专利名称：过氧化物酶体增殖物-活化的受体α辅激活物1的抑制剂的利记博彩app
过氧化物酶体增殖物-活化的受体ot辅激活物1的抑制剂发明领域本发明涉及将寡核苷酸用作治疗糖尿病、胰岛素耐受和代谢综合征的药物。 更具体说，本发明涉及用作药物的化合物，该化合物能通过肠道或胃肠道外途径给药，具有抑制过氧化物酶体增殖物-活化的受体a辅激活物l(PGC-la)，并导致血糖水平降低的特性。因此，本发明涉及在糖尿病个体和对胰岛素耐受的个体中促 进葡萄糖血清水平改善、血浆胰岛素浓度升高和对胰岛素的耐受性降低的药物化合 物。本发明具有巨大的社会效益，从商业观点来看，本发明也会对制药工业带来巨 大的效益。发明背景在过去十年期间，在世界上几个区域中观察到肥胖和2型糖尿病的发病率不断 增加(K叩elman PG 2000， Obesity as a medical problem (肥胖成为医学问题)，Nature 404:635-43; Flier JS 2004 Obesity wars: molecular progress confronts an expanding epidemic(肥胖之战分子进展面临扩张性流行)，Cell 116:337-50; Stein CJ， Colditz GA 2004 The epidemic of obesity(肥胖的流行)，J Clin Endocrinol Metab 89:2522-5)。作 用于有利遗传背景的饮食方式改变和久坐习惯被认为是这些疾病的最重要病因。2 型糖尿病-和肥胖紧密相关。体重指数增加1.0 kg/r^可以使发生糖尿病的相对风险 翻一倍(Kopelman PG 2000， Obesity as a medical problem(月巴胖成为医学问题)，Nature 404:635-43)。在2000年巴西进行的流行病学评价中，9%人群出现糖尿病，15%肥胖 (Kopelman PG 2000， Obesity as a medical problem(肥胖成为医学问题)，Nature 404:635-43)。相同研究提出预计到2020年，即在这些疾病的治疗方案没有显著改变 的情况下，糖尿病发病率应达到15%，肥胖的发病率应超过25% (Kopelman PG 2000， Obesity as a medical problem(月巴胖成为医学问题)，Nature 404:635-43)。体重维持取决于摄入的卡路里和能量消耗之间的复杂平衡。正能量平衡导致以 甘油三酯的形式在脂肪组织中不断储存过剩的能量，维持一段较长时间后，将导致 发生肥胖(Schwartz MW， Kahn SE 1999， Insulin resistance and obesity(胰岛素耐受和
肥胖)，Nature 402:860-1)。虽然能量的获取仅取决于摄入的食物，但能量消耗是一系 列因素的结果，这些因素加总起来，构成所测定个体的总能量消耗。(Schwartz MW， Kahn SE 1999， Insulin resistance and obesity(胰岛素耐受和肥胖)，Nature 402:860-1; Schwartz MW， Woods SC， Porte D， Jr.， Seeley PJ, Baskin DG 2000， Central nervous system control of food intake(食物摄入的中枢神经系统控制)，Nature 404:661-71)。这些因素包括身体活动和产热作用的两种形式，强制性和适应性。 (Schwartz MW， Kahn SE 1999， Insulin resistance and obesity(胰岛素耐受和肥胖)， Nature 402:860-l;Schwartz MW， Woods SC， Porte D， Jr., Seeley RJ， Baskin DG 2000， Central nervous system control of food intake(食物摄入的中枢神经系统控制)， Nature 404:661-71)。集中于增加身体活动的肥胖治疗不能获得满意的减肥效果，这 表明，久坐习惯本身肯定在肥胖和随后发生的糖尿病的发病中起到很小作用。另一 方面，产热缺陷被认为是发生这些疾病的重要因素(Schwartz MW， Kahn SE 1999， Insulin resistance and obesity(胰岛素耐受和肥胖)，Nature 402:860-1; Schwartz MW， Woods SC， Porte D， Jr., Seeley RJ， Baskin DG 2000， Central nervous system control of food intake(食物摄入的中枢神经系统控制)，Nature 404:661-71)。参与产热过程的分子机制多种多样。有多种代谢循环能促进ATP消耗，随后释 放热，如糖酵解和糖异生循环，或者甚至是Na+、 K+ ATP酶活性。但是，可通过 ATP水解放热，正如战栗产热中发生的过程。然而，与这些细胞机制平行的是，干 扰线粒体中的电子传递链被认定为最有效的产热和能量消耗机制之一。按照 Mitchell的化学渗透理论，通过线粒体内膜的细胞色素链传递电子产生一个质子梯 度，该梯度能活化导致合成ATP的ATP合酶。准确地说，术语线粒体偶联指使氧化 节奏适应能量需求的线粒体能力。从功能观点来看，ADP的存在导致呼吸节奏加快 (状态3)到没有ADP时(状态4)无法达到的节奏。状态3和状态4之间(状态3/状态 4)的关系揭示出线粒体偶联的程度。因此，线粒体解偶联由能够消除质子梯度的任 何机制产生，从而干扰状态3/状态4关系。这种消除导致产热损害ATP的生产。 (Argyropoulos G， Harper ME 2002 Uncoupling proteins and thermoregulation(角率偶耳关蛋 白和热调节)'J Appl Physiol 92:2187-98)。线粒体解偶联蛋白(UCP)实现了消除质子梯度的生理作用，从而干扰状态3/状态 4关系。UCP活性的结果是产热时损害ATP合酶的激活。二十年前在褐色脂肪组织 上鉴定到此家族的第一种蛋白(UCP-1)，最初被命名为产热蛋白(thermogenin) (Maia IG， BenedettiCE， Leite A， Turcinelli SR， Vercesi AE， Arruda P 1998 AtPUMP: an Arabidopsis gene encoding a plant uncoupling mitochondrial protein(编码植物角军偶耳关线 粒体蛋白的拟南芥基因)，FEBS Lett 429:403-6; Bukowiecki LJ 1984 Mechanisms of stimulus-calorigenesis coupling in brown adipose tissue(褐色月旨肪组织中束U激物-产热偶 联的机制)，Can J Biochem Cell Biol 62:623-30)。它被鉴定为肾上腺素能刺激活化的 32kDa蛋白，它能促进环化AMP的激活，从而导致甘油三酯转化为游离脂肪酸，进 而活化UCP-1，导致线粒体呼吸的解偶联。也可通过控制其基因转录的机制调节 UCP-1，其中交感神经紧张也是这种现象的重要诱导物(Palou A， Pico C， Bonet ML， Oliver P 1998 Uncoupling protein, thermogenin(解偶联蛋白-产热蛋白)，Int J Biochem Cell Biol 30:7-11)。1997年，鉴定到属于UCP家族的另外两种蛋白质，它们命名为UCP-2和 UCP-3。第一种在几种组织中表达，第二种主要在骨骼肌组织中表达。近几年，又鉴 定到属于同一家族的两种新蛋白，但同源性程度低于前面鉴定的蛋白，它们称为 UCP-4禾口 UCP-5(Argyropoulos G ， Harper ME 2002 Uncoupling protein and thermogenin(解偶联蛋白和产热蛋白)，J Appl Physiol 92:2187-98)。不同的实验证据表明，UCP参与解偶联，从而参与产热控制。如前所述，褐色 脂肪组织中存在的UCP-1受交感神经刺激的控制，所述交感祌经刺激通过诱导分子 机制，控制游离脂肪酸的产生并调节UCP的活性，除此之外，相同的神经刺激能活 化提高UCP-1蛋白表达的转录程序(Argyr叩oulos G， Harper ME 2002， Uncoupling protein and thermogenin(解偶联蛋白和产热蛋白)，J Appl Physiol 92:2187-98)。在同样 的环境下，UCP-2异位表达或UCP-3转基因超表达通过线粒体解偶联依赖性机制导 致产热增加。因此，明显可以看出UCP家族蛋白在能量消耗和产热机制中起到核心 作用(Chan CB， MacDonald PE， Saleh MC， Johns DC， Marban E， Wheeler MB 1999， Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets(解偶联蛋白2的过表达抑制了葡萄糖-刺激的大鼠胰岛分泌胰岛素)， Diabetes 48:1482-6; Chan CB， De Leo D， Joseph JW， McQuaid TS， Ha XF， Xu F， Tsushima RG, Pennefather PS， Salapatek AM， Wheeler MB 2001 Increased uncoupling protein-2 levels in beta-cells are associated with impaired glucose-stimulated insulin secretion: mechanism of action( 0 -细胞中解偶联蛋白-2水平升高与葡萄糖-刺 激的胰岛素分泌受损有关作用机理)，Diabetes 50:1302-10)。由于在细胞能量流控制中的重要作用，UCP家族蛋白很快成为目的为开发诱导 其活性的药理学机制的研究焦点。如果能成功开发，这种化合物可能用于治疗肥胖
以评价UCP蛋白的功能调节作用为目的的第一种实验方法包括转基因和敲除动物的饲养。UCP-l基因的错排(disarrangment)导致完全缺少它的表达，这不会促进体 重或食物摄入的显著改变，但会导致冷接触的敏感性增加(Melnyk A， Himms-Hagen J 1998 Temperature-dependent feeding: lack of role for lectin and defect in brown adipose tissue-ablated obese mice(温度依赖性饲养褐色脂肪组织消融的肥胖小鼠中缺 少瘦激素的作用和缺陷)，Am J Physiol 274:R1131-5)。另一方面，转基因诱导UCP-1 在骨骼肌上异位表达，使该动物对饮食诱导的肥胖产生抗性(Argyropoulos G， Harper ME 2002 Uncoupling proteins and thermoregulation(解偶联蛋白和热调节)，J Appl Physiol 92:2187-98)。除此之外，血液中葡萄糖和胰岛素水平变低，表明对胰 岛素的敏感型增大。最后，这些小鼠的胆固醇水平也较低。此外，UCP-2表达被基 因消融的动物不会变肥胖，然而，与UCP-1敲除动物不同，它们对冷接触不敏感。 另一方面，用感染性病症追踪后发现，UCP-2敲除小鼠会产生更多的自由基，从而 更易于对抗感染。在由于抑制瘦激素产生的隐性单基因缺陷而发生肥胖和糖尿病的 ob/ob小鼠中消融UCP-2表达，导致胰岛素产量增加并改善升糖水平(glycemic levels) 。 (ChanCB， MacDonald PE， Saleh MC， Johns DC ， Marban E， Wheeler MB 1999， Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets(解偶联蛋白2的过表达抑制了葡萄糖-刺激的大鼠胰岛分泌胰岛素)， Diabetes 48: 1482-6; Chan CB， De Leo D， Joseph JW， McQuaid TS， Ha XF， Xu F， Tsushima RG， Pennefather PS， Salapatek AM, Wheeler MB 2001， Increased uncoupling protein-2 levels in beta-cells are associated with impaired glucose-stimulated insulin secretion: mechanism of action( P -细胞中解偶联蛋白-2水平升高与葡萄糖陽刺 激的胰岛素分泌受损有关作用机理)，Diabetes 50:1302-10; ChanCB, SalehMC， Koshkin V， Wheeler MB 2004， Uncoupling protein 2 and islet function(未偶联蛋白2 和胰岛功能)，Diabetes 53增刊1: S136-42)。最后，UCP-3敲除动物不会变肥胖， 不会发生产热缺陷。然而，这种动物产生更多的活性氧中间体(Zhou M， Lin BZ， CoughlinS ， VallegaG, Pilch PF 2000， UCP-3 expression in skeletal muscle: effects of exercise, hypoxia, and AMP-activated protein kinase(UCP-3在骨骼肌中的表达锻炼、 缺氧和AMP-活化的蛋白激酶的影响)，Am J Physiol Endocrinol Metab 279: E622-9)。有趣的是，UCP-3过表达产生食欲旺盛的痩小动物，其脂肪组织含量少且葡萄 糖清除率高(Zhou M， Lin BZ， Coughlin S， Vallega G， Pilch PF 2000， UCP-3 expression in skeletal muscle: effects of exercise, hypoxia, and AMP-activated protein kinase(UCP-3在骨骼肌中的表达锻炼、缺氧和AMP-活化的蛋白激酶的影响)，Am J Physiol Endocrinol Metab 279:E622-9)。关于UCP-2是胰岛中表达水平最高的UCP家族蛋白的报道使人注意到，它可能 用作胰岛素分泌不能满足需求的病症的治疗靶点。胰岛中UCP-2表达减少的转基因 动物的基线分泌和胰岛素-刺激的分泌水平更高(Chan CB， MacDonald PE， Saleh MC ， Johns DC ， Marban E， Wheeler MB 1999， Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets(解偶耳关蛋白2的过表达抑制 了葡萄糖-刺激的大鼠胰岛分泌胰岛素)，Diabetes 48: 1482-6; ChanCB， DeLeoD， Joseph JW， McQuaidTS， Ha XF， Xu F， Tsushima RG， Pennefather PS ， Salapatek AM ， Wheeler MB 2001 ， Increased uncoupling protein-2 levels in beta-cells are associated with impaired glucose-stimulated insulin secretion: mechanism of action( 3 -细胞中解偶联蛋白-2水平升高与葡萄糖-刺激的胰岛素分泌受损有关作用机理)，Diabetes 50:1302-10; Chan CB ， Saleh MC, Koshkin V， Wheeler MB 2004， Uncoupling protein 2 and islet function(解偶联蛋白2和胰岛功能)，Diabetes 53增刊 l:S136-42)。除此之外，与此蛋白表达降低相比，糖尿病性肥胖小鼠的糖尿病病症显 著改善。对UCP基因、包括UCP-2的表达控制的了解很少，然而，近年来的研究表明， 称为过氧化物酶体增殖物-激活的受体a辅激活物l(PGC-la)的蛋白质在此调节中起 重要作用(De Souza CT， Gasparetti AL， Pereira隱da-Silva M， Araujo EP， Carvalheira JB ， Saad MJ ， Boschero AC ， Carneiro EM ， Velloso LA 2003 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1-dependent uncoupling protein-2 expression in pancreatic islets of rats: a novel pathway for neural control of insulin secretion(过氧化物酶体增殖物-活化的受体Y辅激活物-l-依赖性解偶联蛋白-2在大鼠 胰岛中的表达胰岛素分泌的神经控制新途径)，Diabetologia46:1522-31)。PGC-la是由795个氨基酸组成的蛋白质，最初通过酵母双杂交系统发现于褐色 脂肪组织和骨骼肌中(Yoon JC， PuigserverP， Chen G， Donovan J， WuZ， Rhee J， Adelmant G， Stafford J， Kahn CR， Granner DK， Newgard CB， Spiegelman BM 2001 Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC-l(通 过转录辅激活物PGC-1控制肝糖异生)，Nature 413:131-8)。作为基因转录辅激活 物，PGC-la具有能与转录因子如PPARy、 PPARa、核呼吸因子(NRF)、 CREB结合 蛋白(CBP)、肝细胞核因子ct4(HNF-4a)、分叉头转录因子l(FOXOl)、类固醇受体辅 激活物l(SRC-l)和肌细胞增强子因子2(MEF-2)发生物理相互作用的几个功能结构 域。近年来的研究使PGC-la与控制肝脏和肌肉中的葡萄糖摄取和胰岛素的作用关 联起来(YoonJC， PuigserverP， Chen G， Donovan J， WuZ， Rhee J， AdelmantG， Stafford J， Kahn CR， Granner DK， Newgard CB， Spiegelman BM 2001 Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC-l(通过转录辅f敫f舌 物PGC-l控制肝糖异生)，Nature 413:131-8; Oliveira RL， Ueno M， de Souza CT， Pereira-da-Silva M， Gasparetti AL， Bezzera RM， Alberici LC， Vercesi AE， Saad MJ， Velloso LA 2004 Cold-induced PGC-l alpha expression modulates muscle glucose uptake through an insulin receptor/Akt-independent， AMPK-dependent pathway(冷诱导 的PGC-la表达通过胰岛素受体/Akt-非依赖性、AMPK依赖性通路调节肌肉葡萄糖 摄取)，Am J Physiol Endocrinol Metab 287:E686-95)。除此以外，两项临床研究揭示 出，PGC-la基因中的突变可能与胰岛素耐受和糖尿病有关(Ek J， Andersen G， Urhammer SA， Gaede PH， Drivsholm T， Borch-Johnsen K， Hansen T， Pedersen O 2001Mutation analysis of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 (PGC-l) and relationships of identified amino acid polymorphisms to Type II diabetes mellitus(过氧化物酶体增殖物-活化的受体-Y辅激活物-l(PGC-l)的突变分 析和鉴定的氨基酸多态性与II型糖尿病的关系)，Diabetologia 44:2220-6; Hara K， Tobe K， Okada T， Kadowaki H， Akanuma Y， Ito C， Kimura S， Kadowaki T 2002 A genetic variation in the PGC-l gene could confer insulin resistance and susceptibility to Type II diabetes (PGC-l基因的遗传变异可能产生胰岛素耐受和II型糖尿病易感性)， Diabetologia 45:740-3)。近年来的研究揭示出，在基本耐受胰岛素的个体中，只有P-胰腺细胞无法满足 外周血中逐渐升高的胰岛素需求应导致发生2型糖尿病。因此，在需要更多胰岛素 的临床症状下连续调节胰岛素生产的药理学机制可用于治疗糖尿病(Moller DE 2001 New drug targets for type 2 diabetes and the metabolic syndrome(2型糖尿病禾卩代谢综合 征的新药物靶点)，Nature 414:821-7)。由于UCP蛋白，尤其是UCP-2用作代谢疾病的治疗靶点的可能性，特别是它参 与控制胰岛素分泌，所以研究能够控制UCP-2表达，从而评价它对葡萄糖内稳态和 胰岛素分泌的影响的化合物令人很感兴趣。糖尿病和相似病症是世界上流行最为广泛的疾病之一。
考虑到有效治疗方法很少，而且对这些疾病控制不足的后果是破坏性的，能显 著降低患病个体的预期寿命，因此开发新的治疗方案非常重要，从商业角度来看， 这也会为制药工业带来巨大利益。更具体说，开发PGC-1(X信使核糖核酸的反义脱 氧核糖核酸寡核苷酸(UCP表达的重要核控制物)，可能用于治疗糖尿病和相关疾病。附图简要说明以下参照说明书附图来更好地理解和说明
图1说明了与啮齿动物标准饮食(C)比较，高脂肪饮食(F)对SW/Uni和CBA/Uni 品系小鼠的体重变化(a)、基线葡萄糖血清水平(b)和基线胰岛素血浆水平(c)的影响。 结果表示为平均值±该平均值的标准差，其中11=6; *p<0.05。图2说明了用啮齿动物标准饮食或高脂肪饮食饲养的SW/Uni和CBA/Uni小鼠 的肝脏和脂肪组织(WAT)中PGC-la表达的免疫印迹(IB)分析(IB)。随机选择四周龄 小鼠分入接受标准或高脂肪饮食的小组中，从时间零点开始，每四周获取每组四只 动物的肝脏和脂肪组织的蛋白质提取物的样品。然后，将这些样品用于抗-PGC-loc 抗体的免疫印迹实验。在所有n=4的实验中。结果表示为平均值±该平均值的标准 差。图3代表(a)剂量递增的PGC-1口/AS对SW/Uni小鼠的肝脏和脂肪组织(WAT) 中PGC-1口表达的影响的免疫印迹(IB)分析。b中，用每日剂量1.0 nmol PGC-1口 /AS (AS)与仅用载体(C)或用有义对照寡核苷酸(S)治疗的动物作比较。在此实验中评 价PGC-la和肌动蛋白(肝脏中)以及波形(脂肪组织中)结构蛋白。甚至测试了与载体 (方块)或有义对照寡核苷酸(圆圈)相比，PGC-1口/AS(三角形)对基线葡萄糖血清水平 (c)、基线胰岛素血浆水平(d)、体重(e)和食物摄取(f)的影响。结果表示为平均值士该 平均值的标准差，其中n-4(a和b)或r^6(c-f); 4目对于Cp0.05。图4代表用PGC-1口/AS治疗SW/Uni小鼠对代谢的影响。用1.0 nmol/天的 PGC-1口/AS(三角形，AS)、或者有义对照(圆圈，S)或载体(方块，C)处理小鼠，并通 过葡萄糖耐受测试(a和b)、胰岛素耐受测试(c)或正葡萄糖-高胰岛素钳夹(d)进行评 价。结果表示为平均值±该平均值的标准差，其中n-6; *p<0.05。图5代表通过检测肝脏和脂肪组织中IR酪氨酸磷酸化或Akt丝氨酸，测定用 PGC-la/AS治疗SW/Uni小鼠对IR和Akt表达(每幅图片的上方印迹)和分子激活的 影响。结果表示为平均值±该平均值的标准差，其中n-6; *p<0.05。
发明概述本发明涉及PGC-la蛋白的信使核糖核酸的反义脱氧核糖核酸寡核苷酸。此化 合物具有通过Watson和Crick模式碱基配对将其本身结合于相应序列的特性，通过 这种机制抑制信使核糖核酸翻译成蛋白质。用作治疗糖尿病、胰岛素耐受和代谢综 合征的药物。更具体说，在糖尿病和胰岛素-耐受性个体中，此化合物能促进葡萄糖血清水平 的提高、血浆胰岛素浓度的提高和胰岛素耐受水平的降低。优选通过口服或胃肠道 外途径将该化合物给予患有(2)型糖尿病、胰岛素耐受或代谢综合征的个体，每日给 药一次，剂量为5-10nmol/kg体重。但是，更具体说，本发明涉及序列号1、2和3的修饰的脱氧核糖核酸寡核苷酸， 用作通过肠道或胃肠道外给药治疗2型糖尿病、胰岛素耐受和代谢综合征的药物的 应用。序列号15'-tggagttgaa aaagcttgac tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg acatgtgcaa ccaggactct gagtctgtat-3'序列号25'-tgctctgtgt cactgtggat tggagttgaa aaagcttgac tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg ac晦tgc肌-3'序列号35'-tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg acatgtgcaa ccaggactct gagtctgtat ggagtgacat cgagtgtgct-3'考虑到用于治疗糖尿病和类似疾病的经典治疗方法很少，并且在大部分患者中 无法进行所需控制，导致糖尿病发生许多继发性并发症，导致生活质量下降和患病 个体的死亡率上升，可认为本发明能解决这些问题。更具体说，按照在动物模型中 进行的实验，本发明导致更有效地控制葡萄糖水平，并对与糖尿病和肥胖症相关的 其它并发症起到有益作用。因此，与市场上现有的其它产品相比，本发明的主要优点是控制血糖水平的有 效性和对这些疾病的其它并发症起到有益作用。发明详述本发明涉及序列号1、 2和3的脱氧核糖核酸寡核苷酸，用作通过肠道或胃肠道
外给药治疗2型糖尿病、胰岛素耐受和代谢综合征的药物的应用。 序列号15'匿tggagttgaa aaagcttgac tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg acatgtgcaa ccaggactct gagtctgtat-3'序列号25'匿tgctctgtgt cactgtggat tggagttgaa aaagcttgac tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg3C3tgtgC幼-3'序列号35'- tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg acatgtgcaa ccaggactct gagtctgtat ggagtgacat cgagtgtgct-3'本发明包括^^X^凝^^尸GC-7a翁^^弊浙游尿谅/力腐游资菜 ，所用动物模型的鉴定首先，鉴定了这些实验中所用的动物模型。采用两种不同品系、但具有某些遗传同一性的小鼠，SW/Uni和CBA/Uni小鼠。这两种品系相关，并且与之前描述的用 高脂肪饮食饲养时易于发生糖尿病和肥胖的AKR小鼠有关(Rossmeisl M， Rim JS， Koza RA， Kozak LP 2003 Variation in type 2 diabetes-related traits in mouse strains susceptible to diet-induced obesity(易于发生饮食诱导性肥胖的小鼠品系中2型糖尿病 相关特征的变化)，Diabetes 52:1958-66)。用啮齿动物标准饮食处理时，SW/Uni和 CBA/Uni小鼠不会发生肥胖或糖尿病(图1)。然而，用高脂肪饮食饲养时，CBA/Uni 小鼠变肥胖，而SW/Uni小鼠变肥胖且发生糖尿病，其基线葡萄糖血清水平高于16.0 nmol/l(图1)。接着，测定了高脂肪饮食对两种品系的肝脏和脂肪组织中PGC-la表达的影 响。在这种鉴定中，获得不同年龄并用标准或高脂肪饮食饲养了不同时间的小鼠的 这两种组织的片段。以特异性抗-PGC-la抗体对获自这些片段的蛋白质提取物进行 免疫印迹实验。通过数字光密度测定法定量印迹上的条带，并互相比较。如图2所 示，衰老以及摄取高脂肪饮食能显著增加这两种组织中PGC-la的表达。然而，如 统计学分析所示，SW/Uni品系小鼠的PGC-la表达增量大于CBA/Uni小鼠。^《X^凝穿麼尸GC-7a必^S『/W/ V、嚴游效架 用高脂肪饮食饲养时同时出现肥胖和糖尿病表型的SW/Uni品系小鼠被选择为 测试用动物模型。在鉴定反义寡核苷酸PGC-la(PGC-la/AS)的效果的第一部分，用 免疫印迹技术评价化合物抑制靶蛋白在实验动物的肝脏和脂肪组织中表达的能力。 图3a显示，在高脂肪饮食饲养的SW/Uni小鼠中胃肠道外使用4天时，PGC-la/AS 对靶蛋白在肝脏和脂肪组织中的表达具有剂量依赖性影响。这种作用有特异性，并 且不干扰同一组织中结构蛋白(肌动蛋白和波形蛋白)的表达(图3b)。随后，每日给予一次l.O nmol剂量的PGC-loc/AS时，PGC-la表达对用高脂肪 饮食饲养的SW/Uni小鼠的代谢和激素参数的抑制作用。如图3所示(c-f)，该化合物 促进基线血清葡萄糖水平在处理16天后完全恢复。这种作用伴随着基线血浆胰岛素 水平显著提高。同时，还有体重减少的趋势，但食物摄入没有改变。为了评价该化合物对体内胰岛素分泌和作用的影响，用PGC-la/AS(1.0 nmo1/ 天)、有义对照寡核苷酸或载体处理高脂肪饮食饲养的SW/Uni小鼠，并通过葡萄糖 耐受和胰岛素耐受测试和正葡萄糖-高胰岛素钳夹进行评价。如图4所示， PGC-la/AS处理能促进葡萄糖耐受性测试中的葡萄糖水平降低和胰岛素水平提高(图 4a和b)，胰岛素耐受性测试中的葡萄糖衰变速率提高(图4c)和正葡萄糖-高胰岛素钳 夹中葡萄糖消耗速率提高(图4d)。最后，评价了PGC-la/AS处理对胰岛素作用中起重要作用的两种蛋白质，即胰 岛素受体(IR)和Akt信号转导蛋白的细胞表达和激活的影响。因此，用PGC-la/AS 或对照有义寡核苷酸或载体处理SW/Uni小鼠，将获自肝脏和脂肪组织的片段用于免 疫印迹和免疫沉淀实验以及IR和Akt研究。如图5所示，用PGC-la/AS处理能促进 肝脏和脂肪组织中IR表达水平的提高，以及脂肪组织中Akt表达水平的提高。该处 理仍然导致这两种组织中胰岛素诱导的IR酪氨酸磷酸化增加和这两种组织中胰岛素 诱导的Akt丝氨酸磷酸化增加。以此方式，通过PGC-la/AS处理抑制获得的PGC-la 对胰岛素分子作用机制有重要影响，这有利于此激素在靶组织中的活性。提供上述本发明说明书的目的是说明和描述。除此以外，该说明书不旨在将本 发明限制于其中所揭示的具体形式。因此，与上述说明书相容的改变和修改以及相关技术的能力或知识都属于本发明范围。上述实施方式旨在更好地解释用于实施本发明的己知方式，并使得本领域技术 人员能够以这种方式或者其它方式使用本发明，可根据具体应用的需要进行一些修 改或直接采用本发明。本发明应包括所有修改和变化，以及所附的权利要求书。
权利要求
1.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸由对应于以下修饰或未修饰序列的80个合成或天然碱基组成序列号15′-tggagttgaa aaagcttgac tggcgtcatt caggagctgg atggcgtgggacatgtgcaa ccaggactct gagtctgtat-3′；序列号25′-tgctctgtgt cactgtggat tggagttgaaaaagcttgac tggcgtcatt caggagctgg atggcgtggg acatgtgcaa-3′；序列号3，5′-tggcgtcattcaggagctgg atggcgtggg acatgtgcaa ccaggactct gagtctgtat ggagtgacat cgagtgtgct-3′；或至少具有5个碱基的它们的片段。
2. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的1-20号碱基。
3. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的2-21号碱基。
4. 如权利要求1 序列的3-22号碱基。
5. 如权利要求1 序列的4-23号碱基。
6. 如权利要求1 序列的5-24号碱基。
7. 如权利要求1 序列的6-25号碱基。
8. 如权利要求1 序列的7-26号碱基。
9. 如权利要求1 序列的8-27碱基。
10. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的9-28碱基。
11. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的10-29号碱基。
12. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的11-30号碱基。所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述
13. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的12-31号碱基。
14. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的13-32号碱基。
15. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的14-33号碱基。
16. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的15-34号碱基。
17. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的16-35号碱基。
18. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的17-36号碱基。
19. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的18-37号碱基。
20. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的19-38号碱基。
21. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的20-39号碱基。
22. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的21-40号碱基。
23. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的22-41号碱基。
24. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的23-42号碱基。
25. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的24-43号碱基。
26. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的25-44号碱基。
27. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的26-45号碱基。
28. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 序列的27-46号碱基。
29. 如权利要求 序列的28-47号碱基。
30. 如权利要求 序列的29-48号碱基。
31. 如权利要求 序列的30-49号碱基。
32. 如权利要求 序列的31-50号碱基。
33. 如权利要求 序列的32-51号碱基。
34. 如权利要求 序列的33-52号碱基。
35. 如权利要求 序列的34-53号碱基。
36. 如权利要求 序列的35-54号碱基。
37. 如权利要求 序列的36-55号碱基。
38. 如权利要求 序列的37-56号碱基。
39. 如权利要求 序列的38-57号碱基。
40. 如权利要求 序列的39-58号碱基。
41. 如权利要求 序列的40-59号碱基。
42. 如权利要求 序列的41-60号碱基。
43. 如权利要求 序列的42-61号碱基。所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于， 所述的寡核苷酸，其特征在于，所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述
44. 如权利要求1所述的寡核苷酸，序列的43-62号碱基。
45. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的44-63号碱基。
46. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的45-64号碱基。
47. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的46-65号碱基。
48. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的47-66号碱基。
49. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的48-67号碱基。
50. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的49-68号碱基。
51. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的50-69号碱基。
52. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的51-70号碱基。
53. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的52-71号碱基。
54. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的53-72号碱基。
55. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的54-73号碱基。
56. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的55-74号碱基。
57. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的56-75号碱基。
58. 如权利要求1所述的寡核苷酸， 序列的57-76号碱基。
59. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 其特征在于，所述序列优选包含任意所述序列的58-77号碱基。
60. 如权利要求 序列的59-78号碱基。
61. 如权利要求 序列的60-79号碱基。
62. 如权利要求 序列的61-80号碱基。
63. 如权利要求 序列的26-41号碱基。
64. 如权利要求 序列的27-42号碱基。
65. 如权利要求 序列的28-43号碱基。
66. 如权利要求 序列的29-44号碱基。
67. 如权利要求 序列的30-45号碱基。
68. 如权利要求 序列的31-46号碱基。
69. 如权利要求 序列的32-47号碱基。
70. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述序列号1、2和3中所含 的5-79号碱基之间的任何其它片段。
71. —种用于制备药物的药物化合物，其特征在于，所述化合物是如权利要求 l-70所述的合成或天然、修饰或未修饰的寡核苷酸。
72. 如权利要求71所述的药物化合物，其特征在于，所述药物化合物用于制备 优选通过肠道或胃肠道外途径给药的药物。
73. —种药物化合物用于制备治疗糖尿病、胰岛素耐受和代谢综合征的药物的 应用，其特征在于，用权利要求1-70所述的寡核苷酸和权利要求71和72所述的化 合物配制所述药物化合物。
74. —种用于制备药物的药物组合物，所述药物组合物用药学有效量的权利要所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸， 所述的寡核苷酸，其特征在于, 其特征在于, 其特征在于，所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述 所述序列优选包含任意所述求1-70所述的寡核苷酸和权利要求71和72所述的化合物配制，并含有药学有效量的治疗应用中药学上可接受的载体、稀释剂、溶剂和/或赋形剂。
75. —种药物组合物，其治疗应用更具体为治疗糖尿病、胰岛素耐受和代谢综 合征。
76. 如权利要求74所述的药物组合物，其特征在于，所述制备药物中所含的所 述药学有效量优选约为每剂量200 nMol-2000 nMol。
77. 如权利要求74所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于制备 优选通过肠道或胃肠道外途径给药的药物。
78. —种药物组合物用于制备治疗糖尿病、胰岛素耐受和代谢综合征的药物的 应用，所述药物组合物用药学有效量的权利要求1-70所述的寡核苷酸和权利要求71 和72所述的化合物配制，并含有药学有效量的药学上可接受的载体、稀释剂、溶剂 和/或赋形剂。
79. —种表达载体，其含有对应于权利要求l-70的寡核苷酸的序列，并能够在 权利要求71和72所述化合物的生物反应器中转化宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及PGC-1α蛋白的信使RNA的反义DNA寡核苷酸用作治疗糖尿病、胰岛素耐受和代谢综合征的药物的应用。更具体说，本发明涉及用作药物的化合物，该化合物能通过肠道或胃肠道外途径给药，优选具有抑制过氧化物酶体增殖物-活化的受体α辅激活物1(PGC-1α)蛋白表达、导致血糖水平降低的特性。因此，本发明涉及在糖尿病个体和对胰岛素耐受的个体中促进葡萄糖血清水平提高、血浆胰岛素浓度升高和对胰岛素的耐受性降低的药物化合物。按照在动物模型中进行的实验，本发明能更有效地控制葡萄糖水平，并对与糖尿病和肥胖症相关的其它并发症起到有益作用。以此方式，与市场上现有的其它产品相比，本发明的主要优点是控制血糖水平的有效性和对这些疾病的其它并发症起到有益作用。
文档编号C07H21/00GK101166751SQ200680014733
公开日2008年4月23日 申请日期2006年3月20日 优先权日2005年3月23日
发明者C·T·德苏扎, L·A·维罗索 申请人:坎皮纳斯州立大学-Unicamp