专利名称：一种检测二恶英的单链抗体方法
技术领域：
本发明涉及生物学方法检测二恶英的技术领域，具体涉及一种检测二恶英的单链抗体方法。
背景技术：
二恶英类化学物质在环境中广泛存在，为高滞留性和高生物富集的环境污染物，因其毒性极高，近年来一直受到环境界的高度关注，对其检测方法的研究也已成为当今环境研究领域的前沿课题。二恶英类化学物质的监测属于痕量多组分分析，要求检测方法必须具有较高的灵敏度。由于高分辨气质联用法具有高选择性、高分辨率及高灵敏度等特点，近年来已被公认为二恶英类化学物质的标准分析方法。然而，要建立这种方法，需要购买高分辨气质联用仪和一系列同位素标样，而且试样分离、净化步骤繁琐，使得这一工作在大多数实验室不能开展，难以适应环境监督管理和监测工作的需要。
近年来生物技术的快速发展促进了生物检测法的创新，酶抑制法、免疫分析法以及通过生物芯片进行痕量检测的研究时有报道。作为GC/MS方法的补充，非常适合于大量样品的筛选，最近几年备受人们重视。基于单克隆抗体和多克隆抗体的放射免疫技术(RIA)(Radioimmunoassay)和酶联免疫技术(ELISA)在国外已有相应产品出售，其原理是通过待检样品和酶联标样与固相抗体的竞争反应来实现对待检样品的定量分析，但是试剂盒的价格昂贵，很难满足实际使用的需求。单克隆抗体或多克隆抗体的制备必须通过细胞培养获得，周期长，细胞或动物培养的时间多达24-72小时，整个过程多达几天，不能进行快速检测，且不易进行操作。单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短肽链连接后融合表达出来的抗体片断，具有分子量小、特异性高、结合力强、易于利用基因工程技术操作等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测二恶英的单链抗体方法。方法易行，方便快捷，安全实用，操作简单并且检测速度快。
为达到上述目的，本发明采取以下技术措施。首先用2，3，7，8-四氯代二苯并-对-二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，缩写为2，3，7，8-TCDD)与卵清蛋白(ovalbumin)形成的偶联蛋白(TCDD-OVA)，免疫Balb/c小鼠后，Trizol一步法提取脾细胞总RNA，再逆转录得到cDNA，以cDNA为模板扩增重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因，经叠加延伸聚合酶链式反应(Overlap-PCR)将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因(ScFv)，然后将ScFv与载体pCANTAB5E连接并转化大肠杆菌TG1(载体和大肠杆菌均由美国Pharmacia公司购得)，即得到抗二恶英的噬菌体展示抗体文库。用ELISA方法筛选得到带有特异性的抗二恶英的单链抗体的噬菌体颗粒，通过测序得到了一种分离蛋白质的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO1。将该基因插入到表达载体pET20b，在大肠杆菌BL21中表达(载体和大肠杆菌均由德国NOVAGEN公司购得)。利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过亲和层析纯化单链抗体蛋白，及c-myc标记检测单链抗体蛋白。纯化后的单链抗体蛋白经过透析处理就可用于检测。检测方法用竞争酶联免疫技术(ELISA)，按以下步骤进行检测a)用1μg/mlTCDD-OVA(PBS磷酸钠盐缓冲液50mM，NaCl 200mM，pH7.4)包被96孔板，100μl/孔，37℃1小时；b)用溶液PBS 200μl/孔，清洗3次，加入含有2％脱脂牛奶的PBSM封闭，200μl/孔，37℃1小时；c)用溶液PBS 200μl/孔，清洗3次，即可使用；d)将单链抗体与检测样品混合，37℃1小时后加入96孔板中，37℃1小时；e)用溶液PBST(PBS，0.05％Tween20)200μl/孔，清洗3次，加入抗c-myc的HRP酶标抗体，37℃1小时；f)用溶液PBST(PBS，0.05％Tween20)200μl/孔，清洗3次，加入TMB显色，于室温(20-25℃)下反应，30分钟内加入50μl/孔的2M硫酸终止颜色反应，颜色的深浅与二恶英类化合物的含量成反比。该检测试验证明所纯化的抗二恶英单链抗体是特异性的针对2，3，7，8-TCDD的，具有结合活性，并且呈线性关系，也说明该抗体可用于对2，3，7，8-TCDD的检测，其检测范围是4-40ng/assay。
本发明与其他用酶联免疫技术检测二恶英类化学物的技术相比，具有以下优点和效果单链抗体的制备方便快捷；检测方法稳定性和可重复性好；本方法不需要放射性同位素标记，更加安全实用，且操作简单，检测成本低而检测速度较快；可根据颜色的变化判断检测样品中的二恶英类化合物的有无，结合酶标仪，检测450nm的吸收值即可进行定量分析；可以利用基因工程技术将单链抗体基因与其他蛋白基因融合表达，比如酶蛋白、荧光蛋白等，实现抗体的直接检测，因此，本发明可进一步开发成为二恶英类化合物的检测试剂盒，应用前景广泛。
图1.PCR扩增小鼠脾脏细胞cDNA基因上的VH和VL基因PCR电泳图谱。3、8DL2000分子量标准(marker)(日本Takara公司)；1、2VH基因(340bp)；4、5、6、7VL基因(320bp)。扩增得到了目的基因，单带较纯，说明基因的特异性较高。
图2.ScFv基因Overlap-PCR电泳图谱。1-4，6-8小鼠ScFv基因；5DL2000marker。结果表明，Overlap-PCR成功连接VH和VL基因为ScFv，得到了预期大小的单链抗体基因，为进一步的抗体筛选奠定基础。
图3.抗二恶英单链抗体蛋白表达纯化后的SDS-PAGE图谱。1，2抗二恶英单链抗体(30KD)；3蛋白分子量标准(华美生物工程公司)。筛选到的抗二恶英的单链抗体基因与分泌型表达载体pOPE连接后在大肠杆菌XL1-blue中表达并通过His-tag纯化，得到目的ScFv蛋白产物。所纯化得到的蛋白较纯，经过透析除盐后，即可用于检测。
图4.竞争ELISA检测2，3，7，8-TCDD所得的其含量与抑制率关系曲线。纯化后的抗二恶英ScFv蛋白用竞争ELISA检测2，3，7，8-TCDD的含量，检测的吸光值随着2，3，7，8-TCDD含量的增加而减少，说明所纯化的抗二恶英单链抗体是特异性的针对2，3，7，8-TCDD的，具有结合活性，并且呈线性关系，也说明该抗体可用于对2，3，7，8-TCDD的检测，其检测范围是4-40ng/assay。
具体实施例方式
一种检测二恶英的单链抗体方法，它包括下列步骤1、2，3，7，8-四氯代二苯并-对-二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，缩写为2，3，7，8-TCDD)与卵清蛋白(ovalbumin)形成的偶联蛋白(TCDD-OVA)免疫六周龄Balb/c小鼠，间隔4周，共免疫四次。
2、最后一次免疫小鼠7天后，取出小鼠脾脏组织，用Trizol一步法提取脾细胞总RNA。
3、以RNA为模板逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板扩增小鼠抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。
4、用叠加延伸聚合酶链式反应(Overlap-PCR)将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因(ScFv)，并将ScFv与载体pCANTAB5E连接并转化大肠杆菌TG1(载体和大肠杆菌均由美国Pharmacia公司购得)，即得到抗二恶英的噬菌体展示抗体文库。
5、酶联免疫技术(ELISA)方法筛选带有特异性的抗二恶英的单链抗体的噬菌体颗粒。
6、将筛选到的单链抗体基因插入到分泌型表达载体pET20b中，在大肠杆菌BL21菌株中表达(载体和大肠杆菌均由德国NOVAGEN公司够得)。
7、利用表达载体上带有的组氨酸标记(His-tag)标记通过亲和层析纯化该单链抗体蛋白，纯化后的单链抗体蛋白经过透析处理就可用于检测。
8、单链抗体蛋白上的c-myc标记用于竞争ELISA检测2，3，7，8-TCDD。按以下步骤进行检测a、用1μg/ml TCDD-OVA(PBS磷酸钠盐缓冲液50mM，NaCl 200mM，pH7.4)包被96孔板，100μl/孔，37℃1小时；b、用溶液PBS(磷酸钠盐缓冲液50mM，NaCl 200mM，pH7.4) 200μl/孔，清洗3次，加入含有2％脱脂牛奶的PBSM(在上述磷酸钠盐缓冲液中加入2％的脱脂牛奶)封闭，200μl/孔，37℃1小时；c、用溶液PBS(磷酸钠盐缓冲液50mM，NaCl 200mM，pH7.4)200μl/孔，清洗3次，即可使用；d、将单链抗体与检测样品混合，37℃1小时后加入96孔板中，37℃1小时；e、用溶液PBST(在上述磷酸钠盐缓冲液中加入0.05％Tween20)200μl/孔，清洗3次，加入抗c-myc的辣根过氧化物酶(HRP)酶标抗体，37℃1小时；f、用溶液PBST(在上述磷酸钠盐缓冲液中加入0.05％Tween20)200μl/孔，清洗3次，加入TMB显色，于室温(20-25℃)下反应，出现蓝色反应结果，可肉眼观察颜色的深浅，在30分钟内加入50μl/孔的2M硫酸终止颜色反应，并测定450nm的光吸收值(OD)。得到的吸收值结果与2，3，7，8-TCDD的含量成反比，即随着检测物的含量的增加，吸收值逐渐减少。以抑制率(抑制率按下式计算抑制率＝(实验孔OD值-对照孔OD值)÷对照孔OD值×100％)对2，3，7，8-TCDD含量进行曲线的绘制，即可得到用该抗二恶英单链抗体对2，3，7，8-TCDD进行检测的标准曲线。
9、将所筛选到的抗二恶英的单链抗体基因送上海联众基因研究院测序，得到该基因的全序列，是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。该序列经过比对，与小鼠抗体基因至少具有80％的同源性，证明该基因的确是鼠源的，并且上述检测实验也证明了纯化后的抗二恶英单链抗体蛋白用竞争ELISA检测2，3，7，8-TCDD的含量，其检测的吸光值随着2，3，7，8-TCDD含量的增加而减少，说明所纯化的抗二恶英单链抗体是特异性的针对2，3，7，8-TCDD的，具有结合活性，并且呈线性关系，也说明该抗体可用于对2，3，7，8-TCDD的检测，其检测范围是4-40ng/assay。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院武汉病毒研究所<120>一种检测二恶英的单链抗体方法<130>一种检测二恶英的单链抗体方法<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>792<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1atggcccagg tgaagctgca gcagtctggg gctgagctgg tgaggcctgg ggcctcagtg60aagatttcct gcaaggcttt tgactacacc ttcacaaacc atcatataaa ctgggtgaag 120cagaggcctg gacagggcct ggactggatt ggatatatta atccttataa tgattatact 180acctacagcc agaagttcaa gggcaaggcc acattgactg tagacaaatc ctccagcaca 240gcctatatgg agcttagcag cctgacatct gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga 300atcccctcca ggtacgacga ggtgactatg gactactggg gccaagggac cacggtcacc 360gtctccccaa gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggagg atcggacatt 420gagctcaccc agtctccaac aatcatgtct gcatctccag gggagaaggt caccatgacc 480tgcagtgcca gctcaagtgt aagttacatg cactggtacc agcagaagtc aggcacctcc 540cccaaaagat ggatttatgg cacatccaac ctggcttctg gagtccctgt tcgcttcagt 600ggcagtggat ctgggacctc ttattctctc acaatcagca gcatggaggc tgaagatgct 660gccacttatt actgtcaaca gtggagtagt tacccactca cgttcggctc ggggacaaag 720ttggaaataa aacgggcggc cgcaggtgcg ccggtgccgt atccggatcc gctggaaccg 780cgtgccgcat ag 79权利要求
1.一种分离的蛋白质，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种检测二恶英的单链抗体方法。该单链抗体基因来源于小鼠，克隆到表达载体pET20b，在大肠杆菌BL21中表达，利用表达蛋白上带有的His－tag标记可通过亲和层析纯化单链抗体蛋白，并利用c－myc标记检测单链抗体蛋白。本发明克隆到鼠源的抗二恶英类化学物质的单链抗体，该抗体能应用于检测二恶英类化学物质，检测成本低，应用前景广泛。
文档编号C07K16/00GK1731184SQ200510019329
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月23日 优先权日2005年8月23日
发明者张先恩, 游璠, 周亚凤, 郭永超, 张治平 申请人:中国科学院武汉病毒研究所