专利名称：一种莪术醇的微生物转化产物及其用途和制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种莪术醇的微生物转化产物及其医药用途和制备方法。
背景技术：
病毒作为一种致病源，一直以来都是药物研究工作者的关注对象。由于其对宿主细胞的侵染性强，破坏不可逆转并且难以彻底消灭，对人类健康造成了严重的威胁。莪术为姜科多年生草本，亦称“蓬莪术”、“山姜黄”，根茎入中药。纲目名蓬莪茂，列入草部芳香部。本品为植物蓬莪术Curcuma phaeocaulisValeton、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G..Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，自古就被认为有行气破血、消积止痛的功效，用于治疗淤血经闭、食积胀痛等症。近年研究发现其挥发油具有抗病毒功用，莪术静脉注射液对呼吸道合胞病毒(RSV)有直接灭活作用。(郑企静，复方莪术注射液治疗婴幼儿病毒肺炎的试验和临床研究。友谊医刊，1986，19(3)88-92)。研究表明莪术静脉注射液治疗幼儿RSV肺炎有较好疗效且无副作用，其机理包括(1)抑制病毒作用；(2)改善肺部微循环；(3)减轻支气管的高过敏反应(阎田玉，莪术静脉注射液治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎及其作用原理。中国中西医结合杂志，1992，12(12)711-715)。莪术醇为莪术挥发油中主要有效成份之一，对病毒有明显的灭活作用，但其缺点在于水溶性很差，难以制成良好的药物剂型，而且具有一定的毒性，LD50为250mg/kg(辽宁中医学院医学系肿瘤组，温莪术有效成分抗肿瘤作用的实验研究。新医药学杂志，1976，17(12)28-32)。因此一直以来未被开发为临床用药。
所谓微生物转化反应就是利用微生物代谢过程中某个或一组酶对底物进行催化的反应。具有高度立体选择性，不仅对结构有化学选择性和非对映异构体选择性，并且有严格的区域选择性、面选择性和对映异构体选择性。而且反应条件温和，公害少，成本低廉。对中药成分生物转化进行研究，其主要目的就是通过对中药有效成分在微生物体内的转化产物的研究来寻找新药源，以及对新活性成分的发现、新前体物质的制备，都有着极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是寻找较莪术醇更加高效低毒，具有较好水溶性，更适合药物制剂的有效化合物一种莪术醇的微生物转化产物及其医药用途和制备方法。本试验使用黑曲霉(AS 3.739)对莪术醇进行了微生物转化反应，获得了一种具有抗病毒活性的新化合物--3β羟基莪术醇，该化合物为莪术醇在黑曲霉作用下的主要转化产物，收率约为26％。
本发明中转化产物可以由以下方式得到 a)微生物的培养将微生物从固体培养基接种至预先配置好的液体土豆培养基(含2％葡萄糖)中，置于恒温振荡器中于180rpm，25C条件下培养两日。
b)加入底物将底物溶于适量丙酮中，配成10mg/ml丙酮溶液。加入已培养2日的微生物发酵液中，在相同条件下继续培养5日。
c)发酵液的处理发酵液抽滤后收集滤液，在减压条件下低温浓缩至小体积，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏。
d)转化产物的分离纯化将步骤c)得到的粗浸膏用硅胶柱层析分离，以环己烷∶丙酮梯度洗脱(100，50∶1，25∶1，20∶1，10∶1，5∶1)。在10∶1洗脱部分得到无色结晶即为所需转化产物。其纯度经薄层色谱和高效液相色谱(检测器UV、RID)检测达到99.1％(见附图1和2) 转化产物为(1)
所示的-3β-羟基莪术醇化合物。
所述转化产物为-3β-羟基莪术醇化合物可用于制备抗病毒药物。
利用微生物黑曲霉(AS3.739)对底物莪术醇进行生物转化，并利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱层析法进行转化产物的分离制备。
所制得的转化产物，其纯度根据薄层色谱和高效液相色谱检测可达到99％以上。
该化合物具有以下理化数据colorless needles；[α]25D＝-49.4 (c 0.13，MeOH)；HRMScalcd for C15H25O3[M+H]+，253.1798，found 253.1795；IR νmax(KBr)3433，3073，2968，1646，1460，1367，1333，1281，1131，1053，989，893，799，613cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.87(d，J＝6.5Hz，3H，H-13)，1.00(d，J＝6.4Hz，3H，H-12)，1.10(d，J＝7.0Hz，3H，H-15)，1.25(q，J＝6.7Hz，1H，H-6β)，1.45(m，J＝6.8Hz，1H，H-7)，1.62(o，1H，H-2a)，1.71(o，1H，H-11)，1.80(o，1H，H-4)，2.15(t，J＝12.3Hz，1H，H-6α)，2.18(o，1H，H-2b)，2.49(t，J＝14.6Hz，1H，H-9a)，2.51(o，1H，H-1)，2.55(t，J＝14.9Hz，1H，H-9b)，4.11(t，J＝6.5Hz，1H，H-3)，4.91(t，J＝3.0Hz，2H，H-14).13C NMR(CDCl3，100MHz)δ10.1(C-15)，21.4(C-12)，23.0(C-13)，28.5(C-11)，35.0(C-6)，38.5(C-9)，38.9(C-2)，49.4(C-4)，51.7(C-1)，56.2(C-7)，79.3(C-3)，88.1(C-5)，104.6(C-8)，113.6(C-14)，143.4(C-10).(见附图2) 经实验证实该化合物具有显著的抗病毒活性。可望制备抗病毒药物。
图1为莪术醇转化产物正相高效薄层色谱图。(薄层条件正相高效薄层板，展开条件环己烷∶丙酮(2∶1)，显色条件10％H2SO4) 图2为莪术醇转化产物反相高效薄层色谱图。
图3为莪术醇转化产物高效液相色谱分析图(紫外检测器)(分析色谱柱VP-ODS；流动相50％MeOH；流速1ml/min) 图4为莪术醇转化产物高效液相色谱分析图(示差检测器)(分析色谱柱VP-ODS；流动相50％MeOH；流速Iml/min)
具体实施例方式 实施例1取底物莪术醇500mg，溶解后加入已培养2日的微生物发酵液中，继续培养5日后取下摇瓶。发酵液抽滤除去菌丝体，合并滤液，浓缩至小体积，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，得1.2g粗浸膏。将该浸膏用甲醇溶解，拌入3g100-140目硅胶，挥发溶剂至于，待上样。取50g200-300目硅胶，湿法装柱，然后加入处理好的样品，进行柱层析。用环己烷∶丙酮梯度洗脱(100，50∶1，25∶1，20∶1，10∶1，5∶1)。在10∶1洗脱部分获得无色结晶130mg(收率为26％)，即为转化产物。
试验例1本发明转化产物的体外抗病毒试验 用Hela细胞接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。
(1)细胞毒性试验将莪术醇和转化产物分别稀释为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml.等浓度，将上述用培养液稀释好的不同浓度的药品滴加于Hela单层细胞上，每孔0.2ml，37℃5％CO2孵箱培养，每天镜下观察细胞病变(CPE)，求出药液致细胞毒性，计算药物对细胞毒性浓度。结果表明莪术醇在25μg/ml及以上稀释的各浓度对Hela细胞无毒性作用；转化产物在50μg/ml及以上稀释的各浓度对Hela细胞无毒性作用。
(2)药物对病毒致细胞病变作用的影响在Hela细胞上分别加入6种病毒液(流感病毒FM1株，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒3型(AdV-III)，柯萨奇病毒B3(CVB3)株，副流感病毒，单纯疱疹病毒I型(HSV-I)SM44株)在37℃吸附1h后洗去病毒液，加入无毒界限药液(莪术醇25μg/ml、转化产物50μg/ml、病毒唑62.5μg/ml)，同时设病毒对照，细胞对照。置37℃ CO2培养箱内培养，每天在倒置显微镜下观察病变，连续7d，记录各孔病变情况。结果表明转化产物在体外有较好的抑制抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒III型和单纯疱疹病毒I型的致细胞病变作用，如下表所示 表1莪术醇及其转化产物对病毒致细胞病变作用的影响 病毒株 流感病毒 副流感病毒 CVB5RSV AdVIII HSV-I 感染量100100301003050 莪术醇+±++±++ 转化产物± -+-±± 病毒唑± -±-±- 细胞对照- --- --病毒对照++++++++++++ ++++++++ ++++ (注-示无细胞病变；±示有延缓细胞病变作用；+示1/4以下的细胞病变；++示1/4～1/2的细胞有病变；+++示1/2～3/4的细胞有病变；++++示3/4以上的细胞有病变。) 体外抗病毒试验结果表明转化产物较底物莪术醇的毒性降低了一倍，在相同毒性条件下，转化产物的抗病毒活性较强，和阳性对照药病毒唑基本相当。
试验例2本发明转化产物在小鼠体内抗RSV病毒试验 取昆明种小鼠95只，雌雄各半，随机分为4组A组22只，RSV感染(感染组)；B组23只，RSV感染后，腹腔注射乙醇异丙醇溶液(1∶10)(对照组)；C组25只，RSV感染后，腹腔注射转化产物的乙醇异丙醇溶液(1mg/ml)(治疗组)；D组25只，RSV感染后，腹腔注射病毒唑水溶液(1mg/ml)(药物对照组)。小鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经鼻腔滴入1∶5稀释的RSV悬液0.2ml，4h后，B组给以乙醇异丙醇溶液0.5ml/只；C组给以药液0.5ml/只；D组给以病毒唑0.5ml/只。每日一次，7日为一疗程，分别于5、8天将鼠处死，无菌取肺，用于RSV分离。
表2感染RSV病毒5、8天鼠肺RSV分离阳性率比较 组别 鼠数5天鼠数8天感染数感染率％感染数感染率％感染组对照组治疗组 药物对照组 11 11 12 1211115410010041.733.3 11 12 13 1311113310091.723.123.1 经X2检验，治疗组与感染组及对照组之间有较显著差异(5天P＜0.001，8天P＜0.0001)，而与药物对照组的感染率接近(P＞0.05)，该结果表明转化产物在动物模型体内具有抑制RSV病毒作用。
试验例3本发明转化产物在小鼠体内抗副流感病毒试验 取昆明种小鼠70只，雌雄各半，随机分为5组，每组14只。A组副流感病毒感染(感染组)；B组副流感病毒感染后，腹腔注射乙醇异丙醇溶液(1∶10)(对照组)；C组副流感病毒感染后，腹腔注射转化产物的乙醇异丙醇溶液(1mg/ml)(治疗组)；D组副流感病毒感染后，腹腔注射病毒唑水溶液(1mg/ml)(药物对照组)；E组不感染病毒，腹腔注射乙醇异丙醇溶液(阴性对照组)。小鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经鼻腔滴入未稀释的病毒液0.05ml，1h后，B组给以乙醇异丙醇溶液0.5ml/只；C组给以药液0.5ml/只；D组给以病毒唑0.5ml/只；E组不感染病毒，给以乙醇异丙醇溶液0.5ml/只。每日一次，7日为一疗程，连续观察14天，记录小鼠死亡情况。
表3感染副流感病毒14天后小鼠的死亡情况组别鼠数死亡数死亡率(％)感染组对照组14141414100100治疗组 药物对照组 阴性对照组14141432021.414.30 经X2检验，治疗组与感染组及对照组之间有较显著差异(P＜0.0001)，而与药物对照组的死亡率接近(P＞0.05)，该结果表明转化产物在动物模型体内具有抑制副流感病毒作用。
实施例3 取3β羟基莪术醇50g，加入淀粉细粉160g，用等量递增法混匀，用80％的乙醇，制成颗粒，干燥，整粒，混匀，加入化石粉4g，硬脂酸镁1.6g压片即得(1000片)，每日两次，每次一片。
实施例4 取3β羟基莪术醇100g，加入淀粉细粉200g，化石粉10g，硬脂酸镁5g，制成颗粒，干燥，装入胶囊(2000粒)，每日两次，每次一粒。
实施例5 取3β羟基莪术醇50g，微晶纤维素250g，交联聚乙烯吡咯烷酮70g，混匀，加入适量乙醇制粒，干燥、整粒，在加入羧甲基淀粉钠8g，硬脂酸镁4g，混匀，压片(1000片)，每日两次，每次一片。
权利要求
1、一种莪术醇的微生物转化产物，其特征在于转化产物为(1)
所示的3β-羟基莪术醇化合物。
2、根剧权力要求1所述的一种莪术醇的微生物转化产物，其特征在于所述转化产物3β-羟基莪术醇化合物可用于制备抗病毒药物。
3、一种如权力要求1所述的莪术醇的微生物转化产物的制备方法，其特征在于利用微生物黑曲霉(AS3.739)对底物莪术醇进行生物转化，并利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱层析法进行转化产物的分离制备。
4、据权利要求3所述的莪术醇的微生物转化产物的制备方法，其特征在于所制得的转化产物，其纯度根据薄层色谱和高效液相色谱检测可达到99％以上。
全文摘要
本发明公开了一种莪术醇的微生物转化产物及其用途和制备方法。转化产物为3β－羟基莪术醇化合物。所述转化产物3β－羟基莪术醇化合物可用于制备抗病毒药物。利用微生物黑曲霉(AS3.739)对底物莪术醇进行生物转化，并利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱层析法进行转化产物的分离制备。所制得的转化产物，其纯度根据薄层色谱和高效液相色谱检测可达到99％以上。
文档编号C07D493/08GK1680568SQ20051004577
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月26日 优先权日2005年1月26日
发明者邱峰, 姚新生, 张卉, 曲戈霞 申请人:沈阳药科大学