专利名称：制备酪－丝－缬三肽的方法
技术领域：
本发明涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本发明涉及酪-丝-缬三肽的制备方法。
背景技术：
在多肽合成方法中，常用的液相合成方法是采用最大保护策略，即对氨基酸的相关官能基团，尤其是氨基、羧基和羟基均作出保护，再进行氨基酸间的缩合反应最后脱去所有的保护基从而合成多肽。关于多肽合成的详细描述可参见《多肽合成》，1985年，黄惟德、陈常庆著；《多肽药物化学》，1990年，彭师奇。
例如，在合成酪-丝-缬三肽时，采用最大保护策略方法，可以Boc-Val-OH为原料制备铯盐，接着将羧端苄酯化，随后用HCl脱去Boc，暴露出氨端，然后按照DCC法(HOBT为辅助缩合剂)和侧链用苄基(Bzl)保护的丝氨酸和2，6-二氯苄基(Dcb)保护的酪氨酸进行逐步接肽，接着采用HCl脱去Boc，最后用HF脱去各种保护基，得到酪-丝-缬三肽。
最大保护策略采用侧链保护的氨基酸价格昂贵，在合成的最后需要经过剧烈的HF脱保护。由于HF的剧毒性，反应的危险性较大，必须具备专门的HF脱保护装置。而且由于这类脱保护装置的反应容器体积有限，每一次脱保护所得产品数量有限，因此限制了在产业上的应用。
因此，需要一种避免采用强毒性和刺激性的HF进行脱保护、成本便宜且能够在工业上实施的合成酪-丝-缬三肽的方法。
发明内容
本发明提供了一种采用最小保护策略合成所述酪-丝-缬三肽的方法，所述方法包括以下步骤(1)使L-Val-OH的酯与氨端保护但侧链的羟基无需保护的L-Ser-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的丝氨酸和缬氨酸的二肽缩合物的酯；(2)对(1)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团；(3)使(2)中制得的产物与氨端保护但侧链的羟基无需保护的L-Tyr-0H在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的酪氨酸、丝氨酸和缬氨酸的三肽缩合物的酯；(4)使(3)中制得的产物在有机溶剂中、在碱存在下进行水解皂化，得到氨端保护的H-Tyr-Ser-Val-OH；(5)对(4)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团，得到H-Tyr-Ser-Val-OH。
进一步的，所述的方法还包括在步骤(5)后将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐。
其中所述经C18反相柱纯化脱盐所用的洗脱液为含有反离子酸及有机溶剂的水溶液，洗脱方式可以采用等度或梯度洗脱。
其中所述反离子酸为0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇。
在本发明的一个实施方式中，所述梯度洗脱为三步梯度洗脱，洗脱液分别为含1％HOAC和5％乙晴的水溶液、含1％HOAC和10％乙晴的水溶液、含1％HOAC和15％乙晴的水溶液。
其中，将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐后进一步包括将收集的洗脱液进行冷冻干燥。
进一步的，步骤(2)包括在得到目标化合物之前用甲醇/无水乙醚重结晶。
所述用于氨端保护的保护基团为Boc。
在步骤(1)和步骤(3)中所用的缩合剂均为DCC/HOBt。
在步骤(1)和步骤(3)的反应中pH值均为8～9。
在步骤(2)和步骤(5)中的脱保护采用HCl/乙酸乙酯进行，并且，在步骤(2)中所用的HCl/乙酸乙酯含有体积百分含量为2.5％的三异丙基硅烷。
本发明的有益效果在于相对于HF的脱保护条件，本发明方法的安全性增大，同时对工业化没有障碍。另外，由于侧链不保护氨基酸的价格较为便宜，因此采用本发明的保护路线的合成成本也较小，而且不需要最大保护路线的昂贵的HF脱保护的装置。
进一步的用C18反相柱纯化能够将得到的产物进行脱盐精制，从而提高产物的纯度。
利用分别含1％HOAC和5％乙晴的水溶液、含1％HOAC和10％乙晴的水溶液、含1％HOAC和15％乙晴的水溶液作为C18反相柱纯化的洗脱液依次分三步进行梯度洗脱使分离效果更佳。
步骤(2)中在得到目标化合物之前用甲醇/无水乙醚重结晶能够消除反应过程中带来的杂质，或者采用在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三异丙基硅烷(TIS)能够避免副反应发生，提高中间产物HCl·Ser-Val-OMe的纯度，并使下一步反应更顺利进行。
本发明方法在制备过程中通过选择合适的反应条件，有效地防止副反应的发生，制得的产物经薄层层析测定为单点。
图1为本发明的HCl·Ser-Val-OMe制备工艺流程图；图2为本发明的Boc-Tyr-Ser-Val-OMe制备工艺流程图；图3为本发明的HCl·Tyr-Ser-Val-OH制备工艺流程图；图4为本发明的产品脱盐流程图。
具体实施例方式
尽管不希望受任何理论的限制，但是认为本发明是以下面的事实为基础由于1)酪-丝-缬三肽为仅含有三个氨基酸残基的小肽；2)酪氨酸和丝氨酸的侧链的羟基的亲核反应活性相对氨基较小；因此在合成过程中可以不对两个侧链的羟基进行保护。
申请人将L-缬氨酸的酯与侧链不保护的丝氨酸和酪氨酸进行逐步接肽，皂化脱去酯基，最后脱去保护得到酪丝缬肽的盐，采用C18反相脱盐纯化，冻干得到酪丝缬肽纯品。该合成策略为最小保护策略。简明路线如下所示 1.Boc保护的缬氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯的制备将H-Val-OH的酯用有机溶剂溶解，采用有机碱调节pH值至一定值(中性)。另一方面，将仅对氨基进行保护(醇羟基呈游离状态)的Boc-L-Ser-OH用溶剂溶解，加入缩合剂，随后在一定温度下与H-Val-OH的酯溶液混合反应，在反应过程中采用有机碱维持pH值在一定范围内。得到Boc保护的缬氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯。
在该步反应中采用Boc-作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。
所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。
所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二异丙基乙基胺)等，优选使用NMM。
在该步反应中选用DCC/HOBt作为缩合剂，此外所述缩合剂还可选自DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意缩合剂。
在反应过程中，当pH较低时，反应产物的纯度将降低，而pH太高时，将使产率降低。因此，优选将pH控制在8～9范围内。
反应温度可为-10℃至室温。
2.脱保护Boc保护的二肽缩合物的脱保护可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施。其中优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。
Boc-Ser-Val-OMe二肽用HCl/EtOAc脱保护时，薄层层析显示在产物的上方会出现一个较大的杂点(＞15％)。该副产物在HPLC-MS得到证实，在主峰保留时间后面出现了一个较大的质量数比主峰多56的杂峰，并且脱保护反应过程中没有出现沉淀，可能因为该副反应的发生使沉淀难以形成。
为了提高纯度，在该步中得到目标化合物之前需要用甲醇/无水乙醚重结晶，具体步骤是先将样品用一定体积(尽量少)的甲醇溶解，然后分次逐步加入乙醚，使溶液出现乳浊状，放置静置。
或采用脱保护过程中在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三异丙基硅烷(TIS)能够抑制副反应的发生。
3.Boc保护的缬氨酸、丝氨酸和酪氨酸的三肽缩合物的酯的制备Boc保护的缬氨酸、丝氨酸和酪氨酸的三肽缩合物的酯的制备条件的选择与Boc保护的缬氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯的制备条件的选择类似。
在该步反应中采用Boc作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。
所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。所用的有机碱可选自N-甲基吗啉、三乙胺和DIEA等，优选使用NMM。缩合剂可选自DCC/HOBt、DIC、HBTU、BOP等，优选使用DCC/HOBt。反应过程的pH控制在8～9。反应温度控制为先在0℃下反应2小时，再于室温下反应。
4.Boc-Tyr-Ser-Val-OH的制备将上一步反应产物用醇溶剂溶解，在一定温度下缓慢滴加入碱进行皂化反应，脱去羧酸端的酯基。
反应中使用的溶剂可选自甲醇、乙醇等常用反应溶剂。
反应可在0℃至室温下进行。在室温下进行可缩短反应时间(由0℃下的约5小时缩至2小时)，但发生严重的消旋化，产生较多的包括消旋物在内的副产物。而当在0℃下进行时则得到经薄层层析检测为纯的化合物。因此优选在0℃下实施皂化反应。
5.Boc-Tyr-Ser-Val-OH的脱保护与3中的脱保护条件类似，可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施。但较优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。
6.精制将制得的HCl·Tyr-Ser-Val-OH粗产品先预处理，即用水溶解并过滤后调节pH至5～6，采用C18反相柱进行脱盐纯化，冻干得终产品为酪丝缬肽H-Tyr-Ser-Val-OH。
利用C18反相柱进行脱盐纯化可采用等度或梯度洗脱，洗脱液为含有0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA等反离子酸，并且含有5～30％的有机溶剂如乙腈、甲醇或乙醇的水溶液。由于产品中一般不能残留三氟乙酸，并且乙腈的分离效果要好于醇类溶剂，因此优选的，本发明的洗脱液选用含有0.5～1.5％的HOAC、并且含有浓度范围在大于0、小于等于30％的乙腈的水溶液。
本发明的一个实施例中采用三步梯度洗脱，洗脱液分别为含1％HOAC和5％乙腈的水溶液、含1％HOAC和10％乙腈的水溶液、含1％HOAC和15％乙腈的水溶液。洗脱时pH值的确定为根据该肽的等电点以除去盐酸盐来选择的。
将收集的洗脱液进行冷冻干燥24小时，之后再次加入蒸馏水溶解，并再冷冻干燥48小时得最终产品。
在本文中，所用试剂的缩写为DCC二环己基碳二亚胺HOBt1-羟基苯并三氮唑NMMN-甲基吗啉THF四氢呋喃实施例1.Boc-Ser-Val-OMe的制备50g(0.298mol)HCl·Val-OMe用200ml无水四氢呋喃溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调节pH至7～8，冷却至0℃备用。
61g(0.298mol)Boc-Ser-OH，32g(0.238mol)HOBt用200ml无水四氢呋喃溶解，冷却至0℃，缓慢加入64g(0.313mol)DCC，0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，用N-甲基吗啉维持pH8～9，室温搅拌10小时，TLC(氯仿/甲醇/乙酸，20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的粘稠状物质用1500ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×5)，饱和NaCl水溶液(75ml×1)，5％KHSO4水溶液(75ml×5)，饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到99.2g粘稠状目标化合物。在乙酸乙酯/石油醚(1/1)与氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)两种展开系统中均为单点，Rf值分别为0.28和0.36，该产物可直接用于下一步反应。 (C＝2 MeOH)ESI-MS[M+1]+＝319.2。
2.HCl·Ser-Val-OMe的制备99.2g Boc-Ser-Val-OMe与300ml 4M HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室温搅拌1.5小时，反应液出现粘稠状物质附着瓶壁，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。反应液中加入200ml石油醚使产物全部析出，倾出上清液，残留物用乙酸乙酯(100ml×3)和乙醚(100ml×3)洗涤以除去HCl，再用甲醇/无水乙醚重结晶，得目标化合物46g(产率60％)。
另外，也可采用在HCl/乙酸乙酯中加入2.5％(V/V)三异丙基硅烷(TIS)，从而避免副反应发生，提高纯度。
经重结晶得到的目标化合物，或者在HCl/乙酸乙酯中加入了2.5％(V/V)TIS进行脱保护且未经重结晶得到的目标化合物在氯仿/甲醇(5/1)展开系统中均为单点，Rf＝0.46，熔点90～92℃， (C＝2 MeOH)ESI-MS[M+1]+＝219.2。
3.Boc-Tyr-Ser-Val-OMe的制备50g(0.179mol)Boc-Tyr-OH，19g(0.143mol)HOBt用250ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入39g(0.188mol)DCC，0℃搅拌5分钟，然后加入46g(0.179mol)HCl·Ser-Val-OMe及40ml N-甲基吗啉。0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持pH8～9，室温搅拌12小时，TLC(氯仿/甲醇/乙酸，20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的固体加1500ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×3)，饱和NaCl水溶液(75ml×1)，5％KHSO4水溶液(75ml×3)，饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到84g粗品(产率98％)。在乙酸乙酯/石油醚(2/1)与氯仿/甲醇/乙酸(15/1/0.4)两种展开系统中均为单点，Rf值分别为0.22和0.22，可直接用于下一步反应。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚进行重结晶，得到结晶性粉末用于测定熔点和比旋度，测得熔点97～101℃， (C＝2 MeOH)ESI-MS[M+1]+＝482.1。
4.Boc-Tyr-Ser-Val-OH的制备84g(0.175mol)Boc-Tyr-Ser-Val-OMe，用300ml CH3OH溶解，0℃下缓慢滴入80ml 2M NaOH/H2O，0℃搅拌5小时，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应液用KHSO4/H2O调至中性，减压蒸干甲醇，KHSO4/H2O继续酸化至pH值1～2，乙酸乙酯(300ml×3)萃取，合并有机层，并用(50ml×3)H2O反洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干，得粗品81g(产率99％)。在氯仿/甲醇(5/1)展开系统中为单点，Rf＝0.4，可直接用于下一步反应。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚进行重结晶，得到结晶性粉末用于测定熔点和比旋度，测得熔点117～119℃。 (C＝2MeOH)ESI-MS[M+1]+＝468.1。
5.HCl·Tyr-Ser-Val-OH的制备81g(0.173mol)Boc-Tyr-Ser-Val-OH，0℃下缓慢加入250ml 4M HCl/乙酸乙酯，于0℃搅拌1.5小时，反应液出现大量沉淀，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，过滤，沉淀用乙酸乙酯(50ml×3)和无水乙醚(50ml×3)反复洗涤至无HCl，得目标化合物59g粗品(85％)。氯仿/甲醇/水(1∶1∶0.1)展开系统为一单点，Rf＝0.27。
6.脱盐(精制)采用C18反相柱纯化脱盐。
粗品预处理60g HCl·Tyr-Ser-Val-OH分成5份，分别用5ml水溶解，过滤，滤液用10％稀氨水小心调节pH至5～6。
填料C18，柱长800mm，内径50mm，洗脱条件梯度洗脱，流速2ml/min，先用5％乙腈1％HOAC水溶液洗脱，硝酸银溶液检测氯离子，接收液无氯后换为10％乙腈1％HOAC水溶液，1小时后再转换为15％乙腈1％HOAC水溶液。
收集样品采用TLC茚三酮显色方法检测样品的流出情况，并根据HPLC检测数据收集主成分，合并洗脱液，冷冻干燥24小时后，再次加入蒸馏水溶解续冻干48小时得37g终产品白色冻干粉末酪丝缬肽(产率68％)。 (C＝2冰醋酸)。FAB-MS[M]+＝368.2已经通过非限定性实施例对本发明作出了举例说明。但本领域的技术人员会理解，在没有偏离本发明的宗旨和范围下，可以对本发明作出各种修改、替换和变更。
权利要求
1.一种制备具有以下结构的三肽化合物的方法 所述方法包括以下步骤(1)使L-Val-OH的酯与氨端保护但侧链的羟基无需保护的L-Ser-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的丝氨酸和缬氨酸的二肽缩合物的酯；(2)对(1)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团；(3)使(2)中制得的产物与氨端保护但侧链的羟基无需保护的L-Tyr-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的酪氨酸、丝氨酸和缬氨酸的三肽缩合物的酯；(4)使(3)中制得的产物在有机溶剂中、在碱存在下进行水解皂化，得到氨端保护的H-Tyr-Ser-Val-OH；(5)对(4)中制得的产物的氨端进行脱保护，脱除保护基团，得到H-Tyr-Ser-Val-OH。
2.权利要求1的方法，其中还包括在步骤(5)后将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐。
3.权利要求2的方法，其中所述经C18反相柱纯化脱盐所用的洗脱液为含有反离子酸及有机溶剂的水溶液，洗脱方式采用等度或梯度洗脱。
4.如权利要求3的方法，其中所述反离子酸为0.5～1.5％的HOAC或0.08％～0.12％的TFA，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇。
5.权利要求3的方法，其中所述梯度洗脱步骤为用含1％HOAC和5％乙腈的水溶液、含1％HOAC和10％乙腈的水溶液以及含1％HOAC和15％乙腈的水溶液依次洗脱。
6.权利要求2的方法，其中，将制得的产物经C18反相柱纯化脱盐后进一步包括将收集的洗脱液进行冷冻干燥。
7.权利要求1的方法，其中步骤(2)包括在得到目标化合物之前用甲醇/无水乙醚重结晶。
8.权利要求1的方法，其中所述用于氨端保护的保护基团为Boc。
9.权利要求1的方法，其中在步骤(1)和步骤(3)中所用的缩合剂均为DCC/HOBt。
10.权利要求1的方法，其中在步骤(2)和步骤(5)中的脱保护采用HCl/乙酸乙酯进行，并且，在步骤(2)中所用的HCl/乙酸乙酯含有体积百分含量为2.5％的三异丙基硅烷。
全文摘要
本发明公开了一种采用最小保护策略合成所述酪－丝－缬三肽的方法，所述方法包括步骤(1)使L－Val－OH的酯与氨端保护但侧链羟基无保护的L－Ser－OH进行缩合反应；(2)对(1)的产物的氨端脱除保护基团；(3)使(2)的产物与氨端保护但侧链羟基无保护的L－Tyr－OH进行缩合反应；(4)使(3)的产物进行水解皂化，得到氨端保护的H－Tyr－Ser－Val－OH；(5)对(4)的产物的氨端进行脱除保护基团，得到酪－丝－缬三肽。相对于HF的脱保护条件，本发明方法的安全性增大，同时对工业化没有障碍。另外，由于侧链不保护氨基酸的价格较为便宜，因此本发明的方法成本小。
文档编号C07K5/08GK1935834SQ20061006178
公开日2007年3月28日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者丁文锋, 彭师奇, 赵明, 王超, 林刚 申请人:一泰医药研究(深圳)有限公司