专利名称：：新的疏水蛋白融合蛋白产品、其制备及用途的利记博彩app新的疏水蛋白融合蛋白产品、其制备及用途本发明涉及新的疏水蛋白融合蛋白、其制备及用途。现有技术疏水蛋白是大约100个AA的小蛋白质，其是丝状真菌特有的蛋白质并且不在其他生物中产生.近年来，在天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中发现了称作"Chaplin"的疏水蛋白样蛋白质，其同样具有高表面活性特性。Chaplins可在水-气界面装配，从而产生淀粉样原纤维(amyloid-likefibrils)(Classen等人，2003GenesDev1714-1726;Elliot等人2003，GenesDev.17，1727-1740)。疏水蛋白以水不溶性形式分布在各种真菌结构例如气生菌丝、孢子和子实体的表面。疏水蛋白的基因分离自子嚢菌纲(ascomycetes)、半知菌纲(deuteromycetes)和担子菌纲(basidiomycetes)。一些真菌包含不止一种疏水蛋白基因，例如裂褶菌(Schizophyllumcommune)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。4艮明显，不同的疏水蛋白参与真菌发育的不同阶段。推测所述疏水蛋白负责不同的功能(vanWetter等人，2000，Mol.Microbiol"36，201-210;Kershaw等人1998，FungalGenet.Biol，1998，23,18-33)。所描述的疏水蛋白的生物学功能除了减少水的表面张力以产生气生菌丝外，其还包括孢子的疏水化(W6sten等人1999，Curr.Biol.，19,1985-88;Bell等人1992，GenesDev.,6，2382-2394)。此夕卜，疏7JC蛋白用于内村地衣的子实体中的气体通道(gaschannel)以及通过真菌病原体鉴定植物表面的系统的组分(Lugones等人1999，Mycol.Res.，103，635-640;Hamer&Talbot1998，Curr.OpinionMicrobiol.,第1巻，693-697).互补实验已证明可在单一种类内一定程度上功能性地取代疏水蛋白。使用常规的蛋白质-化学纯化和分离方法只可以以适度的产量和纯度制备以前公开的疏水蛋白.借助遗传方法来提供更大量的疏水蛋白的努力迄今也未获得成功。发明目的本发明的目的是提供新的疏水蛋白和其生产方法，所述方法使得能够经济地生产疏水蛋白并将其用于多种
技术领域：
。发明描述本发明涉及通用结构式(I)的多肽Xn-C、Xi-5(rC2-Xo-5-CVXi-ioO-C4-Xi-ioo-C5-Xi-5(rC6-Xo-5-C-Xi-50""C-Xm①其中X可以是20种天然发生的氨基酸中的任一种(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)，X上的指数表示氨基酸的数目，指数n和m是O和500之间的数目、优选15和300之间的数目，条件是缩写为Xn或Xm的肽序列中的至少一个是长度至少为20个M酸，天然不与疏水蛋白相连的肽序列，该多肽在包4皮玻璃表面后接触角改变至少20°。由d至<:8表示的半胱氨酸在本发明的蛋白质中以还原形式存在或彼此形成二硫键。特别优选形成分子内C-C键，特别是具有至少l个，优选2个，特别优选3个和非常优选4个选自d和C2、<:3和<:4、C5和C6、C7和C8的分子内二硫键的C-C键。如果半胱氨酸也用于X表示的位置中，那么通式中各半胱氨酸位置的编号可相应地改变。特别有利的多肽是通式(II)的那些多肽Xn画C、X3-25國C2-Xo-2-C3-X5-50國C4-X2-35画C5-X2-l5國C6-Xo-2-C7-X3-3S國C8画Xm(II)其中X可以是20种天然发生的氨基酸中的任一种(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly),X上的指数表示氨基酸的数目，指数n和m是2和300之间的数目，条件是缩写为Xn或Xm的肽序列中的至少一个肽序列是长度至少为35个氨基酸，天然不与疏水蛋白相连的肽序列，该多肽在包被玻璃表面后改变接触角至少20。。非常有利的是通式(III)的那些多肽Xn-C、X5-9-C2-C3-Xii-39-C4-X2-23一C5-Xs-9-C6-C7-X^-i8"C8-Xm(M)其中X可以是20种天然发生的氨基酸中的任一种(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly),X上的指数表示氨基酸的数目，指数n和m是0和200之间的数目，条件是缩写为Xn或Xm的肽序列中的至少一个肽序列是长度至少为40个氨基酸、不与疏水蛋白天然iM目连的肽序列，该多肽在包被玻璃表面后改变接触角至少20°,本发明所述的优选的实施方案是具有通用结构式(I)、(II)或(III)的多肽，该结构式包含至少一个种类I的疏7jC蛋白，优选至少一个dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2疏水蛋白或其部分或衍生物。所述疏水蛋白的结构特征存在于下面列出的序列中。可能将多个，优选2或3个，结构上相同或不同的疏水蛋白相互连接，并连接至对应的合适多肽序列，所述多肽序列不与疏水蛋白天然相连。本发明的特别优选的实施方案是具有SEQIDNO:20、22、24所示的多肽序列的新的蛋白质及其编码核酸序列，特别是如SEQIDNO:19，21，23定义的序列。特别优选的实施方案也是这样的蛋白质，该蛋白质始于SEQIDNO:22、22或24所示的多肽序列，由至少1个，多至10个，优选5个氨基酸，特别优选所有氨基酸的5%的氣基酸的取代、插入或缺失产生且仍然具有所述起始蛋白质的至少50%的生物学特性。此处的蛋白质的生物学特性是指如实施例10中所描述的接触角的改变。本发明的蛋白质在缩写为Xn或Xm的位置中的至少一个上具有包含至少20个，优选至少35个，特别优选至少50个和特别优选至少100个氨基酸的多肽序列(在下文中也称为融合伴侣)，其天然不与疏水蛋白相连。这表明本发明的蛋白质由疏水蛋白部分和融合述伴侣部分组成的事实，其中所述融合述伴侣部分在自然界中不以该形式一起发生。所述融合伴倡部分可选自多个蛋白质。也可能将多个融合伴侣在例如疏水蛋白部分的氨基末端(Xn)和羧基末端(Xm)连接至一个疏水蛋白部分。然而，也可能例如将两个融合伴侣连接至本发明蛋白质的单一位置(Xn或Xm)。特别优选的融合伴倡是这样的多肽序列，即这些多肽序列能使本发明如在实验部分详细描述的处理(实施例10)(例如1%SDS/80°C/10分钟)。特别合适的融合伴侣是在微生物中特别是在大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌(Bacillussubtilis)中天然发生的多肽。这些融合伴侣的实例是序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)和硫氧还蛋白质。只包含所述序列的部分，优选70-99%,特别优选80-98%的所迷序列的片段或衍生物，或其中与所述序列相比单个氨基酸或核酸已改变的序列也是非常有用的。例如，可将额外的氨基酸，尤其是两个额外的氨基酸，优选为氨基酸Arg、Ser连接至yaad和yaae序列的C末端。与天然发生的序列相比，插入在yaae序列中的额外氨基酸，例如SEQIDNO:17和18中的第2位氩基酸(Gly)也可能是优选的。此外，也可能在两个融合伴侣的连接处插入额外的两个氨基酸，这是点失活的结果。还可能通it^l基化、乙酰化或通过化学交联例如通过戊二醛交联修饰本发明的蛋白质的多肽序列。本发明的蛋白质的一个特性是当用所述蛋白质包^^面时，所述表面性质改变。可通过在用本发明的蛋白质包祐束面之前或之后测量水滴的接触角并确定两个测量的差异来实验确定所述表面性质的改变。在实施例10中的实验部分中说明了用于测量接触角的确切实验条件。在这些条件下，本发明的蛋白质具有增加接触角至少20度、优选25度、特别优选30度的特性。之前公开的疏水蛋白的疏水蛋白部分的极性和非极性M酸的位置是保守的，从而产生特征疏水性图。生物物理性质和疏水性的差异使之前公开的疏水蛋白分成两类，I类和II类(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol"32，413-437)。I类疏水蛋白的组装膜是高度不溶的(甚至在提高的温度下对于1%的SDS不溶)，其只可用浓缩的三氟乙酸(TFA)或甲酸再次离解.相反地，II类疏水蛋白的装配形式较不稳定。甚至可用60%强度的乙醇或1%的SDS(在室温下)重新将其溶解.IL^酸序列的比较显示II类疏水蛋白中的半胱氨酸d和C4之间的区域的长度明显短于其在I类疏水蛋白中的长度。此外，II类疏水蛋白比I类具有更多的带电荷的氨基酸。本发明还涉及生产本发明蛋白质的方法。可通过已知的肽合成方法例如才艮据Merrifield的固相合成法化学地生产这些多肽。然而遗传方法是特别有用的，在所述遗传方法中，以这样的方式组合分别编码融合伴侣和疏水蛋白部分的两个核酸序列特别是DNA序列，即使在宿主生物中组合的核,列的基因表达产生想要的蛋白质的方式。此处合适的宿主生物(生产者生物)可以是原核生物(包括古细菌(Archaea))或真核生物，特别是细菌包括盐杆菌(halobacteria)和甲烷球菌(methanococci)、真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，特别优选大肠杆菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、米曲霉(Aspergillusoryzea)、构巢曲霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspec.)、Lactobacillen、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、里氏木霉(Trichodermareesei)、SF9(或相关细胞)和其他生物。本发明还涉M达构建体，以及包含至少一个所述表达构建体的载体，所述表达构建体包含在调控核酸序列的基因控制下编码本发明的多肽的核紗列。包含特定编码序列的启动子5，上游和终止子序列3，下游，如果合适，类构建体是优k的。''''"有效连接"是指以这样的方式顺序排列启动子、编码序列、终止子和如果合适还有调控序列，从而使调控元件的各元件能够按照其希望的与表达所述编码序列有关的用途实现其功能。可有效连接的序列的实例是乾向性序列以及增强子、聚腺苷酸化信号等。其他调控元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调控序歹'J的实例描述于Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)。除了这些调控序列外，这些序列的天然调控可仍然存在于实际结构基因的上游，且如果合适，其已进行了基因改造，这样关闭了天然的调控，从而使基因的表达增加。优选的核酸构建体也有利地包括一种或多种已提及的增强子序列，所述增强子序列功能性地连接至启动子并使所述核酸序列的表达增加。其他本发明的核酸也可以以一个或多个拷贝存在于构建体中。如果合适，构建体仍可包含其他标记例如抗生素抗性或与营养缺陷型互补的基因，以选择构所述建体。有利于本发明方法的调控序列的实例存在于启动子例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq誦T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、X-PR或启动子中，所述启动子有利地用于革兰阴性细菌中。有利的调控序列的其他实例存在于革兰阳性启动子amy和SP02中，存在于酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYCl、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。也可能使用人工启动子进行调控。为了在宿主生物中表达，有利地将核酸构建体插入载体例如，质粒或噬菌体，所述载体使得基因能够在宿主中最佳表达。除了质粒和噬菌体外，载体也指本领域技术人员已知的任何其他载体，即例如，病毒例如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环形DNA,还有农杆菌属系统。这些栽体可自主地在宿主生物中复制或通过染色体复制。这些载体组成了本发明的另一个实施方案。合适的质粒的实例是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223画3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III"3-Bl、tgtll或pBdCl、链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101pIJ364、pIJ702或pIJ361、芽胞杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214、棒杆菌(Corynebacterium)中的A77或pAJ667、真菌中的pALSl、pIL2或pBB116、酵母中的2a、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004或pDH51,所述质粒是可能的质粒的少数选择。其他质粒对于本领域技术人员来说是熟知的且可在例如书籍CloningVectors(PouwelsP.H.等人编著，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。为了表达其他存在的基因，有利地，核酸构建体也额外地包含3，-和/或5，-末端调控序列以增加表达，依赖于选择的宿主生物和基因选择所述调控序列以进行最佳表达。这些调控序列使得能够特定地表达基因和蛋白质。依赖于宿主生物，这可以是指，例如，所逸基因只在诱导后表达或过量表达，或立即表达和/或过量表达。在该关系中，所述调控序列或因子优选可对诱导的基因的基因表达具有有益的作用从而增加其表达。因此，可通过使用强转录信号例如启动子和/或增强子，在转录水平上有利地增强调控元件。然而，除此以外，也可能通过例如提高mRNA的稳定性来增加翻译。在载体的另一个实施方案中，也可通过异源或同源重组的方式有利地以线性DNA的形式将包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体导入微生物和整合入宿主生物的基因组中。所述线性DNA可由线性化的载体例如质粒组成或只由本发明的核酸构建体或核酸组成。为了在生物中获得异源基因的最佳表达，有利地根据所述生物中使用的特定密码子选择修饰所迷核酸序列。可基于目的生物的其他已知基因的计算机分析容易地确定密码子选择。通过将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子信号或聚腺鲁酸化信号融合来制备本发明的表达盒。为了该目的，使用熟悉的重组和克隆才支术,在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)，和在T.J.S他avy，M丄.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以;S^Ausubd，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中描述的这些技术。.为了在合适的宿主生物中表达，有利地将所述重组核酸构建体或基因构建体插入宿主特异性载体，所述载体使得基因能够在宿主中最佳表达。载体对于本领域技术人员来说是熟知的，且可在例如"CloningVectors"(PouwelsP.H.等人编著，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。本发明的载体可用于制备以例如至少一种本发明的载体转化的重组微生物以及可用于生产本发明的多肽。有利地，将本发明的上述重组构建体导入合适的宿主系统并在所述系统中表达。此处优选使用本领域技术人员已知的常用的克隆和转染方法例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录转染等，以在特定的表达系统中表达所述核酸。合适的系统描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等人编著，WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中。也可能根据本发明制备同源重组的微生物。为了该目的，制备包含本发明的基因或编码序列的至少一个片段的载体，在所U因的片段中，如果合适，已导入了至少一个氨基酸的缺失、添加或取代以修饰例如功能性地破坏本发明的序列(敲除载体)。所述导入的序列也可以是例如来自相关微生物的同源物或从哺乳动物、酵母或昆虫来源衍生而来。可选择地设计用于同源重组的载体以使内源基因发生突变，或在同源重组期间以一些其他方式进行修饰，但所述内源基因仍然编码功能性蛋白质(例如，可以以改变内源蛋白质的表达的方式修饰上游调控序列)。本发明基因的经修饰部分存在于同源重组栽体中。用于同源重组的合适的载体的构建描述于例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中。任何原核或真核生物原则上适合用作本发明核酸的重组宿主生物或用于核酸构建体。有利地使用的宿主生物是微生物例如细菌、真菌或酵母。有利地使用革兰阳性或革兰阴性细菌，优选为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Str印tomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌、特别优选为埃希杆菌属、假单胞菌属(Pseudomoiias)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、沙门氏菌(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。基于宿主生物，以本领域技术人员已知的方法生长或培养用于本发明方法的生物。通常在o和iooc之间、优选1o和60x:之间的温度下将微生物培养在液体培养基中，同时其通入氧，所述培养基包含通常以蔗糖形式存在的碳源、通常以有机氮源例如酵母提取物，或盐例如硫酸铵形式存在的氮源、微量元素例如铁、锰、镁盐，和如果合适，维生素。营养液的pH在此处可以保持或可以不保持在固定的值上，即在生长过程中受到调控。可通过分批发酵法、半分批发酵法或连续发酵法进行培养。可在发酵开始时一开始就加入营养物或随后半连续或连续地提供营养物。可使用实施例中描述的方法从生物分离酶，或将所述酶作为粗提取物用于反应。本发明还涉及重组产生本发明多肽或其功能性、生物学活性片段的方法，该方法包括培养生产多肽的^t生物，如果合适，包括表达所迷多肽和将其从培养物中分离。如果期望，通过该方法也可在工业规模上生产所述多肽。可通过已知的方法培养和发酵重组;微生物。例如，可在TB培养基或LB培养基中，以20至40"，pH6至9繁殖细菌。在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中详细地描述了合适的培养条件。如果多肽未分泌至培养基中，则破碎细胞并通过分离蛋白质的已知方法从裂解物中分离产物。任选通过高频超声、通过高压(例如在弗氏压碎器中)、通过低渗(osmolysis)、通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用、通过使用匀浆器或通过所列的几种方法的组合破碎细胞。可通过已知的方法，层析法例如分子筛层析法(凝胶过滤)，例如Q-琼脂糖凝胶层析法、离子交换层析法和疏7jC层析法，以及通过其他常用的方法例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳纯化所述多肽。在例如Cooper,F.(i,BiochemischeArbeitsmethoden原始标题Thetoolsofbiochemistry]，VerlagWaterdeGruyter，Berlin,NewYork或在Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中描述了合适的方法。为了分离重组蛋白质，可有利地使用例如载体系统或寡核苷酸，所述载体系统或寡核苷酸通过特定的核苷酸序列延伸cDNA，从而编码例如有助于纯化的改变的多肽或融合蛋白。这些合适的修饰的实例是用作锚的"标记"，例如称作六组氨酸锚的修饰或可被抗体作为抗原识别的表位(描述于例:ft口Harlow,E.和Lane,D.，1988，Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中)。其他合适的标记是例如HA、调钾蛋白质-BD、GST、MBD、壳多糖-BD、链霉抗生物素蛋白-BD-Avi标记、Flag标记、T7等。这些锚可用于将所述蛋白质与固体支持物连接，例如与可被例如导入层析柱，或导入微量滴定板或任何其他支持物的聚合物基质连接。也可从商业亲和标记提供商获得相应的纯化方案。许多包被疏7JC蛋白的真菌表面(孢子、子实体、菌丝体)展示可显微检测的，称作"棒状小体(rodlet)"的特征结构。也可在疏水蛋白包被的亲水表面(例如，玻璃、云母等)上检测到具有大约lOntn厚度的类似的棒状小体(W6sten等人，1993，PlantCell，5，1567-1574)。归因于疏水蛋白用于表面包被的特别的性质(例如抗去垢剂例如1%强度的SDS溶液)，这些蛋白质具有用于许多工业应用的巨大潜力。多种专利文献提到这些应用的实例，此处就疏水蛋白的用途参考这些应用的实例，编号优先权申请人WO03/1033107.23.2001Nanosyste咖B.V.申请WO04/0088006.21.2002NanosystemsB.V.中请WO03/8450804.04.2002NanosystemsB.V.中请WO00/4096801.05.1999UnileverN.V.(HindustanLeverLtd.)EP-B125251602.04.2000NanosystemsB.V.StichtingvoordeTechnischeWetenschappen申请EP-B125757102.04.2000NanosystemsB.V.申请WO01/5706602.04.2000NanosystemsB.V.申请WO03/1033107.23.2001NanosystemsB.V.申请WO03/5338312.14.2001L，Oreal由于缺乏生产和纯化的有效方法，疏水蛋白特别是I类疏7jC蛋白的工业应用至今未获得成功。之前描述的始于天然来源(孢子、真菌、菌丝体等)的方法只产生mg级的量的物质(例如WO96/41882)。通过在多种生产者生物中重组生产的方法同样被证明是特别复杂的并且令人不十分满意。本发明的疏7jC蛋白以其融合形式(即与融合伴侣部分一起)和以其分离形式都具有期望的疏水蛋白的特性。因此可能将本发明的蛋白质以融合蛋白的形式直接使用，以及在切割且除去融合伴侣后以"纯"疏水蛋白的形式使用。如果意欲除去融合伴侣，推荐将潜在切割位点(蛋白质酶的特异性识别位点)在疏水蛋白部分和融合伴侣部分之间引入融合蛋白。特别合适的切割位置是在疏7jC蛋白部分和融合伴侣部分的任何其他位置都不发生的那些肽序列，可使用生物信息学工具容易地确定该序列。特别有用的是例如，甲硫氨酸上的BrCN断裂或通过因子Xa、肠激酶、凝血酶、TEV(烟草蚀紋病毒蛋白质酶)切割进行的蛋白质酶介导的断裂。实施例部分实施例1yaad-His6/yaaE-His6克隆的准备工作借助于寡核苷酸Ha1570和Hal571(Hal572/Hal573)进行聚合酶链式反应。使用的模板DNA是来自细菌枯草杆菌的基因组DNA。获得的PCR片段包含枯草杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列和位于末端的Ncol或Bg瓜限制性切割位点。纯化并用限制性内切核酸酶Ncol和Bgll切割PCR片段。将该DNA片段用作插入片段并克隆入QiagenpQE60载体，之前已用限制性内切核酸酶Ncol和Bg瓜将所述载体线性化。以该方式获得的载体，pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可用于表达分别由YAAD::HIS6和YAAE::HIS6组成的蛋白质。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttettgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc实施例2yaad-疏水蛋白DewA-His6的克隆借助于寡核苷酸KaM416和KaM417进行聚合酶链式反应。使用的模板DNA是来自霉菌构巢曲霉的基因组DNA。获得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列和N末端因子Xa蛋白质酶的切割位点。纯化和并用限制性内切核酸酶BamHI切割PCR片段。将该DNA片段用作插入片段且克隆入pQE60YAAD#2载体，之前已用限制性内切核酸酶Bglll将所述载体线性化。所获得的载体，#508可用于表达由YAAD::Xa::dewA::HIS6组成的融合蛋白。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC实施例3yaad-疏7JC蛋白RodA-His6的克隆类似地使用寡核苷酸KaM434和KaM435将质粒#513克隆入质粒#508。KaM434:GCTMGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG实施例4yaad-疏水蛋白BASF1-His6的克隆类似地使用寡核苷酸KaM417和KaM418将质粒#507克隆入质粒#508。所用的模板DNA是人工合成的DNA序列，疏水蛋白BASF1(参见附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCGCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例5yaad-疏水蛋白BASF2-His6的克隆类似地使用寡核苷酸KaM417和KaM418将质粒#506克隆入质粒#508。所用的模板DNA是人工合成的DNA序列，疏水蛋白BASF2(参见附件)'KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CT(3CCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例6yaad-疏水蛋白SC3-His6的克隆类似地使用寡核苷酸KaM464和KaM465将质粒#526克隆入质粒#508。所用的模板DNA是裂褶菌的cDNA(参见附件)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCWGTTCGCGCGTCTCCCCGTCGT实施例7重组大肠杆菌林系yaad-疏水蛋白DewA-His6的发酵在15mlGreiner管中用表达yaad-疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌林系接种3mlLB液体培养基。将培养物以37*C，在振荡器上200转/分钟培养8小时。在各情况下，用在各情况下1ml的预培养物接种2个装有250mlLB培养基(+100將/ml氨苄青霉素)的11的緩冲的埃伦迈尔烧瓶，并以37X:，180转/分钟在振荡器上培养9小时。在201的发酵罐中用0.51预培养物(相对H20测量的OD卿咖1:10)接种13.51LB培养基(+100將/ml苄青霹素)。在OD6flnm为大约3.5时加入140ml的100mMIPTG。3小时后，将发酵罐冷却至10。C,通过离心除去发酵液。将细胞沉淀用于进一步纯化。实施例8重组疏水融合蛋白的纯化(具有C末端His6标记的疏水蛋白融合蛋白的纯化)将100g细胞沉淀(l00-500mg疏水蛋白)与50mM磷酸钠緩冲液，pH7.5混合形成200ml的总体积，然后重悬浮所述细胞。用UltraturraxT25型(Janke和Kimkel;IKA-Labortechnik)处理悬浮物10分钟，然后与500单位的benzonase(Merck，Darmstadt,德国；目录号1.01沾"7.0001)在室温下温育l小时以降解核酸，在细胞破碎之前，使用玻璃针筒(cartridge)(Pl)进行过滤。在1500巴下运行两个匀浆器以进行细胞破碎并剪切剩下的基因组DNA(M-110EHmicrofluidizer;MicrofluidicsCorp.).离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心瓶，60分钟，4*C，12000转/分钟，23000g)匀浆物，离心后将上清置于冰上并在100ml磷酸钠緩冲液，pH7,5中重悬浮所述沉淀。重复离心和重悬浮三次，在第三次重复期间磷酸钠緩冲液包含1%的SDS。在重悬浮后，搅拌混合物1小时并进行最后的离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心瓶，60分钟，4*C，12000转/分钟，23000g)。SDSPAGE分析表明在最后的离心后疏水蛋白存在于上清液中(图1)。该实验显示疏水蛋白可能以内含体的形式存在于对应的大肠杆菌细胞中。将50ml包含疏水蛋白的上清用于50ml镍-琼脂糖凝胶高效17-5268-02柱(Amersham)，该柱已用50mMTris-Cl緩冲液，pH8.0进行了平衡。用50mMTris-Cl緩冲液，pH8.0洗涤柱子，然后用包含200mM咪唑的50mMTris-Cl緩沖液，pH8,0洗脱疏7JC蛋白。用50mMTris-Cl緩沖液，pH8.0透析所述溶液来除去咪唑。图l描述了本发明的疏水蛋白的纯化泳道l:用于镍-琼脂糖凝胶柱(l:10稀释)的溶液泳道2:流通物=洗涤步骤洗脱物泳道3-5:洗涤级分的OD280峰图1中的本发明疏水蛋白具有大约53kD的分子量。一些更小的条带代表所迷疏水蛋白的分解产物。实施例9具有疏水蛋白的表面的包4iL/评价优选在分别作为亲水和疏7JC表面模型的玻璃和聚四氟乙烯树脂上评价疏水蛋白或疏水蛋白融合蛋白的包被性质，标准的包被实验玻璃-疏水蛋白的浓度1-100pg/mL画用50mM醋酸钠，pH4，+0.1%Tween20过夜温育(温度)玻璃板-包被后，在蒸馏水中洗涤-之后，在80t!下用1%SDS温育10分钟-在蒸馏水中洗涤。聚四氟乙烯树脂-浓度1-100將/mL-用10mMTris，pH8，+0.1%Tween20过夜温育(温度80X:)聚四氟乙烯树脂板包被后，在蒸馏水中洗涤-在80X:下用0.1%Tween20温育10分钟-在蒸馏水中洗涤-之后，在80t!下用1%SDS中温育10分钟-在蒸馏水中洗涤。在空气中干燥样品并确定5jd水滴的接触角(以度表示)，得到例如下列的值用实施例8的yaad-DewA融合蛋白进行的实验(对照无蛋白质；yaad-dewA-his6:100fig/ml纯化的融合伴倡)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>具有疏水蛋白的表面的包^c/评价玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Mannheim，德国)國疏水蛋白的浓度100jig/mL-用50mM醋酸钠，pH4，+0.1%Tween20过夜温育(温度80。C)玻璃板-包被后，在蒸馏水中洗涤-之后，在80。C下用蒸馏水中的1%SDS中温育IO分钟-在蒸馏水中洗涤。在空气中千燥样品并确定5jd水滴的接触角(以度表示)。在DataphysicsContactAngleSystemOCA15+，软件SCA20.2.0.(2002年11月)装置上测量接触角。按照厂商说明书进行测量。未处理的玻璃产生30±5。的接触角；使用实施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包被的玻璃产生75±5°°的接触角。将序列名称分配给序列列表中的DNA和多肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1.通用结构式(I)的多肽Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm(I)其中X是20种天然发生的氨基酸中的任一种，n和m是0和500之间的数目，C是半胱氨酸，条件是缩写为Xn或Xm的肽序列中的至少一个是长度至少为20个氨基酸，天然不与疏水蛋白相连的肽序列，所述多肽在包被玻璃表面后改变接触角至少20°。2.权利要求l的多肽，其中所述结构式(I)包括I类疏水蛋白.3.权利要求1的多肽，其中所述结构式(I)包括选自dewA、rodA、sc3、hypA、hypB、basil、basf2的疏7jC蛋白，4.权利要求l的多肽，其中所述结构式(I)包括选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14的序列。5.权利要求l的多肽，其中Xn或Xm包含选自SEQIDNO:16、18的多欣序列。6.权利要求l的多肽，其中Xn或Xm是(扭S)4.10序列，7.权利要求l的多肽，其中所述结构式(I)包括选自SEQIDNO:20、22、24的多肽。8.编码权利要求1-7中任一项定义的多肽的核酸。9.制备权利要求l-7中任一项定义的多肽的方法，其通过在宿主生物中表达权利要求8定义的核酸，以及如果合适在纯化后分离由此获得的蛋白质。10.权利要求9的方法，其中所用的宿主生物是大肠杆菌。11.权利要求1-7中任一项定义的疏水蛋白用于包被表面的用途。全文摘要本发明公开了通用结构式(I)的多肽X<sub>n</sub>-C<sup>1</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>2</sup>-X<sub>0-5</sub>-C<sup>3</sup>-X<sub>1-100</sub>-C<sup>4</sup>-X<sub>1-100</sub>-C<sup>5</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>6</sup>-X<sub>0-5</sub>-C<sup>7</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>8</sup>-X<sub>m</sub>(I)，其制备及用途。文档编号C07K14/37GK101115768SQ200680004292公开日2008年1月30日申请日期2006年2月7日优先权日2005年2月7日发明者C·博尔施韦勒,H·巴尔格,H-G·勒迈尔,M·考罗什,T·萨布科夫斯基申请人:巴斯福股份公司