生物材料及其用途的利记博彩app

专利名称：生物材料及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及重编程分化细胞或细胞的细胞核和重编程的细胞或细 胞的细胞核的用途。特别的，本发明公开了重编程分化细胞来生产胚 胎干细胞样细胞的方法。
背景技术：
胚胎干细胞是能产生在它起源的生物体内的任何其他细胞类型的 多潜能干细胞。多潜能细胞具有发育成能依次形成每一种机体器官的 全部细胞的所有三类胚胎组织层的能力，并被用来描述能形成机体内 任何和所有细胞及组织的干细胞。这同具有分化成胚外膜和组织、胚 胎和所有胚后组织和器官的能力的全能细胞精细地不同。分化细胞是组成生物体机体组织的细胞，并且，在正常体内情况 下，通常被认为其发育潜能是受到限制的。分化细胞可能会是末端分 化的，即，它们在发育上被阻止为特定的细胞类型(例如，神经元、 肌肉细胞和骨细胞)，或它们可能会保留产生有限数目的在特定谱系内 的其他细胞类型(例如，能产生包括嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和 中性白细胞的许多种免疫细胞的骨髓祖细胞)。哺乳动物，和特别是人类，胚胎干细胞提供了治疗和/或预防许多 人类疾病或病态的可能性。特别地，胚胎干细胞提供了产生大范围人 类细胞类型的方法，这样的细胞具有巨大的治疗价值。然而，当前在 大多数发达国家，在围绕获得和使用哺乳动物尤其是人类胚胎干细胞 的方面存在伦理上和实践上的问题。胚胎干细胞通常起源于胚胎内称作内细胞团(ICM)的多潜能细 胞群，该群是完整生物体起源的细胞群。ICM在发育的早期出现，典 型地是在受精后三到五天，这依赖于所讨论的物种。通过使用克隆操 作，有可能从给定物种的任何个体来生产胚胎。典型地，在当前的克 隆操作中，哺乳动物分化细胞的细胞核被以称为核移植的程序转移入去核的通常来源于同一物种的哺乳动物卵母细胞(Campbdl et al., 2005， Reprod Dom Anim 40:256-268 )。已知核移植是难于操作的并且成功率低(Campbell et al., 2005, Reprod Dom Anim 40:256-268)。当成功时，移植的细胞核DNA被受体 卵母细胞重编程，通过模拟受精效应，所述卵母细胞然后能被刺激来 形成胚胎。通常，所述卵母细胞被刺激进入有丝分裂，并且在桑椹胚或胚泡 期被移植入'收养'母亲的子宫。该操作具有非常低的成功率并且仅 能生产非常少的有活力的胚胎。在胚胎形成的那些例子中，所述ICM 可能被分离来提供能用在其他应用中的胚胎干细胞。当这种操作被应用于人类或哺乳动物胚胎时，它被称作治疗性克 隆，但它有实践上和伦理上必须考虑的事。在实践方面，获得胚胎干 细胞需要来源于雌性动物的卵细胞的捐献，在实践中该卵细胞被局限 为哺乳动物卵细胞，并且这些卵细胞的回收是昂贵的并且从一个雌性 动物中仅能获得非常少的卵细胞。在伦理方面并且尤其是在与人类有 关时，对在另一个过程中作为中间产物的胚胎的生产，例如在治疗性 克隆中生产的胚胎仅作为胚胎干细胞的供体存在广泛的拒绝。因此，存在研制能用在治疗性过程且在没有克隆程序下并且尤其 是在没有使用哺乳动物卵母细胞的情况下获得多潜能、.胚胎干细胞样 细胞来简单生产提供胚胎干细胞的胚胎的需求。通过用分化细胞从克隆实验生产有活力的能繁殖的动物，之前已 经将分化细胞的细胞核成功地向多潜能状态重编程(Wilmut et al (1997) Nature 385:810-813; Polejaeva et al (2000) Nature 407:86-90)。这些操作 具有非常低的效率和成功率。在这些操作中，分化细胞核被通过核移 植移入去核哺乳动物卵母细胞中并暴露到哺乳动物卵母细胞中的因子 中而重编程到多潜能，所述的因子重新活化细胞核中的基因，并通过 胚胎的产生给予所述细胞多潜能。在这些例子中，所有的操作均在使 用来源于同目的细胞相同物种的物质的情况下进行。细胞中的多潜能可能会通过寻找大量标记基因的表达而被鉴定。 在人中，这些基因包括POU5Fl(编码转录因子Oct-4)、NANOG、Rex-l、 Sox-2和Tert (Ginis et al" 2004 Dev Biol 269:Pages 360-380)。技术熟练人员将从上下文理解其中的POU5 (Oct-4)和NANOG或被提及的任何其他基因或蛋白而不管它是不是被讨论的基因或基因产物。Oct-4是通常在包括胚胎干细胞的多潜能细胞中发现和表达的转 录因子，但它在正常分化细胞中不表达。Oct-4的活化是同被重编程向 相似于多潜能性状态的细胞一致的。Oct-4的实验消除导致胚胎中ICM 的彻底缺失，和继续分化成原始外胚层的胚胎干细胞未分化表型的丧 失(Nichols et al (1998) Cell. 95:379-391 )。Nanog是也能在多潜能细胞中发现的另一种转录因子。在nanog 表达缺少的情况下，胚胎干细胞丧失了它们的多潜能性(Chambers (2004) Cloning Stem Cells 6:386-391 )。存在对生产胚胎干细胞或相似于胚胎干细胞的细胞(所谓的胚胎 干细胞样细胞)而没有产生完整胚胎以克服干细胞领域实践上和伦理 上必须要考虑的事情的方法的需求。因此，本发明以称为重编程的程 序提供更改例如来源于哺乳动物分化细胞的分化细胞和/或它们的细胞 核的发育潜能到同胚胎干细胞多潜能状态相似的更多潜能的状态的方 法。发明内容在本发明的第一方面，提供了生产重编程细胞或重编程细胞的细胞 核的方法，该方法包含暴露分化细胞或分化细胞的细胞核到起源于冷 血脊椎动物卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎的细胞或细胞抽提物，其中的冷血脊椎动物具有一个或多个如下性质(i) 包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在鱼中的从位于后部的髋骨延伸而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构(bodyplan);(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(iii) 卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽 提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。优选地，卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或细胞抽提 物表达高度保守形式的Oct-4和nanog。可选地，所述方法能被描述为重编程分化细胞来表达nanog和/或表 达Oct-4和/或是多潜能的方法，所述方法包含暴露分化细胞到冷血脊 椎动物的卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎、或其抽提物，其 中的冷血脊椎动物具有一个或多个下述性质(i) 包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在鱼中的从位于后部的 髋骨延伸而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构。(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(iii) 卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽 提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。优选地，卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或细胞抽提 物表达高度保守形式的Oct-4和nanog。进一歩可选地，所述方法能被描述为本发明提供生产胚胎干细胞样 细胞的方法，或生产重编程的细胞的细胞核的方法，该方法包含将分 化细胞或分化细胞的细胞核同冷血脊椎动物的卵母细胞、卵细胞、卵 巢细胞或早期胚胎、或其抽提物接触，其中的冷血脊椎动物具有一个或多个下述性质(i) 原始脊椎动物基本结构；'(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(iii) 表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog的卵 母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞。重编程细胞是已经去除或改变其正常分化功能的细胞。重编程细胞 的细胞核是其正常分化功能已经被去除或改变的细胞核。分化细胞是已经发育成具有特定功能的特定细胞类型的细胞，例如 神经细胞或肌肉细胞。这些细胞在正常情况下通常不能发育成其他细 胞类型。在本发明的上下文，重分化细胞是已经是一种特定细胞类型 并且通过使用本发明的方法已经被处理来形成干细胞并随后再一次转 化成分化细胞的细胞。重分化细胞可能会是同它最初分化类型相同或 不同类型的细胞。原始基本结构通过考虑属于生物体骨骼结构的两个特定标准的一个或两个能确 定生物体是否具有原始脊椎动物基本结构。第一个标准涉及肋骨结构， 第二个标准涉及髋骨。原始鱼和原始两栖动物具有相似的骨骼结构， 该骨骼结构同带有所谓的"派生的"骨骼(无尾动物(蛙)骨骼；硬 骨鱼骨骼)的生物体的骨骼结构显著对比。诸如肺鱼或蝾螈的具有原始脊椎动物基本结构的生物体具有从脊 骨横向放射的肋骨。这是引起哺乳动物肋架的脊椎动物骨骼的原始情 况。通过同诸如具有派生基本结构的硬骨鱼的生物体对比，该类生物 体的肋骨是背腹放射而不是横向放射。这个不同使得具有原始脊椎动 物基本结构的鱼同那些没有该基本结构的鱼区别开来。作为考虑肋骨的其它选择，具有原始脊椎动物基本结构的生物体也 能通过考虑髋骨而被鉴定。在原始鱼中，骨盘附件从骨骼后部区域中 的髋骨扩展而来。在硬骨鱼骨骼中，髋骨在靠近或邻近肩带甚至是同 肩带融合的非常靠前的、在大约鱼体的中途点或甚至是那个点的前面、 靠近头的定位盆鳍的位置中发现。被蝾螈(美西螈)所例证的原始两 栖动物骨骼保留了连到骨骼后部区域的髋骨。相对照的蛙类具有高度 派生和扩大的骨盆带。此外，蛙类具有大大降低的数目的在骨盆带前 的椎骨。图5图解了鱼和两栖动物中原始脊椎动物基本结构的保留。原始鱼 和原始两栖动物间的骨骼结构的相似性能被清楚地看到，因为在同派 生骨骼的结构相比较的结构中能清楚看到不同。该图比较了代表原始 脊椎动物基本结构的肺鱼骨骼和代表派生的脊椎动物基本结构典型的 硬骨鱼骨骼。也比较了蝾螈(美西螈)和蛙(光滑非洲蟾蜍)的骨骼。肺鱼骨骼以背面图显示(从背的方向看)。重要地，硬骨鱼显示了 侧面图，图示了背腹向的脊髓投射/肋骨放射，而不是横向的。两栖动 物骨骼也是背面图。在鱼骨骼图中，小箭头指向在肺鱼中从脊髓横向 投射的骨头/肋骨。这是产生肋廓的脊椎动物骨骼的原始情况。请注意， 硬骨鱼肋骨腹侧投射，而不是横向投射。这是硬骨鱼的革新。支持鱼 鳍的背部和腹部投射也是硬骨鱼的革新。原始鱼保留了进化成具有四 肢的陆生的四脚动物四肢的四肢。重要地，大箭头指向原始鱼和原始 两栖动物中的髋骨。这是定义原始鱼的一个特点，因为在硬骨鱼中该髋骨消失。原始脊椎动物基本结构在Johnson a a/(2003) Evolution and Development 5:4, 414-431中被更详细地讨论。如被原肠胚形成运动所定义的，鲟鱼、海龟、肺鱼和哺乳动物全都 分享了相似的胚胎学。因此，原始脊椎动物基本结构能被鉴定，例如，在X-射线上通过肋 骨和/或脊髓投射的横向和非背腹向投射。可选的骨骼鉴定是鱼中的髋 骨。没有胚质的生殖细胞在雌性动物中，生殖细胞是指卵母细胞或发育成卵母细胞的前体细胞。当在卵巢中时，卵母细胞定义雌性动物生殖细胞，在排卵后，卵细 胞定义雌性动物的生殖细胞。胚质是在卵细胞、卵母细胞或某些生物体胚胎中发现的含有将产生 生殖细胞谱系的决定子的胞质区域。在没有胚质的动物中，这些同样 的分子被分布到整个卵细胞胞质中，也可能到GV (胚泡)中。这些诸 如"amw、 vma和t/az/基因产物的分子是典型的RNA结合蛋白，或编 码这些分子的信使RNAs，因为这些分子在胚胎干细胞中被发现，因此 它们可能涉及到多能性重编程过程中。具认为，在具有胚质的生物体 中，这些分子被局部化，因此它们在卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或 早期胚胎、或其抽提物中是低丰度和相对不能获得的，这样，使具有 胚质的生物体不适于重编程分化细胞。优选地，与本发明有关，具有原始脊椎动物基本结构的冷血脊椎动 物也具有不含胚质的卵母细胞/卵细胞(生殖细胞)。胚质的存在与否可 能解释了某些生物体如何发育。的确，通过观察生物体的基本结构， 预测在该生物体内的卵母细胞/卵将是否具有胚质是可能的。特别的， 定义躯干后部末端的后肢是关键性的。在缺少胚质时，生殖细胞起源 于在大约被髋骨定义的脊骨部位的后外侧中胚层，它们被形成来适应 被排除到这个胚胎后部区域的胞外信号。这些细胞稍后发育成卵母细 胞。在存在胚质时，生殖细胞在更靠前的位置发育并且产生的生物体具有相对靠前的成体形态。具有胚质的生物体的卵母细胞、卵细胞、 卵巢细胞和早期胚胎同那些不具有胚质的相比，其细胞和细胞核重编 程效率更低。展示了原始脊椎动物基本结构的生物体被理解为在它们的生殖细 胞中不具有胚质。原始脊椎动物基本结构的保留被认为是缺少胚质的 后果。为了鉴定那些卵母细胞/卵含有胚质的动物，定义躯干后外侧的后肢 是关键的。在缺少胚质时，生殖细胞起源于在大约被髋骨定义的脊骨 位置的后侧中胚层。其卵含有胚质的动物不需要被生产生殖细胞所需 的胞外后部信号，因为这些细胞被卵提供的物质所特定化，而不是被 从胞外信号而来的物质所特定化。因此，在具有胚质的诸如蛙类和硬 骨鱼的绝大多数动物中，这些动物具有相对靠前的成体形态。这些动 物的卵母细胞和卵在重编程中没有用处。已经显示，曾经被认为是哺乳动物的革新的哺乳动物中胚质的缺少 在物种的特定谱系中己经是保守的，这些谱系保留了作为在动物的这 个谱系中原始脊椎动物基本结构保留的结果的原始胚胎学特征。在胚 胎保留了原始特征并保留了原始成年脊椎动物形态的哺乳动物和冷血 脊椎动物物种的胚胎中，称为PGCS的产生生殖系(精子和卵细胞)的 干细胞起源于在发育早期出现的多潜能前体。然而，在大多数实验中， 诸如非洲蟾蜍或斑马鱼(硬骨鱼)生物体的非哺乳动物的PGCs通过与 哺乳动物完全不同的机理形成，并且，等同于哺乳动物的那些多潜能 前体的等效物从未形成。在非洲蟾蜍和斑马鱼中，生殖细胞通过含有 生殖细胞决定子的胚质的不相称分布在非常早的时候就与体细胞分离开来。遗传了胚质的细胞然后变成PGCs而不产生体细胞。图7图示了大量不同生物体的卵母细胞中胚质的分布。在非洲蟾蜍 卵母细胞中编码XJaz/和XcW2的RNAs被显示，编码va a的RNA在 肺鱼卵母细胞中显示。编码d。z/和vasa的RNA为鲟鱼卵母细胞而显 示。卵母细胞切片同对这些分子特异的探针反应，并且这些探针通过 使用碱性磷酸酶结合的抗体和颜色检测的标准方法进行检测。Xdazl 和Xcat2 RNAs局限于胞质内，指示了胚质。肺鱼卵母细胞中的Vasa RNA和鲟鱼卵母细胞中的vasa和dazl RNA是均匀分布的，指示了胚乂贝口、J跳，。现在认为，在哺乳动物中产生PGCs的机理在某些更低级的动物中 也存在，但仅在那些符合特定标准的物种中。这些物种能在它们基本 结构的基础上被鉴定。符合这些标准的物种，例如美西螈，具有同哺 乳动物中的PGC发育相似的PGC发育，和例如编码Oct-4和nanog的 基因的控制生殖细胞发育的基因的补足物，并因此能重编程分化细胞， 特别是哺乳动物分化细胞。因此可能能准确预测，符合前面提及的标 准的某些物种的卵母细胞将具有同美西螈相等的重编程潜能。不符合 这些标准的物种将不具有相同的保守的多潜能基因的补足物，因此， 将不具有相等的重编程能力。符合所述标准的物种具有被认为是胚质 缺少的结果的原始脊椎动物基本结构。重要地，因为在缺少胚质时， Oct-4和nanog是生产PGCs所需的，因此Oct-4和nanog的保留被认 为是不具有胚质的结果。成体是它们的胚胎学的产物。由于胚胎学是保守的，因此，成体基 本结构是保守的。强迫胚胎的、阻止在蛙类和硬骨鱼中所见的主要改 变的机理是生产生殖细胞的机理。在不具有胚质的动物中，PGCs具有 更微弱的存在，假如它们的生产所需的信号被改变，它们能被消除， 并将在胚胎细胞运动中发生主要改变。假如胚质存在，PGCs对这些信 号的改变是抗拒的，因为无论如何它们都形成。这样，在胚胎上的强 迫被消散、胚胎学的细胞运动发生改变，这是为什么具有胚质的动物 能具有同它们的原始基本结构不同的形态的原因。没有胚质这个现象 不会发生。如被原肠胚形成运动所定义的，鲟鱼、海龟、肺鱼和哺乳 动物均分享了相似的胚胎学。Oct-4禾口/或nanog的表达优选地，保留原始脊椎动物基本结构的冷血脊椎动物也具有表达 Oct-4和nanog的卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞。Oct-4禾n/或Nanog表达可能会通过测定编码所述蛋白的mRNA或测 定蛋白产物本身进行测定。进行该测定方法的例子包括测定mRNA的 RT-PCR法(Makin d a/, technique 2 p295-301 (1990))或测定蛋白产物的抗体法。为了使在卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞中的Oct-4 和/或nanog被认为是高度保守的，其必须同人转录因子Oct-4或人 nanog蛋白的DNA结合区域(DBD)分别有至少69%的氨基酸同一性。 对于美西螈Oct-4蛋白AxOct-4，它的73%的氨基酸同小鼠Oct-4 DBD 同一，75%的氨基酸同人0ct-4 DBD同源。来源于斑马鱼和非洲蟾蜍 的被基因ZP0U-2和XLPOU91编码的不分别给予重编程分化细胞所述 能力的最接近的蛋白是63%同一的，少于所需的69%同一性。功能等 效的Oct-4基因的同一性和活性能通过使用诸如实施例中公开的那些 技术人员熟悉的标准方法进行检测。优选地，在人0ct-4 DBD和冷血脊椎动物间提起的氨基酸同一性允 许不改变氨基酸残基极性或电荷的氨基酸保守改变。保守改变的例子 是本领域技术人员所熟知的，并且包括，例如， 一个诸如异亮氨酸、 缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的疏水氨基酸残基取代为另一个疏水氨基 酸，或诸如精氨酸取代赖氨酸的一个极性氨基酸取代为另一个极性氨 基酸。优选地，当测定两个蛋白序列间的氨基酸同一性时，保守氨基 酸改变被考虑为相同的氨基酸。因此，氨基酸序列中的保守氨基酸改 变将不影响两条氨基酸序列间的氨基酸同源性百分比。为了进一步支持对上面讨论的内容的理解，编码各种物种的Oct-4 的基因被比较，那些分享经过鉴定为相似的形态特征的物种比缺少该 形态特征的物种被显示出具有更紧密相关的0ct-4编码基因。在这些实 验中，0ct-4编码基因从满足原始形态学描述的标准的水螈 (Notopthalmus viridens)、 f每湾鱼寻鱼(Asciperser oxyrhynchus)、非洲月市 鱼(Protopterus annectans)和红耳红腹拟龟(一种海龟，T.scripta)分 离而来。在图6中，从这些物种分离的Oct-4编码相关基因的DNA序 列被同从其他物种分离的属于公共数据库一部分的最紧密相关的基因 序列相比较，设计来追踪Oct-4编码基因进化历史的假设系统树被图 示。在正常条件下，基因序列进化追踪了动物的进化亲缘关系(即物 种种类史)。因此，由于在蝾螈亚目(美西螈和水螈)和蛙科(非洲蟾 蜍、蟾蜍、中国林蛙)间更近的从共同的两栖动物祖先的分枝，它们 的相关基因的任何序列将被期望是比它们将会是从诸如鱼、爬行动物或哺乳动物等其他进化上更远的物种而来的等效基因序列更相似的。 与诸如哺乳动物和两栖动物等更高级的物种相比，所有的鱼均保存了 相同的必然性(logic)。然而，同传统的系统发育预测相比较，在图6 中的分析显示，蝾螈亚目(即美西螈)、水螈、鲟鱼、肺鱼和海龟的每 一种均含有同小鼠和人Oct-4基因高度相关的基因，同义基因在它们最 紧密相关的姐妹群，即蛙类、斑马鱼等中没有发现。在图6中显示的基因序列关系对科学共同体(scientific community)不是显然的，将不 会在任何传统进化的观点上被预测到。美西螈(蝾螈亚目物种v4mZ ，toma 廳:dc(3/7画)白勺Oct-4基因同喃 乳动物Oct-4基因的相关度比在所述数据库中包括的来源于非洲蟾蜍 的与Oct-4相关的几个基因的任何其他基因同哺乳动物Oct-4基因的相 关度更高，并能拯救ES细胞，在某些情况下，诸如XLPOU91，比美 西螈Oct-4基因更好(Morrison and Brickman， 2006)。(图8显示了美 西螈和小鼠序列的比较)。这个结果暗示，Axoct-4基因是哺乳动物Oct-4 基因的真正的同源物(即通过祖先和功能相关的基因)(这个结论也被 表达谱所支持(Bachvarova ef (2004) Developmental Dynamics 231:871-880)。从祖先Oct-4序列的复制而来的非洲蟾蜍基因数目越高， 就越同Axoct-4和随后的机理亚功能化相似(Prince and Pickett, 2002; NatRev. Genet.: 3; 827-37)。这个结果暗示，美西螈卵母细胞同哺乳动 物卵母细胞的生化相似性比与不含真正的同源Oct-4的非洲蟾蜍卵母 细胞的生化相似性更高。在哺乳动物中，Oct-4是生产PGCs所必需的。在非洲蟾蜍中不是这 样，这意味着任何Oct-4同义基因不是哺乳动物Oct-4的真正同源物。 美西螈Oct-4和表达谱机理的同源性现在暗示，Oct-4是生产PGCs所 必需的。这个观察可能会促成理解为什么美西螈卵母细胞具有比非洲 蟾蜍卵母细胞更高的重编程分化细胞到多潜能的能力，在重编程能力 方面，美西螈卵母细胞表现更像哺乳动物卵母细胞。同时，因为胚质 的缺少也使这些卵母细胞/卵同哺乳动物更相似，因此，与非洲蟾蜍相 比，这一点可能也被涉及到美西螈优良的重编程能力。胚质的缺少可 能会允许诸如Nanos、 vasa和dazl等与胚质相关的全是RNA结合蛋白 的其他因子变得更易于重编程。已经证明，美西螈具有比蛙类Oct-4基因与哺乳动物Oct-4基因更 紧密相关的Oct-4基因，据理解，其他具有与哺乳动物Oct-4基因更紧 密相关的Oct-4基因的生物体也将能重编程哺乳动物分化细胞。同时， Axoct-4的表达谱是同早期哺乳动物胚胎的表达谱等效的。这样，鲟鱼 和肺鱼、其他的蝾螈和"原始鱼"将全具有同美西螈相当并远超非洲 蟾蜍、其他蛙类或硬骨鱼的重编程能力。优选地，重编程细胞是胚胎干细胞样细胞。术语"胚胎干细胞样细胞"在本文中用来指已经被重编程来显示胚 胎干细胞的性质的分化细胞或含有显示胚胎干细胞性质的重编程分化 细胞的细胞核的细胞。在被去分化或重编程前，当同这些细胞中的相 同的参数比较时，胚胎干细胞样细胞可能包括一个或多个但不限定于 下述性质无转化的繁殖；持久的繁殖；自我更新和产生广泛组织的 能力；分化成相同或不同于原始分化细胞的细胞类型的能力(多潜能)。优选地，重编程细胞和/或重编程细胞的细胞核表达Oct-4。可选地， 重编程细胞或重编程细胞的细胞核仅表达nanog。重编程细胞或重编程 细胞的细胞核也可能会是多潜能的。很方便地，根据本发明的任何方法生产的重编程细胞和/或重编程细 胞的细胞核既表达Oct-4也表达nanog和/或其它多潜能标记。其它的 多潜能标记包括Sox-2、 Rex-l和TERT。细胞是否是多潜能的能通过多潜能性质的存在进行鉴定，这些性质 能使所述细胞被刺激来分化成它起源的生物体内几乎任何细胞类型。 多潜能细胞的分化能通过暴露多潜能细胞到祖先介质和/或某些生长因 子中而被诱导，Lanza， 2004. Handbook of Stem Cells: Embryonic/Adult and Foetal Stem Cells 。优选地，在冷血脊椎动物卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎 细胞或细胞抽提物中的Oct-4禾P/或nanog与人类形式的Oct-4和/或 nanog相比是高度保守的，通过这个现象，我们解释在冷血脊椎动物中 的Oct-4 DNA结合区域同人转录因子Oct-4具有至少69%的氨基酸同 源性。优选地，对于nanog基因，同人nanog蛋白分享的类似区域的 同源性将至少是69%，最优选地，是75%。有利地，在冷血脊椎动物卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞中的Oct-4和/或nanog同人转录因子Oct-4或人nanog蛋白的DNA 结合区域(DBD)分别具有至少69%的氨基酸同源性。氨基酸同源性能通过使用ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucl. Acids. Res., 22 p4673-4680或任何可选的氨基酸序列比较工具进行测 算。ClustalW方法能用下述参数进行使用配对比对参数-方法精确矩阵(Matrix): PAM，间隙开放罚分(penalty) 10.00，间隙延伸 罚分(penalty): 0.10;多重比对参数-矩阵(Matrix): PAM，间隙开放罚分(penalty): 10.00， ％延迟同源性30;罚(Penalize)末端间隙开间隙分离 距离0，阴性矩阵无间隙延伸罚分(penalty): 0.20，残基-特定间隙罚 分(penalty):开，亲水间隙罚分(penalty):开，亲水氨基酸残基 GPSNDQEKR。特定氨基酸残基的序列同源性被确定为包括被简单衍 生化的相同氨基酸残基。替代的参数也可能是合适的。核苷酸序列同源性也能通过使用下述参数的ClustalW (Thompson et a1.(1994))进行测定配对比对参数-方法精确，矩阵(Matrix): IUB，间隙开放罚分(penalty): 15.00，间隙延伸 罚分(penalty)- 6.66;多重比对参数-矩阵(Matrix): IUB，间隙开放罚分(penalty): 15.00， ％延迟同源性30，阴性矩阵无，间隙延伸罚分(penalty): 6.66， DNA转换加权0.5。替代的参数也可能是合适的。优选地，编码保守Oct-4和/或nanog的任何核苷酸序列具有同人 Oct-4和/或nanog序列(按照上面公开的实验)或在O.l X SSC 65°C (其中的SSC=0.15 MNaCl、 0.015M柠檬酸钠、pH7.2)的洗涤条件 下同人Oct-4禾口/或nanog序列杂交的编码同人Oct-4禾口/或nanog功能 等效的蛋白超过69%，例如75%、 80%、 90%或95°/。的同一性。本发明的多肽既包括全长的多肽也包括多肽片段。这样的多肽可能通过任何常规的方法制备。功能等效的蛋白或蛋白片段指的是具有同人Oct-4禾口/或nanog至少 69%序列同源性并保留同人Oct-4禾口/或nanog相同功能的蛋白或蛋白片 段。这样的功能能通过本文公开的任何方法进行检测。根据本发明，"核酸分子"包括单链和双链DNA、 RNA和cDNA。 能编码功能等效的多肽的核苷酸序列的衍生物可能会通过使用本领域 所熟知的任何常规方法而获得。包括所有蛙类、所有硬骨鱼、所有鸟类和大多数爬行类的在缺少保 守Oct-4基因的基本结构的基础上预测的生物体的组远大于保留了原 始基本结构的和保留了保守Oct-4基因(包括有尾两栖动物)和编码 nanog的同源物的基因的组。因此，只有非常小数目的物种的卵母细胞、 卵巢、卵和早期胚胎或其抽提物适用于本发明。下述谱系保留了保守 的脊椎动物基本结构蝾螈(美西螈或notopthalamus )海龟鍔鱼 '盲鳗纲(Hyperotreti)(八目鳗类鱼hagfish)七鳃鳗纲(Hyperoartia)(八目鳗lamprey)软骨鱼纲(Chondrichthyes)(鲨鱼、魟鱼、鳐、chimeras)软骨硬鳞鱼纲(Chondrostei)(硬骨鱼纲bichirs、鲟鱼、匙吻鲟)半椎鱼目(Semionotiformes)(长嘴硬鳞鱼)弓鳍鱼目(Amiiformes)(弓鳍鱼)肺鱼亚纲(Dipnoi)(肺鱼);禾口腔棘鱼纲(Coelacanthimorpha)(腔棘鱼)。因此，优选地，冷血脊椎动物从包含两栖动物、爬行类动物和鱼的 组中选择。优选地，冷血脊椎动物从包含蝾螈、海龟、蜥蜴、鳄鱼、盲鳗纲(八 目鳗类鱼)、七鳃鳗纲(八目鳗)、软骨鱼纲(鲨鱼、魟鱼、鳐、chimeras)、 软骨硬鳞鱼纲(硬骨鱼亚纲、鲟鱼、匙吻鲟等)、半椎鱼目(长嘴硬鳞 鱼)、弓鳍鱼目(弓鳍鱼)、肺鱼亚纲(肺鱼)和腔棘鱼纲(腔棘鱼)的组中选择。最优选地，冷血脊椎动物从包含蝾螈、海龟、肺鱼和鲟鱼的组中选择。合宜地，所述冷血脊椎动物是包括美西螈和notopthalmus的蝾螈。 可替换蝾螈地，所述冷血脊椎动物是鲟鱼科学上的属Acipenser)。 一个特别的优点是，在提及的大部分生物体中，获得卵母细胞、卵 细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或它的细胞抽提物相当简单，并且这 些材料是丰富的。两栖动物和硬骨鱼能具有哺乳动物卵细胞体积的几 千倍的卵，并且，在数量上远超哺乳动物卵组织，例如鲟鱼(从该鱼 中获得鱼子酱)能生产其体重15-25%的卵细胞。收回的材料能被储藏 并在需要时使用。与此相对照，哺乳动物卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞材料和/或早期 胚胎稀少且难于获得，此外所述物质在数量上也非常受限。从光滑非洲蟾蜍或任何其它蛙类或任何硬骨鱼而来的卵母细胞、卵 细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞和细胞抽提物不适用于本发明的任何 方法。蛙类和硬骨鱼(都是冷血脊椎动物)是没有保留原始基本结构 的两栖动物和鱼的例子，已知它们的卵母细胞含有胚质，并且它们的 Oct-4蛋白与人Oct-4蛋白相比不是高度保守的。优选地，卵母细胞、卵或早期胚胎细胞抽提物包含从卵母细胞、卵 或早期胚胎细胞的细胞核或胚泡(GV)而来的物质。所述细胞核和GV含有特定的转录因子Oct-4和Nanog。 位于蛙类sna硬骨鱼胚质内的编码生殖细胞特定RNA结合蛋白的 RNADazl、 VASA和Nanos在胞质中是均匀分布的(Johnson et al., 2001, 243:402-415; Dev，. Biol.; Bachvarova et al.， Dev.争.231, 871-880)并能 维持具有胚质的生殖细胞中的多能型或生殖细胞专一性但都不能重编 程细胞。按照本发明的方法，暴露分化细胞到冷血脊椎动物的卵母细胞、卵 或早期胚胎或其抽提物的细胞核或胚泡可能通过注射通透化处理的分 化细胞到卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞细胞或早期胚胎细胞，或通过 将通透化处理的分化细胞同所述卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期 胚胎的抽提物进行孵育而获得。优选地，通透化处理的分化细胞允许在卵母细胞、卵细胞、卵巢细 胞或胚胎或其抽提物中的因子进入该细胞并重编程它，优选地，卵母 细胞、卵细胞、卵巢细胞细胞或胚胎细胞的线粒体或细胞核不能进入 通透化处理的细胞，因此，没有遗传物质的交换。分化细胞的通透化 能通过任何诸如用Triton-X-100、洋地黄皂甙或皂角甙处理细胞等本领 域熟知的方法而获得。优选地，在按照本发明的方法同冷血脊椎动物卵母细胞、卵细胞、 卵巢细胞或早期胚胎或其抽提物进行接触后，通过使用本领域熟知的 技术，被重编程的细胞通过离心到显微镜载玻片或培养皿而回收。优选地，在本发明重编程分化细胞的细胞核的任何方法中，分化细 胞的细胞核可能会通过使用技术人员容易明白的熟知的核移植技术而 同卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎进行接触(参见上面讨论 的文献)。这样的技术包括注射分化细胞核到去核的卵母细胞或卵或将 分化细胞同去核的卵母细胞或卵进行融合。基于细胞的工作具有被重编程细胞完整包含在冷血脊椎动物细胞 内的优点。可选地，分化细胞的细胞核可能被同卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞 或早期胚胎的抽提物进行孵育。使用抽提物具有避免为了使卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚 胎中的因子作用于分化细胞或细胞核并导致它的重编程而注射分化细 胞或细胞核到完整卵母细胞、卵或早期胚胎所必需的操作的优点。使 用抽提物也使回收该物质变得容易并允许数千到数百万的细胞或细胞 核被立即重编程。此外，根据本发明，冷血脊椎动物的卵母细胞、卵 细胞、卵巢细胞和早期胚胎抽提物能以巨大的量进行生产并能被储存， 在需要时可方便取用。优选地，使用完整卵巢的抽提物。通过使用完整卵巢抽提物，不必 分离细胞组分，对冷血脊椎动物的某些物种而言，分离细胞组分是不可能的。可选地，用来抽提的原材料可能会是通过常规技术，例如0.2%胶原酶消化而从卵巢间质解放的卵母细胞。分化细胞指已经获得分化成熟状态的细胞。典型地，分化细胞被给 定细胞内编码分化相关蛋白的基因的表达而给予特征。例如，神经胶质细胞中髓鞘蛋白的表达和髓鞘的形成是末端分化的神经胶质细胞的 典型例子。分化细胞不能进一步分化或仅能分化成特定细胞谱系中的 特定细胞。优选地，在本发明任何方法中使用的分化细胞是真核细胞。优选地， 分化细胞从哺乳动物获得。最优选地，所述细胞是人类细胞。优选地，在本发明的任何方法中，分化细胞或它的细胞核在大约5"c和大约3crc间，更优选地，在大约5"c和大约2rc间被暴露到卵母 细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或其抽提物。更优选地，所 述分化细胞或细胞核在与所述卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚 胎细胞或其抽提物起源的生物体体温一致的温度同卵母细胞、卵细胞、 卵巢细胞或早期胚胎细胞或其抽提物接触。如熟练人员将理解的，冷 血动物不具有它们本身自有的体温，它们身体的温度就是它们环境的温度。更优选地，接触温度是大约18°C，或冷血脊椎动物通常居住的环境的温度。优选地，按照本发明制备的重编程细胞的细胞核表达是多潜能标记的基因。优选地，多潜能标记基因包括编码Oct-4和nanog的基因。假 如Oct-4启动子的脱甲基化发生，Oct-4基因可能会用作标记。在本发明的第二方面，提供了按照本发明第一方面的方法生产的重 编程细胞。优选地，重编程细胞是胚胎干细胞样细胞。在本发明的第三方面，提供了按照本发明第一方面的方法生产的重 编程细胞的细胞核。优选地，所述重编程细胞的细胞核可能会随后被用在标准的己知体 细胞核移植(SCNT)技术中。根据本发明的方法，SCNT技术的效率 被通过第一重编程分化细胞的细胞核而增强。在本发明的第四个方面，提供了生产重分化细胞的方法，该方法包含(a) 生产如本发明第一方面中公开的重编程细胞；禾口(b) 重分化所述重编程细胞到相同类型或不同类型，到该重编程 细胞起源的分化细胞。优选地，通过使用祖先介质影响重分化。 一旦被产生，重编程的分 化细胞能在存在特定生长因子和其它信号分子下(祖先介质)被培养，这些因子或信号分子诱导它们分化到特定细胞类型。生产不同的细胞 类型需要不同的祖先介质。本发明的方法允许从单个个体的分化细胞中获得多潜能的重编程 细胞，这些重编程的细胞然后能被分化成治疗该病人所需要的细胞类 型。在本发明的第五方面，提供了按照本发明第四方面的方法生产的重 分化细胞。在本发明的第六方面，提供了起源于冷血脊椎动物的卵母细胞、卵 细胞、卵巢细胞或早期胚胎的分离细胞或细胞抽提物，其中的冷血脊 椎动物具有一个或多个下述性质(i) 包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或存在于鱼中的从位于后 部髋骨扩展而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构；(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(iii) 卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。优选地，卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽提物表达高度保守形式的Oct-4和nanog。优选地，所述细胞和/或细胞抽提物包含来源于卵母细胞、卵或早期胚胎细胞的细胞核或胚泡(GV)的物质。在本发明的第七方面，提供了包含如在本发明第六方面定义的分离细胞或细胞抽提物的药物组合以及药学上可接受的载体、辅药或稀释剂。此外，提供了包含如在本发明第二方面定义的重编程细胞和/或如在 本发明第三方面定义的重编程细胞的细胞核或如在本发明第五方面定 义的重分化细胞，和药学上可接受的载体、辅药或稀释剂的药物组合。 合适的药物载体、辅药和稀释剂和组成在实施例中被提供。按照本发明第八方面，提供了治疗需要置换或更新细胞的疾病的方 法，该方法包含给予动物有效剂量的如在本发明第六方面定义的分离 细胞或细胞抽提物和/或有效量的如在本发明第二方面定义的重编程细 胞和/或如在本发明第三方面定义的重编程细胞的细胞核或如在本发明 第五方面定义的重分化细胞。按照本发明的第九方面，提供了用作药剂的本发明第六方面定义的 分离细胞或细胞抽提物和/或如在在本发明第二面定义的重编程细胞和 /或如在本发明第三面定义的重编程细胞的细胞核和/或如在本发明第 五定义的重分化细胞。按照本发明的第十方面，提供了如在本发明第六方面定义的分离细 胞或细胞抽提物和/或如在本发明第二方面定义的重编程细胞和/或如 在本发明第三方面定义的重编程细胞的细胞核和/或如在本发明第五方 面定义的重分化细胞在用于治疗需要置换或更新细胞的疾病的药剂的 制造中的使用。在不同医疗条件下的之后的使用需要不同的细胞/组织类型。 例如，造血干细胞能用来治疗遭受白血病痛苦的个体。神经祖细胞 能用来治疗遭受诸如阿尔茨海默氏症或帕金森综合症的神经变性失调 症痛苦的个体。皮肤细胞在个体遭受严重烧伤或瘢痕化的情况下能用 作移植物。干细胞的用来产生用来移植的器官和组织的使用为糖尿病、肝病、 心脏病和自身免疫失调症(仅列举少量例子)提供了有希望的替代治 疗。伴随移植的主要问题是缺少供体和潜在的被移植组织同受体免疫 系统的不相容。艮P，由于受体将该移植物视为异物而产生的被移植组织的免疫排 斥。使用本发明的方法，胚胎干细胞样细胞能起源于需要移植物的病 人并随后被用来生产用来移植到同一病人的组织或器官。这消除了组 织不相容性和免疫排斥的任何问题。这样，能产生多潜能胚胎干细胞 样细胞具有巨大的治疗潜能，特别是这些细胞是同病人的细胞遗传相 同的。因此，在本发明的第八、九和十方面，所述疾病从包含神经学疾病 (帕金森病、阿尔茨海默氏症、脊髓伤害、中风)、皮肤更替、烧伤、 心脏病、糖尿病、骨性关节炎和类风湿关节炎的组中选择。优选地，所述疾病是神经学疾病，并且合宜地，所述疾病从包含帕 金森综合症、阿尔茨海默氏症、脊髓伤害、中风的组中选择。在本发明的第十一方面，为重编程分化细胞或为重编程分化细胞的 细胞核提供了试剂盒，该试剂盒包含起源于冷血脊椎动物的卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎的细胞或其细胞抽提物，其中的冷血脊 椎动物具有一个或多个下述性质(i) 包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或存在于鱼中的从位于后 部髋骨延伸而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构；(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(m)卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽 提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。和使用所述卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎或其抽提物的 说明书。优选地，卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞 抽提物起源的细胞表达高度保守形式的Oct-4和nanog。随意地，所述试剂盒进一步包含一个或多个待重编程的分化细胞。进一步随意地，所述试剂盒可能会包含影响重编程细胞的重分化的 进一步步骤的祖先介质。在本发明的第十二方面，提供了增强细胞克隆的方法，该方法包含 暴露待克隆的细胞到如在本发明第六方面定义的分离细胞或细胞抽提 物中。在本发明的这个方面，所述的待克隆细胞被暴露到的细胞和/或 细胞抽提物以"预浸"("pre-dip")的形式使用。为了提高克隆所述 细胞所需的机会和实验工作，本发明的所述细胞和/或细胞抽提物能帮 助待克隆的细胞到更多潜能状态的逆转。


体现本发明某些优选方面的实施例现在将参考下述附图进行公开图1-显示了寻找在胚胎干细胞(ES)、通透化处理的胎鼠成纤维细 胞(PFF)和注射到美西螈(PFFA)或非洲蟾蜍卵母细胞(PFFX)的 GV中的PFFs中的P -肌动蛋白、nanog和Oct-4基因的RT-PCR实验 的结果；图2-显示了如在Bordzilovskaya等人；1989中定义的超过40个发 育阶段的Axananog表达谱。美西螈胚胎的系列发育阶段。在 Developmental Biology of the Axolotl. (ed. J. B. Armstrong禾口 G. M.Malacinski), pp. 210-219. New York: Oxford University Press。 EC二早期卵裂，LC:晚期卵裂；图3-显示了 PFF在来源于美西螈卵巢的抽提物中的孵育减小了甲 基化DNA的数量。分化细胞是未处理的(对照)或在从美西螈卵巢制 备的抽提物(AxOvEx)中孵育3小时(3h)。细胞用针对甲基化DNA 的抗体进行染色；图4-显示了 PFF在美西螈卵巢抽提物(AvOvEx)中的孵育消除了 H3K9染色。图5-描述了在鱼和两栖动物中的代表进化保守的原始骨骼和派生 成体基本结构的对比。A、以背面观显示的肺鱼骨骼。B、以侧视图显 示的硬骨鱼。C、以背面观显示的蝾螈(美西螈)骨骼。D、以背面观 显示的蛙(非洲蟾蜍)骨骼。小箭头显示肋骨。大箭头指向髋骨；图6-显示了第V级POU结构域转录因子(Oct-4样基因)的系统进 化分析。基因从所述物种的卵巢分离而来并通过简约性比较来测定最 紧密相关的序列。在同一簇内的簇族是最紧密相关的；和图7-显示了在冷血脊椎动物的胞质中作为胚质存在或缺少的指示 子的生殖细胞特定RNAs的分布的例子；图8-显示了通过使用Clustal-W测定的小鼠和美西螈Oct-4的氨基 酸比较。图9-显示了通过使用Clustal-W测定的小鼠、大鼠、人、奶牛、犬、 负鼠、鸡和美西螈nanog的氨基酸比较。图10-A、注射哺乳动物细胞后两天分离的美西螈胚泡；B、用人原 代成纤维细胞注射的卵母细胞在指定的天数被收集及肌动蛋白、Nanog 和Oct-4的表达被通过RT-PCR分析；图11-显示了分化细胞暴露到非洲蟾蜍、美西螈和/或鲟鱼抽提物后 Nanog和P -肌动蛋白的表达的RT-PCR凝胶；图12-显示了存在nanog结合位点的报告基因的激活；图13-显示了通过使用Clustal W获得的Oct-4 DNA结合区域的序列比较-高度保守的物种。图14-显示了通过使用Clustal W获得的Oct-4 DNA结合区域的序列 比较-高度保守的物种和诸如非洲蟾蜍(XLPOU-60和XLPOU-91)和斑马鱼(zPou2)的非相关物种。图15-显示了非洲蟾蜍和斑马鱼中的非保守Oct-4等效物与高度保 守Oct-4基因的序列比较的同一性的表格。图16-在美西螈卵母细胞抽提物(AOC)中孵育的细胞中的DNA 甲基化通过5-甲基胞嘧啶染色进行评估。在处理后1和3小时后经过 处理的细胞通过FACS分类(荧光活化细胞分捡器)。而且，补充腺苷 三磷酸双磷酸酶(ATP酶抑制剂)的组被包括来显示所述过程是能量 依赖的。AP:通透化后对照。图17-在美西螈卵母细胞抽提物中孵育的细胞中的三磷酸化的组蛋 白H3赖氨酸9 (TriH3K9)通过用特异抗体进行的TriH3K9染色进行 评估。在抽提物中孵育处理1和3小时后，处理过的细胞用FACS进 行分类。而且，补充腺苷三磷酸双磷酸酶(ATP酶抑制剂)的组被包 括来显示所述过程是能量依赖的。AP:通透化后对照。
具体实施方式
实施例实施例1-来源于美西螈的卵母细胞重编程分化的哺乳动物细胞的能力为了证明来源于美西螈的卵母细胞重编程分化的哺乳动物细胞的 能力，通过使用Byrne " a/(2003) Curr Biol 15:13(14) 1206-13的仅使用 非洲蟾蜍的方法相似的方法，小鼠胎鼠成纤维细胞被直接注射到非洲 蟾蜍(PFFX)和美西螈(PFFA)卵母细胞的GV (胚泡)。培养的小鼠胎鼠成纤维细胞按照Alberio " "/ (2005) Exp Cell Res. 307(1):131-41的方法通过用弱去污剂(洋地黄)的处理进行通透化处 理。当被通透化处理时，来源于GV的分子能弥散进分化细胞或PFF (通透化处理的胎儿成纤维细胞)。大约50到200个PFF细胞被注射到每个Gv中，并且被注射的卵母细胞在2rc下孵育过夜。在那个时间，所述GV被从卵母细胞分割，那些包含PFF的被进一歩考虑。RNA 被从GV中抽提并逆转录成cDNA， PCR被用来检测来源于所述PFF的多潜能基因的表达。更特别的地，PCR被用来测定编码nanog和Oct-4 的基因的表达。P-肌动蛋白水平被测定作为对照。上面公开的方法具有超过已知方法的有点，该优点为，它浓縮了被 哺乳动物分化细胞表达的RNA并产生了在检测哺乳动物转录物中更高 的敏感性。因为所述目标是来检测仅是总RNA的极小部分的哺乳动物 RNA， GV的简单分离提供了庞大的纯化步骤，并相应提高了敏感性。结果RT-PCR被进行来检测PFF细胞中编码Oct-4和nanog的多潜能标 记基因的表达。P-肌动蛋白的表达也被研究来作为对照。iB-肌动蛋白 在所有细胞中在所有时间进行表达并作为阳性对照来确保实验操作的 有效性。图1显示了当在琼脂糖凝胶上跑胶时RT-PCR反应的结果。因 为技术熟练人员将知道白色条带的存在指明了 cDNA的存在，该条带 的强度指示了cDNA (基因特定产物)的量。图1中使用的简写如下ES-小鼠胚胎干细胞(从Chemicon可获得)PFF -小鼠通透化处理的胎鼠成纤维细胞-按照Alberio " a/ (2005) Exp Cell Res. 307(1):131画41的方法制备。PFFA-注射进美西螈卵母细胞GVs的PFF。PFFX-注射进非洲蟾蜍卵母细胞GVs的PFF。如能从图1看到的，所有研究的样品均强烈表达了e-肌动蛋白基 因，这证明来源于每一个处理的细胞的RNA能被RT-PCR检测并且来 源于细胞的组成型高水平基因表达是可检测的，不管其是否经过处理。 编码nanog的nanog基因和编码Oct-4的基因在ES细胞中表达，这是 被期望的，因为这些细胞是多潜能的。Oct-4和nanog (多潜能的标记 物)不在正常的未处理PFF细胞中表达，因为这些细胞是不具有多潜 能的分化的成纤维细胞。当PFF细胞在美西螈卵母细胞的GV中过夜 孵育时(PFFA)， Oct-4和nanog的表达被检测到。当PFF细胞在非洲 蟾蜍卵母细胞的GV中过夜孵育时(PFFX)，没有Oct-4或nanog的表 达被检测到。在PFF细胞在非洲蟾蜍卵母细胞的GV中孵育两天后， 低水平的Oct-4表达被检测到但仍没有nanog的表达被检测到(数据未显示)。在2天后被检测到的Oct-4表达仅能通过RT-PCR实验的检测 能力的巨大增加而观测到，即，通过增加复制的循环数，从30增加到 60个循环。PCR的每一个增加的循环均有效倍增了敏感性，因此，到 60个循环的增加代表了敏感性2到30个幂的增加。甚至是在增加了的 敏感性的条件下，nanog表达也不能被检测到。来总结，同通透化处理的哺乳动物分化细胞接触的美西螈卵母细胞 在孵育的18小时内诱导了编码Oct-4和nanog的多潜能标记基因的强 烈表达。这是同非洲蟾蜍卵母细胞相比较的，非洲蟾蜍卵母细胞尽管 在几天后也仅诱导了低水平的Oct-4表达，没有nanog的表达被检测到。 这样，美西螈卵母细胞在重编程哺乳动物分化细胞中的多潜能标记基 因的表达方面远较非洲蟾蜍卵母细胞有效。相应地，美西螈卵母细胞 在重编程分化细胞到胚胎干细胞样细胞方面也是非常更有效的。在这个及随后的实施例中，基因的表达通过检测被所述基因编码的 RNA进行测定。实施例2-同非洲蟾蜍比较的美西螈和鲟鱼材料和方法卵、卵母细胞和卵巢抽提物的制备非洲蟾蜍卵母细胞和卵抽提物按照Hutchison et al., (1988) Dew/c^me"f, 103, 553-566的方法进行制备。未受精的非洲蟾蜍卵细胞 从成熟雌性动物采集而来并在去胶(dejellying)溶液(20mM TrisHCl pH 8.5、 1 mMDTT和110mMNaCl)孵育5分钟。在去胶后，所述卵细 胞在0.9。/。NaCl盐水中漂洗三次，在冰冷的含蛋白酶抑制剂(3 u gml-l 亮抑酶肽、1 ugml-l胃酶抑素和l ugml-l抑肽酶)的抽提缓冲液(20mMHepes,pH7.5， 100mMKCl、 5mMMgCl2、 2 mM 醇)中漂洗两次。所述卵细胞被填充入10ml离心管中并在4'C100,000g 离心10分钟前移除多余的缓冲液。胞质层被移除并在4。C100,000g离 心30分钟前补充50ugml-l细胞松弛素B。澄清化的胞质补充10%的 甘油，并以100-200ul等份速冻在液氮中。卵母细胞抽提物从成熟卵 巢通过使用在OR2培养基(82.5 mMNaCl、 2.5 mMKCl、 1 mMCaCl2、1 mM MgCl2、 1 mM NaHC03、 5 mM Hepes， pH 7.8)中的1 mg/ml胶原酶在25'C下消化卵泡细胞2小时进行制备。第4-6期卵母细胞在大小 的基础上进行选择，在抽提缓冲液中洗涤并以卵抽提物制备的方法进 行制备。对于美西螈和非洲蟾蜍卵巢抽提物，所述卵巢在冰冷的抽提缓冲 液中洗涤并通过使用电动匀浆机在冰上进行5-10个冲程进行裂解。裂 解物被离心并按公开的用于非洲蟾蜍卵抽提物的方法进行冷冻保藏。鲟鱼(小体鲟；科学名Acipenserruthenus)抽提物按如下方法制 备对于卵巢抽提物，所述卵巢在冰冷的抽提缓冲液(如实施例1中 用于蛙类卵抽提物的缓冲液)洗涤并通过使用电动匀浆机在冰上进行 20个冲程进行裂解。裂解物被离心并按公开的用于非洲蟾蜍卵抽提物 的方法进行冷冻保藏。细胞培养、细胞通透化处理和在抽提物中孵育成纤维细胞从35-45日龄的胎牛或从12.5-13.5日龄的小鼠中分离 而来并在培养基(含2mM谷氨酰胺、O.lmM P-巯基乙醇、2mM非必 需氨基酸、100 IU ml-1青霉素和100 u g m"链霉素并补充10% FBS 的CM: DMEM培养基)中，在对于牛是39'C对于小鼠和人是37"C的 温度下在5%C02中培养最多5代。成纤维细胞从去除了生殖脊的13.5 日龄的小鼠中分离而来(小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs)。 MEFs在37 °C 5% 02和C02中培养并在被传代3或4次时被使用。细胞生长到80%融合度并被用于实验。在胰蛋白酶消化后，细胞 在通透化缓冲液(PB: 20 mM Hepes, pH 7.3、 110 mM醋酸钾、5 mM 醋酸钠、2mM醋酸镁、lmMEGTA、 2 mM DTT和蛋白酶抑制剂)中 洗涤，并随后在1ml 20-30 u g ml—1的洋地黄皂甙中在冰上孵育1分钟 15秒(Adam et al (1992) Methods Enzymol. 219， 97—110)。通透化反应通过加入10ml PB进行终止，然后在4°C700g离心10 分钟。在这些条件下，质膜通透化率为95-100%。通透化处理的细胞被加入到补充了能量再生系统(ERS: 150 ug ml-1肌酸磷酸激酶、60 mM磷酸肌酸)的卵母细胞/卵/卵巢抽提物中 (每u 1抽提物1000个细胞)。通透化处理的MEFs以5000个细胞/u 1被加入到20tU卵母细胞抽提物(美西螈、鲟鱼或非洲蟾蜍)并在15'C孵育3小时、6小时或过夜。对照细胞用20ulPB进行孵育。在孵育后，0.5ml PB被加入来漂洗所述细胞，这些细胞然后在 3500G离心5分钟进行沉淀。上清被移除，沉淀在直到被需要前均冷 冻在-8(TC.反转录(RT) PCR反应MEF细胞沉淀被收集并存储在-8(TC。通过使用RNAeasy系统 (Qiagen)总RNA被抽提(从~100000个细胞中)并在通过使用 Superscript III系统(Invitrogen)进行反转录前用DNA酶进行处理 (Ambion)。 2ng的RT反应被用于RT-PCR。使用的引物和条件如下B-肌动蛋白ttctttgCagCtCCttCgtt ，cttttcacggttggccttag (402bp; 56。C退火、1分10秒延伸、32个循环)。 Nanog: atgaagtgcaagcggcagaaa ， cctggtggagtcacagagtagttc (464bp; 56 。C退火、1分10秒延伸、35个循环)。Oct-3/4: gtttgccaagctgctgaagc， caccagggtctccgatttgc (238bp; 56。C退火、1分10秒延伸、38个f盾环)。 RediTaq系统被用于PCR反应(Sigma)。小鼠ES细胞cDNA用作阳性 对照，没有RT的作为阴性对照。反应产物跑标准的1.2%琼脂糖凝胶并用溴乙锭染色，并在UV灯 下被视觉化和拍照(图11)。凝胶中的泳道对应于从在美西螈抽提物中 孵育的细胞抽提的RNA (AX);从在光滑非洲蟾蜍抽提物中孵育的细 胞抽提的RNA (XL);或从在鲟鱼抽提物中孵育的细胞抽提的RNA (ST)，或从未用抽提物处理的细胞抽提的RNA (-);孵育3小时、6 小时或过夜(18小时)。左边的泳道显示了从Invitrogen购买的作为分子量标准的lOObp DNA梯度。顶部的胶显示了被预测的来源于用nanog引物进行的PCR 扩增的464bp的DNA条带，在同用美西螈或鲟鱼抽提物处理细胞相对 应的泳道中存在，但在同用非洲蟾蜍抽提物处理的细胞或未用抽提物 处理的细胞相对应的泳道中不存在。底部泳道显示了作为阳性对照的小鼠3 -肌动蛋白cDNA的扩增。 注意，预测的402bp条带如期望地在所有泳道中均出现，因为这个基因不被重编程所诱导，它在所有小鼠中在任何时候都存在。如所预期地，更多循环的PCR被检测nanog所需要，因为这是一个调控基因并 在正常条件下在细胞中以低水平表达。如所预测地，作为结构基因的 P-肌动蛋白被丰富表达。在这些实验中，Oct-4表达未被激活。这是被预测到的，因为Oct-4 启动子被甲基化负调控。因此，作为转录激活前提的激活需要该启动 子的去甲基化，也预测到，在这些实验中使用的短暂的孵育时间对所 述启动子的彻底去甲基化是不充足的。与此相一致的，实施例1和5 (注射实验)显示，在注射进美西螈 卵母细胞的GV后，nanog是相对容易激活的。它需要一天进行激活。 Oct-4转录需要大约5天，大概反映了去甲基化Oct-4启动子所需要的 时间。在注射进非洲蟾蜍卵母细胞中的细胞中的nanog从未被激活， 即使它不需要在先的去甲基化。实施例3 -使用表观遗传标记鉴定重编程寻找分化细胞到更多潜能状态的重编程的另一条途径是观察细胞 的表观遗传轮廓。表观遗传标记在分化细胞的DNA和蛋白质化合物(染色质)中是容易表观的。在许多情况下，表观遗传标记持久地灭 活细胞中某些基因的转录。表观遗传标记经常簇生在被紧紧压縮成称 为异染色质的构型的DNA的巨大区域内。为了获得分化细胞到多潜能 状态的重编程，需要这些被抑制的表观遗传标记的一些或全部逆转， 从而使大部分DNA易接近激活。在这一点上，诸如胚胎干细胞的多潜 能细胞比典型的分化细胞含有少得多的异染色质和少得多的表观遗传 标记。可能，这反映了在多潜能细胞中的所有或大多数基因对激活的 明显的可接近性，这是多潜能假定的基本性质。两个表观遗传标记与无活性基因典型相关。大多数细胞的DNA含 有共价连接到CpG岛内的胞嘧啶残基的甲基(CH3)。甲基化的DNA(CH3-DNA)在异染色质中是显著的，在异染色质中，它能以通过在 免疫化学实验中使用CH3-DNA特异性抗体明亮染色的核酸点被检测 至廿。除了CH3-DNA，第二个表观遗传标记是CH3基加入到组蛋白的特定氨基酸残基，组蛋白是结合到DNA来给予核酸DNA更高级的称为染色质的结构的小的带高电荷的核蛋白。通常，无活性基因被加入到组蛋白H3的赖氨酸残基9 (K9)， H3K9的CH3基的存在所标记。在 这种情况下，甲基化的组蛋白(CH3-组蛋白)残基被结合到DNA并抑 制了它的转录激活。为了重编程细胞的基因表达到多潜能状态，降低 分化细胞的细胞核内的CH3-DNA和CH3-组蛋白的水平将是必需的。 在这一点上，胚胎干细胞含有低水平的CH3-DNA和CH3-组蛋白残基。图3图示了从美西螈卵巢制备的抽提物消除存在于小鼠胎鼠成纤 维细胞(PFF)染色质内的表观遗传标记的能力。更明确地，图3图示 了所述抽提物消除DNA甲基化的能力。对照的未处理细胞(A)，或 孵育在美西螈卵巢抽提物(AxOvEx)中3小时的细胞(B)通过加入 显示绿色荧光的FITC-抗5-MeC抗体的免疫细胞组化分析CH3-DNA 的存在。然而，在黑白图中，这些染色在图像A、 B、 E和F中均能以 白点的形式被看到。对照细胞(C)和未处理细胞(D)也用碘化吡啶 处理来评估在所述抽提物中的细胞的通透性。碘化吡啶染色是红色的， 然而在黑白像中它以黑灰色的基本装满C和D的细胞的形式被看 到。图形E和F显示了既用碘化吡啶也用FITC-抗5-MeC抗体染色的 细胞。同对照细胞相比，在所述抽提物中孵育三小时的PFF含有大大 降低的CH3-DNA染色水平。所述数据表明，美西螈卵巢抽提物具有强 大的去甲基化PFFDNA的能力，消除了一种主要的指示转录被抑制的 DNA的表观遗传标记。图4图示，PFF在美西螈卵巢抽提物(AxOvEx)中的孵育消除了 H3K9染色，因此指明了表观遗传标记的消除。PFF在美西螈卵巢抽提 物中孵育3小时(处理过的细胞)。处理过的细胞和未经处理的对照PFF 通过免疫细胞组化分析H3K9染色的存在，鉴定了与转录抑制相关的 组蛋白的主要修饰。在A (未处理的)和B (处理过的)细胞中这些 细胞已经用发绿色荧光的FITC-抗H3K9抗体孵育。在黑白图像中， 这个染色能被看到亮点。细胞的两个组也都用DNA特异性染料DAPI 处理来指示所述DNA的定位。这个染色发射蓝色荧光，然而在黑白图 中，它能以黑灰形式被看到，参见图4中的C和D。来源于H3K9染 色和DAPI染色的荧光图像以每一种样品进行归并。该数据表明，在美更通常而言，((3)型的偶氮有机硅氧烷优选为包含2-20个、更优选2-12 个(例如2-6个)硅原子(数量对应于式X中m+n+o+p+q之和)的硅氧烷低聚物。在本发明的橡胶组合物中，偶合体系的总含量优选为2-15phr，更优选 2-12phr(例如4-8phr)。然而，通常希望其用量尽可能地少。相对于增强无机填 料的重量，偶合体系的含量通常为0.5-15重量％;优选小于12重量％，更优 选小于10重量％。(化合物I:化合物n)重量比优选为1:10-10:1，更优选为1:5-5:1，还更 优选为1:3-3:1，例如，:2(0.5)-2:1(2.0)。本发明偶合体系的全部或部分可以(经由"X"官能团师预接枝到本发明组 合物的异戊二烯弹性体上，因而官能化或"预偶合"的弹性体包含用于增强无机 填料的游离"Y"官能团。该偶合体系的全部或部分还可以(经由"Y"官能团)而预 接枝到增强无机填料上，由此"预偶合"的填料然后可经由游离"X"官能团而键 合于二烯弹性体上。然而，特别为了更好地使用原态橡胶组合物，优选使用 的全部或部分偶合剂或者接枝到填料上或呈游离态(即未接枝)。 II-4.各种添加剂根据本发明，轮胎面的橡胶组合物还包含所有或部分常用添加剂，所述 添加剂通常用在用于轮胎面制造的弹性体组合物中，例如增塑剂或增量油， 不管后者为芳香性或非芳香性；颜料；保护剂如抗臭氧蜡、化学抗臭氧剂、 抗氧化剂，其优选存在于胎体中；抗疲劳剂；增强或增塑树脂；描述于例如 上述申请WO 02/10269中的亚甲基受体(例如可溶可熔酚醛树脂)或亚甲基给 体(例如HMT或H3M);基于硫或基于硫给体和/或基于过氧化物和/或基于双 马来酰亚胺的交联体系；硫化促进剂或硫化活化剂。优选这些组合物包含至少一种选自环烷油、石蜡油、MES油、TDAE油、 甘油酯(尤其为三油酸酯)、具有优选大于30°C的高Tg的增塑烃树脂及所述化 合物的混合物的化合物作为优选的非芳香性增塑剂或微芳香性增塑剂。所述 优选增塑剂的总含量优选为15-45phr，更优选20-40phr。取决于目的应用，还可以向上述增强填料中加入可用于例如有色轮胎的 侧壁或轮胎面的惰性填料(即非增强性填料)，例如粘土颗粒、斑脱土、滑石、 白垩、高岭土，即若适用的话，浅色增强填料(尤其无机填料)加上炭黑。除偶合剂以外，这些组合物还可以包含偶合活化剂、用于浅色增强填料的卵母细胞在18'C孵育5天。胚泡被从组中的卵母细胞上切离，那些含有人类细胞的胚泡被冷冻 用于分析(图IOA)。总RNA使用商品抽提试剂盒(RNAeasy试剂盒)进行抽提和用DNA 酶I处理来避免基因组DNA污染。从每一个样品抽提的RNA被反转 录来产生互补DNA (cDNA)。所述cDNA被用于通过使用为下述基因设计的特异引物的标准聚合 酶链反应(PCR)扩增人Nanog (正向5， aggcaaacaacccacttctg 3，，和 反向5， tcttcggccagttgtttttc 3，)，人P0U-5F1 (Oct-4基因；正向5， tcccttcgcaagccctcat 3,， 反向5 ， tgacggtgcagggctccggggaggccccat 3 ，)， 禾口 人P-肌动蛋白(正向5， ggacttcgagcaagagatgg 3，，禾Q反向5， agcactgtgttggcgtacag 3 ，)。如在图10B中显示的，Nanog表达在孵育于美西螈卵巢中48小时 后的细胞中检测到。与此相对照，没有Nanog表达在被注射的非洲蟾 蜍卵母细胞中检测到。Oct-4表达在被注射后5天的美西螈卵母细胞中 检测到。因此，在成X细胞(分化细胞)被注射进美西螈卵母细胞的细胞核 后，它们已经被重编程来表达Oct-4和nanog基因。在非洲蟾蜍卵母细 胞中的注射不产生nanog的激活。这些结果是重要的，因为它们显示，人和小鼠的细胞均能被具有本 发明的性质(例如原始脊椎动物基本结构)的来源于冷血脊椎动物的 细胞/细胞抽提物重编程以及成年细胞能被重编程。分化的成年细胞是 比胎儿细胞更难重编程的，胎儿细胞是在它们的发育中仍然前进的并 且可能还没有永久的表观遗传标记被强加到染色质上。在18摄氏度而不是在室温孵育被注射的卵母细胞给予了被注射卵 母细胞增强的存活性的优点，所述细胞能被培养至少5天，而该时间 允许充足的时间来激活Oct-4的活化。而且，因为从哺乳动物基因组的 转录是温度依赖的(Alberio et al， 2005)，因此，在这个温度下转录的 抑制可能进一歩帮助重编程。实施例6-包含nanog结合位点的报告基因的激活为了显示nanog是存在的，显示nanog能激活包含诸如GATA-4启 动子的nanog结合位点的报告基因是可能的。在图12中，实验测试美 西螈nanog (Axnanog)激活报告基因的能力的结果被展示。GATA-4 启动子被融合到编码萤火虫萤虫素酶(使萤火虫在黑暗中发光的蛋白) 的报告基因上。这个蛋白发出能被称为照度计的机器测量的光线。所 述输出能被定量。在这个实验中，空DNA同具有人nanog的DNA和两个推动Axnanog 表达的克隆进行比较。图12的方法NIH3T3细胞被接种到24孔板并用0.25 y g/孔的GATA-4报告基因、 0.05ug/孔的pTK-RL (Promega)和空载体(cDNA)、人Nanog或未 标记的美西螈nanog(CMV)或标记的(mR)RFP通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)进行转染。转染后24小时，细胞被收集并用 双重萤虫素酶实验(Dual luciferase assay) (Promega)进行处理。RLU (相 对萤虫素酶单位)同空载体对照进行比较。线段显'示了标准偏差；n=3。实施例7 -美西螈中的nanog分离的确认Axnanog的表达谱被检查并同小鼠nanog基因的表达谱对照相比 较。发现，Axnanog恰好在它将被预测被表达时表达，就像它在美西 螈发育过程中在多潜能中扮演了角色似的。在小鼠胚胎中，nanog基因在(tin)内细胞团和早期胚泡的细胞的 早期发育过程中被非常短暂的表达。Nanog被知道在这个阶段多潜能 的维持中扮演了基本的角色。为了测验Axnanog在相当的阶段是否被 表达，我们分析了它在早期胚胎中的表达。低水平的母源Axnanog RNA 在早期和晚期分裂阶段(EC; LC)是可检测到的，然后在第9阶段促 进表达的开始，这标记了当从美西螈胚胎的结合子基因组的转录开始 时中-囊胚的转变。表达在早期原肠胚达到顶峰(第10阶段)，并在后 期原肠胚下降(第12阶段)。在更后的阶段表达是不能检测到的。因此，Axnanog在同多潜能细胞存在巧合的发育窗期间表达，并且表达 在原肠胚阶段后消失，此时所有细胞被认为已经遭遇了到体细胞谱系 的定型，并将被预测不能是多潜能的。在早期胚胎中AxNanog表达通过使用Trizol的标准方法，RNA从处于图2中指定的阶段的每一 个阶段的(8、 9、 10、 12、 16、 20、 25、 30、 35和40个发育阶段)5 个美西螈胚胎中抽提而来(Bordzilovskaya et al; 1989. Devel叩mental stage series of axolotl embryos. In Developmental Biology of the Axolotl. (ed. J. B. Armstrong and G. M. Malacinski), pp. 210-219. New York: Oxford University Press.)，然后用DNA酶I进行处理。所述RNA使用Superscript (Invitrogen)进行反转录。来源于每一 个阶段的0.5份cDNA胚胎相等物被用在RCR中，使用的引物为对 于 Axnanog ( Fl : GTTCCAGAACCGAAGGATGA ; Rl : CGAAGGGTACTGCAGAGGAG， 58°C45秒，72。C退火1分钟)或美 西螈鸟氨酸脱羧酶(ODC; Fl: TGCGTTGGTTTAAAGCTCTC; Rl: ACATGGAAGCTCACACCAAT， 56°C45秒，72°C1分钟)， 一种组成 型表达的基因用作cDNA完整性的阳性对照。PCR进行35个循环 (Axnanog)或30个循环(ODC)。反应产物在含有溴乙锭的1.2%琼脂糖凝胶上进行分离，然后在UV 灯下拍照(图2)。实施例8 - DNA甲基化确认总体的DNA甲基化通过使用先前描述的具有轻微修改的流程 (Habib " a/" (1999). Exp.Cell Res.风46-53.)的流式细胞术进行确 认。混悬液中的细胞用补充0.1 % tween20和1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)进行 连续两次的低速(300g)沉淀运动和轻轻的重悬步骤进行洗涤，然后 用9倍体积的甲醇/PBS (88。/。甲醇/12。/。PBS，体积比)混合并在-2(TC冷冻20分钟。在室温下用PBST-BSA洗涤两次后，细胞用2NHC1在 37。C下连续处理30分钟，然后用Tris HC1缓冲液(pH 8.8)处理5分 钟。然后细胞在4。C下用抗-5-MeC抗体(where)孵育过夜后，细胞再 用封闭溶液在37"C处理1小时，所述封闭溶液用PBS-T制备并补充5% BSA。细胞然后用PBS-T连续漂洗三次并在室温下用以1比200稀释到 PBST-BSA中的结合到异硫氰酸酯荧光素上的兔抗-小鼠免疫球蛋白 (Dako， Trappes,法国)孵育1小时。最后，样品在进行流式细胞术 前用PBS洗涤三次并用碘化吡啶(PI) (50 mg/ml，在PBS中)染色 30分钟。分析用Epics XL流式细胞仪(Beckman Coulter)进行。通过流式细胞术的类似的流程被用于检测H3K9和HP1阿尔法的改 变。简而言之，细胞用pH 7.4的补充1% BSA和0.1% Tween 20的PBS (PBST-BSA)洗涤两次并进而用9倍体积的甲醇/PBS (88%甲醇 /12%PBS，体积比)混合并在-20。C冷冻20分钟。然后细胞在4t:下用抗-三甲基化的H3K9或抗-HPl阿尔法抗体 (where)孵育过夜后，细胞再在37"C下用封闭溶液处理1小时，所述 封闭溶液用PBS-T制备并补充5% BSA。细胞然后用PBS-T连续漂洗 三次并在室温下用分别以1比200稀释到PBST-BSA中的结合到异硫 氰酸酯荧光素上的Dunkey抗兔(1:100， Juckson美国)或山羊抗-小 鼠免疫球蛋白(Dako,Trappes，法国)孵育1小时。最后，样品在进行流式细胞术前用PBS洗涤三次并用碘化吡啶(PI) (50mg/ml，在PBS中)染色30分钟。分析用Epics XL流式细胞仪(Beckman Coulter)进行。 流式细胞术的结果在图16和17中给出。讨论细胞基于用CH3-DNa抗体和组蛋白H3K9抗体进行的荧光染色进 行分拣，并随后被检査什么百分比的细胞具有完全对照水平的染色， 和什么百分比的细胞显示出随时间而降低的荧光。如所述图表显示的，在两个实验中的细胞中全部水平的荧光均被降 低。这确证了更早的结果并证明，甲基化DNA和组蛋白H3K9的降低实施例9-美西螈卵母细胞抽提物在增强绵羊克隆中的使用本发明的细胞和细胞抽提物可能会用于通过在核移植(NT)前用美 西螈卵母细胞抽提物孵育细胞增强诸如绵羊克隆等克隆操作。绵羊成纤维细胞按Alberio et al.， (2005)描述的针对牛细胞的方法进 行通透化处理。所述细胞在18'C下在美西螈卵母细胞抽提物中孵育3 小时并继而用作NT的细胞核供体。通透化处理的细胞具有膨胀和圆的 形状，因此一般很容易在显微镜下识别出来并因此选来用于NT。核移 植操作以与Lee et al., (2006) Biol Reprod. 74:691-8描述的相同方式进 行。在培养物中7天后，到胚泡的发育在显微镜下进行评估。在7天后， 五个克隆的胚胎发育到胚泡，这表明，在美西螈抽提物中孵育的细胞 是NT有活力的供体。这个实验已经显示，暴露哺乳动物体细胞到美西螈卵母细胞抽提物 对克隆的哺乳动物胚胎的前植入发育是没有害处的。被预测，这些胚胎将显示出在用暴露到本发明的抽提物的细胞制备 的克隆胚胎到期发育中的改善。妊娠和胚胎的发育是进行的。实施例10-重编程试剂盒本发明的细胞和细胞抽提物能以试剂盒的形式提供，用在本发明的 方法中。这些试剂盒优选地包含所述细胞/细胞抽提物试剂，和至少一 种下述物品使用说明书；用于所述重编程细胞重分化的祖先介质；用于实施所 述重编程的一次性设备，例如，多孔板、诸如预装移液管的分配器； 将被重编程的分化细胞和通透化处理缓冲液。所述试剂盒能按照所需要的重分化细胞类型进行定制化，在这种试 剂盒中，祖先培养基和说明书可能会根据细胞的类型和终端使用而变 化。实施例11-药物配方和给药本发明的进一步的方面是提供药物配方，该药物配方包含按照本发 明的第一方面的以及在带有药学上或兽医学上可接受的佐剂、稀释剂 或载体的混合物中的化合物。优选地，所述配方是单位剂量，包含活性组分的每日剂量或单位、 每曰亚剂量或它的适当的部分。本发明的化合物将以包含活性成份的药物配方的形式，任意地，以 无毒有机或无机酸、加成盐的形式，以药学上可接受的剂量形式，被 经口或通过任何胃肠外的途径而正常给药。依赖于将被治疗的病症和 病人以及给药的途径，所述组合可能会以变化的剂量给药。在人类治疗中，本发明的组合能被单独给药但将通常以混合物的形 式给药，该混合物具有考虑到预期的给药途径和标准药学实践而选择 的合适的药物辅药、稀释剂或载体。例如，本发明的化合物能经口、经口腔或经舌下，以可能包含调味 剂或染色剂的片剂、胶囊剂、胚珠剂、酏剂、溶液或混悬液的形式， 用于即释-、延释-或控释应用目的而给药。本发明的化合物也可能会经 海绵窦注射而给药。这样的片剂可能会含有诸如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、 二元磷酸钙和甘氨酸的辅药，诸如淀粉(优选地，玉米、土豆或木薯 淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂硅酸盐类的崩解齐IJ，和诸如聚维酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶的造粒粘合剂。此外，诸如硬脂酸镁、硬脂酸、 甘油二十二烷酸酯和滑石粉的润滑剂可能会被包括。相似类型的固体成分也可能会在明胶胶囊中用作填充剂。优选的辅 药在这一点上包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙烯二醇。 对于水混悬液和/或酏剂，本发明的化合物可能会同各种增甜或调味剂， 色素或染料，同乳化剂和/或助悬剂和同诸如水、乙醇、丙二醇和甘油 及其组合的稀释剂进行组合。本发明的成分也能经胃肠外而给药，例 如，经静脉、经动脉、经腹膜、经髓鞘、经心室、经胸骨、经颅内、经肌肉或经皮下，或它们可能会通过注射技术而给药。它们以无菌水 溶液的形式能被最好的使用，该水溶液可能含有其他物质，例如，使 溶液同血液等渗的足够的盐或蔗糖。假如必需，该水溶液应该被合适 地缓冲(优选地，到从3到9的pH)。在无菌条件下合适的胃肠外组 成物的制备通过本领域熟练人员熟知的标准药学技术可容易地完成。合适的用于胃肠外给药的配方包括水和非水无菌注射溶液，该溶液 可能含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和帮助配方同预期的受者的血液等 渗的溶质；及水和非水无菌混悬剂，该混悬剂可能包括悬浮剂和增稠 剂。配方可能在单位剂量或多剂量容器中存在，例如密封的氟奋乃静 癸酸酯和管形瓶，并可能在冷冻干燥(冻干)条件下进行储存，仅需 要在使用前加入无菌的例如用于注射的水的液体载体。临时注射溶液 和混悬剂可从先前公开种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。对于给人类患者的经口和胃肠外给药，本发明的化合物的每日剂量水平将通常从lmg/kg到30mg/kg。这样，例如，本发明化合物的片剂 或胶囊剂可能含有适当的用于单次或两次或更多次给药的活性化合物 的剂量。医生无论如何将确定对任何单个病人最合适的实际剂量并且 该剂量将随具体病人的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情 况可效仿的。当然，能有个别的例子，在这些例子中更高或更低的范 围是值得的并且这样的例子也包括在本发明的范围内。本发明的化合物也能经鼻或通过吸入而给药，并通常以干粉吸入器 或从带有合适的例如二氟二氯甲垸、三氯氟甲垸、二氯四氟乙烷、诸 如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)的氢氟酸、二氧化碳或其他合适气体的喷射剂的使用的增压 容器、泵、喷雾器或雾化器提供的气溶胶喷雾的形式进行传递。在增 压气体的情况下，剂量单位可通过提供阀门来传递测定的数量而确定。 增压的容器、泵、喷雾器或雾化器可能含有活性物的溶液或混悬剂， 例如，使用作为溶剂的乙醇和喷射剂的混合物，它可能又含有例如三 油酸山梨坦的润滑剂。用在吸入器或吹入器中的胶囊剂和药筒(例如， 从明胶制备)可能被配方来含有本发明的化合物和诸如乳糖或淀粉的 合适粉末基的粉末混合物。气雾剂或干粉配方是优先安排的，以便每一个经过测量的剂量或"一喷"传递合适剂量到本发明的化合物到病人。对于气雾剂，它全 部的每日剂量将从病人到病人而变动，并可能在全天以单剂量或，更 通常，以分份剂量而给药，这将是被重视的。可选地，本发明的化合物能被以栓剂或子宫托的形式给药，或它们 可能以洗液、溶液、乳剂、软膏剂或丸衣粉的形式被局部给药。本发 明的化合物可能也被经皮给药，例如，通过使用皮肤贴剂。它们可能 也通过经眼途径被给药，特别是对治疗眼病。对于眼药使用，本发明的化合物能以在等渗、调整pH的、无菌盐 水中的微粒化的悬液或优选地以在等渗、调整pH的、无菌盐水中的溶液，任意地同诸如benzylalkonium chloride的防腐剂组合而配方。可选 地，它们可能以诸如凡士林油的软膏剂进行配方。对于皮肤局部应用，本发明的组合能以合适的含有活性物的在例如具有一种或多种下述物质的混合物中混悬或溶解的软膏剂而配方矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙烯乙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯化合 物、乳化蜡和水。可选地，它们能以合适的在例如一种或多种下述物质的混合物中混悬或溶解的洗液或乳膏被配方矿物油、硬脂山梨坦、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酯60、十六垸基酯蜡、棕榈油、2-辛基月桂醇、苯甲醇和水。 嘴部局部给药的合适组合包括锭剂，该剂型包含在通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的调味基中的活性成分；软锭剂，该剂型包含在诸如 明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基中的活性成分；和漱口剂， 该剂型包含在合适液体载体中的活性成分。通常，在人类中，本发明的化合物经口或局部给药是优选的途径， 是最方便的。在受体遭受吞咽紊乱或遭受经口给药后药物吸收损害的 情况下，所述药物可能经胃肠外，例如经舌或经口腔而给药。对于兽医使用，本发明的化合物根据正常的兽医实践以适于接受的 配方而给药，并且兽医外科将确定对特定动物最合适的给药方案和给 药途径。
权利要求
1、生产重编程细胞或重编程细胞的细胞核的方法，所述方法包含暴露分化细胞或分化细胞的细胞核到起源于冷血脊椎动物的卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎的细胞或其细胞抽提物，其中的冷血脊椎动物具有一个或多个下述性质(i)包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在鱼中的从位于后部的髋骨延伸而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构；(ii)不含胚质的生殖细胞；和/或(iii)卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。
2、 根据权利要求l的方法，其中的重编程细胞是胚胎干细胞样细胞。
3、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的重编程细胞和/或重编 程细胞的细胞核表达Oct-4。
4、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的重编程细胞或重编程 细胞的细胞核表达nanog。
5、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的重编程细胞或重编程 细胞的细胞核是多潜能的。
6、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的在冷血脊椎动物卵母 细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或细胞抽提物中的Oct-4和/ 或nanog分别具有同人转录因子Oct-4和人nanog蛋白至少69%的氨基 酸同一性。
7、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的在冷血脊椎动物卵母 细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞中的Oct-4和/或nanog分别具有同人转录因子Oct-4或人nanog蛋白的DNA结合区域(DBD)至 少69%的氨基酸同源性。
8、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的冷血脊椎动物从包含 两栖动物、爬行动物和鱼的组中选择。
9、 根据权利要求8的方法，其中的冷血脊椎动物从包含蝾螈，海 龟，蜥蜴，鳄鱼，盲鳗纲(八目鳗类鱼)；七鳃鳗纲(八目鳗)；软骨 鱼纲(鲨鱼、魟鱼、鳐、chimeras);软骨硬鳞鱼纲(硬骨鱼亚纲、鲟 鱼、匙吻鲟等)；半椎鱼目(长嘴硬鳞鱼)；弓鳍鱼目(弓鳍鱼)；肺鱼 亚纲(肺鱼)和腔棘鱼纲(腔棘鱼)的组中选择。
10、 根据权利要求9的方法，其中的冷血脊椎动物从包含蝾螈、海龟、肺鱼和鲟鱼的组中选择。
11、 根据权利要求io的方法，其中的冷血脊椎动物是蝾螈。
12、 根据权利要求ll的方法，其中的蝾螈是美西螈或notopthalmus。
13、 根据权利要求10的方法，其中的冷血脊椎动物是鲟鱼。
14、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的卵母细胞、卵或早 期胚胎细胞抽提物包含来源于卵母细胞、卵或早期胚胎细胞的细胞核 或胚泡(GV)的物质。
15、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的分化细胞被通透化 处理。
16、 根据任何在先的权利要求的方法，其中的分化细胞是真核细胞。
17、 根据权利要求16的方法，其中的分化细胞是哺乳动物细胞。
18、 根据权利要求17的方法，其中的分化细胞是人类细胞。
19、 根据权利要求1到18的方法生产的重编程细胞。
20、 根据权利要求2到18的方法生产的胚胎干细胞样细胞。
21、 根据权利要求1到18的方法生产的重编程细胞的细胞核。
22、 生产重分化细胞的方法，所述方法包含(a) 如权利要求1到18的任何一项公开的方法生产重编程细胞;和(b) 重分化所述重编程细胞到同一类型或不同类型的分化细胞， 到所述分化细胞起源的分化细胞。
23、 如权利要求22要求的方法，其中的重分化通过使用祖先介质 进行影响。
24、 根据权利要求22或23的方法生产的重分化细胞。
25、 起源于冷血脊椎动物的卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期 胚胎的分离细胞或细胞抽提物，其中的冷血脊椎动物具有一个或更多 个下述性质(0包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或在鱼中的从位于后部的 髋骨延伸而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构；(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(iii) 卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽 提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。
26、 根据权利要求25的细胞抽提物，其中的抽提物包含来源于卵 母细胞、卵细胞或早期胚胎细胞的细胞核或胚泡(GV)的物质。
27、 药物组合物，所述药物组合物包含如在权利要求25和26中 定义的分离细胞或细胞抽提物和药学上可接受的载体、辅药或稀释剂。
28、 药物组合物，所述药物组合物包含如在权利要求19中定义的 重编程细胞和/或如在权利要求21中定义的重编程细胞的细胞核或如 在权利要求24中定义的重分化细胞，和药学上可接受的载体、辅药或 稀释剂。
29、 治疗需要置换或更新细胞的疾病的方法，所述方法包含给予 有效量的如在权利要求25和26中定义的分离细胞或细胞抽提物和/或 有效量的如在权利要求19中定义的重编程细胞和/或如在权利要求21 中定义的重编程细胞的细胞核和/或有效量的通过权利要求24的方法 生产的重分化细胞到动物。
30、 如在权利要求25和26中定义的分离细胞或细胞抽提物和/或 如在权利要求19中定义的重编程细胞和/或如在权利要求21中定义的 重编程细胞的细胞核和/或如在权利要求24中定义的重分化细胞用作 药剂。
31、 如在权利要求25和26中定义的分离细胞或细胞抽提物和/或 如在权利要求19中定义的重编程细胞和/或如在权利要求21中定义的 重编程细胞的细胞核和/或如在权利要求24中定义的重分化细胞制备 在用于治疗需要置换或更新细胞的疾病的药剂中的用途。
32、 权利要求29的方法或权利要求30或31的使用途，其中的疾 病从包含神经学疾病(帕金森病、阿尔茨海默氏症、脊髓伤害、中风)、 皮肤更替、烧伤、心脏病、糖尿病、骨性关节炎和类风湿关节炎的组 中选择。
33、 权利要求32的方法或用途，其中的疾病是神经学疾病。
34、 权利要求33的方法或用途，其中的神经学疾病从包含帕金森病、阿尔茨海默氏症、脊髓伤害、中风的组中选择。
35、 用于重编程分化细胞或用于重编程分化细胞的细胞核的试剂 盒，该试剂盒包含起源于冷血脊椎动物的卵母细胞、卵细胞、卵巢细 胞或早期胚胎的细胞或其细胞抽提物，其中的冷血脊椎动物具有一个 或多个下述性质(i )包括横向投射肋骨和/或脊髓投射和/或存在于鱼中的从位于后 部髋骨延伸而来的骨盘附件的原始脊椎动物基本结构；(ii) 不含胚质的生殖细胞；和/或(iii) 卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽 提物起源的细胞表达高度保守形式的Oct-4禾卩/或高度保守形式的 nanogo和使用所述卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎或其抽提物 的说明书。
36、 如权利要求35所要求的试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种 或多种待重编程的分化细胞。
37、 根据权利要求35或36的试剂盒，所述试剂盒进一步包含影 响重编程细胞的重分化的进一步步骤的祖先介质。
38、 增强细胞克隆的方法，所述方法包含暴露待克隆细胞到如在 权利要求25和26中定义的分离细胞或细胞抽提物中。
39、 基本上如本文参照所述实施例和附图公开的方法。
40、 基本上如本文参照所述实施例和附图公开的分离细胞或细胞 抽提物。
41、 基本上如本文参照所述实施例和附图公开的组合。
42、 基本上如本文参照所述实施例和附图公开的使用。
43、基本上如本文参照所述实施例和附图公开的试剂盒。
全文摘要
生产重编程细胞或重编程细胞的细胞核的方法，所述方法包含暴露分化细胞或分化细胞的细胞核到起源于冷血脊椎动物卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎的细胞或其细胞抽提物，其中的冷血脊椎动物具有一个或多个如下性质(i)包括横向投射肋骨和/或脊髓投射的原始脊椎动物基本结构；(ii)不含胚质的生殖细胞；和/或(iii)卵母细胞、卵细胞、卵巢细胞或早期胚胎细胞或所述细胞抽提物，表达高度保守形式的Oct-4和/或高度保守形式的nanog。本发明也提供了重编程细胞的用途。
文档编号C07K14/47GK101228263SQ200680026855
公开日2008年7月23日 申请日期2006年7月21日 优先权日2005年7月22日
发明者A·约翰逊, K·坎贝尔, R·阿尔贝里奥 申请人:诺丁汉大学