专利名称：一种高纯度四水合辅羧酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种四水合辅羧酶的制备方法，特别是高纯度四水合辅羧酶的制备方法。
背景技术：
四水合辅羧酶(Cocarboxylase tetrahydrate)是一种辅酶，它的活性成份辅羧酶(Cocarboxylase)参与催化许多有机酸的脱羧反应，可对细胞色素C的活性起到促进作用。
1937年，K.Lohmann和Ph.Schuuster从发酵粉中以氯化维生素B1焦磷酸酯的形式分离出辅羧酶。辅羧酶是维生素B1焦磷酸酯的内盐。
同时，利用氯化维生素B1焦磷酸酯制备辅羧酶也就变成了一种经典的方法。实际上，氯化维生素B1焦磷酸酯更应该称为氯化脱羧辅酶。辅羧酶是指维生素B1焦磷酸酯的内盐。
制备氯化脱羧辅酶的方法多种多样。
Stern和Hofer利用维生素B1和POCl3反应制备了氯化脱羧辅酶。J.Weijlard和H.Tauber利用维生素B1和焦磷酸钠与磷酸的混合液制备了氯化脱羧辅酶。而H.Weil-Malherbe利用维生素B1的相似物5-溴化乙烯-噻唑和磷酸银的反应制备了氯化脱羧辅酶。在上述方法中，脱羧辅酶是以银盐的形式被分离出来的。J.Weijlard和H.Tauber首先用H2S处理了上述银盐，接着用盐酸将氯化脱羧辅酶分离。Weil-Malherbe利用磷酸对氯化脱羧辅酶进行了精制。在1946年，Karrer和Viscontini对J.Weijlard和H.Tauber的方法进行了改进。
此外，美国专利US2,991,284、US2,415,544、US5,047,223、US6,596,865 B1也都介绍了氯化脱羧辅酶的制备和纯化。上述制备方法中，有的使用剧毒品如POCl3为原料，或者由于收率太低，有的跟本就没有分离得到四水合辅羧酶纯品，有的则结果重现差，而不能达到工业化生产。
发明内容本发明的目的是提供一种简单，经济和技术上操作性强，产率高、纯度高的方法来制备辅羧酶。
本发明采用的技术方案如下一种高纯度四水合辅羧酶的制备方法，磷酸与五氧化二磷在加热条件下与维生素B1充分反应至无游离氯离子，冷却得到辅羧酶粗品；再将所述的辅羧酶粗品纯化先装入大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂柱用纯水洗脱并收集洗出液A，所述的洗出液A为用碱液检测呈黄色的洗出液，将洗出液A浓缩后再置于弱酸性的阳离子交换树脂柱，用纯水洗脱并收集洗出液B，所述的洗出液B为用碱液检测呈黄色的洗出液，经后处理后结晶制得高纯度四水合辅羧酶。
通常所用的纯水是指去离子水或蒸馏水。检测洗出液是否呈黄色的碱液指碱性溶液，可以使用NaOH溶液，优选1.0mol/L的NaOH溶液。
其中所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为下列型号之一D315、D301、D335、D345，优选型号D315；所述的弱酸性的阳离子交换树脂为下列型号之一HZD-2、HZ016、JK006、JK008，优选HZD-2。
所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，所述的维生素B1∶磷酸∶五氧化二磷的质量比为1∶2～3∶1～3，具体步骤如下将磷酸加入到反应容器中，130～175℃充分搅拌，加入五氧化二磷后165～175℃保温反应，130℃～145℃加入维生素B1发生酯化反应，充分反应至反应液中无游离的氯离子，具体可取反应液用0.1M的硝酸银溶液进行检测，无白色浑浊时停止搅拌，冷却至50℃以下，加入到冷水中，控制水温在70℃以下，形成透明溶液，冷却至室温后滴入装有95％乙醇的除酸反应容器中-5～5℃静置过夜，除去上清液后得所述的辅羧酶粗品，再将辅羧酶粗品纯化。所述的冷却可采用将所得不合游离氯离子的黄色粘稠状反应液转移到正在搅拌的装有冰水的反应容器中(外加冷冻盐水冷却罐体，使物料温度不超过10℃)进行。
进一步，所述的辅羧酶粗品纯化的步骤为将所述的辅羧酶粗品溶于水中，装入所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂柱，用纯水洗脱，用氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液A，直至接收到氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，将洗出液A浓缩后再置于弱酸性的阳离子交换树脂柱，当用氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液B，直至接收到氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，经后处理后结晶制得高纯度四水合辅羧酶。
以上纯化步骤中，在接受完洗出液B后，可再改用10％HCl溶液淋洗阳离子交换柱，接受洗出液C，同样，当用氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收，直至接收到氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，此洗出液C为反应的副产物维生素B1磷酸酯。
所述的后处理为将洗出液B减压蒸馏浓缩至原体积的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，过滤，得湿产物粗品，再将湿产物粗品干燥至恒重。
具体的，高纯度四水合辅羧酶的制备方法中所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂柱选用D315，该树脂含有甲基化多胺基团的交联聚丙烯酰胺结构，可以很好得吸附住副产物维生素B1三磷酸酯和维生素B1四磷酸酯，以及磷酸，并且可以减少甚至避免辅羧酶在柱分离时分解；所述的弱酸性的阳离子交换树脂柱选用HZD-2型，利用该树脂的吸附功能可以在水淋洗时牢牢吸附住维生素B1磷酸酯，而辅羧酶却可以毫无保留的洗出，当该树脂柱用10％盐酸淋洗时，又可以将维生素B1磷酸酯完全洗出。
更为具体的，所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法为将所述的辅羧酶粗品溶于水中，装入D315交换树脂柱，用纯水洗脱，用1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液A，直至接收到1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，将洗出液A浓缩后再置于HZD-2交换树脂柱，用纯水洗脱，当用1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液B，直至接收到1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，将洗出液B减压蒸馏浓缩至原体积的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，有白色粉末析出，滴加完乙醇后，室温下静置3小时左右，过滤，得湿产物粗品，再将湿产物粗品干燥至恒重，即得所述的高纯度四水合辅羧酶。
具体的，所述的干燥可在25℃以下，真空度-0.098Mpa以上，烘至干燥失重小于0.2％结束。
本发明中的离子交换柱可利用超纯水再生。具体的，阴离子交换树脂用1mol/L氢氧化钠溶液再生，再用超纯水洗至中性；阳离子交换树脂用10％盐酸淋洗出维生素B1磷酸酯后，直接用超纯水洗至中性。
本发明与现有技术相比，其优势体现在原料易得，分离过程简单容易控制，所使用的离子交换树脂价廉易得，制得的辅羧酶纯度高，含量大于99.0％(HPLC)，总收率较高，大于20％。
具体实施例方式以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此实施例1称量225.0g磷酸加入到反应容器中，升温至135℃，保温搅拌3小时。控制温度175℃以下，加入称量好的175.0g五氧化二磷。待加入完毕以后，控制温度在165℃至175℃保温搅拌3小时。然后降温至130℃，保持该温度，在2小时内分批加入完100.0g维生素B1，并保持该温度反应。当取反应液用0.1mol/L的硝酸银溶液检测不再有白色浑浊现象时，停止搅拌。趁热将所得黄色粘稠状反应液转移到正在搅拌的装有0.5Kg冰水的反应容器中(外加冷冻盐水冷却罐体，使物料温度不超过10℃)，待形成透明溶液以后，将所得溶液再缓慢滴入到正在搅拌的装有5.0L95％乙醇的除酸反应容器中，滴加完后保持在0℃下静置过夜。
将过夜后的产物混合液除去上清液，加入0.5L水将下层糖浆状产物溶解后，加入到装有2.5KgD315弱碱型阴离子树脂交换柱中，用超纯水淋洗。当用1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液，直至接收到1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色。一共接得约3.8L洗出液。接收完毕后先用1.0mol/L氢氧化钠溶液，再用超纯水再生该离子树脂柱。
将以上所得3.8L洗出液，35℃减压蒸馏至约0.5L。然后将该溶液加入到装有2.5KgHZD-2型弱酸性阳离子树脂交换柱中，先用超纯水淋洗。当用1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液，显黄色时，开始接收洗出液。直至接收到1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，共接到约5.5L洗出液。再改用10％HCl溶液淋洗，接收洗出液，同样，直至接收到1.0mol/L氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，共接到约3.7L洗出液。然后用超纯水再生该离子树脂柱。
将经阳离子树脂交换过后所得到的5.5L溶液加入至结晶罐，35℃以下减压蒸馏至约75ml，然后边搅拌，边慢慢滴加入375ml95％乙醇，有白色粉末析出。乙醇滴加完毕后，室温下静置3小时，然后减压过滤，得湿产物粗品。25℃以下，真空度-0.098Mpa以上，烘至干燥失重小于0.2％结束，得到高纯度四水合辅羧酶29.7g，含量≥99.0％(HPLC)，总收率20.0％。
实施例245.0g磷酸加入到250ml四口烧瓶中，快速搅拌加热到135℃～145℃，保温3小时，然后控制温度在不高于175℃的条件下加入五氧化二磷35.0g，加入完毕后在165～175℃保温2.5～3小时。然后降温至130℃，并维持该温度分批加入维生素B120.0g。保温反应至取少许反应液用0.1mol/1AgNO3检测不再有白色沉淀生成为止。
待上述反应液冷至温度低于50℃以后，慢慢倒入到80～100ml水中，控制温度在加入反应液时温度不超过70℃。待溶解后搅拌0.5～1小时，反应液冷至室温后，在搅拌的条件下加入到1000ml 95％乙醇中，静置过夜。
倾倒出上清液，取水60ml溶解下层黄棕色糖浆状物质，加入到装有200～250ml D315大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱中，进行离子交换，用纯水淋洗，当洗出液用氢氧化钠检测变黄时收集洗出液，直至到洗出液再次用氢氧化钠检测时不再变黄，共得洗出液200ml。
将所得洗出液加入到装有200～250ml HZD-2弱酸性阳离子交换树脂柱中，用纯水淋洗。当洗出液用氢氧化钠检测变黄时开始接收洗出液，当洗出液再次用氢氧化钠检测不再变黄时，停止接收，共接得洗出液600ml，35℃以下，-0.096MPa旋转蒸发仪浓缩至120ml。将所得浓缩液在搅拌条件下滴加入95％乙醇600ml，最终得白色固体粉末5.5g，四水合辅羧酶含量99.2％。此时，改用10％盐酸淋洗，并收集洗出液，当用氢氧化钠检测洗出液不再变黄时，停止接收。共接得洗出液450ml，45℃以下-0.096MPa，旋转蒸发仪浓缩至200ml，滴加95％乙醇，最终得微黄色固体粉末14.2g含量95.5％，该黄色粉末即为副产物维生素B1磷酸酯的盐酸盐。
权利要求
1.一种高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的方法为磷酸与五氧化二磷在加热条件下与维生素B1充分反应至无游离氯离子，冷却得到辅羧酶粗品；再将所述的辅羧酶粗品纯化先置于大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂柱中，用纯水洗脱并收集洗出液A，所述的洗出液A为用碱液检测呈黄色的洗出液，将洗出液A浓缩后再置于弱酸性的阳离子交换树脂柱，用纯水洗脱并收集洗出液B，所述的洗出液B为用碱液检测呈黄色的洗出液，经后处理后结晶制得高纯度四水合辅羧酶。
2.如权利要求1所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为下列型号之一D315、D301、D335、D345。
3.如权利要求2所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂型号为D315。
4.如权利要求1所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的弱酸性的阳离子交换树脂为下列型号之一HZD-2、HZ016、JK006、JK008。
5.如权利要求4所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的弱酸性的阳离子交换树脂型号为HZD-2。
6.如权利要求1所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的制备方法中，所述的辅羧酶粗品纯化的步骤为将所述的辅羧酶粗品溶于水中，装入所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂柱，用纯水洗脱，用氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液A，直至接收到氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，将洗出液A浓缩后再置于弱酸性的阳离子交换树脂柱，当用氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液B，直至接收到氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，经后处理后结晶制得高纯度四水合辅羧酶。
7.如权利要求6所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的后处理为将洗出液B减压蒸馏浓缩至原体积的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，过滤，得湿产物粗品，再将湿产物粗品干燥至恒重。
8.如权利要求6所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂柱选用D315，所述的弱酸性的阳离子交换树脂柱选用HZD-2型。
9.如权利要求1～8之一所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的维生素B1∶磷酸∶五氧化二磷的质量比为1∶2～3∶1～3，具体步骤如下将磷酸加入到反应容器中，130～175℃充分搅拌，加入五氧化二磷后165～175℃保温反应，130℃～145℃加入维生素B1，充分反应至反应液中无游离的氯离子，冷却至50℃以下，加入到冷水中，控制水温在70℃以下，形成透明溶液，冷却至室温后滴入装有95％乙醇的除酸反应容器中-5～5℃静置过夜，除去上清液后得所述的辅羧酶粗品，再将辅羧酶粗品纯化。
10.如权利要求9所述的高纯度四水合辅羧酶的制备方法，其特征在于所述的方法为将所述的辅羧酶粗品溶于水中，装入D315交换树脂柱，用超纯水洗脱，用1.0mol/l氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液A，直至接收到1.0mol/l氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，将洗出液A浓缩后再置于HZD-2交换树脂柱，当用1.0mol/l氢氧化钠溶液检测洗出液显黄色时，开始接收洗出液B，直至接收到1.0mol/l氢氧化钠溶液检测洗出液不显黄色，将洗出液B减压蒸馏浓缩至原体积的1/8至1/5，再滴加95％的乙醇，过滤，得湿产物粗品，再将湿产物粗品干燥至恒重，即得所述的高纯度四水合辅羧酶。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度四水合辅羧酶的制备方法。所述的方法为磷酸与五氧化二磷在加热条件下与维生素B
文档编号C07F9/6539GK1887891SQ20061005259
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者王维, 蒋勇, 张晓东 申请人:杭州德默医药科技有限公司