专利名称：靶向凋亡诱导因子的抗流感病毒反义寡核苷酸的结构及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种通过靶向凋亡诱导因子(AIF，apoptosisinducing factor，)mRNA序列，并抑制其表达，从而达到抗流感病毒(IV，influenza virus)的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其用途。
背景技术：
IV可引起的急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的″西班牙流感″在全球范围内造成了2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型IV(H2N2)所致的″亚洲流感″、1968由甲型IV(H3N2)所致的″香港流感″、1977年由甲型IV(H1N1)所致的″俄罗斯流感″、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，都威胁了人们的健康和正常生活。H5N1型AIV已经穿越种间屏障，是可引起人、禽类等动物共患的急性传染病。香港、泰国、越南、柬埔寨等世界各地相继出现过由H5N1型AIV引起的人禽流感患者，并致使数百人死亡。患者急性起病，早期表现类似普通流感患者，普遍体温升高，重度患者有下呼吸道感染的临床表现，外周血淋巴细胞均明显降低，病情发展快，短期(2～5d)急剧恶化，因多器官功能衰竭死亡，死亡率高。我国湖南、湖北、安徽、广东、广西、上海、新疆等地也先后发现H5N1引起的禽流感，并已发现数起感染人的病例。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。
由于IV变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内IV几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如达菲和帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制IV方法的已成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗IV药物对治疗与预防具有重要现实意义。
病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。
AIF是近年来发现的一种凋亡效应分子。正常情况下，AIF是一种定位于细胞线粒体膜间隙中的黄素蛋白；当有凋亡信号刺激时，AIF分子从线粒体释放到细胞浆，再通过其核定位信号转位到细胞核中，直接引起染色体凝集和DNA呈大片段(～50kb)断裂，导致细胞凋亡。AIF似乎参与了个体发生和种系发生早期阶段的程序性细胞死亡过程，在神经细胞和非神经细胞的凋亡中都发挥着重要作用。因此，AIF介导的细胞凋亡代表了独立于caspase信号通路之外的另一条更原始、更保守、更普遍的凋亡途径。已有大量的报道证实乙肝病毒、艾滋病毒等病毒诱导细胞凋亡的过程中均有AIF的参与。因此小的AIF抑制分子可能将成为新一类细胞保护剂。
ASODN是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于ASODN作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
发明内容
本发明的目的是根据IV病毒复制、致病需要宿主细胞AIF的表达，并依此设计并制备一种寡核苷酸，通过抑制AIF的表达以阻止病毒的复制增殖，抑制病毒的致细胞病变，以此作为预防和治疗IV感染的药物。
具体的说，本发明根据已公开的AIF基因mRNA序列(NM 004208)，设计针对AIF的ASODN，通过抑制AIF的表达，以阻止IV的复制和致病，为治疗IV感染提供新的特效的药物。本发明提供了一种靶向人AIF的寡核苷酸，其特征为包含SEQ1～11所示的任一核苷酸序列。
上述寡核苷酸可以通过修饰来增加其稳定性，组成寡核苷酸的磷酸二酯键部分的单键氧位置可以是氧、甲基或硫。
优选的，上述寡核昔酸包含SEQ1所示的任一核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，提供了一种最佳的方案，其中寡核苷酸选自SEQ1。
根据本发明，针对人AIF的ASODN能特异性抑制IV的复制和导致的细胞病变，其长度、细胞通透性与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关。本发明的寡核苷酸及其修饰物可单独或以组合物形式包括联合其它反义寡核苷酸及其衍生物用于制备治疗及预防IV感染的新型生物工程药物。
另一发明，本发明提供了一种用于防治IV感染的药物组合物，其中至少含有一种本发明的寡核苷酸或其修饰物，如果适当的话，还可以含有治疗上可以接受的载体材料，如脂质体、融合肽或病毒载体等。该药物组合物可依不同情况，包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
本发明通过以下方法得以完成以人AIF基因的mRNA为靶标，对其进行RNA二级结构的计算机模拟，共设计了11条反义寡核苷酸。从所设计的11条ASODNs中进行初步筛选，优选出效果较好的ASODNs。结果显示除AIF-2、3、5、6外，其余7种寡核苷酸均显示出较好的活性；其中AIF-1抑制病毒致细胞CPE作用最佳，AIF-10和-11次之。同时设计了AIF-1的正义、错配和置乱序列。
反义寡核苷酸的分子设计
在A549细胞系中以AIF-1为代表进一步评价了抑制IV复制和致细胞病变的特性。结果表明AIF-1针对H1N1、H3N2、H5N1型流感病毒的IC50分别为0.93、1.86和1.54μmol/L，并且AIF-1对病毒致细胞病变的抑制率呈剂量依赖关系；而对照药物病毒唑(RBV，Ribavirin)各项对应值分别为1.47、8.47、5.72μmol/L，达菲(Tamiflu)各项对应值分别为1.088、1.084、2.27μmol/L。可见AIF-1的作用优于RBV，与Tamiflu相当。同时通过RT-PCR验证通过抑制AIF基因的表达可以抑制病毒基因的复制。
总之，根据本发明，人AIF基因的mRNA为靶标互补结合的寡核苷酸均能有效的抑制病毒和保护流感病毒致细胞病变，是一种特异性高、毒副作用小的新型抗流感病毒的潜在药物。本发明的实施对严重危害人类健康的IV感染的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
图1 AIF1～11(4μmol/L)抑制病毒致细胞病变的作用。
图2 AIF-1抑制H1N1型流感病毒致细胞病变作用。
图3 AIF-1抑制H3N2型流感病毒致细胞病变作用图4 AIF-1A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)流感病毒致细胞病变图5 AIF-1A/Tiger/Shanxi/02/2002(H5N1)流感病毒致细胞病变图6 AIF-1A/Tiger/Shanghai/04/2003(H5N1)流感病毒致细胞病变图7 A～E为AIF-1对A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)病毒致细胞病变的抑制作用，其中A.病毒感染阳性对照细胞；B.流感病毒+0.25μmol/LAIF-1；C.流感病毒+1μmol/LAIF-1；D.流感病毒+4μmol/LAIF-1；E.未感染病毒的正常细胞对照；图8 病毒感染24h后不同浓度AIF-1对其NP基因表达的抑制图9 4μmol/LAIF-1在病毒感染12、24、48h后对病毒NP基因表达的抑制图10 AIF-1、Sense、Mismatch对基因mRNA的抑制图11 2μmol/LAIF-1在不同时相对基因mRNA的抑制具体实施方式
实施例一本实施例主要说明靶向人AIF基因抗流感病毒反义寡核苷酸的设计、合成和筛选。
1.反义寡核苷酸AIF-1的设计和合成参考人AIF基因的mRNA序列，设计11条反义寡核苷酸。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，过程如下将硫代试剂(Beaucage regent，Transgenomic)溶于无水乙腈中使其终浓度为1g/100ml，置于DNA合成仪的AUX位置处，采用合成仪上提供的DNA硫化程序进行自动合成硫代寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo PrepOP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。
2.A549细胞、病毒和对照药物病毒在10日龄SPF鸡胚传代，收集尿囊液，测定其血凝(Hemagglutination，HA)效价，取HA价＞1∶26者，混匀、分装、保存于-70℃备用。使用的病毒毒株有A/京防/86-1(H1N1)、A/鲁防/93-9(H3N2)、A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)、A/Tiger/Shanxi/02/2002(H5N1)、A/Tiger/Shanghai/04/2003(H5N1)。A549细胞培养液为含10％小牛血清(GIBCO.BRL)的1640培养液，病毒感染和细胞病变测定时使用含2％小牛血清和5g/ml胰蛋白酶的维持液。阳性对照药物为病毒唑(山东鲁抗集团)和达菲(军事医学科学院六所合成)。
3.反义寡核苷酸的筛选A549细胞在含10％小牛血清(Gibco)的1640培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以10000～12000个细胞/孔将细胞接种至96孔细胞培养板中，次日60～80％长满。用含2％小牛血清的1640稀释AIF-1～-11至4μmol/L。以PBS(pH7.5)冲洗一次，每孔加入100TCID50的A/京防/86-1(H1N1)病毒稀释液50μl，37℃感作60min，后用PBS(pH7.5)冲洗一次，将AIF-1～-11以100μl/孔的量加入各孔。同时设立病毒感染阳性对照和A549细胞阴性对照。37℃(培养2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution试剂盒(Promega产品)测定细胞病变程度(以OD490表示)，并以如下公式计算药物的病毒抑制率[(OD试验-OD病毒)/(OD细胞-OD病毒)]×100。筛选出最佳的反义寡核苷酸以进一步评价。
结果从所设计的11条ASODNs中进行初步筛选，以选出效果最佳的ASODNs，以便于进一步的评价。结果显示在浓度为4μmol/L时以AIF-1抑制病毒致细胞CPE作用最佳，抑制率为79.81％，AIF-10和-11次之，抑制率为65.00％和63.98％(见图1)。
实施例二本实施例主要说明体外A549细胞水平AIF-1抗H1N1、H3N2、H5N1型流感病毒活性的研究。
1.AIF-1抑制流感病毒致细胞病变作用参照实施例一将A549细胞铺板96空细胞培养板，次日60～80％长满。用含2％FBS的1640稀释AIF-1至0.25、0.5、1、2、4μmol/L。以PBS(pH7.5)冲洗一次，加入100TCID50的病毒稀释液50μl，37℃感作60min。再以PBS(pH7.5)冲洗一次，加入不同浓度的AIF-1。同时设立阳性药物对照组、病毒感染阳性对照和A549细胞阴性对照。37℃培养2d。利用CellTiter96Aqueous One Solution试剂盒(Promega产品)测定细胞病变程度(以OD490表示)。计算药物的细胞病变抑制率和IC50。
2.AIF-1抑制病毒非结构蛋白(NP)基因的表达A549细胞在含10％小牛血清(Gibco)的1640培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好。培养至对数生长期后，将细胞接种至6孔细胞培养板中，次日60～80％长满。接种100TCID50的A/京防/86-1(H1N1)病毒稀释液，37℃感作60min。以PBS(pH7.5)冲洗一次，加入不同浓度的AIF-1，24h后提取总RNA。另进行同一浓度AIF-1(4μmol/L)给药后，12、24、48h不同时相提取总RNA。
按照Trizol试剂盒(Invitrogen)说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，OD260/280在1.8-2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解。然后进行逆转录，具体方法如下各取总RNA 1μg，PCR下游引物0.5μg，RNA酶抑制剂(40U)0.1μl，共10.3μ，混匀，70℃温育10min，立即冰上冷却。加入第一链反应缓冲液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制剂0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混匀，42℃反应2min，加入逆转录酶superscript II0.5μl，42℃温育1h，最后70℃变性15min。反转录产物取1μl作为PCR扩增的模板。以看家基因β-Actin为内标。NP基因上游引物为5’CAG(A/G)TA CTG GGC(A/T/C)AT AAG(A/G)AC3’，下游引物为5’GCATTG TCT CCG AAG AAA TAA G3’，扩增片断为330bp。β-Actin的上游引物为5’TTCAGGTTT ACT CAC GTC ATC C3’，下游引物为5’CCA AAT GCG GCA TCT TCA AAC C3’，扩增片断317bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为1μM，Mg2+浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq 1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，循环30次，最后72℃延伸10min。2％琼脂糖胶(Sigma)电泳检查。
结果1.AIF-1抑制H1N1型流感病毒致细胞病变作用不同浓度AIF-1、RBV、Tamiflu抑制H1N1型流感病毒致细胞病变抑制率见图2。
该反义序列能较好地抑制H1N1型流感病毒致细胞病变，在细胞水平抗H1N1病毒的效果与Tamiflu相当，并优于RBV。AIF-1反义核酸三次实验IC50的平均值为0.93μmol/L，RBV为1.47μmol/L，Tamiflu为1.088μmol/L。
2.AIF-1抑制H3N2型流感病毒致细胞病变作用不同浓度AIF-1、RBV、Tamiflu抑制H3N2型流感病毒致细胞病变抑制率见图3。
该反义序列能较好地抑制H3N2型流感病毒致细胞病变，在细胞水平抗H3N2病毒的效果稍逊于Tamiflu，并优于RBV。AIF-1反义核酸三次实验IC50的平均值为1.86umol/L，RBV为8.47umol/L，Tamiflu为1.084μmol/L。
3.AIF-1抑制H5N1型流感病毒不同毒株致细胞病变作用不同浓度AIF-1、RBV、Tamiflu抑制A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)流感病毒致细胞病变抑制率见图4。不同浓度AIF-1、RBV、Tamiflu抑制A/Tiger/Shanxi/02/2002(H5N1)流感病毒致细胞病变抑制率见图5。不同浓度AIF-1、RBV、Tamiflu抑制A/Tiger/Shanghai/04/2003(H5N1)流感病毒致细胞病变抑制率见图6。
该反义序列能较好地抑制H5N1型流感病毒致细胞病变，在细胞水平抗H5N1病毒的效果好于Tamiflu，并远较RBV更好。对于A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)毒株，AIF-1反义核酸三次实验IC50的平均值为1.54μmol/L，RBV为5.72μmol/L，Tamiflu为2.27μmol/L。对于A/Tiger/Shanxi/02/2002(H5N1)毒株，AIF-1反义核酸的IC50为1.64μmol/L，RBV为7.01μmol/L，Tamiflu为2.20μmol/L。对于A/Tiger/Shanghai/04/2003(H5N1)毒株，AIF-1反义核酸的IC50为1.95μmol/L，RBV为7.88μmol/L，Tamiflu为2.89μmol/L。
图7为A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)流感病毒接种48h后不同浓度AIF-1抑制病毒致细胞病变的光镜照片，明显可见随着AIF-1浓度的增加，细胞病变逐渐减轻，生长趋于正常。
4.AIF-1抑制病毒非结构蛋白(NP)基因的表达图8为病毒感染24h后，不同浓度AIF-1对其NP基因表达的抑制情况，可见AIF-1在2μmol/L显著抑制了病毒NP基因的表达，且呈现抑制作用与剂量的依赖关系。
图9为4μmol/LAIF-1在病毒感染12、24、48h后对病毒NP基因表达的抑制情况，可见在不同时相AIF-1均有效的抑制了病毒NP基因的表达。
说明AIF基因表达的抑制间接的使病毒的复制、增殖在基因水平受到了阻滞。
实施例三本实施例主要说明体外AIF-1抑制AIF基因表达的特异性。
AIF-1抑制基因mRNA表达的特异性参照实施例三，将A549细胞铺板(6孔细胞培养板)，分别进行AIF-1抑制AIF mRNA表达的剂量依赖检测和不同时相抑制情况的检测。剂量依赖检测分别设对照、AIF-1(0.5、1、2μmol/L)、Sense(2μmol/L)和Mismatch(2μmol/L)。不同时间点检测以2μmol/L AIF-1给予正常细胞后12、24、36、48h提取总RNA。
参照实施例二进行。提取总RNA，进行逆转录，以OligodT(15)0.5μg作为引物。以看家基因β-Actin为内标。靶基因AIF上游引物为5’ACA AGC ACG CTC TAA BCA TBC TG G3’，下游引物为5’GTG GGC AAA CTA CTG CCT ACA A3’，扩增片断为231bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为lμM，Mg2+浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq 1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，循环30次，最后72℃延伸10min。2％琼脂糖胶(Sigma)电泳检查。
结果图10为不同浓度AIF-1，以及Sense、Mismatch对基因mRNA的抑制情况，可见AIF-1特异有效的抑制基因mRNA的表达，且呈现剂量与效应的依赖关系。Sense、Mismatch未见明显的抑制作用。
图112μmol/LAIF-1在不同时相对基因mRNA的抑制情况，可见其抑制作用在24h和36h是最为明显。
说明AIF-1作用的特异性，其抗流感病毒和保护细胞的作用是通过AIF基因的抑制而特异有效的。
核苷酸序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>靶向凋亡诱导因子的抗流感病毒反义寡核苷酸的结构及其用途<160>11<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CAGATTTGGGGTTGTCTTGT 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCACCAGCTTCTGCTTCAAA 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ACCAGCTTCTGCTTCAAAGC 20<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ACCAAGGGCACCAGCTTCTG 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5GCACCAAGGGCACCAGCTTC 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6CACCAAGGGCACCAGCTTCT 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7CCAATTCCACTGTGGGGCTT 20
<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8GCCAATTCCACTGTGGGGCT20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9TGCCAATTCCACTGTGGGGC20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10GTGGGGCTTCAGTCTTCATG 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11TGGGGCTTCAGTCTTCATGA 20
权利要求
1.一类靶向凋亡诱导因子(AIF)mRNA的的寡核苷酸，其特征为包含如下所示的任一核苷酸序列1)CAG ATT TGG GGT TGT CTT GT2)GCA CCA GCT TCT GCT TCA AA3)ACC AGC TTC TGC TTC AAA GC4)ACC AAG GGC ACC AGC TTC TG5)GCA CCA AGG GCA CCA GCT TC6)CAC CAA GGG CAC CAG CTT CT7)CCA ATT CCA CTG TGG GGC TT8)GCC AAT TCC ACT GTG GGG CT9)TGC CAA TTC CAC TGT GGG GC10)GTG GGG CTT CAG TCT TCA TG11)TGG GGC TTC AGT CTT CAT GA
2.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征为组成寡核苷酸的磷酸二酯键部分的单键氧位置选自氧、甲基或硫。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征为包含如下所示的任一核苷酸序列1)CAG ATT TGG GGT TGT CTT GT2)GTG GGG CTT CAG TCT TCA TG3)TGG GGC TTC AGT CTT CAT GA
4.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征为包含如下所示的核苷酸序列CAG ATT TGG GGT TGT CTT GT
5.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征为具有如下所示的核苷酸序列CAG ATT TGG GGT TGT CTT GT
6.一种治疗流感病毒的药物组合物，其特征为活性成分选自权利要求1-5所述任一寡核苷酸或其组合。
7.权利要求1-5所述任一寡核苷酸或其组合在制备治疗流感病毒的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是靶向凋亡诱导因子(AIF)抗流感病毒(IV)反义寡核苷酸的结构和用途。设计合成了靶向AIF的反义寡核苷酸，采用A549细胞(人肺癌上皮细胞)，对11条反义寡核苷酸序列进行了筛选，并就效果最佳的一条反义进行了评价。该寡核苷酸AIF－1在培养的A549细胞中能有效地抑制H1N1、H3N2、H5N1型流感病毒所致的细胞病变。因此，本发明涉及到靶向AIFmRNA抗IV感染的反义寡核苷酸的序列与结构及其成为治疗流感病毒感染的一种新型生物工程药物。
文档编号C07H21/00GK101092620SQ20061008694
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者王升启, 段铭, 林汝仙, 杨静 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所