表皮生长因子受体突变的利记博彩app

专利名称：：表皮生长因子受体突变的利记博彩app
技术领域：
：本申请涉及表皮生长因子受体("EGFr")突变、编码突变型EGFr多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、表达该多核苷酸的细胞以及与该多肽结合的抗体。本申请还涉及磷脂酰肌醇3，-激酶("PI3K")突变、编码突变型PI3K多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、表达该多核苷酸的细胞及与该多肽结合的抗体。本申请还涉及B-Raf突变、编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸、含有该多核苦酸的载体、表达该多核苷酸的细胞及与该多肽结合的抗体。本申请还涉及诊断癌症的方法；用与突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽或突变型B-Raf多肽发生反应的化合物治疗癌症的方法；以及预测抗EGFr特异性结合剂、抗-PBK特异性结合剂或抗B-Raf特异性结合剂在肺瘤治疗中的有效性的方法和试剂盒。
背景技术：
：单克隆抗体在癌症疗法中的某些应用取决于抗体将细胞毒效应子功能特异性传递到癌组织的能力，细胞毒效应子功能例如免疫增强同种型、毒素或药物。一个选择性方法是利用单克隆抗体使肺瘤细胞丧失必需的胞外增殖信号来直接影响肿瘤细胞的存活，例如由生长因子通过其细胞受体介导的增殖信号。该方法中一个颇有吸引力的靶为表皮生长因子受体(EGFr),该受体与EGF和转化生长因子a(TGFa)结合(参见例如Ullrich等，Cell61:203-212,1990;Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等，BiologicTherapyofCancer607-623,Philadelphia:J.B,LippincottCo.,1995;Fan等，Curr.Opin.Oncol.10:67-73,1998)。EGF或TGFoc与EGFr(—种170kDa跨膜细胞表面糖蛋白)结合，触发一系列的细胞生物化学反应，包括在细胞增殖中达到顶点的EGFr自身磷酸化和内化(参见例如Ullrich等，Cell61:203-212,1990)。多个观察结果表明EGFr参与支持人实体瘤的发生和发展。已经证实EGF-r在许多类型的人实体瘤中过量表达(参见例如MendelsohnC""cerCe〃s7:359(1989),Mendelsohn飾/ogy1:339-344(1990)，Modjtahedi和Dean/W/J.(9"co/。^4:277-296(1994))。例如，在某些肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部癌、卯巢癌和前列腺癌中观察到EGF-r过量表达(参见例如Modjtahedi和DeanJ.(9"co/ogy4:277-296(1994))。据才艮道，受体水平提高伴有临床预后不良(参见例如Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等，BiologicTherapyofCancer,第607-623页，Philadelphia:J.B.LippincottCo.,1995;Modjtahedi等，Intl.J.ofOncology4:277-296,1994;Gullick,Br.MedicalBulletin,47:87-98,1991;Salomon等，Crit.Rev.Oncol.Hematol.19:183-232,1995)。已经证实，表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-a(TGF-a)与EGF-r结合并导致细胞增殖和肿瘤生长。在许多情况下，肺瘤细胞表面EGFr表达增加伴有TGFoc或EGF产生，这提示这些肺瘤发展中涉及自分泌生长控制(参见例如Baselga等，Pharmacol,Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等,BiologicTherapyofCancer,第607-623页，Philadelphia:J.B.LippincottCo.,1995;Modjtahedi等，Intl.J.ofOncology4:277-296，1994;Salomon等，Crit.Rev.Oncol.Hematol.19:183-232，1995)。因此，某些研究小组提出，抗EGF、抗TGF-a和抗EGF-r抗体可以用于治疗表达或过量表达EGF-r的肿瘤(参见例如MendelsohnC朋cerCe〃s7:359(1989),MendelsohnC朋cer说o/ogy1:339-344(1990),Modjtahedi和DeanOco/ogy4:277-296(1994),Tosi等，Int'lJ.Cancer62:643-650(1995))。事实上，已经证实，阻断EGF和TGF-a与受体结合的抗EGF-r抗体看来可抑制胂瘤细胞增殖。但是同时，抗EGF-r抗体并不抑制不依赖EGF和TGF-a的细胞生长(Modjtahedi和DeanInt'lJ.Oncology4:277-296(1994))。已经用小鼠和大鼠产生人EGFr特异性单克隆抗体，该抗体在体外能够抑制EGF和TGFot与肿瘤细胞的结合并且能够抑制配体介导的细胞增殖(参见例如Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等，BiologicTherapyofCancer607-623,Philadelphia:J.B.LippincottCo.,1995;Fan等，Curr.Opin.Oncol.10:67-73，1998;Modjtahedi等，Intl.J.Oncology4:277-296,1994)。已经在异种移植小鼠模型中，对某些这类抗体影响肺瘤生长的能力进行了全面的评价，这类抗体例如小鼠108、225单克隆抗体(参见例如Aboud-Pirak等,J.Natl.CancerInst.80:1605-1611,1988)和小鼠528单克隆抗体(参见例如Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等，BiologicTherapyofCancer607-623,Philadelphia:J.B,LippincottCo.，1995)，或者大鼠ICR16、ICR62和ICR64单克隆抗体(参见例如Modjtajedi等，Intl.J.Oncology4:277-296,1994;Modjtahedi等，Br.J.Cancer67:247-253,1993;Modjtahedi等,Br.J.Cancer67:254-261,1993)。大多数抗EGFr单克隆抗体当与人肿瘤细胞一起给予无胸腺小鼠时，对预防无胸腺小鼠胂瘤形成是有效的(Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Modjtahedi等,Br.J.Cancer67:254-261,1993)。当小鼠单克隆抗体225和528注射到带有确立的人肿瘤异种移植物的小鼠体内时，引起了部分肿瘤消退，为了根除肺瘤，则需要联合给予化疗药物例如多柔比星或顺铂(Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等，BiologicTherapyofCancer607-623,Philadelphia:J.B.LippincottCo.，1995;Fan等，CancerRes.53:4637-4642,1993;Baselga等，J.Natl.CancerInst85:1327-1333,1993)。225单克隆抗体的一个嵌合体(chimericversion(C225))，显示出体内抗肺瘤活性提高，但是只是在高剂量时，该嵌合体中，小鼠抗体可变区与人抗体恒定区连接(参见例如Goldstein等，ClinicalCancerRes.1:1311-1318,1995;Prewett等，J.Immunother.EmphasisTumorImmunol.19:419-427，1996)。大鼠ICR16、ICR62和ICR64抗体引起确立的肿瘤消退，但却不能完全根除(Modjtahedi等，Br.J.Cancer67:254-261，1993)。这些结果证实EGFr为一种抗表达EGFr实体瘤抗体疗法大有希望的靶，引起在多发性人实体癌中用C225单克隆抗体进行人体临床试验(参见例如Baselga等，Pharmacol.Ther.64:127-154,1994;Mendelsohn等，BiologicTherapyofCancer,第607-623页，Philadelphia:J.B.LippincottCo.，1995;Modjtahedi等，Intl.J.ofOncology4:277-296,1994)。生物学领域的某些进展使完全人抗EGFr抗体的产生成为可能。用人免疫球蛋白基因转基因的小鼠(XenomouseTMtechnology,Abgenix,Inc.),开发出对人EGFr特异性的人抗体(参见例如Mendez,NatureGenetics,15:146-156,1997;Jakobovits,AdvancedDrugDeliveryReviews,31(1-2):33-42,1998;Jakobovits,ExpertOpiniononInvestigationalDrugs,7(4):607-614,1998;Yang等，Crit.Rev.Oncol.Hematol.38(1):17-23,2001;WO98/24893;WO98/50433)。其中一种称为帕尼单抗(panitumumab)的抗体，是一种对人EGFr的亲和性为5x10-11M的人IgG2单克隆抗体，该抗体显示体外阻断EGF与EGFr结合，阻断受体信号传导，抑制肿瘤细胞活化和增殖(参见例如W09固433;美国专利申请第6,235,883号)。在无胸腺小鼠中的研究表明，帕尼单抗还具有体内活性，不仅抑制无胸腺小鼠中人表皮样癌A431异种移植物的形成，而且还根除已确立的大型A431肺瘤异种移植物(参见例如Yang等，Crit.Rev.Oncol.Hematol.38(l):17-23，2001;Yang等，CancerRes.59(6):1236-43,1999)。已经考虑把帕尼单抗用于治疗癌症，尤其是治疗肾癌、结肠直肠腺癌、前列腺癌和非小细胞鳞状细胞肺癌(参见例如美国专利申请第2004/0033543号)，该抗体的临床试验正在进行中。在某些细胞类型中，生长因子(例如EGFr)的结合，通过剌激磷脂酰肌醇3-激酶("PI3K")和B-Raf来阻止细胞凋亡。PI3K活化触发分子级联，导致控制程序性细胞死亡主要途径的减量调节(Yao,R.,Science267:2003-2006,1995)。Raf家族成员也已被鉴定为哺乳动物程序性细胞死亡的调节剂(Hunter,Cell80:225-236,1995)。在Raf敲出小鼠中，缺失B-Raf的小鼠表现出细胞存活障碍，而缺失Raf-1或A-Raf的小鼠则不表现出这种障碍(参见例如Pritchard,Curr.Biol.6:614-617,1996;Woj歸ski,Nat.Genet.16:293-297,1997),这表明B-Raf在细胞死亡调节中具有特定的功能。在细胞增殖疾病尤其是癌症中，PI3K和B-Raf令人关注。发明概述在某些实施方案中，提供包含至少一个选自以下氨基酸序列的分离的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，提供由至少一个选自以下的氨基酸序列组成的分离的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸编码包含至少一个选自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸编码由至少一个选自以下的氨基酸序列组成的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，提供包含至少一个选自以下氨基酸序列的分离的多肽SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。在某些实施方案中，提供由至少一个选自以下的氨基酸序列组成的分离的多肽SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。在某些实施方案中，提供分离的多核苷酸，该多核苦酸编码包含至少一个选自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。在某些实施方案中，提供分离的多核普酸，该多核苷酸编码由至少一个选自以下的氨基酸序列组成的多肽SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。在某些实施方案中，提供包含至少一个选自以下氨基酸序列的分离的多肽SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供由至少一个选自以下的氨基酸序列组成的分离的多肽SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸编码包含至少一个选自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供分离的多核普酸，该多核香酸编码由至少一个选自以下的氨基酸序列组成的多肽SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供包含至少一种分离的多核苷酸的载体，该多核苷酸编码包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供包含该载体的宿主细胞。在某些实施方案中，提供用至少一种分离的多核普酸转化的细胞，该多核苷酸编码包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供制备多肽的方法。在某些实施方案中，该方法包括将包含栽体的宿主细胞在有效用于多肽产生的条件下进行培养，该载体包含至少一种编码多肽的分离的多核普酸。在某些实施方案中，该方法包括在有效用于多肽产生的条件下培养细胞，该细胞包含至少一种编码多肽的分离的多核苷酸。在某些实施方案中，该方法还包括对多肽进行分离。在某些实施方案中，提供制备多肽的方法。在某些实施方案中，提供包含分离的多肽及与所述多肽融合的异源多肽的融合蛋白，该分离的多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供能够与分离的多肽结合的特异性结合剂，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，特异性结合剂选自至少一种选自以下的分子抗体、其中重链和轻链通过接头连接的抗体、单链Fv抗体、免疫功能性免疫球蛋白片段、Fab抗体、Fab'抗体、(Fab，)2抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、抗独特型抗体、完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体和抑制EGF与分离的多肽结合的抗体，该分离的多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种多肽结合的抗体的方法，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，该方法包括给予动物至少一种多肽，该多肽包含至少一个选自以下的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，该方法还包括从动物中获得能够与至少一种多肽结合的抗体，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，提供包含至少一种多核苷酸的转基因非人类动物，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供与固相支持体(solidsupport)连接的多核苷酸，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供与固相支持体连接的包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供一种多核苷酸阵列，该阵列包含至少一种编码至少一个选自以下氨基酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供一种多肽阵列，该阵列包含至少一种包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的核酸探针。在某些实施方案中，该区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，该核酸探针与互补的多核苦酸杂交。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，该方法还包括根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该方法还包括根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，提供确定样品中编码突变型EGFr多肽的多核苷酸存在与否的方法。在某些实施方案中，提供确定样品中突变型EGFr多肽存在与否的方法。在某些实施方案中，该方法包括使样品暴露在与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，该方法还包括确定样品中编码突变型EGFr多肽的多核苷酸的存在与否。在某些实施方案中，该方法包括确定样品中突变型EGFr多肽的存在与否。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者的EGFr相关癌症的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多肽的存在与否，该多肽包含至少一个选自以下的突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在与否，该多核苷酸编码包含至少一个选自以下突变的多肽L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，至少突变型EGFr多肽的存在可诊断出受治疗者的EGFr相关癌症。在某些实施方案中，至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在可诊断出受治疗者的EGFr相关癌症。在某些实施方案中，提供确定受治疗者发生EGFr相关癌症的可能性的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多肽的存在与否，该多肽包含至少一个选自以下的突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在与否，该多核香酸编码包含至少一个选自以下突变的多肽L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，至少突变型EGFr多肽的存在表明受治疗者发生EGFr相关癌症的可能性。在某些实施方案中，至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在表明受治疗者发生EGFr相关癌症可能性。在某些实施方案中，EGFr相关癌症为非小细胞性肺癌。在某些实施方案中，提供筛选至少一种突变型EGFr多肽的活性调节剂的方法，该多肽包含至少一个选自以下的突变L6S8P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，该方法包括使细胞与试验化合物接触，测定试验化合物是否调节突变型EGFr多肽的活性。在某些实施方案中，提供通过该方法鉴定的化合物。在某些实施方案中，提供治疗与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法，该EGFr突变选自L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，该方法包括向需要治疗与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的受治疗者给予该化合物。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，该方法包括检出受治疗者的多核苷酸中的至少一个EGFr突变，其中至少一个EGFr突变的检出表明，患者发生与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的易感性增加。在某些实施方案中，该方法包括检出受治疗者的多核苷酸中的至少一个EGFr突变，其中至少一个EGFr突变的检出表明，患者患有与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症。在某些实施方案中，该方法还包括给予受治疗者与突变型EGFr多肽特异性结合的抗体。在某些实施方案中，抗体为人抗体。在某些实施方案中，该抗体为帕尼单抗或其抗原结合区。在某些实施方案中，EGFr突变选自L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症为非小细胞性肺癌。在某些实施方案中，提供治疗与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，该方法包括给予需要这种治疗的受治疗者多核苷酸，该多核苦酸为编码至少一个选自以下氨基酸序列的多核苷酸的反义多核苷酸SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，提供用于确立个体的特定群体中突变型EGFr群体特征的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定群体内个体的基因序型(geneticprofile)中存在至少一个EGFr突变。在某些实施方案中，该方法还包括确立突变型EGFr基因序型和个体的具体特征之间的关系。在某些实施方案中，个体的具体特征包括发生与EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，个体的具体特征包括出现与EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，提供预测吉非替尼(gefitinib)在治疗受治疗者的疾病或病症中的功效的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者的突变型EGFr多肽中EGFr突变T790M的存在与否。在某些实施方案中，在一种或多种突变型EGFr多肽中EGFr突变T790M的存在表明对用吉非替尼治疗的抗性。〖036]在某些实施方案中，提供确定在患癌症的受治疗者中对用抗EGFr抗体治疗的反应性的方法。在某些实施方案中，该方法包括确定受治疗者体内EGFr突变T790M的存在与否。在某些实施方案中，抗体为帕尼单抗或西妥昔单抗。在某些实施方案中，提供用于检测受治疗者的多核苷酸的试剂盒，该多核苷酸编码突变型EGFr多肽。在某些实施方案中，试剂盒包含与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针，其中该区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，试剂盒还包含两种以上扩增引物。在某些实施方案中，试剂盒还包含检测组分。在某些实施方案中，试剂盒还包含核酸取样组分。附图简述图1是显示按照实施例1所述研究，对二十名患者的非小细胞性肺癌("NSCLC")肿瘤样品进行突变分析的图表。对得自每个肺瘤基因组DNA的EGFr外显子18、19、20、21和23，PI3K外显子9和20,以及B-Raf外显子15进行扩增、测序并与野生型EGFr、PBK或B-Raf序列相比较。图2是显示按照实施例1所述研究，对二十名患者的结肠直肠腺癌("CRC")肿瘤样品进行突变分析的图表。对得自每个胂瘤基因组DNA的EGFr外显子18、19、20、21和23,PI3K外显子9和20，以及B-Raf外显子15进行扩增、测序并与野生型EGFr、PI3K或B-Raf序列相比较。图3是显示按照实施例2所述研究，对三十九名患者NSCLC肿瘤样品进行突变分析的图表。对得自每个肿瘤基因组DNA的EGFr外显子18、19、20、21和23以及B-Raf外显子11和15进行扩增、测序并与野生型EGFr或B-Raf序列相比较。图4表示按照实施例3所述研究，对吉非替尼和帕尼单抗抑制野生型EGFr和T790MEGFr自身磷酸化活性的放射性凝胶电泳分析。图5表示某些突变型EGFr多核苷酸序列和多肽序列以及某些PI3K多核苷酸序列和多肽序列与相应野生型序列的比对。图6显示野生型EGFr分子和突变型EGFr分子的多核苦酸序列和多肽序列。图7显示野生型PI3K分子和突变型PI3K分子的多核苦酸序列和多肽序列。图8显示野生型B-Raf分子和突变型B-Raf分子的多核苷酸序列和多肽序列。某些优选的实施方案详述本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教材等，以及本文所引用的在某种程度上尚不完全的资料，都通过引用全部结合到本文中。本文各部分的标题仅出于组织目的，不得解释为对所述主题实质的限制。定义除非另有规定，否则所使用的有关本发明的科技术语具有本领城普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非文章中需要，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。—般地讲，所使用的与本文所述细胞和组织培养技术、分子生物学技术、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学技术及杂交技术有关的命名是本领域众所周知和通用的。重组DNA、寡核苷酸合成及組织培养和转化(例如电穿孔、脂转染)都采用标准技术。按照生产商的说明书或者按照本领域常规方法或本文所述方法，实施酶促反应和纯化技术。通常按照本领域众所周知的常规方法以及本说明书全文所引用和讨论的各种一般性的和更为具体的参考文献，来实施前述才支术和方、法。参见例^口Sambrook等,A^o/ecw/"rC7om'"g:爿Z/a/0r"to/7A/awwa/(第二片反,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(l989)),所述文献的内容通过引用结合到本文中。所使用的与本文所述分析化学、合成有机化学和药物化学和制药化学的实验室方法和技术有关的命名是本领域众所周知和通用的。化学合成、化学分析、药物制备、制剂和给药，以及患者治疗都采用标准技术。本申请中，"或"的用法是指"和/或"，除非另有说明。此外，术语"包括"的用法以及其它形式不是限制性的。同样，术语例如"元件"或"组分"既包括包含一个单位的元件和组分，也包括包含不止一个亚单位的元件或组分，除非另有说明。如本说明书所使用的一样，以下术语除非另有说明，否则应理解为具有以下含义术语"分离的多核苷酸"与"分离的核酸"可互换使用，本文提及时是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或者它们的某些组合，根据其来源，该多核苷酸(l)与其中是天然存在的"分离的多核苷酸"的多核苷酸的全部或部分无关，(2)与天然不被连接的多核苷酸操作性地连接，或者(3)天然情况下不会成为较大序列的部分。术语"分离的蛋白质"和"分离的多肽"可互换使用，本文提及时是指cDNA、重組RNA或合成来源的蛋白质或者它们的某些组合，根据其来源或衍生物来源，该蛋白质(l)与天然存在的蛋白质无关，(2)不含同一来源的其它蛋白质，例如不含鼠类蛋白质，(3)用异种细胞进行表达，或者(4)天然不存在。术语"多肽"和"蛋白质"可互换使用，本文用作通用术语，是指天然蛋白质、片段、肽或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质、片段和类似物为一种多肽类。在本文多肽序列突变的内容中，术语"X#Y"是本领域公知的，其中"弁"表示按照多肽氨基酸编号的突变位置，"X"表示在野生型氨基酸序列中氨基酸所处位置，"Y"表示该位置上的突变氨基酸。例如，关于EGFr多肽的符号"L688P",表示野生型EGFr序列氨基酸编号688上有一个亮氨酸，在突变型EGFr序列中亮氨酸被脯氨酸置换。术语"突变型EGFr多肽"和"突变型EGFr蛋白"可互换使用，是指包含至少一个选自以下EGFr突变的EGFr多肽L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。某些示例性的突变型EGFr多肽包括但不限于等位变异体、剪切变异体(splicevariant)、书f生变异体(derivativevariant)、取代变异体、缺失变异体和/或插入变异体、融合多肽、直向同源物及种间同源物。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽包括C端或N端上的其它残基，例如但不限于前导序列残基、寻耙残基(targetingresidue)、N端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、标记残基和/或融合蛋白残基。术语"突变型PI3K多肽"和"突变型PI3K蛋白"可互换使用，是指包含至少一个选自以下PI3K突变的PI3K多肽E542K、E545A和H1047L。某些示例性的突变型PI3K多肽包括但不限于等位变异体、剪切变异体、衍生变异体、取代变异体、缺失变异体和/或插入变异体、融合多肽、直向同源物及种间同源物。在某些实施方案中，突变型PBK多肽包括在C端或N端的其它残基，例如但不限于前导序列残基、寻靶残基、N端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、标记残基和/或融合蛋白残基。术语"突变型B-Raf多肽"和"突变型B-Raf蛋白"可互换使用，是指包含至少一个选自以下B-Raf突变的B-Raf多肽V600E和K601E。某些示例性的突变型B-Raf多肽包括但不限于等位变异体、剪切变异体、衍生变异体、取代变异体、缺失变异体和/或插入变异体、融合多肽、直向同源物及种间同源物。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽包括C端或N端的其它残基，例如但不限于前导序列残基、寻靶残基、N端曱硫氨酸残基、赖氨酸残基、标记残基和/或融合蛋白残基。术语"突变型EGFr融合蛋白"是指在突变型EGFr多肽的N端或C端上融合一个或多个氨基酸(例如异源多肽)。术语"突变型PI3K融合蛋白"是指在突变型PI3K多肽的N端或C端上融合一个或多个氨基酸(例如异源多肽)。术语"突变型B-Raf融合蛋白"是指在突变型B-Raf多肽的N端或C端上融合一个或多个氨基酸(例如异源多肽)。本文所用术语"天然存在的"当用于物体时，是指物体可以在自然界中存在的事实。例如，生物(包括病毒)中存在的、可以从自然界来源中分离的、未在实验室中被人为有意修饰的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。本文所用术语"操作性连接(的)"是指组分的定位，以使它们具有允许以其预期方式发挥功能的关系。控制序列与编码序列"操作性连接"是在与控制序列相容的条件下，以实现编码序列表达的方式连接。本文所用术语"控制序列"是指与编码序列连接的实现编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。该控制序列的性质取决于宿主生物；原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合部位和转录终止序列；真核生物中，这些控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语"控制序列"是指最少包括其存在是表达和加工所必需的所有组分，还可包括其存在是有利的其它组分，例如前导序列和融合陪"f半序列(fusionpartnersequence)。本文所用术语"多核苷酸"是指多聚形式的长度至少为10个碱基的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者这两种核苷酸类型的修饰形式。该术语包括单链和双链DNA形式。本文所用术语"寡核苷酸"包括天然存在的核苷酸和修饰的核普酸，通过天然存在和非天然存在的寡核苷酸键连接在一起。寡核苷酸为多核苷酸的一部分，一般包含长度为200个以下的碱基。优选寡核苷酸长度为10-60个碱基，更优选长度为12、13、14、15、16、17、18、l9或20-40个石咸基。寡核苷酸通常为单链(例如对于探针)，虽然寡核苷酸可以为双链(例如用于构建基因突变体)。本发明的寡核普酸可为有义寡核苷酸或反义寡核苷酸。术语"突变型EGFr多核苷酸"、"突变型EGFr寡核苷酸"和"突变型EGFr核酸"可互换使用，是指编码包含至少一个选自以下EGFr突变的EGFr多肽的多核苷酸L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。术语"突变型PI3K多核苷酸"、"突变型P13K寡核苷酸"和"突变型PI3K核酸"可互换使用，是指编码包含至少一个选自以下PI3K突变的PI3K多肽的多核苷酸E542K、E545A和H1047L。术语"突变型B-Raf多核苷酸"、"突变型B-Raf寡核苷酸"和"突变型B-Raf核酸"可互换使用，是指编码包含至少一个选自以下B-Raf突变的B-Raf多肽的多核苦酸L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。本文提及的术语"天然存在的核香酸"包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语"修饰的核苷酸"包括用糖基团等修饰或取代的核香酸。本文提及的术语"寡核香酸键"包括诸如硫代磷酸酯、二硫代-寿酸酯、踊代磷酸酯(phosphoroselenoate),二励代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)、氨基磷酸酯等寡核苷酸键。参见例如LaPlanche等，油d.^c油to.14:9081(1986);Stec等，J,為.C/2置Soc.106:6077(1984);Stein等,Nucl.AcidsRes.16:3209(1988);Zon等,Anti-CancerDrugDesign6:539(1991);Zon等，OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,第87-108页(F.Eckstein主编,OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991));Stec等，美国专利第5,151，510号；Uhlmann和PeymanChemicalReviews90:543(1990);所有这些文献的内容都通过引用结合到本文中。如有需要，寡核苷酸可包括检测用标记。本文提及的术语"选择性杂交"是指可检测和特异性的结合。在使与非特定核酸可检测结合的可检测量最小化的杂交和洗涤条件下，使多核苷酸、寡核苷酸及其片段与核酸链选择性地杂交。可采用如本领域已知的以及本文所讨论的非常严^f备的条件，以达到选择性杂交条件。一般地讲，核酸序列与多核普酸、寡核苷酸、目标片段和目标核酸序列的同源性为至少80%，更通常优选同源性增加为至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%和100%。如果两个氨基酸序列在它们的序列之间部分或完全相同，则两个氨基酸序列是同源的。例如，85%同源性是指，当两个序列进行最大配对的比对时，85%的氨基酸相同。在使配对最优化时，允许有空位(两个配对序列中任一个序列)；优选空位长度为5个以下，更优选为2个以下。任选和优选，两个蛋白质序列(或从长度为至少30个氨基酸的蛋白质衍生的多肽序列)是同源的，按本文所使用的该术语，如果运用具有突变数据矩阵(mutationdatamatrix)和空位罚分(gappenalty)为6分以上的程序ALIGN，它们具有的比对分值〉5(标准差单位中)。参见Dayhoff,M.O.,AtlasofProteinSequenceandStructure,第101-110页(笫5巻，NationalBiomedicalResearchFoundation(1972))和该巻增刊2,笫1-10页。如果当运用ALIGN程序进行最佳比对，两个序列的氨基酸或其部分>50%同一性时，更优选两个序列或其部分是同源的。本文所用术语"与...…一致"是指多核苷酸序列与参比多核苷酸序列的全部或部分是同源的(也就是说是相同的，不是严格进化意义上相关的)，或者是指多肽序列与参比多肽序列是相同的。与之不同的是，本文所用术语"与...…互补"是指互补序列与参比多核普酸序列的全部或部分是同源的。举例来说，核苷酸序列"TATAC"与参比序列"TATAC，，一致，与参比序列"GTATA"互4卜。我们使用下列术语描述两个或多个多核香酸或氨基酸序列之间的序列关系:"参比序列"、"比较窗(comparisonwindow)"、"序列同一性"、"序列同一性百分数"和"基本相同"。"参比序列"是用作序列比较基础的规定序列；参比序列可以是较大序列中的一小部分例如为序列表中给定的全长cDNA或基因序列的区段，或者可以包含完整的cDNA或基因序列。一般地讲，参比序列长度为至少18个核普酸或6个氨基酸，通常长度为至少24个核苷酸或8个氨基酸，一般长度为至少48个核苷酸或16个氨基酸。由于两个多核苷酸序列或氨基酸序列可以各自(1)包含两个分子之间是相似的序列(也就是说，完整多核苷酸序列或氨基酸序列的一部分)，(2)还包含两个多核苦酸序列或者两个氨基酸序列之间是不同的序列，两个(或两个以上)分子间的序列比较通常是通过"比较窗"，对两个分子的序列进行比较，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。本文所用"比较窗"是指至少18个连续核苷酸位置或6个氨基酸的概念区段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以与至少18个连续核苷酸或6个氨基酸序列的参比序列相比较，其中当与参比序列(不包含添加或缺失)进行两个序列最佳比对的比较时，比较窗中部分多核苷酸序列可包含20%以下的添加、缺失、取代等(即空位)。用于比对比较窗序列的最佳比对可以用以下方法进行Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))、Pearson和Lipman的相似性才全索方法(Proc.Natl.Acad(T/.S.A」85:2444(1988))、通过计算机化执行这些算法(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.),Geneworks，或者MacVector软件包)或者通过检查(inspection),然后选择出通过不同方法所产生的最佳比对(也就是说，产生与比较窗同源性最高的百分数)。术语"序列同一性"是指在比较窗内的两个多核苷酸序列或者两个氨基酸序列是相同的(也就是说，在核苷酸接核苷酸或者残基接残基的基础上)。术语"序列同一性百分数"按以下方法计算得出在比较窗内比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列上出现的相同核酸石成基(例如A、T、C、G、U或I)或残基的位置数，得出配对位置数，将配对位置数除以比较窗中总的位置数(即窗体大小)，结果再乘以100就得出序列同一性百分数。本文所用术语"基本相同"是指多核苦酸序列或氨基酸序列的特征，其中与比较窗内为至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置、通常窗体内为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的参比序列相比，多核苷酸或氨基酸包含具有至少85%序列同一性、优选至少90-95%序列同一性、更通常至少96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，其中使参比序列与可以包括缺失或添力口(共计占比较窗内参比序列的20%以下)的序列相比较，计算出序列同一性百分数。参比序列可为较大序列的一小部分。本文所用的20种常用氨基酸及其缩写词按常规用法。参见/m薩wo/ogy國jS声/3eWs(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren主编,SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991》，所述文献的内容通过引用结合到本文中。本文所用术语"氨基酸"或"氨基酸残基"是指天然存在的L-氨基酸或D-氨基酸。本文采用常用的氨基酸单字母缩写词和三字母缩写词(BruceAlberts等，MolecularBiologyofthecell，GarlandPublishing,Inc.,NewYork(第四版,2002》。20种常用氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如a,a-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它不常用的氨基酸也可以是本发明合适的多肽组分。不常用的氨基酸的实例包括4-羟脯氨酸、y-羧基谷氨酸、s-N,N,N-三曱基赖氨酸，s-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-曱酰曱硫氨酸、3-曱基组氨酸、5-鞋赖氨酸、(7-N-曱基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号与标准用法和惯例一致，左手方向为N端方向，右手方向为C端方向。同样地，除非另有说明，否则单链多核苷酸序列的左手端为5'端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。5'至3，添加新生RNA转录物的方向称为转录方向。与RNA序列相同并且位于RNA转录物5'端的5，的DNA链上的序列区称为"上游序列"。与RNA序列相同并且位于RNA转录物3'端的3，的DNA链上的序列区称为"下游序列"。当应用于多肽时，术语"基本相同"是指当进行最佳比对时，例如当使用程序GAP或BESTFIT并且使用缺省空位加权(defaultgapweight)时，两个肽序列共享至少80%序列同一性，优选至少卯％序列同一性，更优选至少95%、96%、97%或98%序列同一性，最优选至少99%序列同一性。优选不相同的残基位置的差别是保守氨基酸取代。正如本文所讨论的一样，本发明包括抗体或免疫球蛋白分子中氨基酸序列的孩么小变化，前提条件是氨基酸序列的变化保持至少75%、更优选至少80%、90%、95%和更优选99%不变。保守氨基酸取代是发生在与其侧链有关的氨基酸家族内的取代。基因编码的氨基酸一般分成以下家族(l)酸性氨基酸-天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性氨基酸=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族为丝氨酸和苏氨酸，为脂族羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺，为含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，为脂族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，为芳族家族；半胱氨酸和曱硫氨酸，为含硫侧链家族。例如，分别用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸、用丝氨酸置换苏氨酸或者用结构上相关的氨基酸置换类似氨基酸，将不会对所得分子的结合或性质产生重大影响，特别是如果置换并不涉及构架位点(frameworksite)内的氨基酸，这种预期也不为过。优选的保守氨基酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、半胱氨酸-甲硫氨酸和天冬酰胺-谷氨醜胺。优选的氨基酸取代是以下这类取代(l)减少对蛋白酶解的敏感性，(2)减小对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合体的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，(》赋予这些类似物其它的物理化学性质或功能性质或者改进它们的其它物理化学性质或功能性质。类似物可包括除天然存在的肽序列以外的序列的不同突变蛋白。例如，单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列(优选结构域外的多肽部分)中进行以形成分子间接触。保守氨基酸取代不应实质性地改变亲本序列的结构特性(例如置换氨基酸不应使亲本序列中产生的螺旋断裂或者破坏表征亲本序列特征的其它类型的二级结构)。本领域/>知的多肽二级结构和三级结构的实例记载于/V6^e/"s,5Vrw"wresA/o/ecw/ar尸n力cz》/es(Creighton主纟扁,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));/"&O(iMC"o"to/>o&/"5Yractore(C.Branden和J,Tooze,主编,GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991》；以及Thornton等，Nature354:105(1991)，这些文献的内容都通过引用结合到本文中。本文所用术语"类似物"是指由至少25个氨基酸的区段组成的多肽，该多肽与天然存在的多肽的部分氨基酸序列基本相同，且具有至少一种天然存在的多肽活性。相对于天然存在的序列，多肽类似物通常包含保守氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常长为至少20个氨基酸，优选长为至少50个氨基酸或更长，一般可以与全长天然存在的多肽一样长。肽类似物通常用于制药工业，作为具有类似于模板肽性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为"肽模拟物"。Fauchere,丄MZ>wgb.15:29(1986);Veber和Freidinger『愿第392页(1985);Evans等，丄MedC7zew.30:1229(l987)，这些文献的内容都通过引用结合到本文中。常常借助计算机化分子建模来研发这类化合物。结构上类似于治疗上有益的肽的肽模拟物可用于产生等同的治疗或预防效果。一般地讲，肽模拟物结构上类似于范例多肽(即具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，例如人抗体，但却具有一种或多种通过本领域众所周知的方法、任选用选自以下键置换的肽键—CH2NH—、—CH2S—、—CH2-CH2—、—CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2—、—CH(OH)CH广和—CH2SO—。相同类型的D-氨基酸可以用来进行共有序列的一个或多个氨基酸的系统取代(例如D-赖氨酸置换L-赖氨酸)，以产生更为稳定的肽。另外，可以通过本领域已知方法产生约束肽，该肽包含共有序列或基本相同的共有序列变异((Rizo和GieraschJ朋.Wev.61:387(1992),该文献的内容通过引用结合到本文中)；例如，通过内部加入半胱氨酸残基，该残基能够形成使肽环化的分子内二硫键。优选的片段或类似物的N端和C端出现在接近功能域的边界。可以将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共序列数据库和私有序列数据库相比较，来鉴定结构域和功能域。优选计算机化比较法用于鉴定序列模体或者预测已知结构和/或功能的其它蛋白质存在的蛋白质构象域。测定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法已为人们所了解(参见Bowie等，S"騰253:164(1991))。按照本发明，本领域技术人员可以识别可用于确定结构域和功能域的序列模体和结构构象。术语"特异性结合剂"是指与靶特异性结合的天然分子或非天然分子。特异性结合剂的实例包括但不限于蛋白质、肽、核酸、糖、脂质和小分子化合物。在某些实施方案中，特异性结合剂为抗体。在某些实施方案中，特异性结合剂为抗原结合区。术语"突变型EGFr多肽特异性结合剂"是指与突变型EGFr多肽任何部分特异性结合的特异性结合剂。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽特异性结合剂为抗突变型EGFr多肽抗体。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽特异性结合剂为抗原结合区。术语"突变型PI3K多肽特异性结合剂"是指与突变型PI3K多肽任何部分特异性结合的特异性结合剂。在某些实施方案中，突变型PI3K多肽特异性结合剂为抗突变型PI3K多肽抗体。在某些实施方案中，突变型PI3K多肽特异性结合剂为抗原结合区。术语"突变型B-Raf多肽特异性结合剂"是指与突变型B-Raf多肽任何部分特异性结合的特异性结合剂。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽特异性结合剂为抗突变型B-Raf多肽抗体。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽特异性结合剂为抗原结合区。术语"特异性结合"是指特异性结合剂与靶结合的能力要比其与非靶结合的亲和性大些。在某些实施方案中，特异性结合是指与耙结合的亲和性比与非靶结合的亲和性大至少10、50、100、250、500或1000倍。在某些实施方案中，亲和性通过亲和ELISA实验测定。在某些实施方案中，亲和性通过BIAcore实验测定。在某些实施方案中，亲和性通过动力学方法测定。在某些实施方案中，亲和性通过平衡/溶液法测定。在某些实施方案中，当抗体与一种或多种抗体识别表位间的解离常数《l)LiM、优选S100nM、最优选S10nM时，就认为抗体能特异性结合抗原。"天然抗体和免疫球蛋白"通常为异四聚体糖蛋白，约150，000道尔顿，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，不同免疫球蛋白同种型重链间二硫键的数目变化不定。每条重链和轻链还具有间隔规则的链内二硫键。每条重链一端具有可变区(VH),随后为许多恒定区。每条轻链一端具有可变区(VL),另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链笫一个恒定区相对，轻链可变区与重链可变区相对。一般认为特定的氨基酸残基在轻链可变区和重链可变区之间形成界面(Chothia等，J.舰廳.186:651(1985;Novotny和Haber,Proc.扁.爿co^.n82:4592(1985);Chothia等，胸麼342:877-883(1989》。术语"抗体"是指完整抗体及其抗原结合片段，在特异性结合方面，抗体片段与完整抗体竟争。"其抗原结合片段"是指完整抗体分子的部分或片段，其中抗体片段保留抗原结合功能。结合片段通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶切或化学裂解产生(例如用木瓜蛋白酶切割)。结合片段包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、单链抗体("scFv")、Fd，和Fd片段。从单克隆抗体中产生不同片段的方法为本领域技术人员所熟知(参见例如Pluckthun,1992，Immunol.Rev.130:151-188)。除"双特异性"或"双功能"抗体外，一般认为抗体的每个结合部位都是相同的。当过量抗体减小受体结合在反受体上的量为至少约20%、40%、60%或80%,更通常大于约85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%(按体外竟争性结合实验测定)时，抗体基本上抑制受体附着在反受体上。"分离的"抗体是已经鉴定和分离出来和/或从其天然环境的组分中回收的抗体。其天然环境的污染组分是可能干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，(l)按Lowry法测定，使用转杯式测序仪进行末端氨基酸或内部氨基酸测序，使抗体纯化至抗体重量>95%,(2)在还原或非还原条件下，用考马斯蓝或者优选银染色，用SDS-PAGE使抗体纯化成同质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。但是通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。术语"可变(的)"是指抗体序列中某些可变区部分差别很大，用在各个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，整个抗体可变区内可变性不是均匀分布的。它集中在3个区段，该区段在轻链可变区和重链可变区中皆称为互补决定区(CDR)或超变区。可变区中更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含4个FR区，主要采用(3-折叠构型，通过3个CDR连接，这形成环连接，在某些情况下，形成部分卩-折叠结构。各条链的CDR通过FR区与另一条链的CDR紧密结合在一起，有助于形成抗体的抗原结合部位(参见Kabat等(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原结合，但却具有不同的效应子功能，例如在依赖抗体的细胞毒性中抗体的参与。"Fv"是含有完全抗原识别部位和结合部位的最小抗体片段。在2条链的Fv类型中，该区由一条重链可变区和一条轻链可变区紧密、非共价締合的二聚体组成。在单链Fv类型中，一条重链可变区和一条轻链可变区可以通过柔性肽接头共价连接，因此轻链和重链可以締合成类似于2条链Fv类型的"二聚"结构。正是这种构型使得各可变区的3个CDR相互作用，限定了VH-VL二聚体表面的抗原结合部位。总起来说，6个CDR将抗原结合特异性赋予了抗体。然而，即使单个可变区(或Fv的一半，包含仅3个抗原特异性的CDR)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和性比完整结合部位的低。本文当使用术语"超变区"时，是指负责与抗原结合的抗体上的氨基酸残基。超变区一般包含轻链可变区上"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如残基24-34(Ll)、50-62(L2)和89-97(L3),以及重链可变区的31-55(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，SequenceofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)),和/或轻链可变区"超变环"的残基(例如残基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区的26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和LeskJ.舰胸/196:901-917(1987》。"构架区"或"FR"残基是如本文的超变区残基以外的其它可变区残基。本文当使用术语"互补决定区"或"CDR，，时，是指与特异性配体接触并决定其特异性的免疫受体部分。免疫受体的CDR是受体蛋白可变性最大的部分，赋予受体多样性，位于受体可变区远端的6个环上，3个环分别来自两个受体可变区。"依赖抗体的细胞毒性"和"ADCC"是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别粑细胞上的结合抗体，继而引起耙细胞裂解。介导ADCC、NK细胞的初级细胞仅表达FcrRIII，而单核细胞则表达FcyRI、FcyRI1和FcyRIII。Ravetch和Kinet在^朋仏尺ev./www"o/9:457-92(1991),第464页表3中概括了Fc在造血细胞中的表达。为了评价目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC实验，例如参见美国专利第5,500,362号或第5,821,337号。对这些实验有益的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者另外可体内评价目标分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例如参见Clynes等，iWAS1(^7&i)95:652-656(1988)。术语"表位"包括任何能够与免疫球蛋白和/或T-细胞受体特异性结合的蛋白质决定子。表位决定子通常由分子的化学活性表面集合(surfacegro叩ing)组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特殊的三维结构特征，以及特殊的电荷特征。术语"结合剂"本文所用是指化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。本文所用术语"标记"或"标记的"是指掺入可检测标记，例如通过掺入放射性标记的氨基酸或连接到生物素(biotinyl)部分的多肽上，该部分可以通过标记的抗生物素蛋白进行4企测(例如可以通过光学法或比色法，检测含有荧光标记的链霉抗生物素蛋白或酶活性)。在某些情况下，标记也可为治疗剂。标记多肽和糖蛋白的不同的方法为本领域所知，并且可以加以采用。多肽标记的实例包括但不限于放射性同位素或放射性核素(例如311、14C、15N、35S、90Y、"Tc、mIn、125I、mI)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系元素荧光粉(lanthanidephosphors))、酶标记(例如辣根过氧化物酶、(5-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团以及通过次级报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链配对序列(zipperpairsequence)、第二抗体的结合位点、金属结合域、附加表位)。在某些实施方案中，标记通过不同长度的间隔臂连接，以减小潜在的位阻。本文所用术语"药剂或药物"是指当适当给予患者时，能够诱导指所需治疗效果的化合物或组合物。本文其它化学术语按照本领域常规用法使用，参见r/zeA/cGraw-州〃Z)/c"o聰o;0/C/2e腦ca/7^ww(Parker,S.主编，McGraw-Hill,SanFrancisco(1985)),该文献的内容通过引用结合到本文中)。本文所用术语"抗肿瘤药"是指具有抑制人体赘生物、尤其是恶性(癌性)病变(例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病)发生或发展的功能性质的药物。抑制转移通常为抗肿瘤药的性质。本文所用"基本纯的"是指存在的主要物质种类(即在组合物中，以摩尔浓度计，它比任何其它各种类的含量都更丰富)，优选基本纯的部分是其中该物质种类占存在的所有大分子种类的至少约50%(以摩尔浓度计)的组合物。一般地讲，基本纯的组合物占组合物中存在的所有大分子的约80%以上，更优选大于约85%、卯％、95%、96%，97%,98%或99%。更优选该物质种类经纯化成为基本同质的(通过常规检测方法不能检测出组合物中的污染物质)，其中组合物主要由单一种类的大分子组成。术语患者包括人和动物受治疗者。用于治疗目的术语"哺乳动物"和"动物"是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、驯养动物和农场动物以及动物园动物、竟技动物或宠物，例如狗、马、猫、牛等。优选哺乳动物为人。术语"疾病状态"是指细胞或整个哺乳动物的生理学状态，其中发生细胞功能或身体功能、系统或器官中断、停止或失调。术语"治疗"是指治疗性治疗和预防性措施，其中，目标是预防或减緩(减轻)不需要的生理学变化或病症，例如癌症的发生或扩散。对于本发明的目的，有益的或所需要的临床结果包括但不限于緩解症状、缩小疾病范围、稳定疾病状态(即不使之恶化)、延迟或减緩疾病进程、改善或减轻疾病状态和消除(不论部分还是全部)，不论是否可检测出。"治疗"还可指与如果不接受治疗的预期存活相比，可延长存活期。需要治疗的患者包括已经患上疾病或病症以及易患疾病或病症的患者，或者疾病或病症受到抑制的患者。"疾病"是任何可能受益于一种或多种治疗的病症。它包括慢性和急性病症或障碍，包括使哺乳动物易患所述疾病的病理条件。本文待治疗疾病的非限制性实例包括良性胂瘤和恶性肺瘤、白血病和淋巴恶性肺瘤，特别是乳腺癌、直肠癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。本发明优选的待治疗的疾病为恶性肿瘤，例如宫颈癌、宫颈上皮内鳞状细胞癌、宫颈上皮内腺瘤样病变、肾细胞癌(RCC)、食管肿瘤和癌衍生细胞系。"与突变型EGFr多肽相关的疾病或病症"包括一种或多种以下的疾病或病症由突变型EGFr多肽引起的疾病或病症；归咎于突变型EGFr多肽的疾病或病症；引起突变型EGFr多肽的疾病或病症；以及与突变型EGFr多肽的存在相关的疾病或病症。在某些实施方案中，与突变型EGFr多肽相关的疾病或病症可存在于突变型EGFr多肽不存在时。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽的存在可加剧与突变型EGFr多肽相关的疾病或病症。在某些实施方案中，与突变型EGFr多肽相关的疾病或病症为癌症。示例性的癌症包括^f旦不限于非小细胞性肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部癌、卵巢癌和前列腺癌。"与突变型PI3K多肽相关的疾病或病症"包括一种或多种以下的疾病或病症由突变型PI3K多肽引起的疾病或病症；归咎于突变型PI3K多肽的疾病或病症；引起突变型PI3K多肽的疾病或病症；以及与突变型PI3K多肽的存在相关的疾病或病症。在某些实施方案中，与突变型PI3K多肽相关的疾病或病症可存在于该突变不存在时。在某些实施方案中，突变型PI3K多肽的存在可加剧与突变型PI3K多肽相关的疾病或病症。在某些实施方案中，与突变型PI3K多肽相关的疾病或病症为癌症。示例性的癌症包括「{旦不限于非小细胞性肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部癌、卵巢癌和前列腺癌。"与突变型B-Raf多肽相关的疾病或病症"包括一种或多种以下疾病或病症由突变型B-Raf多肽引起的疾病或病症；归咎于突变型B-Raf多肽的疾病或病症；引起突变型B-Raf多肽的疾病或病症；与突变型B-Raf多肽的存在相关的疾病或病症。在某些实施方时。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽的存在可加剧与突变型B-Raf多肽相关的疾病或病症。在某些实施方案中，与突变型B-Raf多肽相关的疾病或病症为癌症。示例性的癌症包括但不限于非小细胞性肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部癌、卵巢癌和前列腺癌。在"联合疗法"中，将靶抗原的特异性结合剂与化学疗法或抗胂瘤药物疗法和/或放射疗法联用，对患者进行治疗。按以下方案治疗癌症在标准一线疗法和二线疗法中，将特异性结合剂加到突变型EGFr多肽中，将特异性结合剂加到突变型PI3K多肽中和/或将特异性结合剂加到突变型B-Raf多肽中。方案设计将强调有效性(用减小肿瘤的质量来评价)以及降低标准化疗常用剂量的能力。剂量减少由于减小了化疗剂的剂量相关性毒性，所以允许额外和/或长期的治疗。"单一疗法"是指给予患者免疫治疗来治疗疾病而无需兼用化疗剂或抗肿瘤药。某些实施方案多肽、片段和融合蛋白在某些实施方案中，缺失变体为全长突变型EGFr多肽的片段。在某些实施方案中，该片段与突变型EGFr多肽的表位一致。在某些实施方案中，该片段是天然存在的(例如由体内蛋白酶活性所致)。在某些实施方案中，该片段是通过化学合成的。在某些实施方案中，该片段可与多肽连接形成突变型EGFr融合蛋白。在某些实施方案中，该片段长为至少5、6、8或10个氨基酸。在某些实施方案中，该片段长为至少14个、至少20个、至少50个或至少70个氨基酸。在某些实施方案中，提供缺失变体，该缺失变体为全长突变型PI3K多肽的片段。在某些实施方案中，该片段与突变型PI3K多肽的表位一致。在某些实施方案中，该片段是天然存在的(例如由体内蛋白酶活性所致)。在某些实施方案中，该片段是通过化学合成的。在某些实施方案中，该片段可与多肽连接形成突变型PI3K融合蛋白。在某些实施方案中，该片段长为至少5、6、8或10个氨基酸。在某些实施方案中，该片段长为至少14个、至少20个、至少50个或至少70个氨基酸。在某些实施方案中，提供缺失变体，该缺失变体为全长突变型B-Raf多肽的片段。在某些实施方案中，该片段与突变型B-Raf多肽的表位一致。在某些实施方案中，该片段是天然存在的(例如由体内蛋白酶活性所致)。在某些实施方案中，该片段是通过化学合成的。在某些实施方案中，该片段可与多肽连接形成突变型B-Raf融合蛋白。在某些实施方案中，该片段长为至少5、6、8或10个氨基酸。在某些实施方案中，该片段长为至少14个、至少20个、至少50个或至少70个氨基酸。在某些实施方案中，突变型多肽可与至少一种非蛋白连接。该类型包括但不限于N-连接或O-连接的糖链、水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)及其衍生物(参见例如美国专利第4,179,337号)。该术语含义内的其它化学修饰包括但不限于乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇和有关分子。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽可以在分子内的随机位置或分子内的预定位置进行修饰，并可包括1、2、3个或多个连接的化学部分。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽还可在多肽内的预定位置进行修饰，例如在N端或在多肽内经选择的赖氨酸或精氨酸残基上。其它化学修饰包括但不限于可检测标记，例如允许检测和分离突变型EGFr多肽的酶标记、荧光标记、同位素标记或亲和标记。在某些实施方案中，突变型PI3K多肽可以在分子内的随机位置或分子内的预定位置进行修饰，并可包括1、2、3个或多个连接的化学部分。在某些实施方案中，突变型PI3K多肽还可在多肽内的预定位置进行修饰，例如在N端或在多肽内经选择的赖氨酸或精氨酸残基上。其它化学修饰包括但不限于可检测标记，例如允许检测和分离突变型PI3K多肽的酶标记、荧光标记、同位素标记或亲和标记。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽可以在分子内的随机位置或分子内的预定位置进行修饰，并可包括1、2、3个或多个连接的化学部分。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽还可在多肽内的预定位置进行修饰，例如在N端或在多肽内经选择的赖氨酸或精氨酸残基上。其它化学修饰包括但不限于可检测标记，例如允许检测和分离突变型B-Raf多肽的酶标记、荧光标记、同位素标记或亲和标记。在某些实施方案中，提供突变型EGFr融合蛋白。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽可以与同源多肽融合形成同二聚体，或者可与异源多肽融合形成异二聚体。示例性的异源多肽和异源肽包括但不限于允许检测和/或分离融合蛋白的表位；跨膜受体蛋白或其部分，例如胞外域、跨膜结构域或胞内域；配体或其与跨膜受体蛋白结合的部分；酶或其有催化活性的部分；促进寡聚化的多肽，包括但不限于亮氨酸拉链域；增加融合蛋白稳定性的多肽，包括但不限于免疫球蛋白恒定区；以及具有不同于突变型EGFr多肽治疗活性的多肽。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽或突变型EGFr融合蛋白可以与N端甲硫氨酸连接，可以用于在原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)中表达。在某些实施方案中，提供突变型PI3K融合蛋白。在某些实施方案中，突变型PI3K多肽可以与同源多肽融合形成同二聚体，或者可与异源多肽融合形成异二聚体。示例性的异源多肽和异源肽包括但不限于允许检测和/或分离融合蛋白的表位；跨膜受体蛋白或其部分，例如胞外域、跨膜结构域或胞外域；配体或其与3争膜受体蛋白结合的部分；酶或其有催化活性的部分；促进寡聚化的多肽，包括但不限于亮氨酸拉链域；增加融合蛋白稳定性的多肽，包括但不限于免疫球蛋白恒定区；以及具有不同于突变型PI3K多肽治疗活性的多肽。在某些实施方案中，突变型P13K多肽或突变型P13K融合蛋白可以与N端曱硫氨酸连接，可以用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达。在某些实施方案中，提供突变型B-Raf融合蛋白。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽可与同源多肽融合形成同二聚体，或者可与异源多肽融合形成异二聚体。示例性的异源多肽和异源肽包括但不限于允许检测和/或分离突变型B-Raf融合蛋白的表位；跨膜受体蛋白或其部分，例如胞外域、跨膜结构域或胞外域；配体或其与跨膜受体蛋白结合的部分；酶或其有催化活性的部分；促进寡聚化的多肽，包括但不限于亮氨酸拉链域；增加融合蛋白稳定性的多肽，包括但不限于免疫球蛋白恒定区；以及具有不同于突变型B-Raf多肽治疗活性的多肽。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽或突变型B-Raf融合蛋白可以与N端甲硫氨酸连接，可以用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达。在某些实施方案中，异源多肽或同源多肽与突变型EGFr多肽的N端融合。在某些实施方案中，异源多肽或同源多肽与突变型EGFr多肽的C端融合。在某些实施方案中，一种或多种异源多肽或异源肽或者同源多肽或同源肽与突变型EGFr多肽的N端和C端两端都融合。在某些实施方案中，多肽与突变型EGFr多肽直接融合。在某些实施方案中，多肽通过如本领域已知的接头分子或衔接分子与突变型EGFr多肽融合。在某些这样的实施方案中，使接头分子或衔接分子设计成含有蛋白酶的切割位点以便分离融合多肽。在某些实施方案中，异源多肽或同源多肽与突变型PI3K多肽的N端融合。在某些实施方案中，异源多肽或同源多肽与突变型PI3K多肽的C端融合。在某些实施方案中，一种或多种异源多肽或异源肽或者同源多肽或同源肽与突变型PI3K多肽的N端和C端两端融合。在某些实施方案中，多肽与突变型PI3K多肽直接融合。在某些实施方案中，多肽通过如本领域已知的接头分子或衔接分子与突变型PI3K多肽融合。在某些这样的实施方案中，使接头分子或衔接分子设计成含有蛋白酶的切割位点以便分离融合多肽。在某些实施方案中，异源多肽或同源多肽与突变型B-Raf多肽的N端融合。在某些实施方案中，异源多肽或同源多肽与突变型B-Raf多肽的C端融合。在某些实施方案中，一种或多种异源多肽或同源多肽与突变型B-Raf多肽的N端和C端两端融合。在某些实施方案中，多肽与突变型B-Raf多肽直接融合。在某些实施方案中，多肽通过如本领域已知的接头分子或衔接分子与突变型B-Raf多肽融合。在某些这样的实施方案中，使接头分子或衔接分子设计成含有蛋白酶的切割位点以便分离融合多肽。栽体、宿主细胞、转基因动物和蛋白质产生与纯化在某些实施方案中，提供包含至少一种编码突变型EGFr多肽的多核苷酸的载体。在某些这样的实施方案中，突变型EGFr多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，载体为表达载体。在某些实施方案中，提供包含至少一种编码突变型PI3K多肽的多核苷酸的载体。在某些这样的实施方案中，突变型PI3K多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。在某些实施方案中，突变型PBK多肽包含至少一个选自以下的PI3K突变E542K、E545A和H1047L。在某些实施方案中，载体为表达载体。在某些实施方案中，提供包含至少一种编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸的载体。在某些这样的实施方案中，突变型B-Raf多肽包含选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些实施方案中，突变型B-Raf多肽包含至少一个选自以下的B-Raf突变V600E和K601E。在某些实施方案中，载体为表达载体。在某些实施方案中，表达载体可含有启动子，该启动子可被宿主生物识别并与编码突变型EGFr的核酸分子操作性地连接。在某些实施方案中，可根据用于表达的宿主细胞和所需蛋白质的产量，使用天然启动子或异源启动子。与原核宿主一起使用的示例性启动子包括但不限于P-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶启动子系统；色氨酸(trp)启动子系统；及杂合启动子例如tac启动子。在某些实施方案中，可以使用其它已知的细菌启动子。已知细菌启动子的序列业已发表，因此使得本领域技术人员能够用接头或衔接子，按需要供应任何所需的限制位点，使启动子与所需要的核酸序列连接。与酵母宿主一起使用的合适的启动子也是本领域众所周知的。在某些实施方案中，酵母增强子最好与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适的启动子也广为人知。与哺乳动物宿主细胞一起使用的示例性的启动子包括但不限于得自病毒基因组的启动子，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选猿猴病毒40(SV40)。示例性的哺乳动物启动子包括但不限于异源哺乳动物启动子。示例性的异源哺乳动物启动子包括但不限于热激启动子和肌动蛋白启动子。可以用于表达突变型EGFr多核苷酸的示例性启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Benoist和Chambon(1981),Atowe,290:304-310);CMV启动子；包含在劳斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus)的3，长末端重复序列的启动子(Yamamoto等，(1980),Ce〃,22:787-97);疱渗病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，(1981),Prac.Waf/./leadSc/.78:1444-5);金属硫蛋白(metallothionine)基因的调节序列(Brinster等，(1982),Nature,296:39-42);原核表达载体例如p-内酰胺酶启动子(Villa陽Kamaroff等，(1978),pro.Matl.Acad.Sci.U.S.A.753727-31);以及tac启动子(DeBoer等，(1983),pro.Matl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)在某些实施方案中，在真核宿主细胞增加转录的栽体中可以包括增强子序列。示例性的得自哺乳动物基因的增强子序列包括但不限于球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰岛素。在某些实施方案中，使用得自病毒的增强子。用于真核启动子活化的示例性增强子序列包括但不限于SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。在某些实施方案中，增强子可以在载体5'位或3'位与多肽编码区拼接在一起。在某些实施方案中，增强子位于启动子的5M立。在某些实施方案中，增强子位于多肽编码区末端的3，位上。在某些实施方案中，载体是与至少一种细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的载体。示例性的载体包括但不限于pCRII、pCR3和pcDNA3.1(InvitrogenCompany,SanDiego,CA)、pBSII(StratageneCompany,LaJolla,CA)、pET15(Novagen,Madison,WI)、pGEX(PharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)、pEGFP画N2(Clontech，PaloAlto,CA)、pETL(BlueBacII;Invitrogen)、pDSR-oc(PCT公布号WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco/BRL,GrandIsland,NY)。示例性的载体包括但不限于翻粒、质粒和与所选宿主细胞相容的修饰病毒。在某些实施方案中，载体可包括质粒，包括但不限于Bluescript⑧质粒衍生物(高拷贝数的基于ColEl的噬菌粒，StratageneCloningSystemsInc.,LaJollaCA)，设计用来克隆Taq-扩增PCR产物的PCR克隆用质粒(例如TOPOTACloning⑧试剂盒、PCR2.1⑧质粒衍生物，Invitrogen,Carlsbad,CA),以及哺乳动物载体、酵母载体或病毒载体例如杆状病毒表达系统(pBacPAK质粒衍生物，Clontech,PaloAlto,CA)。在某些实施方案中，可以通过转化、转染、感染、电穿孔或其它已知技术，将重组分子导入宿主细胞内。术语"转染"是指由宿主细胞摄取表达载体，无论任何编码序列事实上是否进行表达。转染的许多方法为本领域普通技术人员所知，包括但不限于CaP04沉淀和电穿孔。在某些实施方案中，当宿主细胞内出现转染载体的运作迹象时，就被认为是成功的转染。在某些实施方案中，宿主细胞可以是原核宿主细胞(例如大肠杆菌)或真核宿主细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞或脊推动物细胞)。在某些实施方案中，原核宿主细胞例如大肠杆菌产生未糖基化的蛋白质；例如未糖基化shBCMA和未糖基化shTACI，它们可以具有优于糖基化真核分子的优势。在某些实施方案中，宿主细胞当培养在合适条件下时，就能表达本发明的多肽，随后可从培养基中收获多肽(如果宿主细胞将多肽分泌到培养基的话)，或者直接从产生多肽的宿主细胞收获(如果宿主细胞不分泌多肽的话)。在某些实施方案中，选择合适的宿主细胞应考虑诸多不同的因素，例如所需要的表达水平、对于活性是需要的或必需的多肽修饰，例如糖基化或磷酸化，和/或易于折叠成生物活性分子。许多合适的宿主细胞为本领域所知，许多可得自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC)),Manassas,VA。示例性的宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC保藏号CCL61)CHODHFR细胞(Urlaub等，(1980)，Prac.扁.爿cW.Sc..,97,4216-20)、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC保藏号CRL1573)和3T3细胞(ATCC保藏号CCL92)。选择合适的哺乳动物宿主细胞以及转化、培养、扩增、篩选和产物产生与纯化的方法都为本领域所知。示例性的宿主细胞包括但不限于猴COS-1(ATCC保藏号CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC保藏号CRL1651)以及CV-1细胞系(ATCC保藏号CCL70)。动物细胞系，包括转化细胞系。示例性的宿主细胞包括但不限于正常的二倍体细胞、得自原代组织体外培养的细胞抹、干细胞系和原代外植体。在某些实施方案中，候选细胞在选择基因上可以是基因型有缺陷的，或者可含有主要起作用的选择基因。示例性的宿主细胞包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞、得自Swiss的3T3系、Balb-c小鼠、NIH小鼠，BHK仓鼠细胞系或HaK仓鼠细胞系，这些都可得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。每个细胞系都为蛋白质表达领域技术人员所知，并且可以获得。在某些实施方案中，宿主细胞可为细菌细胞。示例性的细菌宿主细胞包括但不限于不同的大肠杆菌菌抹(例如HB101、(ATCC保藏号33694)DH5ot、DH10和MC1061(ATCC保藏号53338))。示例性的宿主细胞还包括但不限于假单胞菌(尸wwfifomo"owspp.)的不同菌抹、枯草芽胞杆菌CS.w6"fo)、其它芽胞杆菌(BacillusSpp.)和链霉菌(浙一0/77戸SSpp)。本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株也可用作表达多肽的宿主细胞。某些这类实施方案利用市售的表达系统，例如毕赤酵母(Pichia)表达系统(Invitrogen,SanDiego,CA)，按生产商说明书使用。在某些实施方案中，这类系统依赖pre-pro-alpha序列指导分泌。在某些实施方案中，插入片段的转录在曱醇诱导下由醇氧化酶(AOXl)启动子驱动。在某些实施方案中，宿主细胞可为酿酒酵母(Sacharomycescerivisae)在某些实施方案中，植物细胞系统可用作宿主细胞。在某些这样的实施方案中，使用用病毒表达载体转染的植物细胞系统(例如花椰菜花叶病毒CaMV或烟草花叶病毒)。在某些实施方案中，将编码突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽的多核苷酸克隆到杆状病毒表达载体例如pVL1393(PharMingen，SanDiego,CA)中。在某些实施方案中，可按照生产商的说明书(PharMingen)，在无sF9蛋白培养基中，用该载体感染草地贪夜蛾(S/ocfc^era/n/^perafa)细胞，产生重组多肽。在某些实施方案中，用肝素-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia),从这些培养基中纯化和浓缩突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽。39]在某些实施方案中，昆虫细胞系统可用作宿主细胞。某些这样的系统记载于例如Kitts等，(1993),历自/m々腊,14:810-7,Lucklow(1993),Curr.Opin.Biotechnol.,4:564-72,以及Lucklow等，(1993),J.Virol.,67:4566-79。示例性的昆虫细胞包括但不限于Sf-9和Hi5(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在某些实施方案中，可以通过众所周知的方法实现将编码突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽的多核苷酸转化或转染到经选择的宿主细胞中，该方法包括例如氯化钙、电穿孔、显微注射、脂转染或DEAE-葡聚糖等方法。在某些实施方案中，所选方法将部分地随所使用的宿主细胞类型而变化。这Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989》。包含编码突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽的表达载体的宿主细胞(如通过转化或转染)，可以用本领域技术人员熟知的标准培养基培养。在某些实施方案中，培养基可含有细胞生长和存活必需的所有养分。在某些实施方案中，大肠杆菌细胞可以在LuriaBroth(LB)和/或TerrificBroth(TB)中培养。培养真核细胞示例性的培养基包括但不限于RPMI1640、MEM、DMEM,所有这些培养基都根据所培养的特定细胞系补充血清和/或生长因子。在某些实施方案中，昆虫细胞可以培养在补充了yeastolate、水解乳白蛋白和/或胎牛血清的Grace培养基中。在某些实施方案中，将用于转染或转化细胞选择性生长的抗生素或其它化合物作为补充剂加入到培养基中。在某些实施选择将使用的化合物。在某些实施方案中，如果可选择标记元件有卡那毒素抗性，则加入到培养基中的化合物应为卡那毒素。用于选择性生长的示例性化合物包括但不限于氨节青毒素、四环素和新霉素。在某些实施方案中，宿主细胞产生的突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽的量可以用本领域已知标准方法评价。示例性的方法包括但不限于蛋白质印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝月交电泳、HPLC分离、免疫沉淀和活性实验。在某些实施方案中，在原核宿主细胞中表达的突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽，可以可溶形式存在于周质间隙或胞质中，或者以可溶形式作为胞内包含体的部分。在某些实施方案中，可以采用本领域技术人员已知的任何标准技术，从宿主细胞中提取突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，可以通过弗氏压碎器、匀浆和/或超声处理，随后离心，使宿主细胞裂解以释放周质/胞质的内容物。在某些实施方案中，可用本领域已知方法，进一步纯化存在于胞质中或从周质间隙释放的可溶形式的突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽通过渗压震扰技术从细菌周质间隙释放出来。如果突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽形成了包含体，它们常常可与内细胞膜和/或外细胞膜结合，因此主要存在于离心后的沉淀物中。在某些实施方案中，沉淀物因此可用极端pH处理，或者在还原剂(reducingpartner)(例如石咸性pH下的二硫苏糖醇或酸性pH下的三(羧乙基)膦(triscarboxyethylphosphine)存在时，用离'液剂(chaotropicpartner)例如去污剂、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物处理，以释放、分开包含体并〗吏包含体增溶。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽然后可用凝胶电泳、免疫沉淀等方法进行分析。在某些实施方案中，可用标准方法例如本文以下方法及Marston等，(1990)，Me仇五虹，182:264-75中所述方法，分离出突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽分离时可能没有生物活性。在某些实施方案中，可以用"重折叠"或转变多肽为其三级结构和形成二硫键的方法，来恢复生物活性。在某些实施方案中，在特定浓度的离液剂存在下，将增溶多肽暴露在通常为7以上的pH中，即可恢复生物活性。离液剂的选择与用于包含体增溶的选择非常相似，但是，在某些实施方案中，使用较低浓度的离液剂，不必与用于增溶的离液剂相同。在某些实施方案中，重折叠/氧化溶液还含有还原剂，或者还原剂按特定比例加上其氧化形式以产生特定的允许二硫键改组的氧化还原电位，形成蛋白质半胱氨酸桥。示例性的氧还偶包括但不限于半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫代双谷胱甘肽、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷二硫苏糖醇和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。在某些实施方案中，可以用助溶剂或需要助溶剂以增加重折叠的效率，用于该目的的示例性助溶剂(repartner)包括但不限于甘油、不同分子量的聚乙二醇、精氨酸和有关分子。在某些实施方案中，可通过化学合成方法制备突变型EGFr多肽、突变型PBK多肽和/或突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，化学合成方法可合并固相肽合成。在某些实施方案中，化学合成方可以采用本领域已知技术，例如记载于Merrifield等，(1963)，丄v4w.CAem.85:2149;Houghten等，(1985),ProcNatlAcad.Sci.USA82:5132;以及Stewart和Young(1984),SolidPhasePeptideSynthesis,PierceChemicalCo.,Rockford,IL。在某些实施方案中，在所合成的多肽在N端含有或不含甲硫氨酸。在某些实施方案中，可用参考文献所述形成二硫键的方法，使化学合成的突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽发生氧化。在某些实施方案中，如此制备的突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽将保持至少一种与天然或重组产生的突变型EGFr多肽、突变型PBK多肽和/或突变型B-Raf多肽相关的生物活性。在某些实施方案中，可以使用转基因动物表达突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，可以使用转基因产奶动物(例如母牛或山羊)，在动物乳汁中获得糖基化突变型EGFr多肽、糖基化突变型PI3K多肽和/或糖基化突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，利用植物产生如本领域所知的糖基化突变型EGFr多肽、糖基化突变型PI3K多肽和/或糖基化突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，使突变型EGFr多肽基本纯化。在某些实施方案中，使突变型PI3K多肽基本纯化。在某些实施方案中，使突变型B-Raf多肽基本纯化。某些蛋白质纯化技术为本领域技术人员所知。在某些实施方案中，蛋白质纯化涉及从非多肽部分中粗放分级分离的多肽级分。在某些实施方案中，多肽用层析技术和/或电泳技术纯化。示例性的纯化方法包括但不限于用石克酸4务沉淀；用PEG沉淀；免疫沉淀；热变性后离心；层析，包括但不限于亲和层析(例如蛋白质-A-琼脂糖凝胶)、离子交换层析、排阻层析和反相层析；凝胶过滤；轻基磷灰石层析；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。在某些实施方案中，多肽通过快速蛋白质液相层析或通过高压液相层析(HPLC)进行纯化。在某些实施方案中，可以改变纯化步骤或者可以省略某些步骤，仍然得到用于制备基本纯的多肽的合适方法。在某些实施方案中，突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽可以在C端或N端任一端用一种或多种亲和标记物制备，并可通过一步亲和柱纯化，亲和标记物例如六聚组氨酸(hexahistidine)或其它小型肽例如FLAG(EastmanKodakCo.，NewHaven,CT)或myc(Invitrogen)。在某些实施方案中，多聚组氨酸以高亲和力与镍结合，且特异性强，因此镍亲和柱(例如Qiagen镍柱)可用来纯化多聚组氨酸标记的特异性结合部分。参见例如Ausubel等主编，(1993),CurrentProtocolsinMolecularBiology,笫10.11.8节，JohnWiley&Sons,NewYork。在某些实施方案中，可用不止一个纯化步骤。在某些实施方案中，可定量测定多肽制备物的纯化程度。某些纯化程度的定量方法为本领域技术人员所知。某些示例性的方法包括但不限于确定制备物的特异性结合活性，通过SDS/PAGE分析，评价制备物内多肽的含量。某些用于评价纯化的多肽制备物含量的示例性方法包含计算制备物的结合活性，将其与最初提取物的结合活性进行比较。在某些实施方案中，该计算结果用"纯化倍数(foldpurification)"表示。用来表示结合活性的量的单位取决于所进行的具体实验。在某些实施方案中，对多肽进行部分纯化。在某些实施方案中，用较少的纯化步骤或利用相同的总纯化流程的不同形式，实现部分纯化。例如，在某些实施方案中，利用HPLC仪器所进行的阳离子交换柱层析比利用低压层析系统的同一技术，一般产生较大的"纯化倍数"。在某些实施方案中，导致较低纯化程度的方法在多肽总的回收方面，或者在维持多肽结合活性方面可能都具有优势。某些情况下，多肽的电泳迁移可随SDS/PAGE的不同条件而变化，有时十分明显。参见例如Capaldi等，历oc/zem说op/2"lR^Comm,76:4"(l977)。应该理解的是，在不同的电泳条件下，纯化多肽或部分纯化多肽的表观分子量可能不同。转基因动物55]在某些实施方案中，提供包含一种或多种编码一种或多种多肽的多核苷酸的转基因非人类动物，该多肽为突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，非人转基因动物包括但不限于啮齿动物例如小鼠或大鼠、兔、山羊、绵羊和其它农场动物。某些转基因动物可以用众所周知的方法制备，该方法包括但不限于记载于美国专利第5，489,743号和WO94/28122中的方法。在某些实施方案中，显示组织特异性的动物转录控制区可以用来构建转基因动物。用于转基因动物组织特异性表达的示例性转录控制区包括但不限于在胰腺腺泡细胞内具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，(1984),Cell38:639-46;Ornitz等，(1986),ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald(1987),Hepatology,7:425-515);在胰腺P细胞内具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan(1985)，Nature,，315:115-122);在淋巴细胞内具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，(1984),Cell，38:647-58;Adames等，(1985),Nature,,318:533-8;Alexander等，(1987),Mol.Cell.Biol,7:1436-44);在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴细胞和肥大细胞内具有活性的小鼠乳癌病毒控制区(Leder等，(1986),Cell，45:485-95);在肝内具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，(1987)，GenesandDevel,1:268-76);在肝内具有活性的曱胎蛋白基因控制区(Kmmlauf等，(1987),Mol.Cell.Biol,5:1639-48;Hammer等，(1987),Sccience，235:53-58);在肝内具有活性的al-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，(1987)，GenesandDevel,1:161-171);在髓样细胞内具有活性的(3-球蛋白基因控制区(Mogram等，(1985),Nature,315:338-340;Kollias等，(1986)，Cell，46:89-94);在脑内少突胶质细胞内具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，(1987),Cell，48:703-712);在骨骼肌内具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani(1985),Nature,314:(Mason等，(1986),Science,234:1372-8)。在某些实施方案中，提供一种非人类动物，其中编码野生型EGFr多肽的多核苷酸遭破坏(即"敲除")并被一种或多种编码突变型EGFr多肽的多核苷酸置换，因此使得动物体内野生型EGFr多肽的表达水平明显降低或遭完全破坏，并且使得突变型EGFr多肽在动物体内进行表达。在某些这样的实施方案中，可以采用例如记栽于美国专利第5,557,032号的技术和方法或者其它本领域众所周知的技术，来产生该动物。在某些实施方案中，提供一种非人类动物，其中用于一种或多种突变型EGFr多肽的启动子活性受到调节(例如通过用本领域已知的同源重组方法)，以改变一种或多种突变型EGFr多肽的表达水平。在某些这样的实施方案中，突变型EGFr多肽的表达水平提高。在某些这样的实施方案中，突变型EGFr多肽的表达水平降低。在某些实施方案中，提供一种非人类动物，其中编码野生型PI3K多肽的多核苷酸遭破坏(即"敲除")并被一种或多种编码突变型PI3K多肽的多核苷酸置换，因此使得动物体内野生型PI3K多肽的表达水平明显降低或遭完全破坏，并且使得突变型PI3K多肽在动物体内进行表达。在某些这样的实施方案中，可以采用例如记载于美国专利第5,557,032号的技术和方法或者其它本领域众所周知的技术，来产生该动物。在某些实施方案中，提供一种非人类动物，其中用于一种或多种突变型PI3K多肽的启动子活性受到调节(例如通过用本领域已知的同源重组方法)，以改变一种或多种突变型PI3K多肽的表达水平。在某些这样的实施方案中，突变型PI3K多肽的表达水平提高。在某些这样的实施方案中，突变型PI3K多肽的表达水平降低。在某些实施方案中，提供一种非人类动物，其中编码野生型B-Raf多肽的多核苷酸多肽遭破坏(即"敲除")并被一种或多种编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸置换，因此使得动物体内野生型B-Raf多肽的表达水平明显降低或遭完全破坏，并且使突变型B-Raf多肽在动物体内进行表达。在某些这样的实施方案中，可以用例如记载于美国专利第5,557,032号的技术和方法或其它本领域众所周知的技术，来产生该动物。在某些实施方案中，提供一种非人类动物，其中用于一种或多种突变型B-Raf多肽的启动子活性受到调节(例如通过用本领域已知的同源重组方法)，以改变一种或多种突变型B-Raf多肽的表达水平。在某些这样的实施方案中，突变型B-Raf多肽的表达水平提高。在某些这样的实施方案中，突变型B-Raf多肽的表达水平降低。在某些实施方案中，非人转基因动物可以用于候选药物筛选。在某些实施方案中，测定了候选药物对非人转基因动物的影响。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型EGFr多肽表达的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型EGFr多肽表达的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型EGFr多肽活性的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型EGFr多肽活性的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型EGFr多肽活化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型EGFr多肽活化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型EGFr多肽自身磷酸化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型EGFr多肽自身磷酸化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制与一种或多种突变型EGFr多肽特异性结合剂结合的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加与一种或多种突变型EGFr多肽特异性结合剂结合的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物改善突变型EGFr多肽相关疾病或病症的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物改善突变型EGFr多肽相关癌症的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型PI3K多肽表达的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型PI3K多肽表达的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型PI3K多肽活性的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型PI3K多肽活性的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型PI3K多肽活化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型PI3K多肽活化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型PDK多狀自身石舞酸化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型PI3K多肽自身磷酸化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制与一种或多种突变型PI3K多肽特异性结合剂结合的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加与一种或多种突变型PI3K多肽特异性结合剂结合的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物改善突变型PI3K多肽相关疾病或病症的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物改善突变型PI3K多肽相关癌症的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型B-Raf多肽表达的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型B-Raf多肽表达的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型B-Raf多肽活性的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型B-Raf多肽活性的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型B-Raf多肽活化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型B-Raf多肽活化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制突变型B-Raf多肽自身磷酸化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加突变型B-Raf多肽自身磷酸化的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物减少或抑制与一种或多种突变型B-Raf多肽特异性结合剂结合的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物增加与一种或多种突变型B-Raf多肽特异性结合剂结合的能力。在某些这样的实施方案中，测定了候选药物改善突变型B-Raf多肽相关疾病或病症的能力。在某些实施方案中，测定了候选药物改善突变型B-Raf多肽相关癌症的能力。特异性结合剂和抗体在某些实施方案中，提供突变型EGFr多肽的特异性结合剂。在某些实施方案中，提供突变型PI3K多肽的特异性结合剂。在某些实施方案中，提供突变型B-Raf多肽的特异性结合剂。在某些这样的实施方案中，该特异性结合剂为抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，可以用Kohler等(A^wre256:495(1975))最先介绍的杂交瘤方法，制备单克隆抗体。在某些实施方案中，可以用重组DNA方法(美国专利笫4,816,567号)制备单克隆抗体。在某些杂交瘤方法的实施方案中，对小鼠或其它合适的宿主动物(包括但不限于仓鼠或猕猴)进行免疫，诱导淋巴细胞产生抗体或能够产生抗体，该抗体将与用于免疫的蛋白质特异性结合。在某些实施方案中，可体外免疫淋巴细胞。在某些实施方案中，通过电促细胞融合法或通过用合适的融合剂(例如聚乙二醇)，使淋巴细胞或富含B细胞的'淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细月包(Goding,Mwoc/o願/^4"站0(i/wjPriwcip/^朋dPr"chce，第59-103页，[AcademicPress,1996])。在某些实施方案中，将杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并让其生长，培养基优选含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。在某些实施方案中，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄。票呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)时，用于杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质抑制HGPRT缺陷型细胞的生长。在某些实施方案中，通过选择抗体生成细胞，选择融合效率高，支持生成稳定且高水平的抗体并且对培养基(例如HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。示例性的骨髓瘤细胞系包括但不限于鼠骨髓瘤系(例如衍生自MOP-21骨髓瘤系)、MC,ll小鼠肿瘤(得自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA)以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(得自美国典型培养物保藏中心Rockville,MarylandUSA)。在某些实施方案中，用人骨髓瘤和/或小鼠-人异源骨髓瘤细胞系来产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Jmmunol.133:3001(1984;Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplication,第51-63页,MarcelDekker，Inc.,NewYork,[1987])。在某些实施方案中，分析了杂交瘤细胞生长以产生针对抗原的单克隆抗体的培养基。在某些实施方案中，通过免疫沉淀或通过体外结合实验，测定了由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。示例性的结合实验包括但不限于放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和斯卡查德分析(Scatchardanalysis)(Munson等，Anal.Biochem.107:220(1980)。在某些实施方案中，产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞经鉴定后，通过有限稀释方法使细胞亚克隆，并用标准方法(Goding,MonoclonalAntibodies:Principlesandpractice,,第59-103页，AcademicPress,1996),使之生长。用于该目的的示例性培养基包括但不限于DMEM培养基和RPMI-1640培养基。在某些实施方案中，杂交瘤细胞可^L为腹水肿瘤在动物体内生长。在某些实施方案中，通过常规免疫球蛋白纯化方法例如A蛋白琼脂糖层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，适于从培养基、腹水或血清中分离出由亚克隆分泌的单克隆抗体。在某些实施方案中，编码单克隆抗体的多核苷酸便于用常规方法分离和测序(例如使用能够与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。在某些这样的实施方案中，杂交瘤细胞用作这类多核苷酸的优选来源。在某些实施方案中，可将分离的多核苷酸置入表达载体中。在某些这样的实施方案中，使表达载体转染到宿主细胞内以在重组宿主细胞内获得合成的单克隆抗体。示例性的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生别的免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，多核苷酸可以被修饰，例如，通过与免疫球蛋白编码序列、全部或部分编码非免疫球蛋白多肽的序列共价连接，产生"嵌合"抗体或"杂合"抗体。在某些实施方案中，非免疫球蛋白多肽取代了抗体恒定区。在某些实施方案中，非免疫球蛋白多肽取代了抗体的1个抗原结合部位可变区以产生嵌合二价抗体，该抗体包含一个对耙抗原具有特异性的抗原结合部位和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合部位。在某些实施方案中，可以用合成蛋白化学的已知方法，包括但不限于涉及交联剂的方法，体外制备嵌合抗体或杂合抗体。在某些这样的实施方案中，可以用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的示例性试剂包括但不限于亚氨基石克醇盐和4-巯基亚氨丁酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。在某些实施方案中，提供抗靶抗原的人抗体。在某些实施方案中，杂交瘤技术用异源骨髓瘤作为融合部分以产生人抗体(小鼠x人杂合骨髓瘤)(参见例如Kozbor,/廳圃/.133:3001(1984);Brodeur等，Mo朋c/o船/^油力0(^y尸rot/MC加wrec/w々wes4pp"ca"ww,第5卜63页，MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。在某些实施方案中，人抗体分泌细胞可以通过用埃巴病毒(Epstein-Barrvims(EBV》感染4吏之无限i曾殖4b(James禾口Bell,</./wwwo/.A^Aocfe100:5-40[1987])。在某些实施方案中，可以通过导入规定的转化基因组合实现人B细胞的无限增殖化(Hahn等，A^wre400:464-468[簡])。在某些实施方案中，不存在产生内源免疫球蛋白的情况下，经免疫能够产生人抗体所有组成成分的转基因动物(例如小鼠)可用来产生人抗体(参见例如Jakobovits等，Atowe362:255-258[1993];Lonberg和Huszar,/wf.尺ev./wmw"o/.13:65-93[1995];Fishwild等，iVat祝咖/mo/.14:845-851[1996];Mendez等，胸.15:146-156[1997];Green,J./画画/.淑/w^r231:11-23[1999];Tomizuka等,Ato/./4rad[/&497:722-727[2000];有关综述参见Little等，了附ww"o/.7b^7_y21:364-370[2000])。Jakobovits等(尸rac.Ato/.JcadSci.USA90:2551-2555[1993])介绍了在嵌合小鼠和种系突变型小鼠抑制。在该种系突变型小鼠中，在抗原攻击时，人种系免疫球蛋白基因阵列的转移会导致产生人抗体(Jakobovits等，Atow,e362:255-258[1993])。Mendez等(M7m^Ge恥"cs15:146-156[1997])已经生产了被命名为"XenomouseII"的转基因小鼠品系，当用抗原攻击时，就会产生高亲和性的完全人抗体。这可通过将兆碱基(megabase)人重链和轻链转座子经种系整合进入具有缺失小鼠的内源JH区段而获得。XenomouseII包括1,020kb含有约66个Vh基因、完全Dh区和完全JH区以及3个不同的恒定区(iu、S和y)的人重链基因座，还包括800kb含有32个Vk基因、Jk区段和Ck基因的人k基因座。在某些实施方案中，这些小鼠产生的抗体与人体内所发现的抗体在各个方面都十分相似，包括基因重排、装配和所有组成成分。在某些实施方案中，人抗体比内源抗体优先表达，这是因在鼠基因座中抑制基因重排的内源JH区段缺失所致。在某些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如XenomouseII(Abgenix，Inc.))可以用特定的目标抗原免疫，例如用突变型EGFr多肽、突变型PI3K多肽和/或突变型B-Raf多肽免疫。在某些实施方案中，用得自这些免疫动物的血清筛选抗原始抗原的抗体反应性。在某些实施方案中，从淋巴结或脾细胞内分离出淋巴细胞，此外还可通过选择CD138阴性细胞和CD19+细胞来富集B细胞。在某些实施方案中，使这些B细胞培养物(BCC)与骨髓瘤细胞融合产生上述杂交瘤。在某些实施方案中，进一步筛选抗原始抗原反应性的B细胞培养物。这些筛选包括但不限于ELISA、具有已知结合目标抗原的抗体的竟争性实验，以及与表达抗原的瞬时转染CHO细胞体外结合。在某些实施方案中，通过特异性溶血噬斑试验鉴定分泌目标抗体的单一B细胞。在某些这样的实施方案中，裂解所针对的细胞为用抗原包被的绵羊红细胞(SRBC)。在某些这样的实施方案中，噬斑的形成表示特异性抗原介导的輩巴细胞裂解，因此存在分泌目标免疫球蛋白和补体的B细胞培养物。在某些这样的实施方案中，可以分离出噬斑中间的单个抗原特异性浆细胞并用于分离mRNA。在某些实施方案中，编码分泌的抗体可变区的多核苦酸可用反转录酶PCR克隆。在某些实施方案中，将克隆的多核苷酸再插入合适的表达载体，例如载体盒例如pcDNA，或者含有免疫球蛋白重链和轻链恒定区的pcDN载体。在某些实施方案中，使所产生的载体转染宿主细胞(即CHO细胞)，并在经改良的适于导入启动子、选择转化子或扩增编码所需序列基因的常用营养培养基中培养。在某些实施方案中，噬菌体展示技术用来从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库(repertoire)中体外产生人抗体和抗体片段(参见例如McCafferty等，Nature348:552-553[1990];有关综述参见Kipriyanov和Little,Mo/.S/Wec/mo/.12:173-201[1999];Hoogenboom和Chames,Immunol.Today21:371-378[2000])。在某些这样的实施方案中，使抗体V区基因符合读框地克隆到丝状噬菌体(例如M13或fd)的大王外被蛋白基因(majorcoatproteingene)或小外被蛋白基因中，并作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒表面展示。在某些实施方案中，丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体多种格式进行噬菌体展示，包括但不限于下述文件中所筌定的格式Johnson和Chiswell，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571[1993)];Winter等，Annu.Rev.Immunol12:433-455[1994];Dall'Acqua和Carter,Curr.Opin.Struct.Biol.8:443-450[1998]；和Hoogenboom和Chames,Immunol.Today21:371-378[2000]。噬菌体展示的V-基因区段来源包括但不限于小的衍生自免疫小鼠脾脏的V基因的随机组合文库(Clackson等(Nature352:624-628[W91])以及未免疫人供体的V基因库(Marks等J.A/o/.说'o/.222:581-597(1991)，或者Griffiths等，五7WS(9丄12:725-734(1993))。在某些实施方案中，天然免疫应答中，抗体基因以高速累积突变(体细胞高变)。在某些实施方案中，某些引入的变化提供较高的亲和性。在某些实施方案中，展示高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞在随后的抗原攻击中优先复制和分化。在某些实施方案中，可以应用称为"链改组"的技术才莫拟天然过程(Marks等，说o/Tec/wo/.10:7W-783[1992])。在某些这样的实施方案中，通过噬菌体展示获得的"原始"人抗体的亲和性，可以通过用从未免疫供体获得的V区基因的全套天然存在的变异体(所有组成成分)，依次置换重链和轻链V区基因而得以改进，使产生的抗体和抗体片段具有nM范围的亲和性。在某些实施方案中，构建了一个非常大型的噬菌体抗体库(亦称"母库(themother-of-alllibraries)"),参见Waterhouse等，AAwc/.v4cZ血尺e兄21:2265-2266(1993)。在某些这样的实施方案中，高亲和性人抗体从大型噬菌体文库直接分离出来(参见例如Griffiths等，￡A^5(913:3245-3260(1994》。在某些实施方案中，基因改组可以用来从啮齿动物抗体中衍生出人抗体，该人抗体具有与原来的啮齿动物抗体相似的亲和性和特异性。在某些这样的实施方案中，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V区基因用人V区基因库置换，产生啮齿动物-人嵌合体(亦称"表位印迹(epitopeimprinting)")。在某些实施方案中，通过抗原选择可变区导致分离出能够恢复功能性抗原结合部位的人可变区，即表位支配(印迹(imprint))选择部分。在某些实施方案中，当为了置换余留的啮齿动物V区而重复该过程时，获得没有啮齿动物来源的构架或CDR残基的人抗体(参见l993年4月1日公布的PCT专利申请第WO93/06213号)。阵列在某些实施方案中，提供包含一种或多种多核苷酸的微阵列，该多核苷酸编码一种或多种突变型EGFr多肽。在某些实施方案中，提供包含一种或多种多核苷酸的微阵列，该多核苷酸与一种或多种编码一种或多种突变型EGFr多肽的多核苷酸互补。在某些实施方案中，提供包含一种或多种多核苷酸的微阵列，该多核苷酸编码一种或多种突变型PI3K多肽。在某些实施方案中，提供包含一种或多种多核苷酸的^[敬阵列，该多核苦酸与一种或多种编码一种或多种突变型PI3K多肽的多核苷酸互补。在某些实施方案中，提供包含一种或多种多核苷酸的微阵列，该多核苷酸编码一种或多种突变型B-Raf多肽。在某些实施方案中，提供包含一种或多种多核苷酸的二微阵列，该多核苷酸与一种或多种编码一种或多种突变型B-Raf多肽的多核苷酸互补。在某些实施方案中，用微阵列技术评价两种以上的细胞或组织样品中一种或多种突变型EGFr多核苷酸的存在与否。在某种或多种突变型EGFr多核苷酸的量。在某些这样的实施方案中，评价前对细胞或组织进行处理，还对处理影响一种或多种突变型EGFr多核苦酸的量的能力进行评价。在某些实施方案中，用微阵列技术评价两种以上的细胞或组织样品中一种或多种突变型PI3K多核苷酸的存在与否。在某些实施方案中，用孩i阵列技术评价两种以上细胞或组织样品中一种或多种突变型PI3K多核苷酸的量。在某些这样的实施方案中，评价前对细胞或组织进行处理，还对处理影响一种或多种突变型PBK多核苷酸的量的能力进行评价。在某些实施方案中，用孩t阵列技术评价两种以上的细胞或组织样品中一种或多种突变型B-Raf多核苷酸的存在与否。在某种或多种突变型B-Raf多核苷酸的量。在某些这样的实施方案中，评价前对细胞或组织进行处理，还对处理影响一种或多种突变型B-Raf多核苷酸的量的能力进行评价。在某些实施方案中，用微阵列技术评价两种以上的细胞或组织样品中一种或多种突变型EGFr多肽的存在与否。在某些这样的实施方案中，首先从细胞或组织样品中抽提mRNA，继而使之转化为与微阵列杂交的cDNA。在某些这样的实施方案中，与微阵列特异性结合的cDNA的存在与否，是突变型EGFr多肽存在与否的指标。在某些这样的实施方案中，通过定量测定与^t阵列特异性结合的cDNA的量，评价一种或多种突变型EGFr多肽的表达水平。在某些这样的实施方案中，评价前对细胞或组织进行处理，还对处理影响一种或多种突变型EGFr多肽表达的能力进行评^阶。在某些实施方案中，用微阵列技术评价两种以上的细胞或组织样品中一种或多种突变型PBK多肽的存在与否。在某些这样的实施方案中，首先从细胞或组织样品中抽提mRNA,继而使之转化为与微阵列杂交的cDNA。在某些这样的实施方案中，与微阵列特异性结合的cDNA的存在与否，是突变型PI3K多肽存在与否的指标。在某些这样的实施方案中，通过定量测定与^:阵列特异性结合的cDNA的量，评价一种或多种突变型PI3K多肽的表达水平。在某些这样的实施方案中，评价前对细胞或组织进行处理，还对处理影响一种或多种突变型PI3K多肽表达的能力进行评价。在某些实施方案中，用微阵列技术评价两种以上细胞或组织样品中一种或多种突变型B-Raf多肽的存在与否。在某些这样的实施方案中，首先从细胞或组织样品中抽提mRNA，继而使之转化为与微阵列杂交的cDNA。在某些这样的实施方案中，与微阵列特异性结合的cDNA的存在与否，是突变型B-Raf多肽存在与否的指标。在某些这样的实施方案中，通过定量测定与^敛阵列特异性结合cDNA的量，评价一种或多种突变型B-Raf多肽的表达水平。在某些这样的实施方案中，评价前对细胞或组织进行处理，还对处理影响一种或多种突变型B-Raf多肽表达的能力进行评价。在某些实施方案中，提供包含一种或多种突变型EGFr多肽的微阵列(参见例如McBeath等，Science,289:1760-1763,2000)。在某些实施方案中，用突变型EGFr多肽微阵列，筛选一种或多种突变型EGFr多肽的候选特异性结合剂。在某些实施方案中，用突变型EGFr多肽孩i阵列，筛选调节突变型EGFr多肽活性的候选化合物。在某些这样的实施方案中，对候选化合物减少或抑制突变型EGFr多肽自身磷酸化的能力进行评价。在某些这样的实施方案中，对候选化合物增加突变型EGFr多肽自身磷酸化的能力进行评价。在某些实施方案中，提供包含一种或多种突变型PI3K多肽的微阵列(参见例如McBeath等，Science,289:1760-1763,2000)。在某些实施方案中，用突变型PI3K多肽微阵列，筛选一种或多种突变型PI3K多肽的候选特异性结合剂。在某些实施方案中，用突变型PI3K多肽微阵列，筛选调节突变型PI3K多肽活性的候选化合物。在某些这样的实施方案中，对候选化合物减少或抑制突变型PBK多肽自身磷酸化的能力进行评价。在某些这样的实施方案中，对候选化合物增加突变型PI3K多肽自身磷酸化的能力进行评价。在某些实施方案中，提供包含一种或多种突变型B-Raf多肽的微阵列参见例如McBeath等，Science,289:1760-1763,2000)。在某些实施方案中，用突变型B-Raf多肽;(鼓阵列，筛选一种或多种突变型B-Raf多肽的候选特异性结合剂。在某些实施方案中，用突变型B-Raf多肽孩i阵列，筛选调节突变型B-Raf多肽活性的候选化合物。在某些这样的实施方案中，对候选化合物减少或抑制突变型B-Raf多肽自身磷酸化的能力进行评价。在某些这样的实施方案中，对候选化合物增加突变型B-Raf多肽自身磷酸化的能力进行评价。在某些实施方案中，提供包含一种或多种突变型EGFr多肽的一种或多种特异性结合剂的微阵列。在某些这样的实施方案中，对细胞或组织中一种或多种突变型EGFr多肽的存在与否进行评价。在某些这样的实施方案中，对细胞或组织中一种或多种突变型EGFr多肽的量进行评价。在某些实施方案中，提供包含一种或多种突变型PI3K多肽的一种或多种特异性结合剂的微阵列。在某些这样的实施方案中，对细胞或组织中一种或多种突变型PI3K多肽的存在与否进行评价。在某些这样的实施方案中，对细胞或组织中一种或多种突变型PI3K多肽的量进行评价。在某些实施方案中，提供包含一种或多种突变型B-Raf多肽的一种或多种特异性结合剂的微阵列。在某些这样的实施方案中，对细胞或组织中一种或多种突变型B-Raf多肽的存在与否进行评价。在某些这样的实施方案中，对细胞或组织中一种或多种突变型B-Raf多肽的量进行评^N某些方法在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种突变型EGFr多肽结合的抗体的方法。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种突变型PI3K多肽结合的抗体的方法。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种突变型B-Raf多肽结合的抗体的方法。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种突变型EGFr多肽结合的抗体的方法，该方法包括给予动物至少一种突变型EGFr多肽，并从该动物中荻得能够与至少一种突变型EGFr多肽结合的抗体。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种突变型PI3K多肽结合的抗体的方法，该方法包括给予动物至少一种突变型PI3K多肽，并从该动物中获得能够与至少一种突变型PI3K多肽结合的抗体。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种突变型B-Raf多肽结合的抗体的方法，该方法包括给予动物至少一种突变型B-Raf多肽，并从该动物中获得能够与至少一种突变型B-Raf多肽结合的抗体。在某些这样的实施方案中，抗体为人抗体。在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种多肽结合的抗体的方法，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20，该方法包括给予动物至少一种多肽，该多肽包含至少一个选自以下的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20;并提供从该动物中获得能够与至少一种多肽结合的抗体，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些这样的实施方案中，抗体为人抗体。99]在某些实施方案中，提供获得能够与至少一种多肽结合的抗体的方法，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20,该方法包括给予动物至少一种多肽的至少一个片段，该多肽包含至少一个选自以下的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20，其中至少一个片段包含至少一个突变；并提供从该动物中获得能够与至少一种多肽结合的抗体，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。在某些这样的实施方案中，抗体为人抗体。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者的与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，4是供诊断受治疗者的与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型EGFr多肽的存在或表达量；(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型EGFr多核苷酸的存在或者转录量或翻译量；(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者的与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型PI3K多肽的存在或表达量；(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型PI3K多核苷酸的存在或者转录量或翻译量；(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断与一个或多个PBK突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17;(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17;(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断与一个或多个PBK突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者的与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，-渗断受治疗者的与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型B-Raf多肽的存在或表达量；(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型B-Raf多核香酸的存在或者转录量或翻译量；(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个B-Raf突变相关疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:20;(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，诊断受治疗者的与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:20;(b)根据该多核普酸的存在或者转录量或翻译量，诊断与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型EGFr多肽的存在或表达量；(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型EGFr多核苷酸的存在或者转录量或翻译量；(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断对与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;(b)根据该多肽的存在或者转录量或翻译量，诊断对与一个或多个EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者易感与一个或多个PBK突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型PI3K多肽的存在或表达量；(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型PI3K多核苷酸的存在或者转录量或翻译量；(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断对与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17;(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多核普酸的存在或者转录量或翻译量，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17;(b)根据该多肽的存在或者转录量或翻译量,诊断对与一个或多个PI3K突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，提供诊断受治疗者易感与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型B-Raf多肽的存在或表达量；(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中突变型B-Raf多核苷酸的存在或者转录量或翻译量；(b)根据该多核苷酸的存在或者转录量或翻译量，诊断对与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多肽的存在或表达量，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:20;(b)根据该多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，诊断受治疗者易感与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的方法包括(a)确定受治疗者的样品中多核苦酸的存在或者转录量或翻译量，该多核苷酸编码至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:20;(b)根据该多肽的存在或者转录量或翻译量，诊断对与一个或多个B-Raf突变相关的疾病或病症的易感性。在某些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在某些实施方案中，提供确定编码突变型EGFr多肽的多核苷酸存在与否的方法。在某些实施方案中，确定样品中编码突变型EGFr多肽的多核苷酸存在与否的方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A，(b)确定样品中编码突变型EGFr多肽的多核苷酸的存在与否。在某些实施方案中，确定样品中突变型EGFr多肽存在与否的方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A,(b)确定样品中突变型EGFr多肽的存在与否。在某些实施方案中，提供确定编码突变型PI3K多肽的多核苷酸存在与否的方法。在某些实施方案中，确定样品中编码突变型PI3K多肽的多核苷酸存在与否的方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型PI3K多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的PI3K突变E542K、E545A和H1047L,(b)确定样品中编码突变型PI3K多肽的多核苷酸的存在与否。在某些实施方案中，确定样品中突变型PBK多肽存在与否的方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型PBK多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的PI3K突变E542K、E545A和H1047L,(b)确定样品中编码突变型PI3K多肽的多核苦酸的存在与否。在某些实施方案中，提供确定编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸存在与否的方法。在某些实施方案中，提供确定样品中编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸存在与否的方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型B-Raf多肽区的多核普酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的B-Raf突变V600E和K601E，(b)确定样品中编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸的存在与否。在某些实施方案中，确定样品中突变型B-Raf多肽存在与否的方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型B-Raf多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中该区包含至少一个选自以下的B-Raf突变V600E和K601E,(b)确定样品中突变型B-Raf多肽的存在与否。在某些实施方案中，提供筛选至少一种突变型EGFr多肽活性调节剂的方法。在某些实施方案中，筛选至少一种突变型EGFr多肽活性调节剂的方法包括，使表达至少一种编码突变型EGFr多肽的多核苷酸的细胞与试验化合物接触；测定试验化合物是否调节突变型EGFr多肽的活性。在某些这样的实施方案中，试验化合物增强EGFr多肽的活性。在某些这样的实施方案中，试验化合物降低EGFr多肽的活性。在某些这样的实施方案中，鉴定为降低EGFr多肽活性的试验化合物可以用来治疗与至少一种突变型EGFr多肽相关的疾病或病症。在某些这样的实施方案中，鉴定为增强EGFr多肽活性的试验化合物可以用来治疗与至少一种突变型EGFr多肽相关的疾病或病症。在某些实施方案中，提供筛选至少一种突变型PI3K多肽活性调节剂的方法。在某些实施方案中，筛选至少一种突变型PI3K多肽活性调节剂的方法包括，使表达至少一种编码突变型PI3K多肽的多核苷酸的细胞与试验化合物接触；测定试验化合物是否调节突变型PI3K多肽的活性。在某些这样的实施方案中，试验化合物增强PI3K多肽的活性。在某些这样的实施方案中，试验化合物降低PI3K多肽的活性。在某些这样的实施方案中，鉴定为降低PI3K多肽活性的试验化合物可以用来治疗与至少一种突变型PI3K多肽有关的疾病或病症。在某些这样的实施方案中，鉴定为增强PI3K多肽活性的试验化合物可以用来治疗与至少一种突变型PI3K多肽有关的疾病或病症。在某些实施方案中，提供筛选至少一种突变型B-Raf多肽活性调节剂的方法。在某些实施方案中，筛选至少一种突变型B-Raf多肽活性调节剂的方法包括，使表达至少一种编码突变型B-Raf多肽的多核苷酸的细胞与试验化合物接触；测定试验化合物是否调节突变型B-Raf多肽的活性。在某些这样的实施方案中，试验化合物增强B-Raf多肽的活性。在某些这样的实施方案中，试验化合物降低B-Raf多肽的活性。在某些这样的实施方案中，鉴定为降低B-Raf多肽活性的试验化合物可以用来治疗与至少一种突变型B-Raf多肽相关的疾病或病症。在某些这样的实施方案中，鉴定为增强B-Raf多肽活性的试验化合物可以用来治疗与至少一种突变型B-Raf多肽相关的疾病或病症。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法，该方法包括(a)在得自受治疗者的多核苷酸中检出至少一个EGFr突变，其中至少一个EGFr突变的检出表明患者发生与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的易感性增加；和(b)给予受治疗者与突变型EGFr多肽特异性结合的抗体。在某些这样的实施方案中，抗体为人抗体。在某些这样的实施方案中，抗体为帕尼单抗或其抗原结合区。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法，该方法包括(a)在得自受治疗者的多核苷酸中检出至少一个EGFr突变，其中至少一个EGFr突变的检出表明患者患有与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症；和(b)给予受治疗者与突变型EGFr多肽特异性结合的抗体。在某些这样的实施方案中，抗体为人抗体。在某些这样的实施方案中，抗体为帕尼单抗或其抗原结合区。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法，其中至少一个EGFr突变选自L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法，其中与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症为非小细^^性肺癌。在某些实施方案中，提供用于治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病或病症的方法，该方法包括给予需要这种治疗的受治疗者突变型EGFr多核苷酸的反义多核苦酸。在某些实施方案中，提供用于确立个体的特定群体中突变型EGFr群体特征的方法，该方法包括(a)确定群体内个体的基因序型中存在至少一个EGFr突变；(b)确立突变型EGFr基因序型与个体之间的关系。在某些这样的实施方案中，个体的具体特征包括发生与EGFr突变相关的疾病或病症的易感性。在某些这样的实施方案中，个体的具体特征包括出现与EGFr突变相关的疾病或病症。在某些实施方案中，提供预测吉非替尼在治疗受治疗者的疾病或病症中的功效的方法，该方法包括确定受治疗者的突变型EGFr多肽中EGFr突变T790M的存在与否，其中在一种或多种突变型EGFr多肽中EGFr突变T790M的存在表明对用吉非替尼治疗的抗性。在某些实施方案中，提供确定在患癌症的受治疗者中对用抗EGFr抗体治疗的反应性的方法，该方法包括确定受治疗者体内EGFr突变T790M的存在与否。在某些这样的实施方案中，抗体为帕尼单抗或西妥昔单抗。在某些实施方案中，提供用于检测受治疗者的多核苷酸的试剂盒，该多核苷酸编码突变型EGFr多肽。在某些这样的实施方案中，试剂盒包含与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针，其中该区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。在某些实施方案中，试剂盒还包含两种以上扩增引物。在某些实施方案中，试剂盒还包含检测组分。在某些实施方案中，试剂盒还包含核酸取样组分。本发明所提供的以下实施例，包括所进行的实验和所得到的结果仅用于说明性目的，并不解释为对本发明的限制。实施例实施例1鉴定非小细胞性肺癌和结肠直肠腺癌肿瘤样品中的EGFR、PI3K和B-RAF突变为了鉴定伴随非小细胞性肺癌("NSCLC")产生的EGFr、磷脂酰肌醇3'-激酶("PBK")和B-Raf的突变，从NSCLC胂瘤样品中，分离出EGFr、PI3K和B-Raf的特异性外显子并进行扩增。在第一期NSCLC试验中，将仅化学疗法治疗(卡铂/紫杉醇)对与帕尼单抗、人抗EGFr抗体(Amgen)联用的化学疗法治疗进行比较，在用化学疗法和/或帕尼单抗治疗患者前，从招募的二十名患者中获得双盲胂瘤样品。为了鉴定伴随结肠直肠腺癌("CRC")产生的EGFr和PI3K中的突变，从二十名CRC患者肿瘤中分离出EGFr和PI3K的特异性外显子并进行扩增。在笫一期CRC试验中，将仅用化学疗法治疗(卡铂/紫杉醇)对与帕尼单抗、人抗EGFr抗体(Amgen)联用的化学疗法治疗进行比较，在用化学疗法和/或帕尼单抗治疗患者前，从招募的二十名患者中获得双盲肿瘤样品。对每个分离的外显子进行测序以鉴定出这些外显子的野生型序列的任何变化。收集二十名患者的NSCLC肿瘤样品(表l)和二十名患者的CRC肿瘤样品(表2)。对每个肿瘤样品的一部分进行染色以鉴定肿瘤的EGFr表达量，并用3分等级对染色评级(其中3为染色的最大程度)。每个肿瘤样品至少10%显示染色水平为3级以上。对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行大致切分，把肿瘤组织与相邻的正常组织、坏死碎片和基质分开。将准备好的样品固定在显^t镜载玻片上，并在室温下保存。表l:NSCLC患者样<table><row><column>组织编号</column><column>患者编号临床试验患者编号</column></row><row><column>04H-361JH-2</column><column>169144146</column></row><row><column>04H-362JLM-2</column><column>169174178</column></row><row><column>04H-366JKH-1</column><column>169284103</column></row><row><column>04H-368DC-2</column><column>16935</column><column>4133</column></row><row><column>04H-370WRW-2</column><column>16941</column><column>4140</column></row><row><column>04H-423GHBS-l</column><column>17093</column><column>4113</column></row><row><column>04H-453DSPS-l</column><column>17183</column><column>4130</column></row><row><column>04H-487MMHS-l</column><column>17255</column><column>4118</column></row><row><column>04H-488NSPS-l</column><column>17258</column><column>4121</column></row><row><column>04H-489JDES-l</column><column>17261</column><column>4135</column></row><row><column>04H-496BAHS-l</column><column>17282</column><column>4161</column></row><row><column>04H-499JMWS-l</column><column>17291</column><column>4143</column></row><row><column>04H-511LRRS-1</column><column>17327</column><column>4182</column></row><row><column>04H-512GLPS-l</column><column>17330</column><column>4183</column></row><row><column>04H-523RLLS-l</column><column>17363</column><column>4116</column></row><row><column>04H-524FPJS-l</column><column>17366</column><column>4120</column></row><row><column>04H-525DJKS-l</column><column>17369</column><column>4122</column></row><table><table><row><column>04H-526JMS-l</column><column>17372</column><column>4129</column></row><row><column>04H-593KMW-1</column><column>17891</column><column>4101</column></row><row><column>04H-595REG-1</column><column>17897</column><column>4123</column></row><table>表2:CRC患者样品<table><row><column>组织编号</column><column>患者编号</column><column>临床试验患者编号</column></row><row><column>04H-537MLBS-l</column><column>17380</column><column>9006</column></row><row><column>04H-538TAOS-l</column><column>17383</column><column>9021</column></row><row><column>04H-540RRKS-l</column><column>17389</column><column>9001</column></row><row><column>04H-541HJBS-l</column><column>17392</column><column>9002</column></row><row><column>04H-542PJW-1</column><column>17395</column><column>9003</column></row><row><column>04H-543JWJS-l</column><column>17398</column><column>9004</column></row><row><column>04H-546RFHS-l</column><column>17407</column><column>9011</column></row><row><column>04H-547WCDS-l</column><column>17410</column><column>9014</column></row><row><column>04H-548LKWS-l</column><column>17413</column><column>9024</column></row><row><column>04H-550DGAS-l</column><column>17419</column><column>9038</column></row><row><column>04H-551TLRS-l</column><column>17422</column><column>9020</column></row><row><column>04H-552KSS-l</column><column>17425</column><column>9037</column></row><row><column>04H-556MJJS-l</column><column>17437</column><column>9015</column></row><row><column>04H-557MLRS-l</column><column>17440</column><column>9034</column></row><row><column>04H-559PHS-l</column><column>17446</column><column>9040</column></row><row><column>04H-563AMFS-l</column><column>17458</column><column>9033</column></row><row><column>04H-565RCRS-l</column><column>17464</column><column>9029</column></row><row><column>04H-566GCS-l</column><column>17467</column><column>9039</column></row><row><column>04H-567GWBS-l</column><column>17470</column><column>9013</column></row><row><column>04H-568HLBS-l</column><column>17473</column><column>9019</column></row><table>按照生产商的方案，用PinpointSlideDNA分离系统(ZymoResearch,Orange，CA)从载玻片上的样品制备基因组DNA。将最终分离的基因组DNA产物溶于500)li1水中。用每个外显子的特异性引物，通过PCR扩增对应于人EGFr外显子18、19、20、21和23的序列，对应于人PI3K外显子9和20的序列以及对应于人B-Raf外显子15的序列。用野生型EGFrcDNA序列(Ge油ank检索号AC006977;SEQIDNO:55)中内含子序列的5，和各外显子的3，，设计出每个外显子的引物序列。野生型EGFr基因组的核普酸序列见Genbank检索号AC073324。野生型EGFr多肽序列见Genbank检索号AAS83109(SEQIDNO:1)。EGFr外显子18的正向引物为5，-GGGCCATGTCTGGCACTGCTTTCC-3，(SEQIDNO:22)，EGFr外显子18的反向引物为5'-GAAATATACAGCTTGCAAGGACTC画3，(SEQIDNO:23)。EGFr外显子19的正向引物为5，-AATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCC-3，(SEQIDNO:24),EGFr外显子19的反向引物为5'-GAGAAAAGGTGGGCCTGAGGTTC-3，(SEQIDNO:25)。EGFr外显子20的正向引物为5，-CTGCGTAAACGTCCCTGTGCTAGGTC-3，(SEQIDNO:26)，EGFr外显子20的反向引物为5，-GCACGCACACACATATCCCCATGGC-3，(SEQIDNO:27)。EGFr外显子21的正向引物为5，-GCATGAACATGACCCTGAATTCGG-3，(SEQIDNO:28),EGFr外显子21的反向引物为5，-CCTGCATGTGTTAAACAATACAGC-3，(SEQIDNO:29)。EGFr外显子23的正向引物为5，-TCATTCATGATCCCACTGCCTTC-3，(SEQIDNO:30),EGFr外显子23的反向引物为5，-CAGCTGTTTGGCTAAGAGCAGCC-3，(SEQIDNO:31)。野生型PI3K多肽序列见Genbank检索号U79143(SEQIDNO:14)。野生型PI3KcDNA序列见图7(SEQIDNO:58)。PI3K外显子9的正向引物为5，-CTGTAAATCATCTGTGAATCCAGAGGGG-3，(SEQIDNO:32),PI3K外显子9的反向引物为5，-GTAAATTCTGCTTTATTTATTCCAATAGGTATGG-3，(SEQIDNO:33)。PI3K外显子20的正向引物为5,-CTACGAAAGCCTCTCTAATTTTGTGACATTTGAGC-3'(SEQIDNO:34),PI3K外显子20的反向引物为5，画CTTGCTGTAAATTCTAATGCTGTTCATGGATTGTGC-3，(SEQIDNO:35)。野生型B-Raf多肽序列见Genbank检索号NM004333(SEQIDNO:18)。野生型B-RafcDNA序列见图8(SEQIDNO:60)。B-Raf外显子11的正向引物为5，-GGGGATCTCTTCCTGTATCCCTCTCAGGC-3，(SEQIDNO:36)，B-Raf外显子11的反向引物为5'-GTTTATTGATGCGAACAGTGAATATTTCC-3，(SEQIDNO:37)。B-Raf外显子15的正向引物为5，-CATAATGCTTGCTCTGATAGG曙3，(SEQIDNO:38)，B誦Raf外显子15的反向引物为5，-GTAACTCAGCAGCATCTCAG-3，(SEQIDNO:39)。用TaqDNA聚合酶(RocheDiagnosticsCorp)在下列条件下进行PCR:将5iun0xTaq缓沖液、0.5fil24mMMgCl2、lpl基因组DNA(约0.5ng)、7^12.5mMdNTP、Taq聚合酶(5U)和29.5^1双蒸水混合。向每个管中加入6|li1合并的引物母液(各10pM)。循环方案为以93。C4分钟、93。C10秒、62。C30秒、72°C30秒为1个循环，共循环35次，然后72°C4分钟循环1次。反应结束时，温度保持在4°C。合并各个外显子的PCR产物并进行凝胶纯化。按照生产商的说明书，用TOPO-TA克隆试剂盒(InvitrogenCorp)，将经純化的扩增外显子序列亚克隆到pCR2.1载体上。用GenetixColonyPicker挑出含有载体和目标外显子插入片段的大肠杆菌菌落。使这些菌落在液体培养基中生长过夜。按照生产商的说明书，用QIAGEN9600、3000或8000Bio-robot(Qiagen),从过夜的各细菌培养物中分离出质粒DNA。按照生产商的说明书，用BigDye3.1终止试剂盒(AppliedBiosystems,Inc.),对含有每个外显子的分离的质粒DNA进行测序。用3700、3100或3730基因分析仪(AppliedBiosystems,Inc.)收集测序数据，用SeQuencher程序(GeneCodesCorp.)进行分对斤。将得自患者样品中的外显子序列与野生型外显子序列进行比较。结果用示意图1和图2表示。NSCLC患者肿瘤样品的突变分析(图l)在EGFr中鉴定出数个突变2名不同患者中EGFr外显子18的2个不同的突变(Q701H(SEQIDNO:40，该序列编码SEQIDNO:3的多肽)和L688P(SEQIDNO:41，该序列编码SEQIDNO:2的多肽))；2名不同患者中EGFr外显子19的1个l5个碱基对缺失(SEQIDNO:42,该序列编码SEQIDNO:4的多肽)和1个突变(K745N(SEQIDNO:43，该序列编码SEQIDNO:5的多肽》；3名不同患者中EGFr外显子20的3个不同的突变(C781R(SEQIDNO:44，该序列编码SEQIDNO:6的多肽)、T790M(SEQIDNO:45，该序列编码SEQIDNO:8的多肽)和氨基酸771和772之间插入组氨酸(SEQIDNO:46，该序列编码SEQIDNO'.7的多肽))；1名患者中EGFr外显子21的1个突变(Q849R(SEQIDNO:47,该序列编码SEQIDNO:10的多肽))；以及2名不同患者中EGFr外显子23的2个不同突变(V948A(SEQIDNO:48，该序列编码SEQIDNO:13的多肽)和F910L(SEQIDNO:49，该序列编码SEQIDNO:12的多肽))。NSCLC患者样品的PI3K外显子分析鉴定出在7名不同患者中观察到PL3K外显子9的单个突变(E545A(SEQIDNO:50,该序列编码SEQIDNO:16的多肽))，并未观察到PI3K外显子20的突变。对B-Raf外显子15的分析还鉴定出2名不同患者中的单个突变(V600E(SEQIDNO:51,该序列编码SEQIDNO:19的多肽))。相比之下，CRC患者肿瘤样品的突变分析，未在二十名CRC患者中鉴定出任何EGFr突变(图2)。二十名患者中有十三名在PI3K外显子9上具有相同的E545A突变(SEQIDNO:50,该序列编码SEQIDNO:16的多肽)，已在之前的NSCLC患者样品中鉴定出该突变。另外，在其他3名患者中鉴定出该外显子的EM2K突变(SEQIDNO:53,该序列编码SEQIDNO:15的多肽)。在1名患者中鉴定出PI3K外显子20的1个突变(H1047L(SEQIDNO:54，该序列编码SEQIDNO:17的多肽))。因此，在NSCLC患者肺瘤样品中鉴定出12个不同的EGFr突变、1个PI3K突变和1个B-Raf突变，而在CRC患者肿瘤样品中则筌定出3个PI3K突变，但未鉴定出EGFr突变。实施例2非小细胞性肺癌突变的进一步分析对另外的三十九名NSCLC患者的肿瘤样品进行了进一步的突变研究。在笫一期NSCLC试验中，将仅用化学疗法治疗(卡賴/紫杉醇)对与帕尼单抗、人抗EGFr抗体(Amgen)联用的化学疗法治疗进行比较，在患者用化学疗法和/或帕尼单抗治疗前，从招募的三十九名患者中获得双盲肺瘤样品。采用与实施例1相同的DNA分离、扩增、亚克隆以及分析方法，分析了EGFr外显子18、19、20、21和23,以及B-Raf外显子11和l5存在的突变。三十九个样品详情见表3,图3还显示了这些样品的分析结果。表3:NSCLC患者样品的进一步研究<table><row><column>组织编号</column><column>患者编号</column><column>临床试验患者编号</column></row><row><column>04H-424JAQS-2</column><column>17096</column><column>4119</column></row><row><column>04H-425JZ-2</column><column>17099</column><column>4228</column></row><row><column>04H-426PAP-2</column><column>17102</column><column>4233</column></row><row><column>04H-427SFD-2</column><column>17105</column><column>4239</column></row><row><column>04H-428AMBS-2</column><column>17108</column><column>4167</column></row><row><column>04H-429ELHS-2</column><column>17111</column><column>4273</column></row><row><column>04H-430HDDS-2</column><column>17114</column><column>4144</column></row><row><column>04H-431CMWS-2</column><column>17117</column><column>4213</column></row><row><column>04H-432JLS-2</column><column>17120</column><column>4165</column></row><row><column>04H-433RCS-2</column><column>17123</column><column>4170</column></row><row><column>04H-434RZS-2</column><column>17126</column><column>4219</column></row><table><table><row><column>04H-435GKS-2</column><column>17129</column><column>4265</column></row><row><column></column><column>04H-436RTS-2</column><column>17132</column><column>4248</column></row><row><column></column><column>04H-437mMFS-2</column><column>17135</column><column>4240</column></row><row><column></column><column>04H-438JDRS-2</column><column>17138</column><column>4179</column></row><row><column></column><column>04H-439LCS-2</column><column>17141</column><column>4256</column></row><row><column></column><column>04H-440GLPS-2</column><column>17144</column><column>4275</column></row><row><column></column><column>04H-441MHRS-2</column><column>17147</column><column>4206</column></row><row><column></column><column>04H-442JEFS-2</column><column>17150</column><column>4222</column></row><row><column></column><column>04H-443HBAS-2</column><column>17153</column><column>4223</column></row><row><column></column><column>04H-444DTS-2</column><column>17156</column><column>4231</column></row><row><column></column><column>04H-447CDS-2</column><column>17165</column><column>4207</column></row><row><column></column><column>04H-449DWBS-2</column><column>17171</column><column>4164</column></row><row><column></column><column>04H-450DLRS-2</column><column>17174</column><column>4211</column></row><row><column></column><column>04H-454NPJS-2</column><column>17186</column><column>4136</column></row><row><column></column><column>04H-456NENS-2</column><column>17192</column><column>4151</column></row><row><column></column><column>04H-461LWFS-2</column><column>17207</column><column>4218</column></row><row><column></column><column>04H-479MATS-2</column><column>17231</column><column>4229</column></row><row><column></column><column>04H-482GPHS-2</column><column>17240</column><column>4221</column></row><row><column></column><column>04H-484JPS-2</column><column>17246</column><column>4156</column></row><row><column></column><column>04H-493JSS-2</column><column>17273</column><column>4208</column></row><row><column></column><column>04H-497JMPS-2</column><column>17285</column><column>4189</column></row><row><column></column><column>04H-503SASS-2</column><column>17303</column><column>4254</column></row><row><column></column><column>04H-504JDDS-2</column><column>17306</column><column>4152</column></row><row><column></column><column>04H-507RWRS-2</column><column>17315</column><column>4157</column></row><row><column></column><column>04H-510CSLS-2</column><column>17324</column><column>4180</column></row><row><column></column><column>04H-513ALFS-2</column><column>17333</column><column>4205</column></row><row><column></column><column>04H-515VITS-2</column><column>17339</column><column>4149</column></row><row><column></column><column>04H-522VABS-2</column><column>17360</column><column>4257</column></row><table>分析结果未鉴定出EGFr外显子20或23的突变。在4名不同患者的样品中鉴定出EGFr外显子18的单个突变(L688P(SEQIDNO:41，该序列编码SEQIDNO:2的多肽))。在单个患者样品中鉴定出EGFr外显子19中单个的15个碱基对缺失(SEQIDNO:42，该序列编码SEQIDNO:4的多肽)。在2名不同的患者中各鉴定出EGFr外显子21的2个突变(L858R(SEQIDNO:61,该序列编码SEQIDNO:11的多肽)和L828stop突变(SEQIDNO:56,该序列编码SEQIDNO:9的多肽))。未鉴定出B-Raf外显子11的突变。在单个患者的样品中鉴定出B-Raf外显子15的1个突变，K601E(SEQIDNO:57，该序列编码SEQIDNO:20的多肽)。在所观察到的突变中，2个曾在之前实施例1中鉴定出(EGFr外显子18的L688P和EGFr外显子19的15个碱基对缺失)，3个是新鉴定出来的(EGFr外显子21的L858R、EGFr外显子21的L828stop和B-Raf外显子15的K601E)。在8个NSCLC患者样品中，鉴定出总共9个被证实的EGFr基因突变，在1名NSCLC患者中鉴定出1个被证实的B-Raf基因突变。实施例3突变型EGFR多肽自身磷酸化能力的分析通常，EGFr经历自身磷酸化作用作为在与配体例如EGF或TGF-a结合时内化的前体。因此，对实施例2鉴定出的某些EGFr突变型多肽进行研究，以确定EGF诱导的EGFr磷酸化的体外抑制。丙氧基]-4-喹唑啉胺，一种小分子激酶抑制剂)处理。计算出经吉非替尼和帕尼单抗处理的样品中，EGF诱导的自身磷酸化的IC50(表4)。野生型EGFr和T"0M突变型EGFr多肽的原始电泳数据如图4所示。表4:吉非替尼或帕尼单抗处理后EGFr自身磷酸化的IC50<table><row><column>EGFr突变</column><column>吉非替尼预处理IC50(nM)</column><column>帕尼单抗预处理IC50(nM)</column></row><row><column>无(野生型)</column><column>14.6</column><column>0.23</column></row><row><column>外显子19的15个个成基对缺失</column><column>1.4</column><column>0.17</column></row><row><column>外显子21的L858R</column><column>3.2</column><column>0.18</column></row><row><column>外显子20的T790M</column><column>>2000</column><column>0.23</column></row><table>如表4所示，吉非替尼和帕尼单抗在低浓度下对抑制野生型EGFr和15个碱基对缺失和L858REGFr突变型的EGFr自身磷酸化是有效的。然而，T"OM突变型EGFr多肽的自身磷酸化不被吉非替尼所抑制(IC50>2000nM)，但却被帕尼单抗有效地抑制(IC50为0.23nM)。因此，对于具有EGFr外显子20的T790M突变的NSCLC患者，帕尼单抗治疗可能比吉非替尼治疗更有效。实施例4突变分析与帕尼单抗功效的相关性在实施例2的突变分析之后，研究结果对于观察到突变的患者是非盲的(表5)。研究人员每六周用实体瘤治疗反应评价标准(ResponseEvaluationCriteriaInSolidTumors(RECIST))评^介临床数据，根据肿瘤大小，为确定疾病改善、病情稳定或进行性疾病提供指导(参见Therasse等，2000年2月，"NewGuidelinestoEvaluatetheResponsetoTreatmentinSolidTumors,"J.Natl.CancerInst.92(3):205-216)。表5:NSCLC患者样品<table><row><column>经鉴定的突变</column><column>性别</column><column>吸烟史</column><column>治疗</column><column>%EGFr(染色水平S)</column><column>反应</column></row><row><column>15个力威基对缺失</column><column>男</column><column>从未吸烟</column><column>化疗</column><column>60</column><column>病情稳定</column></row><table><table><row><column>外显子19</column><column></column></row><row><column>L688P外显子18</column><column>女</column><column>曾吸烟</column><column>化疗</column><column>50</column><column>病情稳定</column></row><row><column>L688P外显子18</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗</column><column>80</column><column>部分应答</column></row><row><column>L688P外显子18</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗</column><column>10</column><column>病情稳定</column></row><row><column>T790M外显子20</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>10</column><column>病情稳定</column></row><row><column>L858R外显子21</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>90</column><column>病情稳定</column></row><row><column>Q701H外显子18</column><column>女</column><column>从未吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>20</column><column>进行性疾病15个碱基对缺失外显子19</column><column>女</column><column>从未吸烟化疗+帕尼单抗</column><column>40</column><column>部分应答</column></row><table>结果表明，对于具有EGFr外显子20中T790M突变和EGFr外显子21中L858R突变的患者，帕尼单抗与化学疗法联合治疗至少12周使得病情稳定。采用化学疗法/帕尼单抗联合治疗，在具有EGFr外显子19中15个碱基对缺失的患者中观察到部分应答。相比之下，只用化学疗法治疗时，在具有相同的EGFr外显子19中l5个碱基对缺失的患者中仅达到病情稳定。近期的研究已从NSCLC肿瘤中鉴定出数个对EGFr酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(IressaTM(AstraZeneca)和埃罗替尼(erlotinib)(Tarceva(Genentech)，N画(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-曱氧基乙氧基)-4画P奎哇淋胺)具有敏感性的EGFr突变。Lynch等(200《"ActivatingMutationsintheEpidermalGrowthFactorReceptorUnderlyingResponsivenessofNon-Small-CellLungCancertoGefitinib，"NewEnglandJ.Med.350(21):2129-39)发现以下EGFr突变与用吉非替尼治疗NSCLC患者肿瘤的易感性有关氨基酸746-"3区缺失、L858R、L861Q和G719C。Paez等(2004,"EGFRMutationsinLungCancer:CorrelationwithClinicalResponsetoGefitinibTherapy,"Science304:1497-1500)公开了与Lynch等人相类似的发现，确定了具有EGFr突变L858R、G719S和氨基酸746和759之间不同缺失突变的肿瘤对用吉非替尼治疗敏感。Pao等，2004("EGFreceptorgenemutationsarecommoninlungcancersfrom"neversmokers"andareassociatedwithsensitivityoftumorstogefitinibanderlotinib,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(36):13306-13311),发现类似的EGFr突变(E746-A750缺失、L747-S752缺失、L858R和R776C/L858R)与NSCLC肿瘤对用吉非替尼或埃罗替尼治疗的易感性有关。像这些研究一样，实施例1和实施例2所进行的研究也鉴定出外显子19中15个碱基对缺失突变型和外显子21中L858R为与NSCLC肿瘤有关的EGFr突变。从非盲患者得到的结果中获得数据，通过帕尼单抗与化学疗法联用，抑制含有这2个突变之一或含有T790M的肺瘤。然而在吉非替尼/埃罗替尼实验中，之前未鉴定出T790M突变。体外研究证实，非常低浓度的帕尼单抗，就能有效抑制T790MEGFr突变型的自身磷酸化，而吉非替尼不是突变型EGFr自身磷酸化的有效抑制剂。因此，帕尼单抗联合治疗而非吉非替尼可有效治疗EGFr突变型T790M。从本发明所公开的说明书和实践考虑，其它实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。本说明书和实施例只应视作示例性的，本发明真正的范围和精神如所附权利要求书中规定。附录A帕尼单抗二期NSCLC临床试验中体细胞EGFr基因突变的鉴定及临床前表征对帕尼单抗敏感性及吉非替尼耐药性的新突变的发现FreemanD,1*JuanT,SarosiI,1CrawfordJ,2SandlerA,3SchillerJ，4PragerD,5JohnsonD,3JerianS,1RadinskyR1(*这些作者对文章的贡献相等)iAmgenInc.,ThousandOaks,CA;2DukeUniversityMedicalCenter,Durham,NC;3Vanderbilt-IngramCancerCenter,Nashville,TN;4UniversityofWisconsin,Madison,WI;5UCLAMedicalCenter,LosAngeles,CA背景了解EGFr酪氨酸激酶抑制剂与单克隆抗体之间的不同机制，会有助于了解EGFr途径和可能带来临床利益的治疗特性。帕尼单抗是一种全人单克隆抗体，针对的是EGFr胞外域，近来在一期NSCLC试验中对帕尼单抗进行了研究，将化学疗法(卡柏/紫杉醇)与化学疗法加上帕尼单抗进行了比较(n=l75;最初终点(primaryendpoint)=至发展的时间(timetoprogression》。对60名患者的EGFr基因突变进行了评价。本研究的目的是确定帕尼单抗针对新的EGFr突变是否具有与吉非替尼不同的活性。方法从解剖FFPE肺瘤切片中分离出基因组DNA(预处理)，对EGFr基因外显子18、19、20、21和23进行PCR,收集PCR产物，亚克隆，对每个外显子的菌落(>30个)测序，用GeneticAnalyzer解析。随后的PCR和基因组DNA测序证实存在突变。这些数据与临床结果数据(研究人员每六周用PECIST进行评价)有关。为了确定EGF诱导的EGFr自身磷酸化的体外抑制，在EGF刺激前，用0-2^M的帕尼单抗或吉非替尼处理WT和突变型EGFr过量表达CHO细胞。结果60名NSCLC患者中，8名患者显示5种不同的体细胞EGFr基因突变。<table><row><column>患者</column><column>性别</column><column>吸烟史</column><column>治疗</column><column>%EGFr(3+)</column><column>突变</column><column>反应*</column></row><row><column>1</column><column>男</column><column>从未吸烟</column><column>化疗</column><column>60</column><column>15个碱基对缺失外显子19</column><column>SD</column></row><row><column>2</column><column>女</column><column>曾吸烟</column><column>化疗</column><column>50</column><column>点突变外显子18</column><column>SD</column></row><row><column>3</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗</column><column>80</column><column>点突变外显子18</column><column>PR</column></row><row><column>4</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗</column><column>10</column><column>点突变外显子18</column><column>SD</column></row><row><column>5</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>10</column><column>点突变外显子20</column><column>SD</column></row><row><column>6</column><column>男</column><column>曾吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>90</column><column>点突变外显子21</column><column>SD</column></row><row><column>7</column><column>女</column><column>从未吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>20</column><column>点突变外显子18</column><column>PD</column></row><row><column>8</column><column>女</column><column>从未吸烟</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>40</column><column>15个碱基对缺失外显子19</column><column>PR</column></row><table>*PR＝部分应答，SD＝病情稳定，PD＝进行性疾病野生型、外显子19缺失、外显子21点突变和新的外显子20突变的EGF诱导的EGFr自身磷酸化，对于用吉非替尼预处理的细胞，IC50为14.6nM、1.4nM、3.2nM和>2000nM，对于用帕尼单抗预处理的细胞，IC50则为0.23nM、0.17nM、0.18nM和0.23nM。结论8名患者具有体细胞EGFr基因突变。在EGFr过量表达CHO细胞中，不论何种突变状况，帕尼单抗都抑制EGF诱导的EGFR自身磷酸化。新的EGFr外显子20突变，与体外对帕尼单抗敏感性、吉非替尼耐药性以及患者的临床获益有关，该患者在响应用帕尼单抗+化学疗法的两个周期(~12周)内，病情稳定。附录B帕尼单抗加上紫杉醇和卡铂或者化学治疗单用的NSCLC患者的EGFr基因突变分析FreemanD,1*JuanT,"SarosiI，1CrawfordJ,2SandlerA,3SchillerJ，4PragerD,5JohnsonD,3MossS，1RadinskyR1(*这些作者对文章的贡献相等)1AmgenInc.,ThousandOaks，CA;2DukeUniversityMedicalCenter,Durham,NC;3Vanderbilt-IngramCancerCenter,Nashville,TN;4UniversityofWisconsin,Madison,WI;5UCLAMedicalCenter,LosAngeles,CA背景帕尼单抗是针对表皮生长因子受体(EGFr)的全人单克隆抗体。近来的数据提示，在一类非小细胞肺癌(NSCLC)患者(pts)中，体细胞EGFr激酶域基因突变与对小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏感有关。为了确定EGFr基因突变与用帕尼单抗治疗患者结果的关系(若有的话)，在对紫杉醇和卡铂(化学疗法)对帕尼单抗加上化学疗法进行功效及安全性比较的二期研究中，对随机招募的60名NSCLC患者的肿瘤EGFr基因进行测序。合乎条件的患者疾病为IIIMV期，用免疫组织化学法显示，^10%的肿瘤细胞中，胂瘤EGFr表达为l+、2+或3+。研究者每六周用RECIST标准评价肿瘤反应。本研究已经完成，登记数(11=175),治疗仍在进行中。方法光学显微镜下，对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行切分，把肿瘤组织(预处理)与相邻的正常组织、坏死碎片和基质分开。分离出基因组DNA，对EGFr基因外显子18、19、20、21和23进行PCR。收集PCR产物并亚克隆，对每位患者每个外显子的最少30个菌落进行分析。随后进行PCR，对纯化基因组DNA测序，用来证实突变的存在。用荧光染料-终止物化学法进行EGFr突变分析,并用GeneticAnalyzer解析。结果60名NSCLC患者的DNA测序显示，共8名患者中有体细胞EGFr基因突变，其中4名来自化学疗法组，4名来自化学疗法加上帕尼单抗组。<table><row><column>患者</column><column>治疗</column><column>%EGFr(3+)</column><column>突变</column><column>反应*</column></row><row><column>1</column><column>化疗</column><column>60</column><column>15个碱基对缺失外显子19</column><column>SD</column></row><row><column>2</column><column>化疗</column><column>50</column><column>点突变外显子18</column><column>SD</column></row><row><column>3</column><column>化疗</column><column>80</column><column>点突变外显子18</column><column>PR</column></row><row><column>4</column><column>化疗</column><column>10</column><column>点突变外显子18</column><column>SD</column></row><row><column>5</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>10</column><column>点突变外显子20</column><column>SD</column></row><row><column>6</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>90</column><column>点突变外显子21</column><column>SD</column></row><row><column>7</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>20</column><column>点突变外显子化</column><column>PD</column></row><row><column>8</column><column>化疗+帕尼单抗</column><column>40</column><column>15个碱基对缺失外显子19</column><column>PR</column></row><table>*PF=部分应答，SD二病情稳定，PD二进行性疾病结论对60名NSCLC患者的体细胞EGFr基因突变进行了评价。发现8名患者具有EGFr基因突变，观察到3名对用帕尼单抗加上化学疗法有部分应答或病情稳定，1名对帕尼单抗加上化学疗法无反应。发现4名患者对仅用化学疗法有部分应答或病情稳定。将提供60名患者的结果。权利要求1.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO12和SEQIDNO13。2.—种分离的多肽，所述多肽由至少一个选自以下的氨基酸序列组成SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。3.—种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。4.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码由至少一个选自以下氨基酸序列组成的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。5.—种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。6.—种分离的多肽，所述多肽由至少一个选自以下的氨基酸序列组成SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。7.—种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。8.—种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码由至少一个选自以下氨基酸序列组成的多肽SEQEDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。9.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。10.—种分离的多肽，所述多肽由至少一个选自以下的氨基酸序列组成SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。11.一种分离的多核苷酸，所述多核香酸编码包含至少一个选自以下氨基酸序列的多肽SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。12.—种分离的多核苷酸，所述多核普酸编码由至少一个选自以下氨基酸序列组成的多肽SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。13.—种载体，所述载体包含至少一种权利要求3、4、7、8、11和12中任一项的分离的多核苷酸。14.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求13的载体。15.—种细胞，所述细胞用权利要求3、4、7、8、11和12中任一项的分离的多核苷酸转化。16.—种制备多肽的方法，该方法包括将权利要求14的宿主细胞在有效用于多肽产生的条件下进行培养。17.权利要求16的方法，该方法还包括对多肽进行分离。18.—种制备多肽的方法，该方法包括将权利要求15的细胞在有效用于多肽产生的条件下进行培养。19.权利要求18的方法，该方法还包括对多肽进行分离。20.通过权利要求16的方法制备的多肽。21.通过权利要求18的方法制备的多肽。22.—种融合蛋白，所述蛋白包含权利要求l、2、5、6、9和10中任一项的分离的多肽及与所述多肽融合的异源多肽。23.—种特异性结合剂，所述结合剂能够与权利要求1、2、5、6、9和10中任一项的分离的多肽结合。24.权利要求23的特异性结合剂，所述结合剂选自至少一种选自以下的分子抗体、其中重链和轻链通过接头连接的抗体、单链Fv抗体、免疫功能性免疫球蛋白片段、Fab抗体、Fab，抗体、(Fab，)2抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、抗独特型抗体、完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体以及抑制EGF与分离的多肽结合的抗体，该多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20。25.—种获得能够与至少一种多肽结合的抗体的方法，所迷多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13,该方法包括给予动物至少一种包含至少一个选自以下序列的多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;和从所述动物中获得能够结合至少一种多肽的抗体，所述多肽包含至少一个选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13。26.—种转基因非人类动物，所述动物包含权利要求3、4、7、8、11和12中任一项的多核苷酸。27.杈利要求3、4、7、8、11和12中任一项的多核苷酸，所述多核苦酸与固相支持体相连接。28.权利要求1、2、5、6、9和10中任一项的多肽，所述多肽与固相支持体相连接。29.—种多核苷酸阵列，所述阵列包含至少一种权利要求3、4、7、8、11和12中任一项的多核香酸。30.—种多肽阵列，所述阵列包含至少一种权利要求1、2、5、6、9和10中任一项的多肽。31.—种核酸探针，所述探针能与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交或者能与所述多核苷酸的互补序列杂交，其中所述突变型EGFr多肽区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。32.—种诊断受治疗者的与一个或多个EGFr突变相关的疾病的方法，该方法包才舌(a)确定受治疗者的样品中权利要求1或2的多肽的存在或表达量5和(b)根据所述多肽的存在或表达量，诊断与一个或多个EGFr突变相关的疾病。33.—种诊断受治疗者易感与一个或多个EGFr突变相关的疾病的方法，该方法包4舌(a)确定样品中权利要求1或2的多肽的存在或表达量；和(b)根据所述多肽的存在或表达量，诊断对与一个或多个EGFr突变相关的疾病的易感性。34.—种确定样品中编码突变型EGFr多肽的多核苷酸存在与否的方法，该方法包4舌(a)使样品暴露在与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针中，其中所述突变型EGFr多肽区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A;和(b)确定样品中编码突变型EGFr多肽的多核苷酸的存在与否。35.—种确定样品中突变型EGFr多肽存在与否的方法，该方法包括(a)使样品暴露在与编码突变型EGFr区的多核苷酸杂交的探针中，其中所述突变型EGFr区编码至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A;和(b)确定样品中突变型EGFr多肽的存在与否。36.—种诊断受治疗者的EGFr相关癌症的方法，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多肽的存在与否，所述多肽包含至少一个选自以下的突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A，其中至少突变型EGFr多肽的存在诊断出受治疗者的EGFr相关癌症。37.—种诊断受治疗者的EGFr相关癌症的方法，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在与否，所述多核苷酸编码包含至少一种选自以下突变的多肽L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A,其中至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在诊断出受治疗者的EGFr相关癌症。38.—种确定受治疗者发生EGFr相关癌症的可能性的方法，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多肽的存在与否，所述多肽包含至少一个选自以下的突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A,其中至少突变型EGFr多肽的存在表明受治疗者发生EGFr相关癌症的可能性。39.—种确定受治疗者发生EGFr相关癌症的可能性的方法，该方法包括确定受治疗者的样品中至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在与否，所述多核苷酸编码包含至少一个选自以下突变的多肽L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A，其中至少一种突变型EGFr多核苷酸的存在表明受治疗者发生EGFr相关癌症的可能性。40.权利要求36、37、38和39中任一项的方法，其中所述EGFr相关癌症为非小细胞性肺癌。41.一种筛选至少一种突变型EGFr多肽的活性调节剂的方法，所述多肽包含至少一个选自以下的突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A,该方法包括(a)使权利要求14或15的细胞与试验化合物接触；和(b)测定试验化合物是否调节突变型EGFr多肽的活性。42.通过权利要求41的方法鉴定的化合物。43.—种治疗与至少一个选自以下EGFr突变有关的疾病的方法L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A,该方法包括给予需要治疗与至少一个EGFr突变有关的疾病的受治疗者权利要求42的化合物。44.一种治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病的方法，该方法包才舌(a)检出得自受治疗者的多核苷酸中的至少一个EGFr突变，其中至少一个EGFr突变的检出表明，患者发生与至少一个EGFr突变相关的疾病的易感性增强；和(b)给予受治疗者与突变型EGFr多肽特异性结合的抗体。45.—种治疗受治疗者的与至少一个EGFr突变有关的疾病的方法，该方法包括(a)检出得自受治疗者的多核苷酸中的至少一个EGFr突变，其中至少一个EGFr突变的检出表明，患者患有与至少一个EGFr突变有关的疾病；和(b)给予受治疗者与突变型EGFr多肽特异性结合的抗体。46.权利要求44的方法，其中所述抗体为人抗体。47.权利要求46的方法，其中所述抗体为帕尼单抗或其抗原结合区。48.权利要求44的方法，其中至少一个EGFr突变选自L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。49.权利要求44的方法，其中与至少一个EGFr突变有关的疾病为非小细胞性肺癌。50.—种治疗与至少一个EGFr突变有关的疾病的方法，该方法包括给予需要这种治疗的受治疗者权利要求3或4的多核苷酸的反义多核普酸。51.—种在个体的特定群体中确立突变型EGFr群体特征的方法，该方法包括(a)确定群体内个体的基因序型中存在至少一个EGFr突变；和(b)确定突变型EGFr基因序型和个体的具体特征之间的关系。52.权利要求51的方法，其中个体的具体特征包括发生与EGFr突变相关的疾病的易感性。53.权利要求51的方法，其中个体的具体特征包括出现与EGFr突变相关的疾病。54.—种预测吉非^^尼治疗受治疗者的疾病的功效的方法，该方法包括确定受治疗者的突变型EGFr多肽中EGFr突变T790M的存在与否，其中在一种或多种突变型EGFr多肽中存在EGFr突变T790M表明对用吉非替尼治疗的抗性。55.—种确定用抗EGFr抗体治疗患癌症的受治疗者的反应性的方法，该方法包括确定受治疗者体内EGFr突变T790M的存在与否。56.权利要求55的方法，其中所述抗体为帕尼单抗或西妥昔单机。57.—种检测受治疗者的多核苷酸的试剂盒，所述多核苷酸编码突变型EGFr多肽，所述试剂盒包含与编码突变型EGFr多肽区的多核苷酸杂交的探针，其中所述突变型EGFr多肽区包含至少一个选自以下的EGFr突变L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间插入组氨酸、T7卯M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。58.权利要求57的试剂盒，所述试剂盒还包含两种以上扩增引物。59.权利要求57的试剂盒，所述试剂盒还包含检测组分。60.权利要求57的试剂盒，所述试剂盒还包含核酸取样组分。全文摘要本发明描述了表皮生长因子受体(EGFr)突变、磷脂酰肌醇3′-激酶(“PI3K”)突变以及B-Raf突变。本发明还描述了用抗EGFr的人单克隆抗体治疗含有突变EGFr的肿瘤的方法。本发明也描述了用于确定样品中存在一种或多种突变型EGFr、突变型PI3K和/或突变型B-Raf，以及用于治疗与存在突变型EGFr、突变型PI3K和/或突变型B-Raf有关的疾病或病症的方法和试剂盒。本发明还描述了治疗含有突变型EGFr、突变型PI3K和/或突变型B-Raf的肿瘤的方法。文档编号C07K14/71GK101208354SQ200680013839公开日2008年6月25日申请日期2006年2月23日优先权日2005年2月24日发明者D·弗里曼,R·拉丁斯基,阮昭杰申请人:安姆根有限公司