专利名称：Sa抗原的纯化方法
技术领域：
本发明涉及利用抗Sa抗体诊断类风湿关节炎中使用的Sa抗原底片，特别是涉及Sa抗原的纯化方法。
背景技术：
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种表现为多关节慢性炎症为主的自身免疫性疾病，主要表现为慢性、对称性、侵蚀性关节炎，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性僵直、纤维性或骨性强直而严重致残。RA的诊断，尤其是早期诊断是世界性的难题。RA患者经早期诊断、早期积极治疗，可以改变病情以降低致残率。现行的美国风湿病学会(ACR)1987年RA分类诊断标准，主要是依靠临床表现、X线改变和类风湿因子(RF)的检测进行综合判断，缺乏可靠的客观指标，往往是符合上述判断标准时，病人已经出现了骨质的破坏，使得早期病例难以诊断。RF是分类诊断标准内唯一的血清学指标，但RF可出现于许多结缔组织病及其它疾病中，如急性病毒感染和结核患者，甚至5％的正常人群中也可能出现，对于诊断RA的特异性很差，不利于早期诊断、早期干预治疗。因此，国内外学者在探讨RA特异性诊断指标方面进行了大量研究工作，相继发现了一些RA患者血清中存在的，对RA较为特异的自身抗体，如抗核周因子抗体(APF)，抗角蛋白抗体(AKA)，抗Sa抗体，抗RA33抗体，抗胶原蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体(AFA)，抗环瓜氨酸肽抗体等。这些自身抗体不同程度地具有一定的早期诊断价值。
1994年，Despres等发现了抗Sa抗体，认为对RA的特异性高达98.9％，且在早期RA患者中阳性率为23.5％。为此，国内外学者在抗Sa抗体方面进行了大量的研究工作，但该项成果却迟迟未能应用于临床，其主要原因之一是Sa抗原极易分解，Sa抗原的提取过程必须保持在4℃进行，且需加入多种蛋白酶抑制剂抑制Sa抗原的降解，提取过程操作困难；其二是Sa抗原需从人胎盘或脾脏中提取，这些组织中蛋白成分丰富，Sa抗原不宜分离、纯化，很难得到纯的Sa抗原，在临床上应用难以避免批间差异。
用Despres布氏漏斗法制备Sa抗原的方法是取新鲜人胎盘组织，匀浆，4℃10000rpm/min离心60分钟；取上清液与预冷活化的DE52混合搅拌60分钟，布氏漏斗抽滤并用匀浆缓冲液洗涤、抽干；将DE52与洗脱液1混合搅拌60分钟，布氏漏斗抽滤，洗脱液1洗涤、抽干，弃滤液；DE52再与洗脱液2混合搅拌60分钟，布氏漏斗抽滤，洗脱液2洗涤，收集滤液；滤液装入透析袋中，用预冷的含0.15mmol/L PEMSF蒸馏水透析24～36小时，冷冻干燥(Despres N，BoireG，lopez-longo FJ，et al.The Sa systema novel antigen-antibody system specificfor rheumatoid arthritis.J Rheumatol，1994，211027-1033)。
将上述布氏漏斗法提取的Sa抗原用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以看到大约8～9种不同分子量的蛋白条带，且浓度基本相同。将电泳凝胶转印至硝酸纤维素膜再通过免疫印迹法检测抗Sa抗体时，由于蛋白条带较多，首先可能将与Sa抗原分子量接近的条带误认为阳性，其次可能由于非特异性抗体的显色而影响所测条带。
发明内容
本发明的目的是在提取Sa抗原的基础上，提供一种进一步纯化Sa抗原的方法，得到纯度更高的Sa抗原，通过免疫印迹法检测显示非特异性条带明显减少，抗Sa抗体的条带更为清晰易辨。
本发明是在原Sa粗抗原提取的基础上，采用亲和层析法对Sa粗抗原进一步纯化，以得到纯化的Sa抗原。纯化Sa抗原的具体步骤包括a)纯化抗Sa抗体在缓冲液B中将Protein G Sepharose 4 Fast Flow浸泡脱气，装柱，缓冲液B平衡；取RA患者血清，离心、0.22μm滤膜过滤、缓冲液B透析，得到抗Sa阳性血清；将抗Sa阳性血清上柱孵育30分钟，先用缓冲液B洗柱，去除杂蛋白，再用洗脱液A洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到抗Sa IgG。
b)制备亲和层析柱取活化的CNBr-Sepharose 4B，在偶联缓冲液中与纯化的抗Sa IgG混合，4℃摇荡过夜，用偶联缓冲液淋洗，洗脱未结合蛋白后，将制备好的亲和介质移入阻断缓冲液中，室温孵育2小时，封闭剩余的反应位点；之后将亲和介质用偶联缓冲液和醋酸盐缓冲液交替淋洗，在缓冲液C中浸泡脱气，装柱，缓冲液C平衡，制成亲和层析柱。
c)Sa抗原的亲和层析取Sa粗抗原，在亲和层析柱上循环上样5小时，用缓冲液C洗柱，洗脱杂蛋白，洗脱液B洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到纯化的Sa抗原。
其中，在步骤a)中使用的缓冲液B为pH7.0，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；洗脱液A为除气过滤后的pH2.7的0.1mol/L甘氨酸-盐酸溶液；中和缓冲液为1mol/L Tris，pH9.0。
步骤b)中使用的缓冲液C为pH7.4，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；偶联缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3，pH8.3；阻断缓冲液为1％牛血清白蛋白，pH8.0；醋酸盐缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc，pH4.0。
步骤c)中使用的洗脱液B为除气过滤后的pH2.5的0.1mol/L甘氨酸-盐酸溶液。
本发明从人胎盘组织中提取粗Sa抗原，利用抗原与抗体特异性、可逆性结合的特点，采用亲和层析法对Sa抗原进行纯化，以达到分离纯化Sa抗原的目的，抗原纯化程度高，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果显示纯化的Sa抗原电泳条带明显减少；免疫印迹法检测也发现抗Sa抗体的显色条带清晰易辨。
使用本发明纯化后的Sa抗原对206例RA患者的血清进行检测，并以粗Sa抗原进行对照，结果见表1。从表1可以看出，粗Sa抗原所测得的72例阳性血清中，纯化Sa抗原检测也全部为阳性，而纯化Sa抗原又在粗Sa抗原所测144例阴性血清中测出5例阳性，说明纯化Sa抗原可以提高抗Sa抗体的检测阳性率。
表1 粗抗原与纯化抗原检测抗Sa抗体的比较亲和层析法纯化Sa抗原 粗Sa抗原阳性7772阴性129 134合计206 206阳性率％37.38 34.95X2值0.084P值 0.786实验也证实，纯化Sa抗原的实验重复性较好，Sa抗原冻干粉可以长期保存，转印至膜上的抗原在4℃保存1年后活性不变，新旧抗原检测抗Sa抗体的符合率为100％。
图1为粗Sa抗原与纯化Sa抗原的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；图2为粗Sa抗原与纯化Sa抗原的免疫印迹法抗体检测结果。
具体实施例方式
1.使用Protein G Sepharose 4 Fast Flow纯化抗Sa抗体取5mLRA患者血清，经免疫印迹法检测抗Sa抗体阳性，且抗体滴度较高，＞1∶64，免疫双扩法及免疫印迹法检测ENA多肽阴性后，离心，0.22μm滤膜过滤，将滤液在含有0.9％NaCl的0.02mol/L PB缓冲液(pH7.0)中透析过夜，得到抗Sa阳性血清。
将5mL Protein G Sepharose 4 Fast Flow在玻璃烧结漏斗上用蒸馏水反复淋洗，抽干，置于上述的缓冲液中浸泡脱气后，装入层析柱，再用缓冲液平衡5个柱床体积，制成Protein G Sepharose层析柱。
将透析过的抗Sa阳性血清上Protein G Sepharose层析柱，孵育30分钟后，以核酸蛋白检测仪监测层析柱流出液，用上述缓冲液淋洗层析柱，去除杂蛋白，一直淋洗至流出液回落到基线并运行稳定后，用除气过滤后的0.1mol/L甘氨酸-盐酸洗脱液(pH2.7)，以1.3mL/min的流速洗脱抗Sa抗体，使用核酸蛋白检测仪监测收集蛋白洗脱峰，共收集到12mL洗脱液，将洗脱液全部收集到预置1mol/L Tris中和缓冲液(pH9.0)的收集管中，混匀、透析后得到纯化的抗Sa IgG。
取透析后的收集液，经免疫印迹法检测抗Sa抗体阳性；检测到蛋白及IgG含量为1.875mg/mL×12mL＝22.5mg。
2.制备亲和层析柱称取约2g CNBr-Sepharose 4B，活化后，在含0.5mol/L NaCl的0.1mol/LNaHCO3偶联缓冲液(pH8.3)中与纯化的抗Sa IgG混合，4℃摇荡过夜后，置于玻璃烧结漏斗上，用上述的偶联缓冲液反复淋洗，洗脱未结合蛋白后，收集洗脱液，检测洗脱下的蛋白含量为3.2385mg。则抗Sa IgG的偶联率为偶联率＝(偶联前蛋白含量-偶联后洗下的蛋白含量)/偶联前蛋白含量×100＝(22.5mg-3.2385mg)×100/22.5mg＝85.61％将制备好的亲和介质移入1％牛血清白蛋白阻断缓冲液(pH8.0)中，室温下孵育2小时，封闭剩余的反应位点，之后用偶联缓冲液和含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc缓冲液(pH4.0)交替淋洗后，在含0.9％NaCl的0.02mol/L PB缓冲液(pH7.4)中浸泡脱气，装柱，再用缓冲液平衡后，制成亲和层析柱。
3. Sa抗原的亲和层析取采用文献方法制备并透析脱盐后的Sa粗抗原，在亲和层析柱上循环上样5小时，以核酸蛋白检测仪监测层析柱流出液，用上述缓冲液淋洗层析柱，洗脱杂蛋白，一直淋洗至流出液回落到基线并运行稳定后，用除气过滤后的0.1mol/L甘氨酸-盐酸洗脱液(pH2.5)，以1mL/min的流速洗脱，使用核酸蛋白检测仪监测洗脱液蛋白含量，并将含蛋白洗脱峰部分的洗脱液全部收集到预置1mol/L Tris中和缓冲液(pH9.0)的收集管中，混匀、透析后得到纯化的Sa抗原。
纯化后的Sa抗原经浓缩后，用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法检测蛋白分子量及抗原活性，分装，-70℃保存。
以Marker迁移距离做标准曲线，将粗Sa抗原与纯化后的Sa抗原用10％SDS-聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后，得到图1的结果。由图1可以看出，与粗抗原相比，Sa抗原条带处蛋白量明显浓集，条带数有所减少。图中，第4泳道为低分子量Marker，第3泳道为粗Sa抗原，第6泳道为纯化后的Sa抗原。
应用免疫印迹法(Western Blot)对粗Sa抗原和纯化后的Sa抗原进行抗原特异性鉴定，根据低分子量Marker绘制的标准曲线及阳性血清条带对反应条带进行分析、确认，结果如图2所示。图中，左侧为低分子量Marker，第1条带为阴性血清，第2条带为阳性血清，用第3、4号条带与第7、8号条带检测同一份血清，相同的上样量，第3、4号条带为粗Sa抗元，第7、8号条带为经亲和层析纯化后的Sa抗原。免疫印迹结果显示，粗Sa抗原所测抗Sa抗体的显色带颜色较浅，且条带较多，不以辨别，而纯化后的Sa抗原所测抗Sa抗体的显色带颜色较深，且条带仅一条，更为清晰易辨。
权利要求
1.一种Sa抗原的纯化方法，是采用亲和层析法对提取的Sa粗抗原进一步纯化，以得到纯化的Sa抗原，其特征是包括以下步骤a)纯化抗Sa抗体在缓冲液B中将Protein G Sepharose 4 Fast Flow浸泡脱气，装柱，缓冲液B平衡；取RA患者血清，离心、0.22μm滤膜过滤、缓冲液B透析，得到抗Sa阳性血清；将抗Sa阳性血清上柱孵育30分钟，先用缓冲液B洗柱，再用洗脱液A洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到抗SaIgG；b)制备亲和层析柱取活化的CNBr-Sepharose 4B，在偶联缓冲液中与纯化的抗Sa IgG混合，4℃摇荡过夜，偶联缓冲液淋洗后移入阻断缓冲液中，室温孵育2小时，制成亲和介质；制成的亲和介质用偶联缓冲液和醋酸盐缓冲液交替淋洗后，在缓冲液C中浸泡脱气，装柱，缓冲液C平衡，制成亲和层析柱；c)Sa抗原的亲和层析取Sa粗抗原，在亲和层析柱上循环上样5小时，缓冲液C洗柱，洗脱液B洗脱，洗脱液收集到预置中和缓冲液的收集管中，透析后得到纯化的Sa抗原。
2.根据权利要求1所述的Sa抗原纯化方法，其特征是所述的缓冲液B为pH7.0，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；缓冲液C为pH7.4，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液。
3.根据权利要求1所述的Sa抗原纯化方法，其特征是所述的洗脱液A为pH2.7的0.1mol/L甘氨酸-盐酸溶液；洗脱液B为pH2.5的0.1mol/L甘氨酸-盐酸溶液。
4.根据权利要求1所述的Sa抗原纯化方法，其特征是所述的偶联缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3，pH8.3。
5.根据权利要求1所述的Sa抗原的纯化方法，其特征是所述的阻断缓冲液为1％牛血清白蛋白，pH8.0。
6.根据权利要求1所述的Sa抗原的纯化方法，其特征是所述的中和缓冲液为1mol/L Tris，pH9.0。
7.根据权利要求1所述的Sa抗原的纯化方法，其特征是所述的醋酸盐缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc，pH4.0。
全文摘要
本发明涉及Sa抗原的纯化方法，是在Despres布氏漏斗法提取Sa粗抗原的基础上，采用CNBr－Sepharose 4B与抗Sa IgG偶联制成亲和层析柱，对Sa粗抗原进一步纯化，得到纯度更高的Sa抗原。经10％SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，显示本发明纯化的Sa抗原电泳条带明显减少，免疫印迹法检测也发现抗Sa抗体的显色条带清晰易辨。
文档编号C07K14/435GK1696156SQ200510012499
公开日2005年11月16日 申请日期2005年5月8日 优先权日2005年5月8日
发明者李小峰, 魏华, 胡学芳, 高圆, 陈竹, 国华 申请人:李小峰