专利名称：：新型高等植物的利记博彩app以及高等植物的生长促进方法
技术领域：
：本发明涉及在叶绿体的类嚢体腔内具有细胞色素C6的新型高等植物的制作(作出)方法、以及使细胞色素C6存在于上述类嚢体腔中从而促进高等植物生长的方法、或促进高等植物的固碳能力的方法。
背景技术：
：以往，关于促进陆地植物等所谓高等植物生长的技术，有提高核酮糖二磷酸羧化酶等酶的活性等与光合作用暗反应(Calvin-Bensoncycle,卡尔文本森循环)相关的报告的例子，具体有通过导入相关酶基因使叶增大的报告例(Shigeoka等人.，Naturebiotechnology,19，965-969(2001))等。但是，在对各种高等植物应用方面上述技术的通用性非常欠缺。已知细胞色素C6是光合作用光反应中的电子传递蛋白质，本来只存在于一部分藻类(蓝藻类等)中，其电子传递能力极为优异(即氧化还原电位是高电位)(图l)。因此人们强烈希望开发出能够在各种高等植物的叶绿体中(具体来说在类嚢体腔内)中表达细胞色素c6并发挥其功能，从而提高光合作用能力的通用性优异的技术。作为在细胞内表达细胞色素c6的4支术，例如已知有F.P.Molina-Heredia等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，243，302-306(1998);T.Satoh等人.，FEBSlett.，531，543-547(2002);R.Gupta等人.，Nature,417,567-571(2002);D.R.Hickey等人.，Gene,105，73-81(1991)等文献中记载的技术。但是，这些技术均使用大肠杆菌、酵母或蓝藻等非高等植物的宿主细胞，其目的只是大量生产上述细胞色素C6或与其类似的蛋白质或进行功能分析，其包含在以往本领域技术人员通常进行的基因表达方法中。在高等植物中，关于使细胞色素C6发挥光合作用光反应的电子传递体功能，也就是说，使细胞色素C6存在于高等植物细胞内的叶绿体中的类嚢体腔内的成功的例子，目前完全未见，被认为是极为困难的
发明内容本发明要解决的课题在于提供在叶绿体的类嚢体腔内具有细胞色素C6的新型高等植物的利记博彩app，进而提供促进高等植物生长的方法，促进选自ATP、NADPH、淀粉和蛋白质中的至少一种的合成的方法，以及促进固碳的方法。本发明人为解决上述课题进行了深入的研究。结果发现，如果将附加有特定信号肽的细胞色素C6蛋白质的基因导入高等植物的基因组DNA中并使其表达，则可以使以往被认为不可能的细胞色素"向叶绿体被膜内和类嚢体膜内的转运(通过)成为可能，从而完成了本发明。即，本发明如下(1)在叶绿体类嚢体腔内具有细胞色素C6的高等植物的利记博彩app，其特征在于将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中，其中所述融合蛋白是在细胞色素C6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。(2)高等植物的生长促进方法，其特征在于将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中并使其表达，使细胞色素C6存在于叶绿体的类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素c6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。(3)促进高等植物的选自ATP、NADPH、淀粉和蛋白质中的至少一种的合成的方法，其特征在于将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中并使其表达，使细胞色素C6存在于叶绿体的类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素C6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。(4)促进高等植物固碳的方法，其特征在于将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中并使其表达，使细胞色素"存在于叶绿体的类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素"蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。上述(l)-(4)的方法中，上述融合蛋白可以是以下的(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白质。(a)含有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白质(b)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜的能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDNO,2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。(C)含有下述氨基酸序列，且具有电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。(d)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力，以及电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列和相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列分别有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。上述(l)-(4)的方法中，上述基因可以是含有以下(a)或(b)的DNA的基因。(a)含有SEQIDNO.l所示碱基序列的DNA(b)在严谨条件下与含有互补碱基序列的DNA杂交的DNA，且是编码具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力、以及电子传递能力的蛋白质的DNA，其中所述互补碱基序列是与含有SEQIDNO.1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列。(5)在细胞色素C6蛋白质上附加50-80个氨基酸残基的信号肽而成的融合蛋白。上述(S)的融合蛋白可以是以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白质。(a)含有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的蛋白质(b)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列(c)含有下述氨基酸序列，且具有电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列是SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述细胞色素Q蛋白质的氨基酸序列有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列(d)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力，以及电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列和相当于上述细胞色素"蛋白质的氨基酸序列分别有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。(6)编码上述(5)的融合蛋白的基因。(7)含有以下(a)或(b)的DNA的基因。(a)含有SEQIDNO.l所示碱基序列的DNA(b)在严谨条件下与含有互补碱基序列的DNA杂交的DNA，且是编码具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力、以及电子传递能力的蛋白质的DNA，其中所述互补碱基序列是与含有SEQIDNO.l所示碱基序列的DNA互补的碱基序列。(8)含有上述(6)或(7)的基因的重组载体。(9)转化体，该转化体是将上述(8)的重组载体导入宿主而成。上述(9)的转化体可以是宿主为土壤杆菌的转化体。(10)转化高等植物，其中，上述(6)或(7)的基因被导入到植物基因组中。上述(10)的转化高等植物优选在植物细胞叶绿体类嚢体腔中具有细胞色素C"图l是表示叶绿体类嚢体膜的光合作用电子传递系统的图。图2是表示本发明的经由土壤杆菌的细胞色素"基因导入和植物内细胞色素C6表达方式的模式图。图3是表示蓝细菌和藻类与高等植物间电子传递系统的区别的图。图4是表示条斑紫菜(Porphyrayezoensis)细胞色素"的cDNA碱基序列以及推定的氨基酸序列的图。图5是表示通过PCR扩增条斑紫菜细胞色素C6基因的成熟蛋白质区的结果图。图6是表示在植物导入用细胞色素C6基因的构建中使用的pBluescriptIISK+A栽体的图。图7是表示来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的质体蓝素的信号肽和来自条斑紫菜的细胞色素C6成熟蛋白质区融合得到的基因碱基序列和推定的氨基酸序列的图。图8是表示通过三亲本杂交进行的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的转化法的模式图。图9是表示通过PCR确定导入到植物中的细胞色素C6基因的电泳结果图。(A)是使用基因组DNA作为模板时的结果，(B)是使用总RNA作为模板时的结果。图10是表示通过电泳确定在植物内表达的细胞色素C6的结果图。(A)是CBB染色的结果，(B)是与细胞色素c6抗体反应的蛋白质印迹结果。图ll是表示伴随生长天数的增加，野生型(O)和转化拟南芥(，)的高度的变化图。图的各数值表示平均土S.D.(标准偏差)(n-20)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图12是表示伴随生长天数的增加，野生型(0)和转化拟南芥(*)的根长的变化图。图表的各值表示平均土S.D.(标准偏差)(1^20)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图13是表示伴随生长天数的增加，野生型(O)和转化拟南芥(，)的叶的大小的变化图。图的各值表示平均土S.D.(标准偏差)(n-20)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图14是表示伴随生长天数的增加，野生型和转化拟南芥在光照射3小时后叶绿素含量变化的图。图的各值表示平均±S.D.(标准偏差)(11=8)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图15是表示伴随生长天数的增加，野生型和转化拟南芥在光照射3小时后ATP含量变化的图。图的各值表示平均土S.D.(标准偏差)(n-8)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图16是表示伴随生长天数的增加，野生型和转化拟南芥在光照射3小时后NADPH含量变化的图。图的各值表示平均±S.D.(标准偏差)(11=8)。星号(*)表示在5°/。显著水平下可见显著差异的值。图17是表示伴随生长天数的增加，野生型和转化拟南芥在光照射3小时后二氧化碳同化能力的变化图。图的各值表示平均±S.D.(标准偏差)(11=10)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图18是表示伴随生长天数的增加，野生型和转化拟南芥在光照射3小时后淀粉量的变化图。图的各值表示平均土S.D.(标准偏差)(n-10)。星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。图19是表示伴随生长天数的增加，野生型和转化拟南芥在光照射3小时后蛋白质量变化的图。图的各值表示平均±S.D.(标准偏差)(11=8).星号(*)表示在5%显著水平下可见显著差异的值。具体实施方式以下对本发明进行详细说明，但本发明的范围并不受限于这些说明，对于以下所列举的内容以外的内容，可以在不损害本发明宗旨的范围适当变更实施。本说明书包含本申请优先权主张的基础-日本特愿2005-27012号说明书整体。本说明书中所引用的全部现有技术文献、以及公开公报、专利公报及其它专利文献可作为参考引入本说明书中。1.本发明的概要本发明涉及将编码细胞色素C6与信号肽的融合蛋白的基因导入高等植物内，使发挥光合作用光反应电子传递体作用的细胞色素C6在高等植物细胞内的叶绿体类嚢体腔中表达，且发挥功能，由此促进高等植物生长的方法(图2)。根据本发明，高等植物细胞内的ATP、NADPH、淀粉和蛋白质的合成得到促进，与其相伴，将二氧化碳(C02)转换为碳水化合物的光合作用暗反应(固碳反应)也得到促进。本发明包含上述促进高等植物中ATP等的合成或固碳的方法，还包含可促进生长、促进ATP等的合成、以及促进固碳的高等植物的利记博彩app。通常，在光合作用光反应(光合作用电子传递反应)中，叶绿素的电子获得太阳光的能量，使类嚢体腔内(类嚢体膜中)的电子传递链依次转移，此时，叶绿素由水获得电子，使氧(02)游离，伴随上述电子传递反应，经由类嚢体膜吸收H+，并通过由此产生的质子的驱动力，在叶绿体基质内合成ATP。一系列反应的结果是入0+(与H+—起)接受高能量电子，合成NADPH。与此相对，在光合作用的暗反应(固碳反应)中，在光合作用光反应中合成的ATP和NADPH分别作为能量来源和还原力发挥作用，由此在叶绿体基质内和细胞质中，C02转化成碳水化合物。通过该固碳反应，在植物的叶等中合成蔗糖。蔗糖被转运到其它组织中，作为各种有机分子的合成材料、继而作为植物自身生长所需的能量来源使用。通常，高等植物的光合作用光反应的电子传递体(电子传递蛋白)是质体蓝素(PC)，关于电子传递能力(氧化还原电位的高低)，已知作为藻类的电子传递体的细胞色素C6明显优异(图3)。因此，以往为了使该细胞色素"在高等植物内表达或发挥功能，从而促进光合作用光反应和暗反应，作了各种尝试。但是，上述尝试在实际应用时极为困难，目前尚未有成功的例子。高等植物中，为了使基于细胞内的基因组信息而表达的蛋白质发挥光合作用光反应电子传递体的功能，存在于类嚢体腔中是必须条件。为此，通常需要通过"叶绿体被膜"和"类嚢体膜"两种膜。这一点是细胞色素C6在高等植物中表达功能极为困难的主要原因。因此，本发明人通过基因重组技术，将细胞色素C6基因导入高等植物的基因组中时，在构建了预先附加有信号肽序列的基因的基础上进行上述导入，使细胞色素C6蛋白质以附加有特定的信号肽(特定长度或特定氨基酸序列的信号肽)的融合蛋白的形式进行表达。结果，导入该基因而制作的植物体中，可见在类嚢体腔中有细胞色素C6蛋白质(没有信号肽)的存在，结果显示，表达的融合蛋白通过其信号肽的作用，可通过上述两种膜，从而完成了本发明。(1)PYC6基因导入系统的研究目前已知PYC6的氧化还原电位是高电位，另外，该PYC6基因序列已经解明。本发明中，首先将PYC6基因连接到双元载体("^于U^^夕夕^)上，制备转化用土壤杆菌。拟南芥(Arabidopsisthaliana)在播种后进行低温处理，然后在长日照条件下生长，在抽苔(抽台)阶段通过减压浸润进行转化。接着对所得转化物进行基因导入和表达的分析，以从植物体提取的基因组DNA和RNA作为模板，分别进行PCR、RT-PCR。结果，可见PYC6基因的扩增，通过DNA测序仪确认该碱基序列与PYC6基因相同。接着，为了分析转化体中确认的PYC6基因是否作为蛋白质表达，从植物体提取叶绿体蛋白质级分，进行电泳，然后进行蛋白质印迹分析。结果确认了PYC6蛋白质的表达。另外，对所得转化体中的PYC6蛋白质的N末端氨基酸序列进行分析，结果，与导入的PYC6氨基酸序列(PIRaccessionNo.:JC5849)—致。该结果表明，在高等植物A.thaliana内成功地表达了来自藻类的cytc6(PYC6)。(2)PYC6导入对植物体的影响如后述实施例所示，观察导入PYC6的植物的生长，发现叶的大小比野生型(WT)增大约1.2-1.3倍，高度增大约1.5倍。导入PYC6的植物在生长初期阶段与WT比较，生长速度提高。对导入PYC6的植物中的叶绿素量进行测定，结果为WT的大约1.1-1.2倍。该通过导入PYC6而在植物体中观察到的现象的原因推测可能是由于利用了作为光反应最终产物的能量物质，光合作用的反应整体活化。为此，通过萤光素■萤光素酶法对导入PYC6的植物的ATP量进行测定，结果与WT比较，约增大1.7倍。这被认为是由于除了在拟南芥(A.thaliana)中发挥功能的质体蓝素之外，红藻CytC6作为新的电子传递体发挥了功能，由此光反应的电子传递被活化，其最终产物ATP量增加，并且植物整体的生长被活化。该融合蛋白通过上述两种膜时，在通过第一膜(叶绿体被膜)时使用了信号肽的一部分，在通过第二膜(类嚢体膜)时使用了其余的部分，分别使用后脱离，PYC6最终以没有信号肽的状态转运到类嚢体腔内。该转运的PYC6蛋白质在该类嚢体腔内与血红素(、厶)(血红素c)结合，且通过折叠，形成可发挥电子传递体功能的细胞色素C6。2.新型高等植物的利记博彩app本发明的利记博彩app如上所述，是在叶绿体的类嚢体腔内具有细胞色素C6的新型高等植物的利记博彩app，该方法的特征在于将编码融合蛋白的基因导入到高等植物的基因组中，其中所述融合蛋白是细胞色素"蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。(1)作为制作对象的高等植物可在本发明的利记博彩app中使用的高等植物、即可转化为在叶绿体的类嚢体腔内具有细胞色素C6的高等植物并没有限定，例如可以是以下高等植物。本发明中，作为对象的植物是指植物整体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等)或植物培养细胞(包含愈伤组织等的组织培养)的任意一种。转化使用的植物包括C3、C4、CAM植物和它们的中间植物等，例如有属于十字花科、茄科、禾本科、豆科、藜科、蔷薇科、菊科、百合科、石竹科、葫芦科、旋花科、苋科、凤梨科、仙人掌科和声荟科等的植物(包含果实、蔬菜、花卉等)(参照下述)，但并不限于这些植物。[C3植物十字花科拟南芥(Arabidopsisthaliana)、萝卜(Raphanus)等.茄科烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum)等.禾本科水稻(Oryzasativa)、玉米(zeamays)、小麦(Triticun)等豆科大豆(Glycinemax)、豌豆(Pisum)等-藜科菠菜(Spinacia)等.蔷薇科山樱(Prunus)、蔷薇(Rosa)等菊科一年蓬(飞蓬属)、蒲公英(Taraxacun)等-葫芦科南瓜(Cucurdida)、黄瓜(Cucumis)等-旋花科红薯(Ipomea)等-兰科羽蝶兰(Poneorchis)等[C4植物禾本科玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、谷子(Setariaitarica)等苋科尾穗苋(Amaranthaceae)等[CAM植物凤梨科菠萝(Ananascomosus)等.仙人掌科翠冠玉(，7-—廿)(Lophophoradifusa)、仙人掌属(Opuntiaspp.)等，荟科木立，荟(Aloearborescens)、芦荟(Aloevera)等[C3-C4中间植物-蕃杏科轮生粟米草(Mollugoverticillata)等禾本科黍子(Panicummilioides)等其中，作为本发明的利记博彩app的效果，从可获得促进生长效果高的植物考虑，例如对于市场性高的植物本发明的利用价值高，具体优选列举食叶植物(菠菜、巻心菜等)、赏花植物(蔷薇、蝴蝶兰等)、食茎植物(马铃薯、藕等)、食根植物(牛蒡、萝卜等)、谷物(水稻、小麦等)、果实植物(菠萝、葡萄等)、观赏植物(松树、枫树等)、木材(杉树、柏树等)等。(2)融合蛋白本发明的利记博彩app中，向高等植物的基因组中导入编码特定融合蛋白的基因，该融合蛋白是在细胞色素C6蛋白质上附加有特定长度的信号肽的融合蛋白，这是非常重要的。对于上述融合蛋白，信号肽的长度为50-80个氨基酸残基是重要的。这样，由于信号肽足够长，因此细胞色素C6蛋白质叶绿体被膜和类嚢体膜均可通过。信号肽的序列通过由高等植物进行基因克隆来确定。上述融合蛋白中的信号肽通常优选附加在细胞色素C6蛋白质的N末端。本发明中，上述融合蛋白例如优选为以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白质。(a)含有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的蛋白质(b)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDNO.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列(c)含有下述氨基酸序列，且具有电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDNO,2所示氨基酸序列中的相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列(d)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力，以及电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列和相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列分别有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列上述(a)的蛋白质如SEQIDN0.2所示，是共含有157个氨基酸的蛋白质，该157个氨基酸是在含有构成细胞色素C6蛋白质的85个氨基酸(SEQIDN0.6)的序列的N末端一侧附加(连接)含有构成信号肽的72个氨基酸(SEQIDN0.4)的序列而成的；也可以是含有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的融合蛋白。信号肽并不限于上述72个。这里，对细胞色素C6蛋白质的来源没有特别限定，可以使用红藻(Porphyrayezoensis,条斑紫菜)、蓝藻、褐藻、硅藻和绿藻等，优选来自红藻(P.yezoensis)的蛋白质。来自P.yezoensis的细胞色素c^蛋白质的氨基酸序列是公知的(PIRaccessionNo.:JC5849)，可通过数据库检索获得。上述(b)的蛋白质只要是含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜的能力即可，没有限定，所述氨基酸序列为构成上述(a)的蛋白质的全部氨基酸序列中的相当于上述信号肽的72个氨基酸序列(SEQIDNO.4)有l或多个(例如l个-10个左右，优选l个-5个左右)氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。上述(b)的蛋白质与上述(a)的蛋白质同样，是具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力的蛋白质，这点是^f艮重要的，因此优选第53号-第72号的氨基酸等被认为是对通过上述叶绿体被膜或类嚢体膜重要的部分的氨基酸序列不被从上述(a)蛋白质的氨基酸序列中突变置换。上述(c)的蛋白质只要是含有下述氨基酸序列、且具有(光合作用光反应)电子传递能力的蛋白质即可，没有限定，所述氨基酸序列为构成上述(a)的蛋白质的全部氨基酸序列中的相当于上述细胞色素C6蛋白质的85个氨基酸序列(SEQIDNO.2)有l个或多个(例如l个-10个左右，优选l个-5个左右)氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。这里，上述"具有电子传递能力的蛋白质"在本发明中是指含有氨基酸序列的氨基酸序列的i白;，是指在与血红"^(血红素，)结合后具有电子传递能力的蛋白质。上述(C)的蛋白质与细胞色素C6蛋白质同样，是具有电子传递能力的蛋白质，这是非常重要的，因此，优选例如第14号-第18号氨基酸、以及第47号-第60号氨基酸等被认为对于在高等植物的光合作用光反应中发挥电子传递功能而言重要的部分的氨基酸序列不被从上述(a)蛋白质的氨基酸序列中突变置换。上迷(d)的蛋白质只要是含有下述氨基酸序列，且有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜的能力，以及(光合作用光反应)电子传递能力即可，没有限定，所述氨基酸序列为构成上述(a)的蛋白质的全部氨基酸序列中的相当于上述信号肽的72个氨基酸序列(SEQIDN0.4)有1个或多个(例如1个-10个左右、优选l个-5个左右)氨基酸缺失、置换或附加，而且相当于上述细胞色素C6蛋白质的85个氨基酸序列(SEQIDN0.6)有l个或多个(例如1个-10个左右、优选l个-5个左右)氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。这里，上述"具有电子传递能力的蛋白质"的含义与上述(c)蛋白质的情形相同。上迷(d)的蛋白质与上述(a)的蛋白质同样，是具有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜能力的蛋白质，除此之外，还与细胞色素"蛋白质同样，是具有电子传递能力的蛋白质，这也是非常重要的，因此，优选例如第53号-第72号的氨基酸等被认为对通过上述叶绿体被膜或类嚢体膜而言重要的部分的氨基酸序列、第14号-第18号氨基酸和笫47号-第60号氨基酸等被认为对在高等植物的光合作用光反应中发挥电子传递体功能而言重要的氨基酸序列不被从上述(a)蛋白质的氨基酸序列中突变置换。可通过立体结构分析和氧化还原电位的测定来确认上述(c)和(d)的蛋白质是否具有电子传递能力，以及具有电子传递能力时进行测定。细胞色素C6的氧化还原电位大约是350-370mV左右。编码上述SEQIDN0.2所示氨基酸序列有l或多个氨基酸缺失、插入或附加的氨基酸序列的多核苷酸可按照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989))、"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons(1987-1997))、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763-6)等记载的位点专一性诱变法等方法制备。制备编码上述氨基酸缺失、置换或附加等的突变型的基因时，例如可通过Kunkel法或缺口双链体法等公知的方法，4吏用利用位点专一性诱变法的突变导入用试剂盒、例如QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(只h歹夕司制)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(47匕*卜口^工7公司制)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan國SuperExpressKm等夕力，,《4才公司制)等进行。(3)基因本发明的利记博彩app中，向高等植物的基因组中导入的基因是编码上述融合蛋白的基因，这是很重要的。本发明中，上述基因例如优选是含有下述(a)或(b)的DNA的基因。要说明的是，以下的(a)和(b)的DNA均是上述融合蛋白的结构基因(即，编码信号肽的基因与细胞色素C6或与其具有同样的电子传递能力的蛋白质的结构基因相连接而成的基因)，含有这些DNA的基因可以只含有这些DNA，还可以含有这些DNA作为一部分，除此之外，还可以含有该融合蛋白的结构基因表达所必须的公知的碱基序列(转录启动子、SD序列、Kozak^列、终止子等)，没有限定。编码细胞色素C6的碱基序列例如在日本DNA数据库(DDBJ)中已经公开发表，为公知的(accessionnumber:AB40818)。(a)含有SEQIDNO.l所示碱基序列的DNA(b)在严谨条件下与含有互补碱基序列的DNA杂交的DNA,且是编码具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力、以及电子传递能力的蛋白质的DNA，其中所述互补碱基序列是与含有SEQIDNO.1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列。上述(b)的DNA可使用含有上述(a)的DNA或与其互补的碱基序列的DNA、或者它们的片断作为探针，实施集落杂交、噬菌斑杂交、以及DNA印迹等公知的杂交方法，由cDNA文库或基因组文库获得。文库可以利用按照z〉知方法所制备的文库，也可以利用市售的cDNA文库或基因组文库，没有限定。编码信号肽部分的碱基序列(SEQIDN0.3)、编码细月包色素C6的碱基序列(SEQIDN0.5)两者或其中一方的一部分可以发生突变。杂交方法的详细步骤可适当参照MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))等，实施杂交法中，"严谨条件"是指杂交后洗涤时的条件，是指緩冲液的盐浓度为15-750mM、温度为25-65*€，优选盐浓度为15-150mM、温度为45-55t:的条件。具体来说，可列举例如50mM、50t)等的条件。并且，除上述盐浓度、温度等条件之外，还可以考虑探针浓度、探针长度、反应时间等各条件，适当设定获得上述(b)的DNA的条件。上述(b)的DNA可按照本领域技术人员所公知的方法，使用适当的片断制备探针，使用该探针，通过集落杂交、噬菌斑杂交、DNA印迹等公知的杂交方法，由cDNA文库和基因组文库获得。上述杂交中，严谨的条件例如可列举lxSSC-2xSSC、0.10/o-0.5。/。SDS以及30lC-80t:的条件，更具体地说可列举以下条件在60-68X:下进行30分钟以上的预杂交，然后添加探针，在68C保持1小时以上，形成杂种，然后在2xSSC、0.:r/。SDS中、在室温下洗涤5-15分钟，进行l-2次。杂交的DNA优选为与上述(a)的DNA碱基序列至少具有70%以上同源性的碱基序列，更优选80%以上，进一步优选90/。以上，更进一步优选95%以上。上述(b)的DNA是编码具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力以及电子传递能力的蛋白质的DNA，这是很重要的，因此在考虑翻译后的氨基酸序列时，优选具有下述碱基序列使例如第53号-第72号氨基酸等被认为对通过上述叶绿体被膜或类嚢体膜而言重要的部分的氨基酸序列、或者第14号-第18号氨基酸以及第47号-第60号氨基酸等被认为是对在高等植物的光合作用光反应中发挥电子传递功能重要的部分的氨基酸序列没有被从上述(a)的蛋白质的氨基酸序列中突变置换的碱基序列。上述(b)的DNA例如并不与上述(a)的DNA完全相同，可优选列举将其中的第103号的碱基由"T(胸腺嘧啶)"置换为"A(腺嘌呤)"，所翻译的氨基酸由"Ser(丝氨酸)"变异为"Thr(苏氨酸)"的DNA;第216号的碱基由"C(胞嘧啶)"置换为"T(胸腺嘧啶)"，但所翻译的氨基酸不变化的DNA;以及将这些碱基置换组合而变异的DNA等。本发明中，上述基因是在高等植物中表达，因此与氨基酸对应的密码子必须含有在转录后显示通常的植物中使用的密码子(优选使用频率高的密码子)的DNA。(4)基因的导入方法不改变高等植物的其它形态，向其基因组中导入编码上述融合蛋白的基因(目标基因)，制作新型高等植物(转化高等植物)，对该方法没有特别限定，可以任意采用土壤杆菌法、电穿孔法、以及基因枪法等公知的基因重组技术。例如优选采用导入了含有目标基因的双元载体的土壤杆菌属细菌(根癌种病菌(根頭力s厶種病菌))的减压浸润法等。以下进行详细说明。(i)重组栽体对含有编码上述融合蛋白的基因的重组栽体没有限定，优选可作为上述双元载体使用的栽体。具体来说，优选将要整合入植物基因组中的目标基因(取代GUS基因)插入到具有因Vir区基因的作用而切取的T-DNA区的载体的该T-DNA区中，从而构建的载体。上述具有T-DNA区的载体优选pBI121载体(Clontech公司制；以卡那霉素耐性基因作为选择标志(選択7—力一)，在35S启动子的下游含有GUS基因)、pBI101栽体(Clontech公司制；以卡那霉素耐性基因作为选择标志，含有GUS基因)等。另外，虽然不能用于减压浸润法，但向适合宿主细胞的公知的表达载体中插入目标基因而构建的重组栽体也包含在本发明的重组载体中。还可根据需要，通过PCR等，在该基因的上游附加转录启动子或SD序列(宿主为原核细胞时)或Kozak序列(宿主为真核细胞时)，在下游附加终止子。上述转录启动子等融合蛋白表达所必须的各要素可以含在目标基因中，原本含在表达载体中时也可以使用其，没有限定。上述重组栽体例如可以用于上述融合蛋白的大量生产等。这些各种重组载体的制备中，可以适当采用使用限制酶的方法、使用拓朴异构酶的方法等公知的基因重组技术和条件等进行。(ii)导入重组栽体而成的转化体对导入重组栽体的宿主没有限定，最终进行减压浸润法时，作为导入双元载体的宿主，可使用土壤杆菌属细菌(Agrobacteriumtumefaciens，根癌土壤杆菌等)。使用土壤杆菌属细菌时，通常使用预先进行了转化的菌体(土壤杆菌属细菌的转化体)，即，该细菌原本所具有的Ti质粒上的T-DNA区中的癌基因被破坏或者被除去等。除此之外，作为重组栽体，导入表达载体时，可以使用公知的宿主，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、霉菌、人或小鼠等各种动物细胞等。对宿主的转化方法没有限定，可以考虑宿主与重组栽体的组合，由公知的方法中适当选择实施。例如可优选实施电穿孔法、脂转染法、热休克法、PEG法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法等。所得转化体中，实际使用的宿主与重组载体中所含有的EBNA1突变体基因的密码子型的宿主可以一致，也可以不同，没有限定。(iii)高等植物的转化和转化高等植物对向高等植物的基因组中导入目标基因，制备转化高等植物的方法没有限定，优选上述减压浸润法。另外，进行转化的植物体的状态优选使用成体或愈伤组织。通过减压浸润法进行高等植物的转化的方法，具体如下(a)使含有重组载体(双元栽体)的转化细菌(土壤杆菌属细菌的转化体)感染高等植物的叶片，其中所述重组载体中插入有编码上述融合蛋白的基因；(b)在含有卡那霉素等抗生素的选择性培养基中培养；(c)形成不定芽愈伤组织，栽培，得到转化高等植物。进行减压浸润法时，各处理步骤的方法和处理条件等都可由公知的范围适当选择进行，没有限定。上述所得到的转化高等植物中，其基因组中导入了编码上述融合蛋白的基因。以该基因为基础表达的融合蛋白具有上述信号肽，具有通过植物细胞中的叶绿体被膜和类囊体膜的能力。从而，所得转化高等植物在类嚢体腔内具有细胞色素"(优选作为光合作用光反应的电子传递体的细胞色素C6)。所得转化高等植物中，作为光合作用光反应的电子传递体，不仅质体蓝素(PC)，细胞色素C6也发挥该功能，有效地实现了促进生长。转化高等植物成体的大小(高度、根长、叶的大小等)没有限定，与野生型相比，例如可以是l.l倍以上，优选1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上(例如约1.9倍)。转化高等植物中，与促进生长的效果同样，也可得到使各细胞中各种分子数增加的效果。例如叶绿素分子的量与野生型相比例如约为l.l倍以上，优选1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上(例如约1.6倍)，光合作用能力进一步提高，但并不限于此。所得转化高等植物中，光合作用效率提高，对其产物ATP的合成量没有限定，与野生型相比例如为l.l倍以上，优选1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上(例如约1.7倍)，同样，对NADPH的合成量没有限定，与野生型相比例如为l.l倍以上，优选1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上(例如约1.7倍)。所得转化高等植物中，由于ATP和NADPH的合成量增加，它们发挥了能量源或还原力的作用，因此光合作用暗反应效率也提高.例如，转化高等植物中，将二氧化碳(C02)转换为碳水化合物的固碳能力与野生型的相比例如为l.l倍以上，优选1.2倍以上，进一步优选1.4倍或以上。并且，所得转化高等植物中，光合作用的光反应、暗反应效率得到促进，由此蛋白质合成效率也提高。例如，转化高等植物的蛋白质含量例如为l.l倍以上，优选1.2倍以上，进一步优选1.5倍以上。也有望获得硫酸和硝酸代谢或者各种氨基酸合成、脂类合成量、色素以及花的增加等。所得转化高等植物中，优选至少具有一种上述各种作用效果，更优选其有两种以上，进一步优选具有所有效果。3.高等植物的生长促进方法，促进ATP、NADPH、淀粉和蛋白质合成的方法以及促进固碳的方法如上所述，在所得转化高等植物中，可见(i)促进生长、(ii)促进ATP、NADPH、淀粉和蛋白质的合成、以及(iii)促进固碳的效果。因此，本发明也包含高等植物生长促进方法，促进高等植物的选自ATP、NADPH、淀粉和蛋白质中的至少一种的合成的方法，以及高等植物的固碳促进方法。这些方法的具体特征是将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中使其表达，使细胞色素C6存在于叶绿体的类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素C6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。这些方法中，对于融合蛋白、编码该蛋白质的基因、该基因向高等植物基因组中导入的方法、以及所得转化高等植物的各种作用效果等均与上述本发明的高等植物的利记博彩app中的说明和列举等同样。以下给出实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不受其限定。[实施例l]导入用细胞色素^基因和植物表达用载体的构建(1)来自条斑紫菜的细胞色素C6成熟蛋白质区基因的制备本实施例中，通过克隆得到来自条斑紫菜的细胞色素C6基因，与载体连接，制备质粒.以该质粒为模板，扩增本说明中的目标DNA—来自条斑紫菜的细胞色素"成熟蛋白质区基因。然后进行电泳，通过凝胶提取，提取目标基因，然后用限制酶(SacI，Pstl)消化，制备基因。反应液按照以下的组成，在0.5ml辅助PCR用离心管(777卜PCR用于二一7，)中制备。模板(质粒DNA(细胞色素Ce全长))1.0"I引物(1)(10pmol/〃D1.0引物(2)(10pmol/"l)1.010xExTaq緩冲液(1^2、1115)(1^2+浓度20mM)2.5"IdNTP混合物(各2.5mM)2.0"IDMSO1.25//1灭菌水16.1"1TaKaRaExTaq(5U///I)0.15"1总体积25.0#1引物(1):PYC6-Oter迈SacI(lOpmol/jil)(30迈er，GC-Cont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.7)引物(2):Cyt-SD(10pmol/pl)(29迈er，GOCont,:48.2%)5'-GCGGGGAGAGGTTAAATTGAAGAAGAAGG-3'(SEQIDNo.8)在上述反应液中铺15jil的矿物油。然后用PTC-10()TM可控热循环控制仪(ProgrammableThermalController)进4亍反应。反应是以94"C48秒、62t)48秒、72X:i分24秒的反应为一个循环，进行31个循环。反应终止后，通过2y。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向20nl所得PCR产物中加入4fil凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTBE)，在100V下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。从2。/。(w/v)琼脂糖凝胶中切取被认为是目标DNA的条带，尽量切细。然后将该凝胶装入AmiconUltrafree(注册商标)DA中，以7，300rpm、4"C离心10分钟。离心后，取下UltrafreeMC(上侧的柱部分)，向洗脱出来的溶液中加入等量的TE-饱和苯盼，使用涡流搅拌器(求少亍？夕只)进行充分搅拌。然后以14,000rpm、4X:离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5Y。乙醇2vo1.。充分搅拌，然后在-20t:下放置30分钟。然后以14，000rpm、4"C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500pl75%乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4"C离心5分钟，弃去上清。将沉淀风干一定程度，然后溶解于50jilTE中。接着，按照下述所示组成，在1.5ml微量离心管中制备样品，通过在37X:下温育120分钟，用限制酶SacI进行消化。凝胶提取后样品5.0#110XL緩冲液2.0/ilSac10.5灭菌水12.5//I总体积20.0jUl向温育后的样品溶液中加入等量的TE-饱和苯酚，使用涡流搅拌器充分搅拌。然后以14，000rpm、4TC离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌后，在-20TC下放置30分钟。然后以14,000rpm、4"C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500jil75%乙醇，充分洗涤沉淀。再以14,000rpm、4*€离心5分钟，弃去上清。将沉淀风干一定程度，然后溶解于20nl的TE中。接着，按照以下所示组成，在1.5ml微量离心管中制备样品，通过在37t:下温育120分钟，用限制酶PstI进行消化。限制酶消化后样品5.0AM10XH緩冲液2.0Pstl0.5/il灭菌水12.5jul总体积20.0/iI反应终止后，通过2。/o(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向20nl所得PCR产物中加入4nl凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTBE)，在IOOV下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光革的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。然后，从2。/o(w/v)琼脂糖凝胶中切取被认为是目标DNA的条带，尽量切细。然后将该凝胶装入AmiconUltrafree(注册商标)DA中，以7，300rpm、4t:离心10分钟。离心后，取下UltrafreeMC(上侧的柱部分)，向洗脱出来的溶液中加入等量的TE-饱和苯酚，使用涡流搅拌器进行充分搅拌。然后以14,000rpm、4"C离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌，然后在-20C下放置30分钟。然后以14，000rpm、4t:离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500jil75%乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4TC离心5分钟，弃去上清。将沉淀进行一定程度的风干，然后溶解于20jilTE中。结果如下所示。以插入了来自条斑紫菜的细胞色素C6基因(全长)的质粒作为模板，通过PCR扩增细胞色素C6成熟蛋白质区(PYC6)基因(图4)。然后将PCR产物进行2。/c(w/v)琼脂糖凝胶(TBE)电泳，在357bp附近可见单一的条带(图5)。该条带可认为是PYC6基因.将该PYC6基因用两种限制酶(SacI、Pstl)消化，进行2%(w/v)琼脂糖凝胶(TBE)电泳，将被认为是PYC6基因(保有SacI、PstI位点)的265bp附近的条带从凝胶中提取，用苯酚提取，用乙醇进行沉淀，得到保有SacI、Pstl位点的PYC6基因。(2)向细胞色素C6附加通过叶绿体被膜和类嚢体膜的肽的基因本项中，是将进行了BamHI和PstI限制酶处理和脱磷酸化(BAP处理)的通过叶绿体被膜和类嚢体膜的肽的基因、与进行了SacI和PstI限制酶处理的来自条斑紫菜的细胞色素C6成熟蛋白质区的基因进行连接。然后与克隆载体(pBluescript(注册商标)IISK+)连接，进行亚克隆，确认植物导入用细胞色素C6(sp+PYC6)基因的碱基序列。DNA测序时使用下述通用引物。FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2pmol/iil)5'-GGCCAGGGTTTTGCGAGTCACGAC-3'(SEQIDNo.9)FITC化通用正向引物(M13Rv引物)(2pmol/pl)5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(SEQIDNo.10)(2-1)植物导入用细胞色素C6基因的制备按照以下组成制备反应液。通过叶绿体被膜和类囊体膜的肽的基因(经BAP处理)4.0JLMP.yezoensis细胞色素ce成熟蛋白质区基因4.0/iI10x连接緩冲液2.0〃I2mg/mlBSA溶液2,5〃I酶溶液(T4DNA连接酶)1.0〃I灭菌水6.5〃I总体积20.0jul将制备的反应液在低温恒温槽(161C)下温育过夜，进行连接反应。接着，向该溶液中加入碱性磷酸酶，进行脱磷酸化。按照以下组成，在1.5ml微量离心管中制备样品，在37X:下温育3小时，通过细菌碱性磷酸酶进行脱磷酸化处理。连接后样品10.0/il10xBAPBuffer10.0#1细菌碱性裤酸酶(BAP)2.5jUl灭菌水77.5/il总体积100.0jUl向温育后的样品溶液中加入等量的PE-饱和苯酚，用涡流搅拌器充分搅拌。然后以14，000rpm、4t:离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌，在-20t:下放置30分钟。然后以14，000rpm、4"C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500nl75%乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4"C离心5分钟，弃去上清，将沉淀风干一定程度，然后溶解于20fil的TE中。(2-2)克隆载体pBluescript(注册商标)IISK+的制备按照以下组成，在1.5ml微量离心管中制备样品，通过在37C下温育5小时，用限制酶SacI进行消化。pBluescriptG主册商标)IISK+20//110xL緩冲液5//1Sac12/iI灭菌水23//I总体积50;Ul向温育后的样品溶液中加入等量的TE-饱和苯酚，用涡流搅拌器充分搅拌。然后以14，000rpm、4t:离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌后，在-20"C下放置30分钟。然后以14，000rpm、4t:离心10分钟，弃去上清，向沉淀中加入500nl75。/。乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4X:离心5分钟，弃去上清。将沉淀风干一定程度，然后溶解于20jU的TE中。接着，按照以下组成，在1.5ml微量离心管中制备样品，通过在37t:下温育5小时，用限制酶BamHI进行消化。限制酶消化后样品20A<l10xH緩冲液5julBamH12jUl灭菌水23jul总体积50//1反应终止后，通过1.5%(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向20jd所得PCR产物中加入4nl凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTAE)，在IOOV下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。然后，从1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中切除认为是目标DNA的条带，将100jig凝胶换算成100jil，向其中加入3vo1.Nal溶液，充分搅拌，在55TC下温育5分钟，使凝胶溶解。向其中加入10nlGLASSMILK，在室温下剧烈搅拌15分钟，以14，000rpm、4t:离心5秒钟，回收沉淀。向该沉淀中加入300(AlNEWWASH,充分搅拌后，以14,000rpm、4t:离心5秒钟，回收沉淀。将该操作重复三次，使所得沉淀干燥，溶解于20nl灭菌水中。然后将溶液转移至0.5ml辅助PCR用离心管中，以14,000rpm、4t:离心30秒钟。将所得上清转移至新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5%乙醇2vol.,充分搅拌，然后在-20"C下放置30分钟，然后以14，000rpm、4"C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500^175%乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4t:离心5分钟，弃去上清。将沉淀风干一定程度，然后溶解于20jil的TE中，(2-3)植物导入用细胞色素C6基因的亚克隆细胞色素C6基因的亚克隆按照公知方法进行(Hanahan，D.，J.Mol.Biol"166(4)，557-580(1983).;中山广树等、乂《4才45久卜l^4^'7卜*11遣伝子解析O基礎:，秀润社，83-88(1996))。植物导入用基因和克隆载体按照以下组成制备。导入用细胞色素c6(BamH1,SacI消化后)(BAP处理)5〃1pBluescript(注册商标)11SK+(BamHI,Sac1消化后)5//110X连接緩沖液2/7l2mg/mlBSA溶液2.5#I酶溶液(T4DNA连接酶)11灭菌水4.5〃1总体积20VI将制备的反应液在低温恒温槽(i6x:)中温育过夜，进行连接反应。对大肠杆菌的转化如下进^f于。首先在冰上将150jil感受态细胞(DH5a)溶解一定程度，向其中緩慢加入4nl进行了连接的反应液，用移液器吸头的尖端轻轻搅拌混合，在冰上放置30分钟。放置结束后，在42t:下进行20秒钟的热休克。然后在冰上静置3分钟，在LB-Ampicillin-X-Gal-IPTG板上，按照Vector:Insert-l:l、1:3，使用接种环(=>>9一^棒)将100ji1、50|11菌体液分别涂抹在整个板上，在37C下培养过夜。(2-4)通过碱-SDS法制备质粒碱-SDS法按照公知的方法进行(Weiss.B，等人.，J.Biol.Chem.，243,4543-4555(1968)、Birnboim，H.C.，MethodsEnzymol.，100,243(1983))。即，向1.5ml微量离心管中分别注入1.5ml在3mlLB-氨苄青霉素液体培养基中以200rpm、37*C振荡培养16小时得到的菌体液，以6,000rpm、4"C离心10分钟，用吸气器吸引上清并除去。向沉淀(菌体)中加入100jd溶液I(50mM葡萄糖、25mMTris國盐酸(pH8.0)、10mMEDTA)，用涡流搅拌器充分搅拌，加入200fi1溶液II，轻轻地颠倒搅拌。在室温下放置5分钟后，再加入150(il溶液III(0.2NNaOH-l。/oSDS)，在冰上放置30分钟，然后加入IOOjil氯仿，以14，000rpm、4"C离心10分钟。将上清回收到新的管中，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，轻轻地颠倒搅拌，在室温下放置15分钟。然后加入5001170%乙醇，以14，000rpm、4"C离心10分钟，将所得沉淀用TOMYMICROVac干燥3-5分钟，溶解于20ji1TE中。为了确认在所得质粒中整合了目标DNA,按照下述组成，在1.5fi1微量离心管中制备样品，通过在37"C下温育120分钟，用限制酶SacI、BamHI进行消化。质粒DNA5.0/il10XL緩冲液2.0/ilSacI0.5AHBamHI0.5/il1mgAnlRNaseA0.5/il灭菌水11.5/il总体积20.0/il反应终止后，通过2y。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向10jil所得PCR产物中加入2fil凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTBE)，在IOOV下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。结果，只对整合了目标DNA的样品，从在3mlLB-氨千青霉素液体培养基中培养的残余的菌体液(1.5ml)中取100Hl，接种于5mlLB-氨苄青霉素液体培养基中，以200rpm、37C振荡培养16小时。(2-5)通过QIAGENSpinMiniprepKit制备质粒将在5mlLB-氨节青霉素液体培养基中培养的菌体液以6,000rpm、4"C离心10分钟，用吸气器吸引上清并除去。向沉淀(菌体)中加入试剂盒(QIAGENSpinMiniprepKit(250)(QIAGEN))中包含的緩冲液P1250ji1，使其充分混悬。QIAGENSpinMiniprepkit(250)(QIAGEN)中含有采集管(Collectiontube)、QIApr印Spin柱、缓冲液P1、緩冲液P2、緩冲液N3、緩冲液PB、緩冲液PE、緩冲液EB。向上述悬浮液中加入250fil緩冲液P2，轻轻地颠倒，搅拌使溶液均匀。再加入350jil緩冲液N3，轻轻地颠倒搅拌，以13，000rpm、4"C离心10分钟。将这里所得到的上清转移至预先设置于采集管的QIApr印Spin柱中，以13，000rpm、4"C离心1分钟。弃去积在采集管中的滤液，向QIAprepSpin柱中加入500jil的緩冲液PB，以13，000rpm、4"C离心1分钟，再次弃去滤液。再向QIAprepSpin柱中加入750jil緩冲液PE，以13，000rpm、4E离心1分钟，弃去滤液，再次以13，000rpm、4*C离心1分钟，只将QIAprepSpin柱转移至新的1.5ml微量离心管中，向QIAprepSpin柱的中央加入50[il緩冲液EB，在室温下放置l分钟，以13，000rpm、4t:离心l分钟，将该滤液作为质粒样品。为了确认所得质粒中整合了目标DNA，按照以下所示组成，在1.5ml微量离心管中制备样品，通过在37"C下温育120分钟，用限制酶SacI、BamHI进行消化。质粒DNA5.0//I10XL緩冲液2.0jUlSacl0.5/ilBamHI0.5jUl灭菌水12.0#1总体积20.0反应终止后，通过2。/。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向10jil所得PCR产物中加入2[il凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTBE)，在IOOV下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。这里，将整合了目标DNA并确认其单一性的DNA作为测序样品。(2-6)通过双脱氧法确定碱基序列碱基序列的确定使用自动测序仪，按照公知的方法(Sanger，F.，Sanger,F.，DeterminationofnucleotidesequenceinDNA.，Science,214，1205-1210(1981))确定。碱基序列确定后，《吏用分析软件GENETYX-MAC进行数据分析。(2-7)结果将进行了两种限制酶(BamHI、PstI)消化和脱磷酸化(BAP处理)的sp基因与进行了两种限制酶(SacI、Pst1)消化的PYC6基因连接，再次进行BAP处理，用苯酚提取，用乙醇沉淀，由此可以制备植物导入用细胞色素"(sp+PYC6)基因。为了确认该sp+PYC6基因的碱基序列，将克隆载体pBluescriptIISK+(图6)用两种限制酶(BamHI、SacI)消化，将sp+PYC6基因与其连接，进行亚克隆，然后通过双脱氧法进行测序，确定sp+PYC6基因的全部碱基序列474bp(图7)。使用GENETYX-MAC将测序结果与已知的sp基因与PYC6基因进行比较，除信号肽序列中第103号的T(胸腺嘧啶碱基)突变成A(腺嘌呤碱基)之外，其余完全一致。另外，附加到引物序列中的限制酶位点也得到确认(图7)。其中所确认的碱基的突变是将所编码的氨基酸由Ser变成Thr，但其性质和分子量均类似，由此导致的二级机构(a螺旋等)没有变化，对信号肽的通过膜的功能没有影响，因此可以将该样品(sp+PYC6)用于以后的实验。(3)植物导入用细胞色素C6表达载体的制备本实施例中，将确认了碱基序列的植物导入用细胞色素C6(sp+PYC6)基因插入表达栽体pBI121中，构建用于导入植物的细胞色素C6表达载体(pBICytc6)。(3-1)植物表达用载体pBI121的制备在1.5ml微量离心管中制备样品，使组成如下，通过在37t:温育5小时，用限制酶SacI进行消化。pB"2120jUl10XL緩冲液5#lSacI灭菌水23jWl总体积50#l向温育后的样品溶液中加入等量的PE-饱和苯酚，用涡流搅拌器充分搅拌。然后以14，000rpm、4"C离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)l/20vo1.、99.5。/o乙醇2voL。充分搅拌后，在-20"C下放置30分钟，然后以14，000rpm、4C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500fil75。/o乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4t:离心5分钟，弃去上清。将沉淀风干一定程度，然后溶解于20jil的TE中。接着，在1.5ml微量离心管中制备样品，使组成如下，通过在37匸温育5小时，用限制酶BamHI进行消化。限制酶消化后的样品20jul10xH緩沖液5/ilBamHI2#1灭菌水23/il总体积50/il反应终止后，通过1.5%(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向20jil所得PCR产物中加入4jil凝胶加样缓冲液，制成电泳样品。电泳是4吏用电泳緩沖液(lxTAE)，在IOOV下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。然后从1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中切除认为是目标DNA的条带，将IOOng凝胶换算成100向其中加入3vo1.Nal溶液，充分搅拌，在551C下温育5分钟，使凝胶溶解。向其中加入IOfilGLASSMILK，在室温下剧烈搅拌15分钟，以14,000rpm、4"C离心5秒钟，回收沉淀。向该沉淀中加入300piNEWWASH,充分搅拌，然后以14,000rpm、4TC离心5秒钟，回收沉淀。将该操作重复三次，干燥所得沉淀，溶解于20jil灭菌水中。然后将溶液转移至0.5ml辅助PCR用的离心管中，以14，000rpm、4X:离心30秒钟。将所得上清转移至新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌，然后在-20t:下放置30分钟。然后以14，000rpm、4"C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500^1175%乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14，000rpm、4"C离心5分钟，弃去上清。将沉淀风干一定程度，然后溶解于20jil的TE中。(3-2)植物表达用细胞色素C6表达载体(pBIcyt")的制备用如上制备的导入用细胞色素C6(sp+PYC6)基因制备反应液，使组成如下。sp+PYC6基因(BamHI,SacI消化后)(BAP处理)4.0j(iIpBI121(BamHI,Sac1消化后)8.0/yI10X连接緩沖液2.0AH2mg/mlBSA溶液2.5"I酶溶液(T4DNA连接酶)1.0jliI灭菌水2.5jul总体积20.0//I将制备的反应液在低温恒温槽中(161C)温育过夜，进行连接反应。结果如下所示。将确认了碱基序列的sp+PYC6基因(BamHI、Sacl消化、BAP处理过的)与用两种限制酶(BamHI、SacI)消化植物表达用栽体(pBI121)所得物质连接，制备植物导入用细胞色素C6表达载体(pBIcytc6)。[实施例2转化植物(导入细胞色素q的拟南芥)的制备(1)用于感染植物的根癌土壤杆菌的制备(1-1)导入细胞色素C6表达栽体(pBIcytC6)的大肠杆菌的制备本实施例中，将植物表达用载体(pBIcytC6)转化宿主大肠杆菌HB101,其中所述植物表达用栽体中插入了植物导入用细胞色素C6基因。然后选择几个集落，在3ml的LB-卡那霉素液体培养基上培养，通过碱-SDS法进行质粒的制备，确认载体的构建以及对宿主大肠杆菌HB101转化的有无。如下对大肠杆菌进行转化。首先，在水上将150jil的感受态细胞(HB101)溶解一定程度，向其中緩慢加入连接了的反应液4jil，用移液器吸头的先端轻轻搅拌混合，在冰上放置30分钟。放置结束后，在42X:下进行20秒钟的热休克。然后在冰上静置3分钟，使用接种环，在LB-卡那霉素上，分别将100ji1、50nl菌体液涂抹在整个板上，在37"C下培养过夜。培养后，随机挑取20个克隆转化体(集落)，将该集落接种于3mlLB-卡那霉素培养基中，以200rpm、37t:振荡培养16小时。将各1.5ml培养的菌体液分注到1.5ml微量离心管中，以6，000rpm、4C离心10分钟，用吸气器吸引上清并除去。向沉淀(菌体)中加入100nl溶液I(同前)，用涡流搅拌装置充分搅拌，加入200jil溶液II(0.2NaOH-l°/。SDS)，轻轻地颠倒搅拌。在室温下放置5分钟后，再加入150jil溶液III(同前)，在水上放置30分钟，然后加入IOOjil的氯仿，以14,000rpm、4"C离心10分钟。回收上清，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，轻轻地颠倒搅拌，在室温下放置15分钟。然后加入500jd的70。/。乙醇，以14，000rpm、4"C离心10分钟，将所得沉淀用TOMYMICROVac干燥3-5分钟，溶解于20nlTE中。为了确认所得质粒中整合了目标DNA，在1.5ml微量离心管中制备样品，使组成如下，通过在37"C下温育120分钟，用限制酶BamHI和SacI进行消化。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>反应终止后，通过1.5"/。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向10fil所得PCR产物中加入2jil凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTAE)，在100V下进行30分钟。电泳终止后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色IO分钟.将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。结果如下所示。将植物导入用细胞色素C6表达载体(pBIcytC6)转化到宿主大肠杆菌HBIOI(图8)。然后随机挑取20个克隆转化体(集落)。结果，可以确认20个样品中的3个克隆在被认为是sp+PYC6基因的大小(474bp)附近具有单一条带。从而显示，该质粒内插入了sp+PYC6基因。将保有该质粒的大肠杆菌HB101用于以后的实验。(1-2)转化根癌土壤杆菌的制备和筛选本项中，为了制备向高等植物拟南芥中导入目标基因所必须的宿主土壤杆菌(根癌土壤杆菌)，进行三者混合培养(三亲本杂交(hy^:r^y夕^吖7—>歹))，在所得的转化体中选多个集落，在3mlLB-卡那霉素液体培养基中培养，通过碱-SDS法进行质粒的制备，由此确认是否对宿主土壤杆菌进行转化。(1-2-1)各种菌体的培养(a)根癌土壤杆菌(LBA4404^保有pAL4404用白金环，将菌体的甘油原种(to—少7卜、;/夕)溶液在YEP-链霉素琼脂培养基(板)(30(ig/ml链霉素)上，在整个板上划线涂布，在301C下培养约40小时。培养后挑取集落，将该集落在5mlYEP-链霉素(:30ng/ml链霉素)培养基中，以100rpm、30"€振荡培养30小时。(b)大肠杆菌(HBIOI)六保有pRK2013用白金环将菌体的甘油原种溶液在LB-卡那霉素琼脂培养基(板)(40吗/ml卡那霉素)上，在整个板上划线涂布，在37r下培养16小时。培养后挑取集落，将该集落在5mlLB-卡那霉素(40吗/ml卡那霉素)培养基中，以200rpm、37"C振荡培养16小时。(c)大肠杆菌(HBIOI)A保有pBIcytc6用白金环将菌体的甘油原种溶液在LB-卡那霉素琼脂培养基(板)(40ng/ml卡那霉素)上，在整个板上划线涂布，在37t:下培养16小时。培养后挑取集落，将该集落在5mlLB-卡那霉素(40吗/ml卡那霉素)培养基中，以200rpm、37"C振荡培养16小时。(1-2-2)三亲本杂交三亲本杂交可按照公知方法进行(驹岭穆、野村港二"生物化学实验法41，，植物细胞工学入门，学会出版电y夕一，298-302(1998))。即，将在5mlYEP-Sm.液体培养基或LB-Km.液体培养基上振荡培养的三种菌体液(根癌土壤杆菌(LBA4404)头保有pAL4404、大肠杆菌(HBIOI)*保有pBIcyt&、大肠杆菌(HB101)头保有pRK2013)以5，000rpm、4"C离心5分钟，用吸气器吸引上清并除去。为了进行洗涤，将培养时使用的液体培养基(YEP培养基或LB培养基)加入到沉淀(菌体)中，充分搅拌，再一次以5,000rpm、4t:离心5分钟。离心后，将菌体溶解于培养时所使用的液体培养基(YEP培养基或LB培养基)3ml中。接着滴加各菌体液各30pl，覆盖在MinA-卡那霉素琼脂培养基(板)上，以静置的状态、在30C培养三天。培养后，将在极限培养基(最少培地)MinA-卡那霉素琼脂培养基(板)上生长的菌体用白金环全部挑取，将该菌体溶解于IOmMMgSO4200fil。然后用白金环将该菌体溶液再次在MinA-卡那霉素琼脂培养基(板)上、在整个板上划线涂布，在30"C下培养大约三天。培养后挑取集落，将该集落在5mlYEP-卡那霉素(40吗/ml卡那霉素)培养基上以200rpm、30"C振荡培养40小时。(1-2-3)通过碱-SDS法制备Ti质粒将在5mlYEP-卡那霉素(40jig/ml卡那霉素)液体培养基上以200rpm、30t:振荡培养40小时的菌体液各1.5ml分注到1.5ml微量离心管中，以5000rpm、4匸离心10分钟，用吸气器吸引上清并除去。将lml的S-緩冲液加入到沉淀(菌体)中，用涡流搅拌器充分搅拌，以8，000rpm、4X:离心10分钟，用吸气器吸引上清并除去。S-緩冲液如下制备称量13.512gC6H1206(葡萄糖(M.W.:180.16))，加入12.5ml1MTris-盐酸(pH8.0)、10ml0.5MEDTA(pH8.0)，用超纯水定容为500ml，进行高压釜处理(121t:、IO分钟)。再向沉淀中加入S-緩冲液IOOnl和10mg/ml溶菌酶5jil，在室温下放置10分钟。向其中加入200jil溶液II、30jilTE-饱和苯纷，轻轻地颠倒搅拌。在室温下放置5分钟后，再加入150fil溶液III，在-20"C下放置15分钟，然后以12，000rpm、4t:离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌，然后在-20t:下放置30分钟。然后以14,000rpm、4"C离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500nl75。/。乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14，000rpm、4匸离心5分钟，弃去上清。将沉淀进行一定程度的风干，然后溶解于20nlTE中。向所得质粒中加入lmlRNaseA,在37"C下温育卯分钟以进行RNase处理。反应结束后，通过1.5。/。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确i人。向10jil所得PCR产物中加入2nl凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是使用电泳緩沖液(lxTAE)在100V下进行30分钟。电泳结束后，用O.lmg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相才几记录在照片上。结果如下所示。根癌土壤杆菌(LBA4404)在YEP-Sm.培养基中培养，大肠杆菌(HB101)在LB-Km.培养基中培养。然后通过三亲本杂交(三者混合培养)向根癌土壤杆菌(LBA4404)中导入pBIcytc6，进行转化。接着，随机挑取10个克隆的通过三亲本杂交导入了Ti质粒(pBIcytc6)的转化体根癌土壤杆菌。将该集落在3mlYEP-Km.培养基中培养，然后通过碱-SDS法制备质粒，将其进行l。/。(w/v)琼脂糖凝胶(TAE)电泳。结果，在1个克隆中，在被认为是pBIcytC6大小(13.5kbp)处确i人到条带。由此显示，Ti质粒(pBIcytC6)导入到转化体根癌土壤杆菌中。(2)转化植物(导入细胞色素C6的拟南芥)的制备(2-1)拟南芥的栽培将蛭石装入经充分水洗的7.5x7.5圆形盆(pot)中，装满至九成。接着，将HYPONeX原液稀释2，000倍，准备500ml所得的溶液，然后加入用刀切成厚度为lcm左右的石棉。用镊子夹取充分含水分而润湿的石棉，在7.5x7.5圆形盆上各放3个。将厨房用的滤水三角网袋(三角3一于一0,"y-)裁成可覆盖盆口的大小，充分水洗，覆盖盆口，用橡胶圏固定。向该盆中各播种一粒种子。播种种子后，在4TC下进行三天低温处理，低温处理结束后，转移至植物培养用光照射培养室内，在22"C、长日照条件下栽培。发芽后，每两天浇一次水，每周给予一次稀释l,000倍的HYPONeX作为液体肥料。进行适当的间苗，大约三周后植物体开始抽苔，此时掐芯，利用竹棍(支柱)支撑生长的植物，待种子完全成熟后采种，在干燥状态下保存。(2-2)转化根癌土壤杆菌对植物体的感染接着，为了向高等植物拟南芥(col-O)中导入植物导入用的细胞色素c6(sp+PYC6基因)，通过土壤杆菌法之一的减压浸润法制备转化植物(Bechtold，N.，Pelletier，G.，MethodsinMolecularBiology,82(1998))。具体如下。(2-2-1)根癌土壤杆菌的培养用白金环，将菌体的甘油原种溶液在MinA-Km.琼脂培养基(板)(40jig/ml卡那霉素)上，在整个板上划线涂布，在30t:下培养约40小时。培养后挑取集落，将该集落在10mlYEP-Km.(40吗/ml卡那霉素)培养基中，以200rpm、30"C振荡培养30小时(预培养)，将该培养液全量地加入到新的100mlYEP-Km.(40ng/ml卡那霉素)培养基上，再以200rpm、30n振荡培养30小时(正式培养)，(2-2-2)植物体拟南芥(col-0)的栽培作为进行转化的植物使用的拟南芥(col-O)由播种直到采集种子期间的栽培条件如下，低温处理4t;(暗处)下静置三天。植物培育温度22匸照射光长日照条件(100nEmY1)液体肥料HYPONeX(l/l，000倍稀释)根据植物个体而多少有些差异，当为野生型植林时，在播种后7天(包括低温处理的3天)发芽，发芽后20天前后植物抽苔。然后进行掐芯处理，5-6天侧枝开始伸长，同时开始最初开花、结果.采种是从绿色的角果(§々)变为浅茶色、并且开始纵向裂开的之中回收。从一个角果大约获得约50粒种子。回收的种子在播种之前在干燥的状态下保存。(2-2-3)对植物体的感染将感染用植物体拟南芥(coI-0)按照上述(2-2-2)所述的方法栽培，培育至开始抽苦。然后，在由茎诱导出茎生叶(茎葉)时进行掐芯，切除已经开花、结果的花。实验是将该植物体和上述(2-2-l)菌体培养液的准备调节得同步进行。首先，在进行浸润操作的实验台上铺无尘室抹布(年A夕才》)。接着，将根癌土壤杆菌培养液用浸润用混悬培养基稀释大约2/3倍，加入到容量为lL的烧杯中。将该烧杯放在吸引钟(吸引鐘)内，为了使植物体不过分吸收培养混悬液而使其在之前充分吸水，将各个栽种了刚充分吸水的植物体拟南芥的盆倒放于烧杯上固定，将植物体浸渍在培养混悬液中。在减压浸润法中使用的根癌土壤杆菌培养液是使用用浸润用混悬培养基稀释约2/3倍，使OD60(^1.2-1.5变为OD6Q(H).8的培养液。以减压浸润时间为30秒、l分钟、5分钟、IO分钟进行研究，结果5分钟最佳。这是由于，减压浸润时间越长，则之后植物体的生长变得越差，处理5分钟时，其生长发育未见显著恶化，花数和结果的角果(种子)数也与处理l分钟的没有大的差异。接着将浸渍在培养混悬液中的植物体放入吸引钟内，通过吸气器进行减压。减压结束后，由吸引钟内取出植物体，用无尘室抹布除去多余的培养混悬液，将该植物体横放在塑料托盘内，向其端部滴加水，盖上盖子，在20X:放置2-3天(其间不给予水)。然后将盆扶起，在植物培养用光照射培养箱内、在22t:、长日照条件下进行通常的栽培。每两天进行一次浇水，作为液体肥料，每周给予一次稀释l，OOO倍的HYPONeX。进行适当的间苗，大约3周后植物体开始抽莒，掐芯，利用竹棍(支柱)支撑生长的植物体，待种子完全成熟时进行采种，在干燥状态下保存。[实施例3转化植物中的细胞色素"基因导入和表达的分析(1)使用PCR法对基因组DNA中的导入基因进行分析本实施例中，由转化体拟南芥中提取基因组DNA，以该基因組DNA为模板，通过PCR确认是否有导入基因扩增，从而确认是否导入到植物体内。(1-1)由转化体提取基因组DNA将叶为2-3片左右的转化体拟南芥放入到预先冷却的乳钵中，迅速加入液氮，匀浆至植物体呈粉末状。然后将呈粉末状的试样放入1.5ml微量离心管中称量。向Washbuffer中加入2-巯基乙醇，使终浓度为0.5%,将lml该溶液加入到上迷称量后的试样中，充分混合。以12，500rpm、4t:离心10分钟后，弃去上清。向溶液I中加入2-巯基乙醇，使终浓度为1%，向上述离心沉淀物中加入300fil所得溶液，用涡流搅拌器充分混合。接着加入1%NaBH430fil、溶液II150fil，用涡流搅拌器搅拌数秒钟，在50t:温育10分钟，向该溶液中加入ISOPLANTII(NIPPONGENE)中含有的100jil溶液III-A和120jil溶液III-B，在冰上放置10分钟。以12,500rpm、4X:离心10分钟，回收水相，向其中加入2倍量的99.5%乙醇，立即以8，000rpm、室温离心l分钟，弃去上清。再加入lml70°/。乙醇，以8，000rpm、室温离心l分钟，弃去上清。将沉淀物风干至一定程度，溶解于50jil的TE中。向该溶液中加入1mg/mlRNaseA1Hl，在37"C温育30分钟。然后，为了确认基因组DNA的提取，向5nl所得基因组DNA中加入1jil凝胶加样緩冲液，使用3iHindlII作为标志、用1.5%(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳。电泳使用电泳緩冲液(lxTAE)，在100V下进行30分钟。电泳结束后，用O.lmg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。通过电泳确认基因组DNA存在后，为了测定其浓度，将基因组DNA溶液稀释100倍，用分光光度计进行UV测定。根据计算的浓度制备基因组DNA溶液，使其浓度为10ng/111，用于今后的实验。(l画2)PCRPCR按照公知的方法进行(Sambrook，J.D.，W.Russell,MolecularCloning:aLaboratoryManual，3rdedn.CorldSpringHarborLaboratoryPress,CorldSpringHarbor,NewYork)。在0.5ml辅助PCR用离心管中制备以下组成的反应液。模板(基因组DNA(10ng))1.0jul引物(1)(10pmol///l)1.0AM引物(3)(10pmol/jul)1.0"I10XExTaq緩冲液(Mg2+plus)(Mg2"浓度20mM)2.5"IdNTP混合物(各2.5mM)2.0//IDMSO1,25"I灭菌水16.1"ITaKaRaExTaq(50,15JUI总体积25'0"1向该反应液铺15(U的矿物油。然后使用PTC-10()TM可控热循环控制仪进行反应。使用的引物如下。引物(3)ATP-NA1Ba迈(10pmol/pl)(31mer,GC-Cont.:54.8%)5'-GGATGCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG-3'加QIDNo.ll)引物(l)PYC6.C-termSacl(10pmol/pl)(30mer，GOCont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.7)FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2pmol/ji1)5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA(;GAC-3'(SEQIDNo.9)FITC化通用反向引物(M13Rv引物)(2pmol/nl)5'-GAGCGGATAACAATTTCACAC;AGG-3，(SEQIDNo.10)反应是在(94XM8秒、64XM8秒、72*Cl分24秒)x31个循环的条件下进行。反应终止后，通过2。/。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确i^。向10jil所得PCR产物中加入2nl凝胶加样緩冲液，制成电泳样品。电泳是4吏用电泳緩冲液(lxTBE)，在100V下进行30分钟。电泳结束后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。(1-3)PCR产物的凝胶提取从2。/。(w/v)琼脂糖凝胶中切取认为是目标DNA的条带，尽量切细。然后将该凝胶装入AmiconUltrafree(注册商标)DA中，以7，300rpm、4"C离心10分钟。离心后，取下UltrafreeMC(上侧的柱部分)，向洗脱出来的溶液中加入等量的TE-饱和苯酚，使用涡流搅拌器进行充分搅拌。然后以14，000rpm、4t:离心10分钟。将水层转移到新的1.5ml微量离心管中，加入3MNaOAc(pH5.2)1/20vol.、99.5%乙醇2vol.。充分搅拌，然后在-20C下放置30分钟。然后以14，000rpm、4TC离心10分钟，弃去上清。向沉淀中加入500jil75%乙醇，将沉淀充分洗涤。再以14,000rpm、4t:离心5分钟，弃去上清。将沉淀进行一定程度的风干，然后溶解于20jilTE中。为了确认该溶液中是否有目标DNA被单一地提取、纯化，进行2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳。向10jil所得样品中加入2jil凝胶加样緩冲液，电泳是使用电泳緩冲液(lxTBE)，在IOOV下进行30分钟。电泳结束后，用0.1mg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。(1-4)PCR产物的亚克隆PCR产物的亚克隆按照公知方法进行(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166(4)，557-580(1983).;中山广树等乂W才,，7卜1/一亍;yKII遣伝子解析cD基礎，秀润社，83-88(1996))。将PCR产物调制成以下组成，<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>将制备的反应液在低温恒温槽(i6t;)中温育过夜，进行连接反应。对大肠杆菌的转化如下进行。首先在冰上将150nl感受态细胞(DH5a)溶解一定程度，向其中緩慢加入4nl连接了的反应液，用移液器吸头的先端轻轻搅拌混合，在冰上放置30分钟。放置结束后，在42TC进行20秒钟的热休克。然后在冰上静置3分钟，使用接种环，在LB-Ampicilin-X-Gal画IPTG板上，按照Vector:insert=1:1、1:3,将IOOjil、50jil菌体液分别涂抹在整个板上，在37"C下培养过夜。(1-5)利用碱-SDS法制备质粒本项中的质粒制备按照与实施例l(2-4)所述内容同样进行。(l画6)通过QIAGENSpinMiniprepKit制备质粒本项的质粒制备按照与实施例l(2-5)所述内容同样进行。(1-7)双脱氧法确定碱基序列本项的碱基序列的确定按照与实施例1(2-6)的方法同样进行。结果如下所示。使用ISOPLANTII，从转化体拟南芥的2-3片叶中提取纯度高的基因组DNA。以该基因组DNA溶液为模板，为了确认植物导入用细胞色素C6基因是否导入，通过PCR扩增目标基因。然后将该PCR产物进行2。/n(w/v)琼脂糖凝胶(TBE)电泳，在474bp附近确认了单一条带(图9)。为了确认该扩增的基因的碱基序列，在凝胶提取后进行亚克隆，通过双脱氧法进行测序，由此确定了扩增的基因的全部碱基序列474bp。使用GENETYX-MAC，由该测序结果与已知的sp基因序列和PYC6基因序列进行比较，与导入基因同样信号肽基因序列中第103号的T(胸腺嘧啶碱基)突变为A(腺嘌呤碱基)，除此之外完全一致。以上结果显示，植物体(拟南芥)内导入了sp+PYC6基因。(2)使用RT-PCR法对总RNA中的表达基因进行分析本项是由转化体拟南芥中提取总RNA，以该总RNA为模板，通过RT-PCR，确认是否有导入基因的扩增，从而确认植物体内的基因的表达。引物(3)ATP.NAlBam(lOpmol/pl)(31mer，GC.Cont.:54.8%)5'-GGATCCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG-3'卿IDNo.8)引物(l)PYC6-Oter迈Sacl(10pmol/pl)(30mer，GOCont.:43.3%)5'-GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG-3'(SEQIDNo.3)FITC化通用正向引物(M13Fw引物)(2p迈ol/pl)5'-CGCCAGGGTTTTCGGAGTCAGGAC-3'(SEQIDNo.6)FITC化通用反向引物(M13Rv引物)(2pmol/ji1)5'-GAGCGGATAACAATTTCACAGAGG-3'(SEQIDNo.7)(2-l)由转化体中提取总RNA由转化体中提取总RNA是使用市售的试剂盒(RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)),按照说明书进行。(2-2)PCRPCR按照7i^知方法进4亍(Sambrook，J.D"W.Russell,MolecularCloning:aLaboratoryManual,3rdedn.CorldSpringHarborLaboratoryPress,CorldSpringHarbor,NewYork),在0.5ml辅助PCR用离心管中制备以下组成的反应液。模板(总RNA(10ng))1.0//1引物(1)(10pmol/jUl)1,0^1引物(3)(10pmol///l)1.0jt/l10xExTaq緩沖液(Mg"plus)(Mg2+浓度20mM)2.5〃ldNTP混合物(各2.5mM)2.0//1DMSO1.25)Ul灭菌水16.1jUlTaKaRaExTaq(5U///I)0.15"I总体积25.0//I向该反应液铺15nl矿物油。然后使用PTC-10()TM可控热循环控制仪进行反应。反应终止后，通过2y。(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行确认。向ioni所得PCR产物中加入2fil凝胶加样緩冲液，作为电泳用样品。电泳是使用电泳緩冲液(lxTBE)，在100V下进行30分钟。电泳终止后，用O.lmg/ml溴化乙锭进行7分钟染色，用超纯水脱色10分钟。将进行了脱色的凝胶置于UV透射仪上，用带有手动遮光罩的一次成形(宝丽来)照相机记录在照片上。(2-3)PCR产物的凝胶提取本项中的PCR产物的凝胶提取与实施例3(l-3)同样进行。(2-4)PCR产物的亚克隆本项中的PCR产物的亚克隆按照实施例3(l-4)的方法同样进行。(2-5)通过碱-SDS法制备质粒本项中的碱-SDS法按照公知方法，与实施例1(2-4)的方法同样进行(Weiss.B，等人"J.Biol.Chem.，243，4543-4555(1968);Birnboim,H.C"MethodsEnzymol.，100，243(1983))。(2-6)通过QIAGENSpinMiniprepKit制备质粒本项中的通过QIAGENSpinMiniprepKit制备质粒是与实施例1(2-5)的方法同样进行。(2-7)通过双脱氧法确定碱基序列本项中的碱基序列的确定与实施例1(2-6)的方法同样进行(Sanger,F.，Sanger,F.，DeterminationofnucleotidesequenceinDNA.，Science,214，1205-1210(1981))。(2-8)结果使用RNeasyPlantMiniKit,从已确认导入了基因的转化植物(PYC6导入植物)的2-3片叶中提取表达的总RNA。以该总RNA溶液为模板，为了确认有否sp+PYC6基因的表达，通过RT-PCR扩增目标基因。然后将该PCR产物进行2。/。(w/v)琼脂糖凝胶(TBE)电泳，在474bp附近确认了单一条带(图9)。为了确认该扩增的基因的碱基序列，在凝胶提取后进行亚克隆，通过双脱氧法进行测序，由此确定了扩增的基因的全部碱基序列474bp。使用GENETYX-MAC，由该测序结果与已知的sp基因序列和PYC6基因序列进行比较，发现与导入基因同样信号肽基因序列中第103号的T(胸腺嘧啶碱基)突变为A(腺嘌呤碱基)，除此之外完全一致。以上结果显示，sp+PYC6基因在植物体(拟南芥)内表达。(3)使用蛋白质印迹法对表达蛋白质的分析本项中，由转化体拟南芥中提取叶绿体，确认了在由此得到的叶绿体蛋白质级分中导入的细胞色素C6表达。(3-1)叶绿体级分的制备叶绿体级分按照公知方法制备(中村研三等(监修)，植物的蛋白质实验手册(植物0夕^八。夕質実験y口卜3—小)，细胞工学系列(細胞工学^y—X、)第9巻，秀润社，114-117(1998))。将5-6g左右转化体拟南芥装入预先冷却的乳钵中，迅速加入液氮，匀浆至植物体成粉末状。然后向粉末状的试样中加入20ml冰冷却的破碎Buffer(破砕Buffer)，充分搅拌，用4层Miracloth(5，夕口只)过滤。将所得滤液转移到15ml容积的Corningtube中，以7,000rpm、4上清。向沉淀中加入5vol.破碎Buffer，混合至均匀，轻轻地倒入预先加入了10ml30。/o珀可(八。一3—々)的玻璃离心管中，以2,000rpm、4"C离心3分钟。结束后除去上清中的珀可，将沉淀用5ml破碎Buffer混合至均匀，再以2,000rpm、4t:离心3分钟(将该操作重复两次)。最后将沉淀溶解于lml破碎Buffer中，将该溶液作为叶绿体级分。(3-2)蛋白质印迹向上述(3-l)所得叶绿体级分溶液中加入lmlCelLyticPPlantCellLysis/Extractionreagent,以10，000rpm、4t:离心10分钟，将所得上清作为叶绿体蛋白质提取溶液。向1.5ml微量离心管中加入1fig/nl分子量标准标记5fil和超纯水5nl，加入叶绿体蛋白质提取溶液，分别向管中加入等量的试样用緩冲液，充分搅拌。将制备的管在40t:下、热水浴中培养30分钟，作为电泳用试样。在电泳槽中加入阳极和阴极电极液、SDS-PAGE凝胶，向孔(Well)中小心加入20jd电泳用试样，在30V的恒定电压下将电泳用试样电泳至分离凝胶的上端，在100V的恒定电压下，使标记由凝胶的下端电泳约5mm左右。电泳过程中，预先将滤纸各两张浸渍在印迹緩冲液A、B、C中，将PVDF膜在少量的甲醇中浸渍5秒，再浸渍到印迹C液中。电泳结束后，将凝胶从玻璃板上取下，浸渍在印迹C液中约5分钟。在半干印迹装置中，从下面开始依次重叠两张A的滤纸、两张B的滤纸、PVDF膜、凝胶、两张C的滤纸，设置后，以60mA的恒定电流转印卯分钟。印迹结束后，立即按照以下所示操作进行抗原抗体反应的操作。(i)将PVDF膜浸在TBS中，振荡5分钟(两次)。(ii)浸渍在含5。/。BSA的TBS中l小时，振荡过夜。(iii)浸在TBS中，振荡5分钟。(iv)浸在st-抗体中，振荡2小时。(v)浸在TTBS中，振荡5分钟(两次)。(vi)浸在第二抗体中，振荡1小时30分钟。(vii)浸在TTBS中，振荡5分钟(两次)。(viii)浸在TBS中，振荡5分钟(两次)。(ix)浸在第二抗体展开试剂中，振荡20分钟(避光)，(X)用超纯水洗涤。(3-3)结果通过珀可的密度梯度离心，从PYC6导入植物中分离叶绿体级分，将所得叶绿体蛋白质通过SDS-PAGE进行电泳，通过分子量进行筛分。接着将分离的所有的蛋白质转印到PVDF膜上，然后使用识别来自条斑紫菜的细胞色素C6的第一抗体(兔抗体)和抗兔抗体(第二抗体)进行抗原抗体反应，可以只在PYC6导入植物中检测出抗原抗体反应(图10),由以上结果表明，在PYC6导入植物中导入的PYC6在叶绿体中表达。(4)表达的细胞色素C6蛋白质的N末端氨基酸序列分析本项中，对在上述(3)中显示抗原抗体反应的PYC6蛋白质的N末端氨基酸序列进行分析，确认是否有信号肽的切断。向上述(3-l)中得到的叶绿体级分溶液中加入lmlCelLyticPPlantCellLysis/Extractionreagent,以10，000rpm、4匸离心10分钟，将所得上清作为叶绿体蛋白质提取溶液。向1.5ml微量离心管中加入1ng/jil分子量标准标记5jil和超纯水5fil，加入叶绿体蛋白质提取溶液，分别向各管中加入等量的试样用緩冲液，充分搅拌。将制备的管在40"C、热水浴中培养30分钟，作为电泳用试样。在电泳槽中加入阳极和阴极电极液、SDS-PAGE凝胶，向孔中小心加入20fil电泳用试样，在30V的恒定电压下将电泳用试样电泳至分离凝胶的上端，在100V的恒定电压下使标记由凝胶的下端电泳约5mm左右。电泳过程中，预先将滤纸各两张浸渍在印迹緩冲液A、B、C中，PVDF膜在少量的曱醇中浸渍5秒，再浸渍到印迹C液中。电泳结束后，将凝胶从玻璃板上取下，浸渍在印迹C液中约5分钟。在半干印迹装置中，从下面开始依次重叠两张A的滤纸、两张B的滤纸、PVDF膜、凝胶、两张C的滤纸，设置后，以60mA的恒定电流转印90分钟。印迹结束后，进行CBB染色、脱色操作，将目标蛋白质部分切成lmmx5mm大小，转移至1.5ml微量离心管中。将其作为测序样品，用A卯liedBiosystemsProteinSequencer492型进行氨基酸序列分析，通过埃德曼法，对与由转化植物得到的与PYC6抗体显示抗原抗体反应的分子量约为9.1kDa的蛋白质N末端氨基酸序列进行分析，结果，该序列是从其N末端笫1个残基开始依次为ADLDNGEKVF(SEQIDNo.l2)(参照下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>这与PYC6成熟蛋白质区的N末端氨基酸序列完全一致，表明在植物体内进行了信号肽的切断，正确地通过了叶绿体类嚢体膜，在腔内一侧表达。即，由所得转化体中PYC6蛋白质N末端氨基酸序列的分析结果可以证实，与叶绿体转运信号被切断后的成熟区的氨基酸序列一致，由此表明sp+PYC6基因在转录、翻译后转运到叶绿体中。[实施例4转化植物的生长发育测定和表现型(表現型)的观察(1)生长发育观察(高度、根长、叶的大小)本项中，对转化体拟南芥播种后的生长发育情况进行观察。播种转化体后，每隔10天观察测定植物体的"高度"、"根长"和"叶的大小"。植物试样是对野生林和转化体共20个个体进行，计算其平均值，通过统计处理求出显著差异。对PYC6导入植物的生长(表现型)进行观察，结果，PYC6导入植物的高度最大比野生型(WT)大1.9倍(播种后40天)，约第60天时增大1.3倍(图ll)。根长最大比WT大1.35倍(播种后40天)，约第60天时增大1.17倍(图12)。叶的大小最大有1.9倍(播种后40天)的差异，在约第60天增大1.3倍(图13)。可以认为，在这些PYC6导入植物中观察到的现象是由于植物体内的PYC6的表达，以某种形式激活了对于植物的生长发育非常重要的光合作用反应，由于该影响使植物体的生长发育速度提高。(2)总叶绿素量的测定本项中，用丙酮从转化体拟南芥中提取总叶绿素，并定量。将转化体拟南芥的叶用叶片打孔采样器(i;一7Ay亍)采集，称量。将试样放入预先冷却的乳钵中，迅速加入液氮，匀浆至植物体呈粉末状。然后向呈粉末状的试样中加入80%丙酮，定容至4ml。用分光光度计UV-VISIBLESPECTROPHOTOMETER测定该溶液在663nm和645nm下的吸光度。将所得663nm和645nm下的吸光值代入以下所示式子中，计算叶绿素量。总叶绿素量(jig/ml)-8.02xABS(663)+20.21xABS(645)测定PYC6导入植物中的叶绿素量，结果，在播种后40天-70天期间，比WT增大1.1-1.2倍(图14)。这可能是由于PYC6的导入使光反应活化，由此增大的光反应最终产物一能量物质(ATP)被用于叶绿素的合成。[实施例5转化植物的光合作用活性测定(1)方法和结果分别按以下所示方法测定作为光合作用活性指标的三磷酸腺苷(ATP)含量、NADPH量、二氧化碳同化能力、淀粉量和蛋白质的量。(1-1)总ATP含量的测定本实施例中，由转化体拟南芥中提取总ATP，通过萤光素■萤光素酶法进行定量。预先称量转化体拟南芥的叶。称量后，装入预先冷却的乳钵中，迅速加入液氮，用乳钵棒匀浆至植物体成粉末状。然后向粉末状的试样中加入2ml0.25M高氯酸，将该溶液回收到15ml容量的Corningtube中。以10，000rpm、4"C离心10分钟，将所得上清转移到另外的15ml容量Corningtube中，用1NKOH调节至pH7.0。制备后，用0.2M磷酸緩冲液(pH7.2)定容至5ml，将其作为ATP提取液。将100nlATP提取液装入1.5ml微量离心管中，添加20jilENLITEN萤光素酶/萤光素试剂，然后在90秒后用发光计(GENELIGHT55)累积计算10秒钟内反应液的发光强度，由所得的RLU值计算溶液的ATP浓度，由此换算成单位植物重量的ATP量。结果，PYC6导入植物的总ATP量最大增大1.93倍(播种后60天X图15)。这可能是由于PYC6导入植物中，除发挥功能的质体蓝素之外，还有作为新的电子传递体的红藻cyt"(PYC6)发挥功能，由此光反应的电子传递被活化，使最终产物ATP的量增加。(1-2)总NADPH含量的测定本实施例中，由转化体拟南芥中提取总NADPH进行定量，预先称量转化体拟南芥。然后加入在70t:左右的热水浴中加温的O.lNNaOH,用求y卜口少匀浆器破碎。然后转移到冰浴中，加入约2ml的0.1NHC1，调节至用pH试纸测pH为7.5。接着加入O.lml甘氨酰甘氨酸緩冲液(pH7.5)，充分搅拌，转移到量筒中测定液量。测定后，转移至15ml容量的Corningtube中，以10，000rpm、4t:离心20分钟。离心后，将上清回收至15ml容量的Corningtube中，在-80"C下冷却过夜，溶解后，以10，000rpm、4t:离心20分钟，用于定量。将IOO.OnlNADPH提取液、346.0fil0.1M甘氨酰甘氨酸緩冲液(pH7.4)、200.0nl0.2M烟酰胺、82.0jd3.2mg/ml吩溱硫酸甲酯(PMS)、67.0fil5mg/ml嚷唑蓝、200jd葡萄糖-6-磷酸二钠水合物混合，设置于分光光度计U3310上，在570nm、25"C下测定。在U3310上安装温度控制单元，设定成25t:。然后每隔30秒测定570nm下的吸光度变化，测定2分钟。由所得吸光值的差计算NADPH的量，由其计算单位植物重量的NADPH量。结果，导入PYC6植物的总NADPH量在播种后40-70天增大1.2-1.4倍(图16)。这可能是由于将PYC6导入高等植物，电子比野生型更多地传递，最终产物NADPH的量增加。(I-3)二氧化碳同化能力的测定本实施例中，使用转化体拟南芥的叶测定二氧化碳的同化能力。二氧化碳的同化能力是使用C02气体分析仪CIRAS-1(小丝工业制造)进行。另外，二氧化碳的供应量设定为350ppm，在饱和光下测定。结果，PYC6导入植物的二氧化碳同化能力最大增加2.2倍(播种后天)(图17)。这可能是由于PYC6对高等植物的导入使得ATP或NADPH的量增加，由此利用该能量的暗反应(卡尔文本森循环)被活化，二氧化碳的同化能力增加。(1-4)淀粉量的测定本实施例中，从转化体拟南芥中提取淀粉，进行定量。采集植物叶后进行干燥(70度、2天)。称量约5mg放入乳钵中，加入3ml32%高氯酸，用乳钵棒充分破碎。然后全部转移到试管中，在20匸下静置20分钟。接着，用6.0cm的WhatmanGF/Agrassfibredisk过滤，向滤液中加入5ml硖溶液，充分混合，在约4"C静置30分钟。然后用1.5cm的WhatmanGF/Agrassfibredisk过滤，使滤器干燥。将干燥的滤器放入试管中，加入4ml0.75M硫酸，在沸腾水浴中温育30分钟。然后回收上清，通过苯酚硫酸法进行显色，使用分光光度计测定485nm下的吸收。结果，PYC6导入植物的淀粉量在播种后40-70天时增大1.15-1，25倍(图18)。这可能是由于向高等植物导入PYC6，C02的同化能力增加，与此相伴，淀粉的合成也得到促进。(1-5)蛋白质的量的测定本实施例中，由转化体拟南芥提取蛋白质，使用Lowry法进行定量。测定植物体的重量并记录，将适量的植物体放入乳钵中，在液氮下，用乳钵棒充分破碎。恢复至常温后，向每lg植物体中加入2mlCelLyticP(Sigma制)，用乳钵棒充分磨碎，转移至试管中。在室温下颠倒混合15分钟，然后离心。将该上清作为提取蛋白质，接着，制备LowryA液0.1N的氢氧化钠溶液中加入碳酸钠，使浓度为2%;LowryB液0.5%硫酸铜五水合物和1%柠檬酸钠；LowryC液1N苯酚溶液；LowryD液LowryA液+LowryB液，然后向O.lml提取的蛋白质溶液中加入l.OmlLowryD液，用涡流搅拌器进行搅拌，然后在30"C下温育15分钟。接着加入O.lmlLowryC液，迅速用涡流搅拌器搅拌，然后在30TC下温育30分钟，测定770nm下的吸光值。结果，PYC6导入植物的蛋白质量最大增加1.3倍(播种后50天)(图19)。这可能是由于向高等植物导入PYC6，增产的ATP或NADPH激活了蛋白质的合成。(2)考察作为由本发明得到的认识，PYC6导入植物与WT比较，生长速度提高。推测原因如下由于PYC6导入植物中的ATP和NADPH增加，因此，除了在拟南芥中发挥功能的质体蓝素之外，新导入的电子传递体红藻cytC6也发挥功能，由此，光反应的电子传递形成两个回路，其最终产物ATP和NADPH的量增加，并且植物整体的生长发育活化。目前，关于通过对陆地植物暗反应(卡尔文'本森循环)相关酶的补强来促进成份量增加的研究正在进行，但象本发明这样的使光反应活化的例子尚未见到。目前，以发挥cyt"功能为目的导入植物的例子尚未见到，本发明的内容在其它种类的植物中也可以应用，可以说是作为有用的植物生长促进方法或植物生产技术(果实植物(果実物)、叶片植物(葉物)、鲜花(生花)等)等的基础的通用性高的发明。并且，通过利用在植物体内增产的ATP和NADPH,其它物质代谢也被活化，在污染物(C02等)的除去方法领域中也极为有效。产业实用性本发明可提供在叶绿体的类嚢体腔内具有细胞色素C6的新型高等植物的利记博彩app，进而提供高等植物的生长促进方法，促进ATP、NADPH、淀粉和蛋白质合成的方法，以及促进固碳的方法，本发明还提供可以转运至叶绿体类囊体腔内的、附加有信号肽的细胞色素"蛋白质，编码该蛋白质的基因，含有该基因的重组载体，含有该重组栽体的转化体，以及该基因导入到植物基因组中得到的转化高等植物。序列表文本SEQIDNo.7:引物SEQIDNo.8:引物SEQIDNo.9:引物SEQIDNo.l0:引物SEQIDNo.ll:引物权利要求1.叶绿体类囊体腔内具有细胞色素c6的高等植物的利记博彩app，其特征在于，将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中，其中所述融合蛋白是在细胞色素c6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。2.高等植物的生长促进方法，其特征在于，将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中并使其表达，使细胞色素C6存在于叶绿体的类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素c6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。3.促进高等植物的选自ATP、NADPH、淀粉和蛋白质中的至少一种的合成的方法，其特征在于，将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中并使其表达，使细胞色素C6存在于叶绿体类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素c"6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。4.促进高等植物固碳的方法，其特征在于，将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中并使其表达，使细胞色素C6存在于叶绿体类嚢体腔内，其中所述融合蛋白是在细胞色素C6蛋白质上附加有50-80个氨基酸残基的信号肽的融合蛋白。5.权利要求l-4中任一项所述的方法，其中，上述融合蛋白是以下的(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白质(a)含有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的蛋白质(b)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列；(c)含有下述氨基酸序列，且具有电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列；(d)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物的叶绿体被膜和类嚢体膜能力、以及电子传递能力的蛋白质，所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列和相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列分别有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。6.权利要求l-5中任一项所述的方法，其中，上述基因是含有以下(a)或(b)的DNA的基因(a)含有SEQIDNO.l所示碱基序列的DNA(b)在严谨条件下与含有互补碱基序列的DNA杂交的DNA，且是编码具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力、以及电子传递能力的蛋白质的DNA，其中所述互补碱基序列是与含有SEQIDNO.1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列。7.融合蛋白，该融合蛋白是在细胞色素￡"6蛋白质上附加50-80个氨基酸残基的信号肽而成的。8.权利要求7所述的融合蛋白，该融合蛋白是以下(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白质(a)含有SEQIDNO.!2所示氨基酸序列的蛋白质；(b)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列；(c)含有下述氨基酸序列，且具有电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述细胞色素C6蛋白质的氨基酸序列有1或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列；(d)含有下述氨基酸序列，且具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜能力、以及电子传递能力的蛋白质，其中所述氨基酸序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列中的相当于上述信号肽的氨基酸序列和相当于上述细胞色素"蛋白质的氨基酸序列分别有l或多个氨基酸缺失、置换或附加的氨基酸序列。9.基因，该基因编码权利要求7或8所述的融合蛋白。10.基因，该基因含有以下(a)或(b)的DNA:(a)含有SEQIDNO.l所示碱基序列的DNA;(b)在严谨条件下与含有互补碱基序列的DNA杂交的DNA,且是编码具有通过高等植物叶绿体被膜和类嚢体膜的能力、以及电子传递能力的蛋白质的DNA，其中所述互补碱基序列是与含有SEQIDNO.1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列。11.重组载体，该重组载体含有权利要求9或10所述的基因。12.转化体，该转化体是将权利要求ll所述的重组栽体导入宿主而成。13.权利要求12所述的转化体，其中，宿主为属于土壤杆菌属的微生物。14.转化高等植物，其中，权利要求9或10所述的基因导入到植物基因组中。15.权利要求14所述的转化高等植物，其中，在植物细胞的叶绿体类嚢体腔中具有细胞色素C6。全文摘要本发明提供在叶绿体的内囊体腔内具有细胞色素c<sub>6</sub>的高等植物的利记博彩app，其特征在于将编码融合蛋白的基因导入高等植物的基因组中，其中所述融合蛋白是在细胞色素c<sub>6</sub>蛋白质上附加50-80个氨基酸残基的信号肽而成。文档编号C07K19/00GK101111595SQ20068000378公开日2008年1月23日申请日期2006年2月1日优先权日2005年2月2日发明者中泽爱子,千田浩隆,奥忠武,河内隆,西尾俊幸申请人:学校法人日本大学