专利名称：肌肽的提取方法
技术领域：
本发明涉及医药化工的生产工艺，具体地说是从动物骨骼肌中提取肌肽的方法。
背景技术：
肌肽是一种天然的二肽，存在于肌肉中，由β-丙氨酸和组氨酸组成。Boldyrev(1988)等报道肌肽具有抗氧化作用，可以抑制由铁、铜、肌红蛋白和脂肪氧化酶引起的脂肪氧化反应。肌肽具有比BHA、BHT、TBHQ、PG及α-生育酚更强的抗氧化作用。Decker等(1990)也研究发现肌肽可以抑制体内由铁、血红素蛋白、脂肪氧化酶和单质氧催化的氧化反应。肌肽还可以抑制酸败气味的形成和颜色的变化，加入肌肽的样品在贮藏1个月后，其酸败气味显著低于加入BHT、α-生育酚和三聚磷酸钠的样品，且它的护色效果比BHT、α-生育酚和三聚磷酸钠要好，BHT、α-生育酚和三聚磷酸钠对保护颜色是无效的(Decker等，1991；1995)。加入肌肽的虾类在贮藏45天后，其虾壳颜色、口味等基本无变化。目前肌肽广泛应用于药物辅剂、食品添加剂、化妆品及饲料添加剂等领域，是一种高效低毒的天然抗氧化剂、护色剂。
现有的肌肽的制备方法为利用化学合成方法而得(F.J.Vinicket al.，J.Org.Chem.1983，48(3)，392等)，其缺点是使用大量的有机化学溶剂联氨化合物、硫化物等是剧毒的化学物质，叠氮化合物为易燃易爆化学品，必须在防爆车间内生产，操作麻烦，污染环境，损害人体健康；而且设备投资大，生产效率低，生产周期长，生产成本高。
发明内容
针对现有的肌肽制备方法存在的危害及生产效率低、生产成本高的问题，本发明目的在于提供一种从动物骨骼肌中提取肌肽的生产工艺。
本发明采用如下技术解决方案(1)取新鲜或冻存健康动物肉，去除非肌肉组织物，用注射用水洗净，沥干；(2)先用绞肉机绞成碎块，用胶体磨磨细，收集匀浆液，加入注射用水搅匀成浆液；(3)将浆液加温至42℃～45℃，用酸调pH至1.5～1.7，加入胃蛋白酶，或酸性蛋白酶或木瓜酶，搅匀后，维持pH1.5～1.7、42℃～45℃的条件水解；(4)用碱将水解后的浆液调pH至7.5～7.7，然后加入胰酶或碱性蛋白酶搅匀后，维持在pH 7.5～7.7、42℃～45℃水解，酶解结束后加热升温至100℃，保温5～15分钟进行酶灭活，降温至30℃以下；(5)用酸调pH至2.8～3.0，静置过夜；
(6)进行固液分离，分离出的清液用碱调pH至6.8～7.0，备用；(7)用注射用水将羟基磷灰石调成糊状装柱，装柱后用酸性磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；(8)收集目标物，用滤膜进行超滤，收集滤出液，对肌肽原液进行喷雾干燥，收集干燥粉；(9)取样进行微生物限度、含量测定、酸度检测。
所述的动物肉可以为牛肉、兔肉、鸡肉、鱼肉、羊肉或猪肉等。
所述的调pH值用的碱可以为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸氢钠或氨水等。
所述的调pH值用的酸可以为盐酸、磷酸、柠檬酸、硫酸等。
用酶进行水解的过程，可以通过控制水解时间来掌握水解进程，水解时间短，水解不充分造成收率低，但水解时间过长又会延长生产周期，增加生产成本。一般步骤(3)中水解时间可以为420～540分钟。同样，所述的步骤(4)中水解时间为120～240分钟。
所述的酸性磷酸盐缓冲液可以为10～30mmol/L pH5.8～6.8磷酸盐缓冲液。
为保证干燥效果，所述的离心喷雾干燥器进料温度可以设为45℃，进出口温度可以为140℃～70℃，喷雾器转速8000r/min。
所述的超滤可以采用截留分子量为3～8KD的超滤膜。
本发明通过对动物骨骼肌进行双酶水解，将大分子蛋白质水解成小分子多肽，然后使用羟基磷灰石层析柱吸附分离纯化，可以分段收集得到单一、纯度比较高的肌肽。这种方法与合成方法相比，具有如下优点1、不使用联氨化合物、硫化物、叠氮化合物等剧毒、易燃易爆化学品，新鲜或冻存动物肉直接经双酶酶解等生产工艺提取肌肽，具安全无污染、少投入生产设备、减少生产环节等优点。
2、双酶水解肌肉组织匀浆液，采用抽取、残渣离心获得上清液，经过滤、上羟基磷灰石层析柱吸附分离纯化，超滤等生产工艺，水解完全，可除去杂蛋白和大分子杂质，达到很好的分离效果。
3、采用双酶酶解，抽取、残渣离心获得上清液，经过滤、上羟基磷灰石层析柱吸附分离纯化，超滤等生产工艺，优点是生产步骤、周期大大缩短、收率提高、生产成本降低、生产环境要求降低、操作简便，减少了药品受微生物污染、变质的机会。
4、采用离心喷雾干燥，可以得到淡黄色粉状颗粒，颗粒均匀，无褐色杂质溶解性好。
5、制备工艺简单易行，原料易得，反应条件温和，收率高，稳定性好，而且周期短，对制备设备及场所要求也很低，适合于大规模工业化生产。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的肌肽的提取方法作进一步说明。
实施例取经检验合格的新鲜或冻存健康牛肉100.0kg，去除结缔组织、油脂、碎骨等非肌肉组织物，用注射用水洗净，沥干，称重。先用绞肉机绞成碎块，用调节刻度至200目的胶体磨磨细，收集匀浆液，加入150.0kg(1.5倍重)的注射用水搅匀。将浆液加温至42℃～45℃，用4.5％盐酸调pH至1.5～1.7，按每kg浆液加入10万国际单位(比活力)胃蛋白酶的比例，加入2500万国际单位(比活力)胃蛋白酶，搅匀后，维持pH1.5～1.7、42℃～45℃的条件水解8小时。用18％NaOH将胃蛋白酶水解浆液调pH至7.5～7.7，按每kg浆液加入4万国际单位(比活力)胰酶的比例，加入1000万国际单位(比活力)胰酶，搅匀后，维持在pH7.5～7.7、42℃～45℃水解4小时，酶解结束后加热升温至100℃，保温15分钟进行酶灭活，降温至30℃以下。用4.5％盐酸调pH2.8～3.0，静置过夜。抽滤得上清液176.0kg，残渣用离心机离心，收集上清液得53.0kg，合并上清液，共229.0kg，进行粗过滤，收集滤出液得227.0kg，用18％NaOH调pH至6.8～7.0，备用。用注射用水将羟基磷灰石调成糊状，采用淤浆式法装柱，装柱压力0.5Mpa。装柱后先用400mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液清洗，再用20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱。收集目标物得285.0kg，用对分子截留为3K的滤膜进行超滤，收集滤出液得274.0kg，将离心喷雾干燥器进料温度设为45℃，进出口温度为140℃～70℃，喷雾器转速8000r/min，对肌肽原液进行喷雾干燥，收集干燥粉，得肌肽粉26.38kg。真空包装，备用。取样进行微生物限度、含量测定、酸度等检测。
六批中试结果
多肽含量根据国家药品标准WS-10001-(HD-0874)-2002中脑苷肌肽注射液多肽含量的方法测定。
权利要求
1.一种肌肽的提取方法，该方法依次由下述过程组成(1)取新鲜或冻存健康动物肉，去除非肌肉组织物，用注射用水洗净，沥干；(2)先用绞肉机绞成碎块，用胶体磨磨细，收集匀浆液，加入注射用水搅匀成浆液；(3)将浆液加温至42℃～45℃，用酸调pH至1.5～1.7，加入胃蛋白酶，或酸性蛋白酶或木瓜酶，搅匀后，维持pH1.5～1.7、42℃～45℃的条件水解；(4)用碱将水解后的浆液调pH至7.5～7.7，然后加入胰酶或碱性蛋白酶搅匀后，维持在pH7.5～7.7、42℃～45℃水解，酶解结束后加热升温至100℃，保温5～15分钟进行酶灭活，降温至30℃以下；(5)用酸调pH至2.8～3.0，静置过夜；(6)进行固液分离，分离出的清液用碱调pH至6.8～7.0，备用；(7)用注射用水将羟基磷灰石调成糊状装柱，装柱后用酸性磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；(8)收集目标物，用滤膜进行超滤，收集滤出液，对肌肽原液进行喷雾干燥，收集干燥粉；(9)取样进行微生物限度、含量测定、酸度检测。
2.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的动物肉为牛肉、兔肉、鸡肉、鱼肉、羊肉或猪肉。
3.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的调pH值用的碱为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸氢钠或氨水。
4.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的调pH值用的酸为盐酸、磷酸、柠檬酸或硫酸。
5.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的步骤(3)中水解时间为420～540分钟。
6.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的步骤(4)中水解时间为120～240分钟。
7.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于在所述的步骤(6)中，先抽滤得上清液，残渣用离心机离心，收集上清液，合并上清液，进行过滤，分离出清液。
8.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液为10～30mmol/L pH5.8～6.8磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的离心喷雾干燥器进料温度设为45℃，进出口温度为140℃～70℃，喷雾器转速8000r/min。
10.如权利要求1所述的肌肽的提取方法，其特征在于所述的超滤采用截留分子量为3～8KD的超滤膜。
全文摘要
本发明公开了一种肌肽的提取方法，该方法依次由下述过程组成将动物肉去除非肌肉组织物并洗净、沥干；磨细加水搅匀成浆液；进行双酶水解，然后进行酶灭活；分离出清液；用羟基磷灰石层析柱进行吸附，用超滤膜进行超滤，收集滤出液，对肌肽原液进行喷雾干燥，收集干燥粉，真空包装。这种提取方法不但安全、无污染，而且原料易得、收率高，生产成本低，适合大规模工业化生产。
文档编号C07K1/36GK1970784SQ20061016114
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者伍曾利 申请人:伍曾利