专利名称：一种提取胶原的方法及用胶原制备胶原蛋白的方法
技术领域：
本发明属于胶原及胶原蛋白制备领域，尤其涉及一种以罗非鱼加工过程中产生的下脚料鱼皮为原料提取胶原的方法以及用提取的胶原为原料制备小分子量胶原蛋白的方法。
背景技术：
胶原及胶原蛋白在医药及化妆品领域得到重要的应用。胶原具有很强的生物活性、较弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域得到广泛的应用。胶原蛋白具有保湿、修复、延缓衰老，营养等作用。胶原蛋白能促进皮肤胶原的合成，促进胶原代谢，能明显改善与老化相关的胶原合成低下的作用。
目前，国内已报导了一些胶原蛋白提取及制备方法。
李彦春、祝德义、侯立杰等以牛皮边角废料为原料，用两步酶解法提取胶原蛋白多肽，对影响酶水解过程的各个因素进行了分析；通过对水解产物分子量分布和等电点等指标的测定，发现分子量呈不连续分布，主要集中在某些分子量处，分子量的分布主要与水解方式和所用酶的种类有关。
2000410024145.1专利介绍了一种用鱼皮生产胶原蛋白肽的工艺，以鱼皮为原料，将鱼皮用水洗净捞出；放入1‰NaOH水溶液中，浸泡24小时，至少重复三次，除去杂蛋白；用浓度为0.5％～1‰的NaOH或NaHCO3除去杂蛋白，用0.5％～1‰的醋酸溶液于40℃～50℃提取后，于反应釜中加热灭菌后，加中性食品酶水解，条件为pH7.5，1～1.5小时，加酶量为1∶50(酶∶皮)；水解液加活性炭处理后采用工业板框过滤器过滤、脱色；过滤液浓缩，喷雾干干燥成产品。还有其它专利介绍不同的方法提取制备胶原或胶原蛋白。但这些方法多只涉及单一的胶原或胶原蛋白的提取或制备；不含提取前的预处理工序，得到的产物中含有较多的杂质，而且提取温度较高，提取时间较长，特定结构的胶原结构被破坏，得到的是变性的胶原蛋白；在酶解过程中得到的产物的分子量分布不集中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取胶原的方法。
本发明的另一目的在于用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法。
本发明用罗非鱼皮提取胶原以及用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白，与已有的报道的不同，其中包括罗非鱼皮的预处理，胶原的低温提取，以获得未变性的高纯度的胶原，同时以高纯度的胶原为原料进行水解胶原蛋白的酶解制备，获得高纯度小分子量的胶原蛋白。
为此，本发明采用的技术方案如下。
一种提取胶原的方法，步骤如下(1)以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1∶10～1∶20g/ml加入正己烷，在温度3℃～25℃下脱脂48～72h；(2)脱脂后用0.05～0.2mol/L的NaOH溶液，在25℃下除杂蛋白2～5h，重复两次；(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白，醋酸溶液的浓度为0.6mol/L，除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1∶10～1∶15g/ml，提取时间为24～48h，提取温度为15～30℃，重复提取二次；(4)按提取物与水的质量体积比1∶2.5g/ml加入水，进行水洗，经纯化、浓缩后，冷冻干燥得到胶原。
所述步骤(3)中可在用醋酸溶液提取的基础上再加超声波辅助提取，功率条件为20～80w/5g预处理的鱼皮，可提高提取效率。
用提取的胶原制备胶原蛋白的方法，步骤如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用蛋白酶进行酶解；(2)酶解结束后，升温至90～100℃，保温5～10min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白。
所述步骤(1)中蛋白酶不同其酶解作用条件也不同，胰蛋白酶酶解作用条件为E/[S]为500～900u/g、酶解时间为90min、酶解温度为35～45℃、pH为7.5～8.5；Alcalase2.4L酶解作用条件为E/[S]为1000～2000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为50～60℃、pH为7.0～8.5；木瓜蛋白酶酶解作用条件为E/[S]为5000～6400u/g、酶解时间为3h、酶解温度为55～65℃、pH为5.0～7.0。
上述方法制备的胶原蛋白中，分子量为500～20000的含量高，其中分子量分布范围为2000～7000的胶原蛋白占较高比例。
本发明制备的胶原及胶原蛋白可用于医药及化妆品中。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(1)本发明以罗非鱼加工的下脚料罗非鱼鱼皮为原料，提取胶原蛋白，并制备水解胶原蛋白，能使罗非鱼鱼皮得到充分的利用，实现罗非鱼鱼皮的高值利用；(2)本发明采用正己烷脱脂，用NaOH除杂蛋白，除去鱼皮中所含的脂肪和杂蛋白，提高提取胶原的纯度；采用醋酸溶液为提取液及温和的提取工艺，保持胶原的不变性；(3)本发明可选用不同的蛋白酶对胶原进行酶解，并采用不同的酶解工艺，酶解产物分子量范围为500～20000的含量高，且产物中分子量分布范围为2000～7000的胶原蛋白占较高比例。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1提取胶原的方法如下(1)以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1∶10g/ml加入正己烷，在温度25℃下脱脂72h；(2)脱脂后用0.05mol/L的NaOH溶液，在25℃下除杂蛋白5h，重复两次；(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白，醋酸溶液的浓度为0.6mol/L，除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1∶10g/ml，提取时间为48h，提取温度为30℃，重复提取二次；(4)按提取物与水的质量体积比1∶2.5g/ml加入水，进行水洗，经纯化、浓缩后，冷冻干燥得到胶原，胶原的得率为44％。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用胰蛋白酶进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为700u/g、酶解时间为90min、酶解温度为35℃、pH为8.5；(2)酶解结束后，升温至90℃，保温10min；
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44％。
实施例2提取胶原的方法同实施例1。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用胰蛋白酶进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为500u/g、酶解时间为90min、酶解温度为40℃、pH为8.0；(2)酶解结束后，升温至95℃，保温8min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的91％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的43％。
实施例3提取胶原的方法同实施例1。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用胰蛋白酶进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为900u/g、酶解时间为90min、酶解温度为45℃、pH为7.5；(2)酶解结束后，升温至100℃，保温5min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44％。
实施例4提取胶原的方法如下(1)以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1∶20g/ml加入正己烷，在温度3℃下脱脂48h；(2)脱脂后用0.2mol/L的NaOH溶液，在25℃下除杂蛋白2h，重复两次；(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白，醋酸溶液的浓度为0.6mol/L，除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1∶15g/ml，提取时间为24h，提取温度为15℃，重复提取二次；(4)按提取物与水的质量体积比1∶2.5g/ml加入水，进行水洗，经浓缩后，冷冻干燥得到胶原，胶原的得率为43％。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用Alcalase2.4L进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为2000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为50℃、pH为8.5；(2)酶解结束后，升温至90℃，保温10min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44％。
实施例5提取胶原的方法同实施例4。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用Alcalase2.4L进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为1000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为55℃、pH为8.0；(2)酶解结束后，升温至95℃，保温8min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的91％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的43％。
实施例6提取胶原的方法同实施例4。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用Alcalase2.4L进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为1500u/g、酶解时间为60min、酶解温度为60℃、pH为7.0；(2)酶解结束后，升温至100℃，保温5min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44％。
实施例7提取胶原的方法如下(1)以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1∶15g/ml加入正己烷，在温度15℃下脱脂60h；(2)脱脂后用0.1mol/L的NaOH溶液，在25℃下除杂蛋白3h，重复两次；
(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白，醋酸溶液的浓度为0.6mol/L，除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1∶12g/ml，提取时间为36h，提取温度为25℃，重复提取二次；(4)按提取物与水的质量体积比1∶2.5g/ml加入水，进行水洗，经浓缩后，冷冻干燥得到胶原，胶原的得率为44％。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用木瓜蛋白酶进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为6400u/g、酶解时间为3h、酶解温度为55℃、pH为5.0；(2)酶解结束后，升温至90℃，保温10min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44％。
实施例8提取胶原的方法同实施例7。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用木瓜蛋白酶进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为5000u/g、酶解时间为3h、酶解温度为65℃、pH为7.0；(2)酶解结束后，升温至95℃，保温8min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的91％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的43％。
实施例9提取胶原的方法同实施例7。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用木瓜蛋白酶进行酶解，酶解作用条件为E/[S]为5800u/g、酶解时间为3h、酶解温度为60℃、pH为6.0；(2)酶解结束后，升温至100℃，保温5min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白，得到的分子量为500～20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90％，其中分子量为2000～7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44％。
实施例1～9中，提取胶原方法中的步骤(3)可在用醋酸溶液提取的基础上再加超声波辅助提取，功率条件为20～80w/5g预处理的鱼皮，如20w/5g、40w/5g、80w/5g等预处理的鱼皮，这样可提高提取效率。
权利要求
1.一种提取胶原的方法，其特征在于步骤如下(1)以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1∶10～1∶20g/ml加入正己烷，在温度3℃～25℃下脱脂48～72h；(2)脱脂后用0.05～0.2mol/L的NaOH溶液，在25℃下除杂蛋白2～5h，重复两次；(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白，醋酸溶液的浓度为0.6mol/L，除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1∶10～1∶15g/ml，提取时间为24～48h，提取温度为15～30℃，重复提取二次；(4)按提取物与水的质量体积比1∶2.5g/ml加入水，进行水洗，经纯化、浓缩后，冷冻干燥得到胶原。
2.根据权利要求1所述的提取胶原的方法，其特征在于所述步骤(3)中在用醋酸溶液提取的基础上再加超声波辅助提取，功率条件为20～80w/5g预处理的鱼皮。
3.一种用权利要求1的方法提取的胶原制备胶原蛋白的方法，其特征在于步骤如下(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解，然后利用蛋白酶进行酶解；(2)酶解结束后，升温至90～100℃，保温5～10min；(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于所述步骤(1)中蛋白酶是胰蛋白酶，酶解作用条件为E/[S]为500～900u/g、酶解时间为90min、酶解温度为35～45℃、pH为7.5～8.5。
5.根据权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于所述步骤(1)中蛋白酶是Alcalase2.4L，酶解作用条件为E/[S]为1000～2000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为50～60℃、pH为7.0～8.5。
6.根据权利要求3所述的制备胶原蛋白的方法，其特征在于所述步骤(1)中蛋白酶是木瓜蛋白酶，酶解作用条件为E/[S]为5000～6400u/g、酶解时间为3h、酶解温度为55～65℃、pH为5.0～7.0。
全文摘要
本发明公开了一种提取胶原的方法及用胶原制备胶原蛋白的方法。本发明以罗非鱼皮为原料，将鱼皮剪碎后加入正己烷，脱脂后用NaOH溶液除杂蛋白，然后用醋酸溶液提取胶原蛋白，经浓缩、冷冻干燥得到胶原。用提取的胶原制备胶原蛋白的方法将提取得到的胶原加入水，溶解，然后利用蛋白酶进行酶解，经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白。本发明用正己烷脱脂，用NaOH除杂蛋白，除去鱼皮中所含的脂肪和杂蛋白，提高了提取胶原的纯度；采用醋酸溶液为提取液及温和的提取工艺，保持了胶原的不变性，采用超声波提高提取效率；采用特定的酶解工艺，控制酶解产物的分子量范围。本发明制备的胶原及胶原蛋白可用于医药及化妆品中。
文档编号C07K14/78GK1903918SQ200610036860
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者曾庆孝, 宁初光, 朱志伟, 阮征, 张立彦, 李汴生 申请人:华南理工大学