专利名称：一种土壤微生物dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤微生物DNA的提取方法。
背景技术：
土壤中微生物的数量和种类十分庞大，据估计，1g土壤中含有1010以上的微生物。长期以来，研究土壤微生物群落的多样性通过传统纯培养方法进行，而在营养平板上能生长的只占其中0.001％～10％，另一方面，被分离培养的微生物通常并不是分离者所期望的自然生境中的某些优势种群。显然，传统的纯培养技术具有较大的局限性，其结果不能准确反映系统中微生物群落的真实组成。近年来，分子生物学的迅速发展，使研究者可以不再依赖于微生物的分离培养技术，而是在基因组DNA水平上对复杂的微生物生态系统进行分析研究。如聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、限制性酶切片段多态性分析(RFLP)和末端限制性酶切片段多态性分析(T-RFLP)等相继用来评价土壤环境微生物群落多样性变化，这就是近年来出现的一门新学科——微生物分子生态学。应用物理或化学方法从土壤中提取高质量的微生物DNA，则是分子水平上揭示生物群落分布多样性的基础。
目前土壤DNA的提取方法主要通过直接原位裂解土壤微生物细胞来提取DNA。DNA提取方法的有效性受各种因素的影响，其中包括细胞裂解不完全，DNA分子吸附在样品基质颗粒的表面，从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂，DNA分子的损耗、降解和破坏等。其中由于提取的DNA中腐殖质和有机酸的含量过高(OD260/OD230一般都小于1.5，OD260/OD280一般都小于1.2)，抑制了限制性内切酶和Taq酶等酶类的作用，是目前各种DNA提取方法中最大的问题。所提取的DNA必须经过一系列的纯化手段(主要通过商品化的试剂盒)，DNA的纯度才能达到分子操作的要求。因而，目前DNA的提取方法不但涉及到繁多的化学试剂和复杂的操作步骤，同时大大增加了操作成本，限制了快速、大量样品的分析。
发明内容本发明的目的则是克服现有土壤DNA提取涉及繁多化学试剂和操作复杂的不足，提供一种可将大量腐殖质和蛋白质去除、所得到的土壤DNA可直接用于PCR等分子操作的土壤DNA的提取方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种土壤微生物DNA的提取方法，所述的方法步骤如下(1)土壤微生物细胞裂解土壤置于含蛋白酶K0.1～0.4g/L、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)0.01～0.02g/L的细胞裂解缓冲液中，50～60℃振荡30～60min后，每100mL裂解缓冲液加入1g表面活性剂，60～70℃温浴，离心，取上清液得细胞裂解液；(2)粗DNA溶液的获得将步骤(1)所得细胞裂解液加入0.5～1倍体积的聚乙二醇溶液，室温沉淀1～3h后，离心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液，所述TE溶液为10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0；(3)土壤微生物DNA的获得将粗DNA溶液去蛋白，经分离纯化即得所述的土壤微生物DNA。
所述步骤(2)中所用聚乙二醇为PEG20000，通常采用300g/L的PEG20000与等体积1.6M NaCl的混合溶液，以促进DNA的沉淀。
所述步骤(3)如下往步骤(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸盐或铵盐沉淀部分蛋白质，离心取上清，再用酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，离心，取上清用异丙醇沉淀过夜，将絮状DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得纯化的土壤微生物DNA。
所述步骤(1)中表面活性剂可用常用的表面活性剂，本发明中采用十二烷基硫酸钠。
所述步骤(1)中细胞裂解缓冲液采用常用的细胞裂解缓冲液即可，本发明中采用的细胞裂解缓冲液为100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0。
所述步骤(3)中去蛋白方法如下往粗DNA溶液中加入乙酸盐或铵盐沉淀部分蛋白质，离心取上清，再用酚氯仿、氯仿异戊醇抽提去除蛋白质。也可采用其他常用的去蛋白的方法进行。
所述步骤(3)中分离纯化方法如下将除去蛋白质的粗DNA溶液离心，取上清用异丙醇沉淀过夜，将絮状DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得纯化的土壤微生物DNA。也可采用其他常用的分离纯化方法来对DNA进行纯化。
具体的，所述的方法如下(1)土壤微生物细胞裂解取土壤置于含细胞裂解缓冲液100mMTris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH 8.0的容器中，每10mL细胞裂解缓冲液加入5g土壤、2mg蛋白酶K、0.1mg交联聚乙烯吡咯烷酮和5g小玻璃珠，55℃振荡30min，加入体积为细胞裂解缓冲液1/10的100g/L十二烷基硫酸钠溶液，振荡1min后65℃温浴1h，离心，取上清液得细胞裂解液；
(2)粗DNA溶液的获得将步骤(1)所得细胞裂解液加入0.5倍体积的300g/LPEG20000与等体积1.6M NaCl的混合溶液，室温沉淀2h后，离心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液；(3)土壤微生物DNA的获得往步骤(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸钾至终浓度至0.5M，沉淀部分蛋白质，离心取上清，再用与上清液等体积的酚∶氯仿体积比为1∶1溶液抽提去除蛋白质，离心，取上清液，再用与上清液等体积的氯仿∶异戊醇体积比为24∶1溶液抽提去除蛋白质，离心，再取上清，用体积为上清液0.6倍的异丙醇，沉淀，将产生絮状DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得纯化的土壤微生物DNA。。
本发明所述的方法是利用PVPP、蛋白酶K等化学物质的有效组合，通过PEG20000、异丙醇等有机溶剂的沉淀后，用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值(注OD260/OD230＞2.0时腐殖质和有机酸含量极低；OD260/OD280＞1.6时蛋白质含量极低)接近于标准值，可直接应用于分子操作，具有重大应用前景。
(四)
图1为实施例1所提取DNA扩增16S rDNA和18S rDNA序列图；泳道1～5为实施例2所提土壤微生物DNA的16S rDNA扩增(引物为27f/1492r)，6～8为实施例1所提取的土壤微生物DNA扩增的16S rDNA片段；9～11为非实施例2所提土壤微生物DNA的18S rDNA扩增(引物为EF4f/Fung5r)；12为DNA Marker；13～14为实施例1所提取的土壤微生物DNA扩增的18S rDNA。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1土壤DNA的提取步骤(1)土壤微生物细胞裂解1)将5g土壤放置于含10ml的土壤提取缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0)的三角瓶中，提取液中添加2mg蛋白酶K、0.1mgPVPP和5g小玻璃珠，55℃振荡30min(转速为180rpm)；2)加入1ml的100g/LSDS，并继续振荡1min；3)样品转到65℃温浴1h后，在6000rpm转速下离心10min，取上清液，得细胞裂解液。
(2)粗DNA溶液的获得1)往细胞裂解液加入1/2体积的PEG20000(300g/L的PEG20000与等体积的1.6M NaCl混合)，室温沉淀2h；2)在10000rpm转速下，室温离心20min，取沉淀；3)沉淀用0.5ml的TE溶解，即得粗DNA溶液。
(3)土壤微生物DNA的获得1)在步骤(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸钾(7.5M)至终浓度为0.5M，颠倒混匀后，冰上放置5min；
2)14000rpm、4℃离心30min，取上清液置于新的离心管，加入等体积的酚/氯仿(体积比1∶1)，上下温和颠倒混匀；3)10000rpm、4℃离心5min，取上清液置于新的离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，上下温和颠倒混匀；4)10000rpm、4℃离心5min，取上清液置于新的离心管，加入0.6体积的异丙醇，上下温和颠倒混匀，放置于室温2hr；5)将产生得絮状DNA沉淀勾出后，用75％乙醇漂洗，并在空气中自然风干，溶于300ulTE中，得到纯化的DNA。
实施例2对比实验对照方法在DNA提取缓冲液中不加PVPP，DNA初沉淀不用PEG20000，而是用异丙醇代替，其它操作步骤不变。
对两种提取方法所提取的DNA纯度进行了对比实验。用分光光度计分别测定对照方法和本发明方法所得DNA溶液的OD260/OD230、OD260/OD280值，结果见表1。从表1中可以看出，对照方法所提取到土壤DNA的OD260/OD230和OD260/280分别只有0.87和1.17远低于标准的2.0和1.6，说明DNA溶液中的腐殖质和蛋白质的含量非常高，不经过进一步的纯化处理无法进行分子操作；而本发明方法所提取的DNA溶液，OD260/OD230和OD260/280都接近于标准值，说明本发明所述方法所提取到的土壤DNA纯度比对照方法高的多，可直接应用于分子操作。
表1将两种方法所提取的DNA在分光光度计中检测OD260/OD230、OD260/OD280值
实施例3其它类型土壤中的微生物DNA的提取利用实施例1所述的方法提取来自四川(取自峨嵋山)、浙江杭州、浙江桐庐土壤DNA。对来自三个不同地方的土壤进行DNA提取，用分光光度计分别测定所得DNA溶液的OD260/OD230、OD260/OD280值，结果见表2。表2结果显示用发明内容中所述方法，所提取到的不同地区的土壤DNA的OD260/OD230都接近2.0，说明DNA溶液中的腐殖质类含量非常低；OD260/280接近于1.6，表明DNA溶液中的蛋白质含量非常低。因此，本发明方法也适合提取其它类型的土壤微生物DNA。
表2不同地区所提取的DNA在分光光度计中检测OD260/OD230、OD260/OD280值
实施例4PCR扩增检验将实施例1本发明提取方法所得DNA溶液和实施例2非本发明方法所得DNA溶液分别进行PCR扩增，用引物27f/1492r(27f，5’-AGA GTT TGATCM TGG CTC AG-3’；1492r，5’-TAC GGH TAC CTT ACG ACT T-3’)扩增细菌16SrDNA片段，目的片段约为1500bp；用引物EF4f/5r(GGAAGGG[G/A]TGTATTTATTAG；Fung5r GTAAAAGTCCTGGTTCCC)扩增真菌18srDNA片段。扩增条件为94℃ 3min(1 cycle)，94℃ 1min，55℃ 1min(EF4f/Fung5r48℃)，72℃ 2min(35 cycles)，72℃ 10min(1cycle)；目的片段约为530bp。结果显示，本发明方法所提到的DNA经两对引物扩增后，分别得到与目的片段大小完全一致的DNA条带(见图1)，说明本发明方法所提取的DNA可直接应用于分子操作。
权利要求
1.一种土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述的方法步骤如下(1)土壤微生物细胞裂解土壤置于含蛋白酶K0.1～0.4g/L、交联聚乙烯吡咯烷酮0.01～0.02g/L的细胞裂解缓冲液中，50～60℃振荡30～60min后，每100mL裂解缓冲液加入1g表面活性剂，60～70℃温浴，离心，取上清液得细胞裂解液；(2)粗DNA溶液的获得将步骤(1)所得细胞裂解液加入0.5～1倍体积的聚乙二醇溶液，室温沉淀1～3h后，离心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液，所述TE溶液为10mMTris，1mM EDTA，pH8.0；(3)土壤微生物DNA的获得将粗DNA溶液去蛋白，经分离纯化即得所述的土壤微生物DNA。
2.如权利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于步骤(2)中所用聚乙二醇为PEG20000。
3.如权利要求2所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于步骤(2)中所用聚乙二醇溶液为300g/L的PEG20000与等体积1.6MNaCl的混合溶液。
4.如权利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤(3)如下往步骤(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸盐或铵盐沉淀部分蛋白质，离心取上清，再用酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质，离心，取上清用异丙醇沉淀过夜，将絮状DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得纯化的土壤微生物DNA。
5.如权利要求1～4之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤(1)中表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
6.如权利要求1～4之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤(1)中细胞裂解缓冲液为100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0。
7.如权利要求1～3之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中去蛋白方法如下往粗DNA溶液中加入乙酸盐或铵盐沉淀部分蛋白质，离心取上清，再用酚氯仿、氯仿异戊醇抽提去除蛋白质。
8.如权利要求1～3之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中分离纯化方法如下将除去蛋白质的粗DNA溶液离心，取上清用异丙醇沉淀过夜，将絮状DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得纯化的土壤微生物DNA。
9.如权利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述的方法如下(1)土壤微生物细胞裂解取土壤置于含细胞裂解缓冲液100mMTris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0的容器中，每10mL细胞裂解缓冲液加入5g土壤、2mg蛋白酶K、0.1mg交联聚乙烯吡咯烷酮和5g小玻璃珠，55℃振荡30min，加入体积为细胞裂解缓冲液1/10的100g/L十二烷基硫酸钠溶液，振荡1min后65℃温浴1h，离心，取上清液得细胞裂解液；(2)粗DNA溶液的获得将步骤(1)所得细胞裂解液加入0.5倍体积的300g/LPEG20000与等体积1.6M NaCl的混合溶液，室温沉淀2h后，离心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液；(3)土壤微生物DNA的获得往步骤(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸钾至终浓度至0.5M，沉淀部分蛋白质，离心取上清，再用与上清液等体积的酚氯仿体积比为1∶1溶液抽提去除蛋白质，离心，取上清液，再用与上清液等体积的氯仿∶异戊醇体积比为24∶1溶液抽提去除蛋白质，离心，再取上清，用体积为上清液0.6倍的异丙醇，沉淀，将产生絮状DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得纯化的土壤微生物DNA。。
10.如权利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述的方法如下(1)土壤微生物细胞裂解1)将5g土壤放置于含10ml的土壤提取缓冲液--100mMTris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0的三角瓶中，提取液中添加2mg蛋白酶K、0.1mgPVPP和5g小玻璃珠，55℃振荡30min，转速为180rpm，；2)加入1ml的100g/LSDS，并继续振荡1min；3)样品转到65℃温浴1h后，在6000rpm转速下离心10min，取上清液，得细胞裂解液。(2)粗DNA溶液的获得1)往细胞裂解液加入1/2体积的300g/L PEG20000与等体积的1.6M NaCl混合溶液，室温沉淀2h；2)在10000rpm转速下，室温离心20min，取沉淀；3)沉淀用0.5ml的TE溶解，即得粗DNA溶液。(3)土壤微生物DNA的获得1)在步骤(2)所得粗DNA溶液中加入7.5M乙酸钾至终浓度为0.5M，颠倒混匀后，冰上放置5min；2)14000rpm、4℃离心30min，取上清液置于新的离心管，加入等体积的酚/氯仿体积比1∶1的溶液，上下温和颠倒混匀；3)10000rpm、4℃离心5min，取上清液置于新的离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇体积比24∶1的溶液，上下温和颠倒混匀；4)10000rpm、4℃离心5min，取上清液置于新的离心管，加入0.6体积的异丙醇，上下温和颠倒混匀，放置于室温2h；(4)将产生得絮状DNA沉淀勾出后，用75％乙醇漂洗，并在空气中自然风干，溶于300ulTE中，得到纯化的DNA。
全文摘要
本发明提供了一种土壤微生物DNA的提取方法，所述的方法包括土壤微生物细胞裂解、粗DNA溶液的获得、土壤微生物DNA的获得等步骤；本发明所述的方法是利用PVPP、蛋白酶K等化学物质的有效组合，通过PEG20000、异丙醇等有机溶剂的沉淀后，用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于标准值，可直接应用于分子操作，具有重大应用前景。
文档编号C07H1/00GK1978453SQ20051006187
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月7日 优先权日2005年12月7日
发明者钱海丰, 程秋霞, 王智烨, 徐茜, 许皓 申请人:浙江工业大学