前体以及胆碱或者磷酸胆碱或它们的盐在介质中混合，根据需要向 所得混合物中添加其它成分，使pH保持5-11 ，更优选6-10,在20-50°C
13下寸呆持2-48小时。
生物催化剂的使用量根据该生物催化剂的比活性等而不同。例如
用将该培养物丄该培^物:处理物离心所得的湿菌体，相对于i' mg
氯化胆减Z使用5-500 mg,优选10-300 mg。
胆碱、磷酸胆碱和它们的盐例如有胆碱、氯化胆碱、溴化胆石咸、 碘化胆碱等面化胆碱，碳酸氬胆碱、硫酸甲基胆碱、柠檬酸二氢胆碱、 酒石酸氩胆碱、磷酸胆碱、氯化磷酸胆石威等磷酸胆石威的卣化物等，优 选使用胆碱或磷酸胆碱的卣化物，进一步优选使用氯化胆碱、氯化磷 酸胆碱。
UTP的前体、胆碱、磷酸胆碱以及它们的盐可以是化学合成获得， 也可以通过发酵法等由生物获得。纯化至高纯度的产品也可使用。另 外，各种底物均有市售，可容易地获得。
UTP的前体、胆碱、磷酸胆碱以及它们的盐的浓度优选1 mmol/L-l mol/L，进一步优选10-100 mmol/L。
必须的其它成分有生成CDP-胆碱所必需的能量供给体、磷酸 离子、镁离子、铵离子、表面活性剂和有机溶剂等。在可由生物催化 剂等带来所需量时，则无需添加这些成分。
能量供给体可使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖，糖蜜、淀粉水解物 等，甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。它们均优选以0.02-2.0 mol/L的浓度 使用。
磷酸离子可以使用正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸等聚磷 酸，聚偏磷酸、磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸一钠、磷酸二钠等无机磷 酸盐等。这些磷酸离子优选以10-500 mmol/L的浓度使用。
镁离子可使用硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机镁盐，柠檬酸镁等 有机镁盐。镁离子优选以5-200 mmol/L的浓度使用。
铵离子可以使用氨水、氨气、各种无机和有机铵盐、酵母提取物、 玉米浆等。还可以使用谷氨酰胺或含有谷氨酰胺的肽或酪蛋白氨基酸 等有机营养源代替铵离子。这些铵离子浓度优选以10mmol/L-2mol/L
的浓度使用。
表面活性剂是二辛基^Tu代琥珀酸钠(例如Rapisol B-80，日本油脂 制备)、月桂酰肌氨酸盐等阴离子性表面活性剂、聚氧乙烯/鲸蜡基醚(例如Nonion P-208,日本油脂制备)等非离子性表面活性剂、烷基二 曱胺(例如叔胺FB，日本油脂制备)等叔胺类等，只要是可催化CDP-胆碱的生成的表面活性剂均可使用。它们通常以0.1-100 g/L、优选1-50 g/L的范围使用。
有机溶剂有二曱苯、曱苯、脂族醇(曱醇、乙醇、丁醇等)、丙 酮、乙酸乙酯、二曱基亚砜等。它们通常以0.1-100 mL/L、优选1-50 mL/L的浓度使用。
作为使生物催化剂与UTP前体和胆碱或磷酸胆碱或它们的盐接
基、该微生;的培养物、i^养物的上清等，也可以使用'水性介质。 水性介质有水、磷酸緩冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌溱-N-乙磺酸)
缓冲液、三[三(羟基曱基)氨基甲烷]盐酸緩沖液等緩冲液。
只要不阻碍反应，即可以向该介质中添加有机溶剂。有机溶剂有
丙酮、乙酸乙酯、二曱基亚砜、二曱苯、曱醇、乙醇、丁醇等。
上述CDP-胆碱的制备方法可以是使用以产氨棒状杆菌
ATCC6872和大肠杆菌MM294/pCKG55林(FERM BP-3717)作为生物
催化剂，生产CDP-胆碱的方法(日本专利第3369236号、美国专利第
6387667号)。
CDP-胆碱生成酶有选自选自乳清酸磷酸核糖基转移酶、乳清苷 -5，-磷酸脱羧酶、尿苷磷酸化酶、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶、尿苷激 酶、尿苷酸/胞苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、PyrG、 CCT、和CKI的1 种或多种酶。
将上述具有酶活性的微生物用匀浆器等破碎，然后进一步实施盐 析处理、等电位沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种色谱 处理等通常的酶的纯化方法，可以将得到的粗制酶或纯化酶用作CDP-胆碱生成酶。还可以将该微生物的破碎物直接作为上述酶使用。
上述微生物破碎物、粗制酶或纯化酶固定在水不溶性的载体或凝 胶等上，将其作为上述酶使用。
CDP-胆碱可如下制备使上述酶与UTP的前体、以及胆碱或磷 酸胆碱或它们的盐在介质中接触，生成CDP-胆碱并使其在介质中积 累，从该介质中收集CDP-胆碱。
具体的生成CDP-胆石威并积累的方法可以是将上述酶和UTP的
15前体以及胆碱或磷酸胆碱或它们的盐在介质中混合，根据需要向所得
混合物中添加其它成分，保持pH为5-11,更优选6-10，在20-50°C 下寸呆持2-48小时。
CDP-胆碱生成酶的用量根据该酶的比活性等而不同。例如使用粗 制酶作为该酶时，相对于1 mg氯化胆碱可使用1 fxg-500 mg,优选10 jig-300 mg。
使用CDP-胆碱生成酶生成CDP-胆碱并积累时所添加的UTP的前 体、胆碱、磷酸胆碱、它们的盐以及根据需要添加的其它成分与使用 上述微生物的培养物等生成CDP-胆碱并积累时的情况同样，还可根 据需要添加腺苷-5，-三磷酸等作为能量供给体，还可进一步添加5-磷 酸核糖二磷酸。
作为使CDP-胆;成生成酶与UTP的前体和胆石威或磷酸胆石威或者它 们的盐接触的介质，可以使用培养用作生物催化剂的微生物的培养 基、该微生物的培养液、培养上清等，也可以使用水性介质。
水性介质有水、磷酸緩冲液、HEPES (N-厶羟乙基哌嗪-N-乙磺酸) 緩冲液、三[三(羟基曱基)氨基曱烷]盐酸緩沖液等緩冲液。
如上所述，从生成并积累有CDP-胆碱的介质中制备CDP-胆碱溶 液时，可使用膜分离、过滤、离心等方法从该介质中分离除去固形物 质。
由上述方法制备的CDP-胆碱溶液中所含的核酸类似物有尿嘧啶、 UTP等。
CDP-胆碱或核酸类似物可通过采用高效液相色谱(UV检测)的常 规方法进行分析。
通过以下的实施例进一 步具体说明本发明，但本发明并不受这些 实施例的限定。
实施例1
使用强酸性阳离子交换树脂纯化CDP-胆碱
将50 g CDP-胆碱(和光纯药工业制备)、2 g尿嘧啶(Nacalai Tesque 制备)、1 g UTP (Nacalai Tesque制备)溶解于水中，制备5 L CDP-胆碱 溶液。将该溶液用硫酸调节至pH3.0，过填充了 10L交联度为4%的 强酸性阳离子交换树脂Diamond ionPK208 (H型)的柱。接着通入水，通过高效液相色谱分析获得尿嘧啶、UTP的各浓度相对于CDP-胆碱 低于0.1% (w/w)的组分。将CDP-胆碱组分浓缩至100 mL，緩慢添加 350mL乙醇。滤取析出的晶体，用100%乙醇溶液洗涤，然后在20°C 下减压干燥三天。结果获得了 40 g相对于CDP-胆碱尿嘧啶、UTP各 浓度低于0.1% (w/w)的CDP-胆碱晶体。
实施例2
从具有生成CDP-胆碱的能力的微生物培养物中纯化CDP-胆碱
将具有PyrG、 CCT、 CKI的酶活性的大肠杆菌MM294/pCKG55 抹(FERM BP-3717)接种于加入了 10 mL含50吗/mL氨卡青霉素的L 培养基[含有10 g/L胰蛋白胨(Difco制备)、5 g/L酵母提取物(Difco制 备)、5g/LNaCl， pH调节为7.2的液体培养基]的试管中，在25。C下 以300 rpm振荡培养24小时。将20 mL该培养液接种于加入了盛有 400 mL含有50 pg/mL氨卡青霉素的L培养基的2L带挡板三角烧瓶 中，在25。C下以190rpm旋转振荡培养16小时。将125mL该培养液 接种于加入了 2.5 L含有5 g/L葡萄糖(另行灭菌)、5g/L蛋白胨(极东 制药工业制备)、6 g/L Na2HP04、 3 g/L KH2P04、 5 g/L NaCl、 1 g/L NH4C1、 250 mg/L MgS04.7H20 (另行灭菌)和4 pg/L维生素Bl(另行灭 菌)组成的液体培养基(未调节pH)的5L容量的培养槽中，在600rpm、 通气量2.5 L/分钟的培养条件下，在25。C下搅拌11小时、然后在32°C 下搅拌13小时，用14。/o氨水调节至pH7.0,进行培养。培养过程中， 从培养开始第11小时至第24小时期间，通过蠕动泵以30mL/小时的 速度流入含有167g/L葡萄糖、167g/L蛋白胨的组成的培养液。
另一方面，将具有由乳清酸生成UTP的活性的产氨棒状杆菌 ATCC21170抹接种于加入了 10 mL含有50 g/L葡萄糖、10 g/L聚胨(大 五荣养化学制备)、10 g/L酵母提取物(大五荣养化学制备)、5 g/L尿素、 5 g/L (NH4)2S04、 lg/LKH2P04、 3 g/L K2HP04、 1 g/L MgS04.7H20、 0.1 g/L CaCl2-2H20、 10 mg/L FeS04'7H20、 10 mg/L ZnS04.7H20、 20 mg/LMnS04' 4-6H20、 20 mg/L L-半胱氨酸、10 mg/L D-扁桃酸钙、5 mg/L维生素Bl 、 5 mg/L烟酸和30 pg/L生物素(用氢氧化钠调节pH7.2) 的组成的液体培养基的试管中，在28。C下以300 rpm往复振荡培养24 小时。将20 mL该培养液4矣种于加入了 230 mL与上述相同组成的液体培养基的2L带挡板三角烧瓶中，在28。C下以190rpm旋转振荡培 养24小时。将250 mL该培养液接种于5L容量的加入了 2.5 L含有 100 g/L葡萄糖、10 g/L肉膏、10 g/L聚胨、1 g/L KH2P04、 1 g/L K2HP04、 1 g/L MgS04'7H20、 0.1 g/L CaCl2'2H20、 20 mg/L FeS04'7H20、 10 mg/L ZnS04'7H20、 20 mg/L MnS04- 4-6H20、 15 mg/L p-丙氨酸、20 mg/L L墨 半胱氨酸、100(ig/L生物素、2 g/L尿素(另行灭菌)和5 mg/L维生素 Bl (另行灭菌)(用氢氧化钠调节pH7.2)的组成的液体培养基的培养槽 中，在32。C下以600 rpm搅拌、2.5 L/分钟通气量的培养条件下用浓 氨水调节至pH6.8，进行种培养。在上述种培养上清中的葡萄糖被消 耗掉时，无菌采集350 mL培养液，接种于5加入了 2.5 L含有180 g/L 葡萄糖、10g/LKH2PO4、 10g/LK2HPO4、 10 g/L MgS04'7H20、 0.1 g/L CaCl2-2H20、 20 mg/L FeS04'7H20、 10 mg/L ZnS04.7H20、 20 mg/L MnS04= 4-6H20 (另行灭菌)、15 mg/L卩-丙氨酸、20 mg/L L-半胱氨酸、 2g/L谷氨酸钠、100fxg/L生物素、2 g/L尿素(另行灭菌)和5 mg/L维 生素Bl (另行灭菌)(用氢氧化钠调节pH7.2)的组成的液体培养基的5 L培养槽中，在32。C下600 rpm搅拌、2.5L/分钟通气量的培养条件下， 用浓氨水调节至pH6.8，进行正式培养。待培养上清中葡萄糖消耗掉 时结束培养。
将360 mL上述得到的大肠杆菌MM294/pCKG55 ^M々培养液和 360 mL产氨棒状杆菌ATCC21170林的培养液加入到2L容量的培养 槽中，向其中添加100 g/L葡萄糖、10g/L乳清酸、8.4g/L氯化胆碱、 5 g/LMgS04.7H20、 20mL/L二曱苯，加入蒸馏水，使总量为800 mL。 在32。C下800 rpm搅拌、通气量0.8 L/分钟的条件下，将该混合液用 10当量氢氧化钠将pH调节至7.2进行反应。反应中途适当添加 KH2P04,使反应上清中磷酸浓度以KH2P04的形式保持为l-5g/L。进 行23小时的反应，生成11.0g/LCDP-胆碱。
用硫酸将上述4次的反应液调节至pH 1.0 ，通过离心(7000 rpm, IO分钟)分离菌体，向所得上清液中添加水，制成6 L (6.0 g/L CDP-胆石咸、0.5g/L尿嘧p定、1.0g/LUTP)。将该胞苷二磷酸胆石威溶液过填 充了 10 L交联度为4%的强酸性阳离子交换树脂Diamond ionSK104 (H型)的柱。持续通入水，通过高效液相色谱分析获得相对于CDP-胆碱尿嘧咬、UTP各浓度低于0.1% (w/w)的组分。使用活性碳对CDP-
18胆碱组分进行脱色，然后浓缩至100mL。向该浓缩液中緩慢添加350 mL乙醇，滤取析出的晶体。将所得晶体用100%乙醇溶液洗涤，然后 在20。C下减压干燥3天。结果得到18gCDP-胆碱晶体，该CDP-胆碱 晶体中，相对于CDP-胆碱尿嘧啶、UTP各浓度低于0.1% (w/w)。
实施例3
由具有生成CDP-胆碱的能力的微生物的培养物纯化CDP-胆碱钠
jnt 。
用硫酸将与实施例2同样得到的四次的反应液调节至pH 1.0,通 过离心(7000 rpm, IO分钟)分离菌体，向所得上清液中添加水，制成 6 L (6.0 g/L CDP-胆碱、0.5g/L尿嘧啶、1.0 g/L UTP)。将该胞苷二磷 酸胆碱溶液过填充了 10 L交联度为4%的强酸性阳离子交换树脂 Diamond ionSK104 (H型)的柱。持续通入水，通过高效液相色谱分析 获得相对于CDP-胆碱尿嘧啶、UTP各浓度低于O.P/c) (w/w)的组分。 用氢氧化钠将CDP-胆碱组分调节至pH 7.5,使用活性碳进行脱色， 然后浓缩至100mL。向该浓缩液中緩慢添加400mL乙醇，滤取析出 的晶体。将所得晶体用100%乙醇溶液洗涤，然后在20。C下减压干燥 3天。结果得到20 g CDP-胆碱晶体，该CDP-胆碱晶体中，相对于CDP-胆石威尿嘧啶、UTP各浓度低于0.1% (w/w)。
以上结果表明，将含有核酸类似物的CDP-胆碱溶液用强酸性阳 离子交换树脂仅处理一次，即可以简便地获得不含有杂质的CDP-胆 碱或其盐。
产业实用性
本发明可低成本提供CDP-胆碱及其盐。
19
权利要求
1. CDP-胆碱的纯化方法，其特征在于使含有核酸类似物且pH为0.5或以上、5.0或以下的胞苷二磷酸胆碱(以下简称为CDP-胆碱)溶液与H型强酸性阳离子交换树脂接触，将吸附在该树脂上的CDP-胆碱用水或离子浓度为0.1mol/L或以下的水溶液洗脱，分离纯化CDP-胆碱。
2. 权利要求1的CDP-胆碱的纯化方法，其中，该CDP-胆碱溶 液是由如下得到的介质制备的溶液使具有由尿苷-5，-三磷酸(以下 简称为UTP)的前体和胆石威或磷酸胆石威生成CDP-胆;威的活性的生物 催化剂与UTP前体、以及胆石威或磷酸胆石威或它们的盐在水性介质中共 存，在该介质中生成并累积CDP-胆碱。
3. 权利要求2的CDP-胆碱的纯化方法，其中，生物催化剂含有 具有由UTP的前体生成UTP的能力的微生物培养物或该培养物的处 理物、以及具有由UTP和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的能力的微 生物培养物或该培养物的处理物。
4. 权利要求2的CDP-胆碱的纯化方法，其中，生物催化剂含有 催化由UTP的前体和胆碱或磷酸胆碱生成CDP-胆碱的反应的酶。
5. 权利要求4的CDP-胆碱的纯化方法，其中，催化生成CDP-胆44的反应的酶选自乳清酸磷酸核糖基转移酶、乳清苷-5，-磷酸脱羧 酶、尿苷磷酸化酶、尿嘧咬磷酸核糖基转移酶、尿苷激酶、尿苦酸/ 胞苷酸激酶、核普二磷酸激酶、胞苷-5，-三磷酸合成酶、磷酸胆碱转 胞苷酰酶、以及胆碱激酶。
6. 权利要求1-5中任一项的CDP-胆碱的纯化方法，其中，核酸 类似物是选自尿嘧"定和UTP的物质。
全文摘要
本发明提供胞苷二磷酸胆碱的纯化方法，其特征在于使含有核酸类似物且pH为0.5或以上、5.0或以下的胞苷二磷酸胆碱溶液与H型强酸性阳离子交换树脂接触，将吸附在该树脂上的胞苷二磷酸胆碱用水或离子浓度为0.1mol/L或以下的水溶液洗脱，分离纯化胞苷二磷酸胆碱。
文档编号C07H19/10GK101448846SQ20068003768
公开日2009年6月3日 申请日期2006年8月10日 优先权日2005年8月10日
发明者村田英城, 盐见道夫, 目代强 申请人:协和发酵工业株式会社