专利名称：利用水稻基因OsRRG1促进植物根的生长和/或提高植物抗旱能力的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物根的伸长生长有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)结合后直接转入一般植物体，转基因植株的根长度显著增加，抗旱能力增强。
背景技术：
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱往往导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育抗旱性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。受到干旱或缺水胁迫时，植物通过一系列机制来抵抗或适应干旱造成的不利因素，其中耐旱性(Drought tolerance)和避旱性(Drought avoidance)是最主要的机制。
耐旱性是指植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等，Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。Kawasaki等(2001)利用表达芯片分析了水稻在高盐胁迫下的早期表达谱，发现有大量的基因能被诱导或抑制，这些基因的诱导表达受到了转录因子的调节参与(Kawasaki S，Borchert C，DeyholosM，Wang H，Brazille S，Kawai K，Galbraith D and Bohnert H J.Gene expression profiles duringthe initial phase of salt stress in rice.Plant Cell.2001，13889-905.)。而在拟南芥中发现AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP类转录因子家族在不同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制(ShinozakiK等.Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stressesby Using a Full-Length cDNA Microarray.Plant Cell.2001，1361-72.)，因而认为这些转录因子家族在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的调控作用。根据已有的拟南芥转录因子的信息，人们已在植物耐旱性改良方面作了许多尝试，例如利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南芥植株，其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(Liu Q等Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought - andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.1998，101391-1406.)。近年来，通过遗传转化其它类型的转录因子来提高植物的抗逆性的报道也不少，如拟南芥NAC基因(Tran等，Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NACtranscription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive todehydration stress 1 promoter.Plant Cell，162481-2498，2004)，水稻锌指蛋白基因OSISAP1(Mukhopadhyay等，Overexpression of a zinc-finger protein gene from rice confers tolerance tocold，dehydration，and salt stress in transgenic tobacco.Proc Natl Acad Sci USA，1016309-6314，2004)。
避旱性是指植物通过各种不同策略避开缺水造成的不利影响，如调整生育期、植株大小、关闭气孔、生理性卷叶、增加根深度等。其中增加根深度被认为是增强植物避旱能力而又不影响植物产量的一种最为有效的措施(Blum A.Crop responses to drought and the interpretation of adaptation.Plant GrowthRegulation 20135-148，1996.)。由于根长度是一个多基因控制的数量性状，目前对其遗传基础的研究还主要停留在数量性状位点(QTL)的定位作图方面(Champoux等，Locating genes associated with rootmorphology and drought avoidance in rice via linkage to molecular markers.Theor.Appl.Genet.90969-981，1995；Yadav等，Mapping genes controlling root morphology and root distributionin a doubled-haploid population of rice.Theor.Appl.Genet.94619-632，1997；Kamoshita等，Mapping QTLs for root morphology of a rice population adapted to rainfed lowland conditions.Theor.Apppl.Genet.104880-893，2002；Zheng等，Mapping QTLs and candidate genes for riceroot traits under different water-supply conditions and comparative analysis across threepopulations.Theor.Appl.Genet.1071505-1515，2003)。仅在拟南芥中报道了一例与根长相关QTL基因的克隆和功能分析(Mouchel等，Natural genetic variation in Arabidopsis identifies BREVISRADIX，a novel regulator of cell proliferation and elongation in the root.Genes Dev.，18700-714，2004)。
水稻是最重要的粮食作物之一，增加最大根长以提高避旱能力对于提高水稻的抗旱性具有重要的意义。但目前在水稻中还没有分离克隆出促进根伸长生长的基因及其转基因植株。本发明在一个与水稻根长度相关的QTL基础上，鉴定出了一个候选基因，利用该基因进行水稻遗传转化并鉴定了转基因植株的根长和抗旱能力。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个根生长相关基因的完整编码区段的DNA片段，利用这个基因促进水稻根的伸长生长和/或提高植物的抗旱能力。对这个基因进行结构分析其属于植物特异的未知基因家族，由于该基因可调控根生长，因此被命名为OsRRG1(Oryza sativa Regulator of Root Growth 1)。
本发明涉及分离和应用一种包含OsRRG1基因的DNA片段，该片段赋予水稻根的伸长生长和/或提高植物的抗旱能力。其中，所述de DNA片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的OsRRG1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsRRG1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsRRG1基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得根长度增加和(或)干旱能力增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。
携带有本发明OsRRG1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本发明的OsRRG1基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育深根和抗旱的植物品种。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
序列表SEQ ID No1显示的是本发明分离克隆的包含有OsRRG1基因编码区的DNA片段序列。
图1本发明OsRRG1基因分离和鉴定流程图。
图2采用ClustalW软件(公开使用软件)将OsRRG1基因与植物中同源基因序列比较结果。
图3用RT-PCR检测OsRRG1基因在不同组织中的的表达水平。1.分蘖期的根；2.剑叶；3.茎；4.短于1cm的幼穗；5.3-5cm的幼穗；6.长于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.3周的幼叶；10.3周的黄化苗。
图4应用Northern杂交分析OsRRG1基因在转基因植株中的表达情况，第一道为对照，其余为转基因独立转基因植株。(A)为RNAi介导的抑制表达(选取分蘖期的根为材料)；(B)为超量表达(选取苗期的叶片为材料)。
图5代表性OsRRG1抑制表达转基因植株(T0代)苗期(生根40天后)的根长。
图6代表性OsRRG1超量表达转基因植株(T0代)苗期(生根30天后)的根长。
图7代表性OsRRG1超量表达转基因植株成株期(种植在PVC管中)的根长和抗旱表现。左图为断水5天后卷叶情况，中间两株为对照(CK)，两边为转基因植株(TG)；右图为植株成熟后根长的比较。
图8本发明的超量表达载体pCAMBIA1301的物理图谱。将本发明实施实例中用到的启动子CaMV 35S插入多克隆位点EcoRI和SacI处，即构成本发明用到的转化载体pC1301S。
图9本发明的抑制表达载体pHellsgate2的物理图谱。
具体实施例方式
本发明的前期工作是根据水稻根形态状的QTL作图(见Yue等，Genetic analysis for droughtresistance of rice at reproductive stage in field with different types of soil.Theor Appl Genet，2005)。所用群体是以于水稻品种“珍汕97”(一种中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)和“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个旱稻品种)为亲本的重组自交系(RIL)群体。通过QTL作图分析，在第2染色体的RM573和RM318两标记的区间检测到控制根长的QTL(qMRDV2-1)。对RM573和RM318两标记的区间的基因组DNA所预测的基因进行分析，发现有一个候选基因(即本发明的OsRRG1)与拟南芥中报道的根生长相关基因BREVIS RADIX有一定序列相似性。据此，按图1的分离流程将该基因的cDNA分离出来，并进一步进行功能验证，结果表明该cDNA是OsRRG1基因的cDNA片段，是一个影响植物根生长的BREVIS RADIX同源基因，而且可以用来提高植物的抗旱能力。主要依据有以下几个方面(1)对OsRRG1进行测序，分析发现其编码产物与人蛋白BREVIS RADIX同源性达62.1％，且含有保守的结构域(图2)。(2)对其在不同组织中的表达分析(图3)，发现在OsRRG1在不同组织中均有一定表达量，而以根中的表达量最高。(3)通过RNAi技术(Wesley等，Construct design for efficient，effectiveand high-throughput gene silencing in plants.Plant J，27581-590，2001)抑制水稻内源基因OsRRG1的表达(图4)，转基因植株与对照植株相比，其根长度降低(图5)；而将其全长基因在植株中超量表达(图4)后，转基因植株与对照植株相比其根长度显著增加(图6)。(4)OsRRG1基因的超量表达转基因植株与野生型对照植株相比，在相同的干旱胁迫条件下，其卷叶时间显著推迟，最大根长显著增长(图7)，显示出避旱能力增强。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsRRG1基因完整编码区段的DNA片段以及验证OsRRG1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1分离克隆包含有OsRRG1基因区段的DNA片段和OsRRG1基因根据Yue等以水稻品种“珍汕97”和“中旱5号”为亲本的重组自交系(RIL)群体的QTL作图分析(见Yue等，Genetic analysis for drought resistance of rice at reproductive stage in field withdifferent types of soil.Theor Appl Genet，2005)结果，在第2染色体的RM573和RM318两标记的区间有一个控制根长的QTL(qMRDV2-1)。我们对RM573和RM318两标记的区间的基因组DNA所预测的基因进行仔细分析，发现有一个预测的基因(即本发明的基因OsRRG1)与拟南芥中报道的根生长相关基因BREVIS RADIX序列相似性达62.1％。通过查找日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J033051H11，该基因的基因组序列位于第2染色体BAC克隆AP003994上位于37924bp-44818bp的位置。根据BAC克隆AP003994中OsRRG1对应的基因组序列，预测其启动子区域，并设计引物PF(5-TAAGGATCCGAGAGGCTAGGAAATGCTTG，序列特异引物外加接头BamHI位点)和FR(5-TAATCTAGAAGCGGCAAAGTAGTAGT，序列特异引物外外加接头XbaI)，将该基因的全长cDNA从“明恢63”(一个中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)的总RNA中扩增出来。扩增产物就是本发明的序列1-2103bp。具体步骤为采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取水稻品种“明恢63”叶片中的总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链，反应条件为65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。用上述引物(PF和PR)扩增出OsRRG1基因的全长cDNA。RT-PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，40个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪)，获得所需的全长基因cDNA。该克隆被命名为pGEM-OsRRGlc。
实施例2，OsRRG1基因抑制表达、超量表达以及启动子表达载体的构建和转化为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中抑制表达和超量表达，从转基因植株的表型来验证。
抑制表达(RNAi)载体构建方法如下首先用RNAi引物R2RF(5’-GCAGGCACCAATACAAGTCC)和R2RR(5’-CTAGATGGAGACGAAGGTGATCTG)以从实施例1获得的克隆pGEM-OsRRG1c为模板扩增出OsRRG1基因的特异片段(401bp)。反应条件为94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5报min。将该片段亚克隆到pGEM-T载体上。再用引物ALLF(5’-GGGGAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G)和ALLR(5’-GGGGAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TAT AG)从带有该片段的pGEM-T载体上扩增出一条可供重组到pHellsgate2载体上的片段(451 bp)。PCR条件同上。重组反应按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行。pHellsgate2是已公开发表的专门用于RNAi载体构建的载体(Wesley等，Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing inplants.Plant J，27581-590，2001)。
超量表达载体构建方法如下首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsRRG1质粒用BamHI和XbaI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带不同启动子的遗传转化载体pC1301S。酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(按以及比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsRRG1基因的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。遗传转化的载体pC1301S是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(图7，来自澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture]实验室)基础上，在酶切位点EcoRI和SacI处引入广泛使用的组成型表达的烟草花叶病毒CaMV 35S启动子而得到的。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将其导入到水稻品种“中花11”(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化方法应用Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6271-282，1994)进行。
上述农杆菌介导的遗传转化具体步骤的培养基如下所述试剂配方(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(激动素或称细胞分裂素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2、4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；Msmix(MS微量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制硝酸钾(KNO3) 28.3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0g硫酸铵((NH4)2SO4) 4.63g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.85g氯化钙(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制碘化钾(KI) 0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.15g室温下溶解并定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinic acid) 0.1g维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol) 10g加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制硝酸铵(NH4NO3) 16.5g硝酸钾 19.0g磷酸二氢钾 1.7g硫酸镁 3.7g氯化钙 4.4g室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制碘化钾 0.083g硼酸0.62g硫酸锰 0.86g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.025g硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.0025g室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液1均为mg/ml。
8)葡萄糖贮存液0.5g/ml。
9)AS贮存液的配制秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4-D贮存液2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4-D贮存液2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液0.75mlCH 0.15g蔗糖5g琼脂粉(Agarose) 1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液 0.75mlCH 0.2g蔗糖 5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X) 0.5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 0.5ml维生素贮存液(100X) 1ml2，4-D贮存液 0.2mlCH 0.08g蔗糖 2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液0.625mlCH 0.15g蔗糖7.5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml6-BA贮存液 0.5mlKT贮存液0.5mlNAA贮存液 50μlIAA贮存液 50μlCH 0.15g蔗糖7.5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μlHN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X) 10ml6-BA贮存液 2mlKT贮存液2mlNAA贮存液 0.2mlIAA贮存液 0.2mlCH 1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基MSmax母液(10X) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X) 5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌将OsRRG1抑制表达的转基因水稻植株分别命名为R2R-N(其中R2R为pHellsgate2-OsRRG1载体，含有组成型启动子CaMV 35S，N独立转化植株的编号)；将OsRRG1超量表达的转基因水稻植株分别命名为R2S-N(R2S为pC1301S-OsRRG1载体，含有组成型启动子CaMV 35S)。每个转化载体获得了至少30株独立的转基因水稻植株，本发明总共获得独立转基因水稻植株70株。
实施例3检测水稻内源基因OsRRG1的表达水平以水稻品种“明恢63”为材料，提取不同生长时期的组织的RNA用RT-PCR检测OsRRG1基因的表达水平。选取的10种组织分别是1.分蘖期的根；2.剑叶；3.茎；4.短于1cm的幼穗；5.3-5的幼穗；6.长于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.3周的幼叶；10.3周的黄化苗。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链(方法根据反转录酶试剂说明书)，反应条件为65℃ 5min，42℃ 50min，70℃10min。以cDNA第一链为模板，采用引物R2RF(5’-GCAGGCACCAATACAAGTCC)和R2RR(5’-CTAGATGGAGACGAAGGTGATCTG)PCR扩增出OsRRG1基因的特异片段(401bp)。采用引物(AF5’-GCGTCGACTCCACTCTCGC和AR5’-CCATGAAACAAATCCAACAACA)扩增出的水稻Actin1基因的特异片段(610bp)以作为内对照进行定量分析。反应条件为94℃预变性2min；94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增出的OsRRG1基因及Actin1基因的特异带用GelImager软件(GenRes公司)进行处理，将带的亮度数量化，并以Actin1基因的特异带的亮度为标准进行均一化后比较不同组织中OsRRG1基因的表达量。结果(图3)表明OsRRG1基因在所选取的组织中均有一定量的表达，但以根和幼穗中表达量相对较高。
实施例4OsRRG1抑制表达转基因T1家系苗期根的生长本发明采用Northern杂交检测检测部分RNAi转基因水稻植株根中OsRRG1的表达是否被抑制(图4A)。结果表明60％以上的RNAi转基因水稻植株中OsRRG1的表达受到不同程度的抑制。本发明选取了5个OsRRG1表达受明显抑制的T1家系进行生长速度的测定。具体步骤如下每个T1代家系选取30-40粒种子在含有G418(一种在植物转基因筛选中使用的商品化的抗生素，购自Promega公司)水溶液(50mg/ml)中浸种，去除不发芽种子(不含转基因的种子)。将转基因和野生型对照(水稻品种中花11)发芽后5天的幼苗水培种植在90×60×20cm3的培养盒中，培养盒上盖有92×62cm2大小的木盖，木盖上钻有均匀分布的96个孔，每孔种一棵苗，用海绵固定植株。水培的营养液成份如下按化学试剂或商品化肥的无机营养元素的纯量计N40ppm；P10ppm；K40ppm；Ca40ppm；Mg40ppm；Mn0.5ppm；Mo0.05ppm；B0.2ppm；Zn0.01ppm；Cu0.01ppm；Fe2ppm。母液配方如下1、NH4NO3914g/10L；2、NaH2PO4-2H2O403g/10L；3、K2SO4714g/10L；4、CaCl2886g/10L；5、MgSO4-7H2O3240g/10L；6、MnCl2-4H2O15g，(NH4)6Mo7O24-4H2O0.74g，H3BO39.34g，ZnSO4-7H2O0.35g，CuSO4-5H2O0.31g，FeCl3-6H2O77g，(CH2O)n119g。分别溶解后与500ml浓硫酸混合，将上述组分用水定容至体积为10L。
水培时，每3970mL水中加上述母液各5mL(使培养液的pH5.8-6.0)。
用于试验的转基因水稻每家系种植8单株，随即区组设计，三次重复(每个盒中设置对照)。在发芽后的第10，20，45天时小心取出秧苗测量根长度。图5是代表性转基因家系和对照的苗期根长度比较。结果表明大部分转基因植株的根长度比对照的根长度短3.8-7.4cm(表1)。
表1本发明的基因OsRRG1抑制转基因植株与对照的根长和株高比较比较(单位cm)
注*表示与对照有显著差别。
实施例5OsRRG1超量表达转基因T1家系苗期根的生长本发明采用Northern杂交(方法参见J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，，2002，科学出版社，北京)检测部分超量表达的转基因水稻植株中OsRRG1的表达量(图4B)。结果表明70％以上的转基因水稻植株中OsRRG1的表达量显著高于对照，说明这些植株中OsRRG1转基因得到了表达。图6是代表性超量表达转基因家系T0代植株在生根过程中和对照的苗期根长度比较。为了进一步比较超量表达该基因对水稻根生长的促进作用，本发明选取了7个OsRRG1超量表达T1家系进行了不同条件下根生长速度的测定。具体步骤如下每个T1代家系选取20-30粒种子在含有50mg/ml的潮霉素的水溶液中浸种，去除不发芽种子(不含转基因的种子)。将转基因和野生型对照(水稻品种中花11)发芽后5天的幼苗水培种植。水培种植方法同实施例4。随即区组设计，三次重复(每个盒中设置对照)，每个重复中，每个转基因水稻家系种植8单株。在发芽后的第10，20，45天时小心取出秧苗测量根长度。结果表明转基因植株的根长度比对照的根长度长6.8-16.4cm(表2)。
表2本发明的基因OsRRG1超量表达转基因植株与对照的根长和株高比较(单位cm)
注*表示与对照有显著差别。
实施例6OsRRG1超量表达转基因T1家系成株期在干旱条件下根的生长和避旱性为了更加准确地验证转基因水稻植株的避旱性是否增强从而导致抗旱性增强，本发明进一步利用PVC管进行了盆栽干旱处理试验。具体步骤如下T1代各家系的种子在含有50mg/ml潮霉素的水溶液浸种，去除不发芽种子，将发芽后1-2cm幼苗小心地直接种在PVC管中；PVC管高1米，直径20cm，置于地面的一端封口使其不漏水，管侧有三个小孔，离封口端的距离分别为10cm，40cm和70cm；不放水时用橡皮塞塞住；管内用与管径相同大小的塑料袋装满混合均匀的沙性土(河沙与细粘土按1∶1均匀混合)；每管种植一株水稻植株，每T1家系种植10个单株。在离抽穗大约15天时断水(拔出橡皮塞并戳破塑料袋)，观察记载叶片开始卷的时间，图6是断水5天后代表性转基因家系和对照在的表现。当对照植株叶片全卷(即在下午5-6点观察，单株所有叶片完全卷拢)后，次日早上对所有植株复水让其生长至成熟后考察结实率。由于转基因植株和对照的抽穗期相同，植株大小基本一致，不同植株所处位置不同的影响也较小(通过在不同位置设置相同对照观察它们的卷叶天数来判断)，土壤条件一致，因此可以把卷叶快慢用来衡量避旱性。成熟后考查转基因家系的结实率(每个家系考查10株，每株考查所有有效穗)、分蘖数和最大根长。数据表明，转基因植株卷叶症状的出现比对照晚1-5天，转基因植株的结实率比对照高出6.1％到25.9％，最大根长比对照长6.4-22.7cm(表3)，分蘖数、抽穗期和生物学产量则无明显差异。说明转基因水稻植株的抗旱性增强主要是由于超量表达OsRRG1基因后其避旱能力增强引起的。
表3本发明的基因OsRRG1超量表达转基因植株与对照孕穗期避旱性比较
注卷叶时间是指从断水到20％左右的叶片开始卷的天数。*表示与对照有显著差别。
序列表序列表(SEQUENCE LISTING)<110>华中农业大学<120>利用水稻基因OsRRG1促进植物根的生长和提高植物抗旱能力<130>
<141>2005-10-13<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2100<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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权利要求
1.OsRRG1基因介导的赋予水稻根的伸长生长和/或提高水稻抗旱能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-2103位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
2.合适启动子连接的权利要求1所述的DNA序列。
3.权利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列
4.赋予植物根的伸长生长并提高抗旱能力的序列，它是与SEQ ID NO1中第1-2103位所示DNA序列相似性达90％以上的DNA序列或与SEQ ID NO1所编码的蛋白质序列相似性达75％以上的蛋白质序列。
5.权利要求1-4任一项所述的DNA序列在增加水稻根的伸长生长和/或提高水稻抗旱能力中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、功能验证及其应用。所述的DNA片断包含与水稻根生长相关基因OsRRG1，它赋予水稻根的伸长生长和/或提高水稻的抗旱能力。将该DNA片段与外源启动子序列连接后直接转入植物体，转基因植物根长度显著增加，抗旱受能力显著增强。
文档编号C07K14/415GK1952144SQ200510019619
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者熊立仲, 梁大成 申请人:华中农业大学