近红外线荧光造影剂的利记博彩app

专利名称：近红外线荧光造影剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及赛安宁(シアニン)类化合物以及近红外荧光造影剂、使用该造影剂的荧光造影方法。
背景技术：
在治疗疾病时，要求在疾病的早期阶段用更为简便的方法精确而迅速检测由于其疾病引起的生物体内的器官·组织的形态变化。特别是治疗癌症时，在癌变初期确定小的病变部位并确定其大小在早期治疗上是必不可少的。作为以此为目的的已知的诊断方法可以举出，采用内窥镜的活体检查、X射线摄影、MRI以及超声波摄影等图像诊断。
活体检查由于可以直接观察病变部分因而对确诊是有效的，但同时增加了受检者的不适或痛苦。X射线摄影或MRI使受检者曝露在对人体有害的放射线或磁场中，随时间推移跟踪病灶·病变部位等，而其曝露时间也与跟踪时间成比例地增大。用于进行MRI诊断的测定通常摄影时间长，另外，从MRI摄影装置发出的声音给受检者带来心理压迫感。另外，由于这些设备或装置均为大型的，因此，在其设置或操作、维持上都需要大量的劳力和费用。
另一方面，光是用比较简单的装置非侵袭地诊断生物体的方法。例如，幼儿用的通过检测鼓膜发出的红外线来测量体温的体温计、通过将沉积于皮下组织的胆红素的黄变程度进行数值化来诊断新生儿的黄疸的黄疸计、以光的吸收测定为基础非侵袭地测量动脉血中的氧饱和度(SaO2)的脉冲测氧计、利用肿瘤细胞的自身荧光比正常细胞的自身荧光(用450nm激发，在520nm产生荧光)小的原理的采用内窥镜的自身荧光观察法等已经实用化。但是，在生物体内具有大量在可见光区域具有吸收的血红蛋白等，因此，存在只能测量、收集生物体的极表面的信息的问题。
但是，在属于比可见光波长稍长的区域的近红外区域，虽然存在具有氢键的各取代基的吸收，但该吸收比较小，因此，近红外光可以容易地透过生物体组织。因此认为，如果利用这样的近红外光特性，就可以不对身体增加无谓的负荷而测量生物体内的信息。但是，由于光被生物体组织强烈地散射，因此通常难以知晓检测的光通过了生物体的那些部分，或者传达了那些部分的信息。最近，通过高灵敏度的传感器、或发射极短脉冲的激光、使用蒙特卡洛法的体内光散射模拟法等的组合，可以得到体内深处的信息。
作为使用近红外光的诊断方法，在肿瘤部分聚集近红外光色素，对肿瘤部分进行成像的近红外光荧光摄影备受瞩目。该方法是，将具有由于近红外区域波长的激发光的照射而放射荧光的性质的化合物作为造影剂向生物体内给药。然后，从身体外侧照射具有近红外波长的激发光，检测从聚集在肿瘤部分的荧光造影剂放射出来的荧光，确定病变部位。作为这样的荧光造影剂，有被确认在生物体的安全性的吲哚赛安宁绿。肿瘤部分的血管的关闭时间是随机的，这被称为血流滞留(即血液池(血液プ一ル))，当对具有肿瘤的动物投放吲哚赛安宁绿时，在正常部分和肿瘤部分，由于在血液中的滞留时间不同(迅速地被由正常细胞构成的组织排泄)，通过照射近红外区域波长的激发光，可以使肿瘤部分浮现出来(大畑他在大白鼠实验肿瘤中使用吲哚赛安宁绿和近红外光受体图像的癌症诊断方法的基础研究日本医放会志.62(6).284-286.2002)。
自有赛安宁类化合物的荧光造影剂的报告以来，为将其改变为亲水性、摩尔吸光系数、高量子收率的化合物，公开了将各种周边的赛安宁类化合物作为造影剂的技术(例如，特开2000-95758号公报、特表2002-526458号公报、特表2003-517025号公报、特开2003-160558号公报、特开2003-261464号公报)。但是，在具有可以识别正常组织和病变组织的分辨能力(造影力)的同时，从生物体内造影后还必须从生物体内完全分解变为无害或完全排出(非蓄积性)，但是，迄今为止，兼备二者、更为安全的赛安宁类化合物以及含有该化合物的造影剂还没有发现。
本发明的目的在于，提供带来可以区别正常组织和病变组织的良好析像度的图象的造影力优异的、同时不易在生物体内蓄积的赛安宁类化合物以及含有该赛安宁类化合物的近红外光造影剂。另外，本发明的其它目的在于，提供使用该荧光造影剂的荧光造影法以及使用其的诊断辅助方法。

发明内容
本发明的上述目的通过以下构成来达到。
(1)本发明涉及的近红外造影剂含有以通式(I)表示的赛安宁类化合物。
通式(I) [式中，R表示氢原子、低级烷基或芳香族基团，R1及R2可以各自相同也可以各自不同，表示用水溶性基团取代的脂肪族基团，R3及R4可以各自相同也可以各自不同，表示低级烷基或芳香族基团，或者，表示R3和R4可以结合而形成碳环的非金属原子团；n为1或2时，表示L6可以和R3或R4结合而形成碳环的非金属原子团；n为0时，表示L4可以和R3或R4结合而形成碳环的非金属原子团。
L1～L6分别表示相同或不同的次甲基。
Z1和Z2可以相同也可以不同，表示对于结合在杂5员环上而形成5员或6员的稠环而必需的非金属原子团。
X表示中和分子电荷所必需的反离子，p表示中和分子全体的电荷所必需的X的数目。
m表示2～4的整数，n表示0～2的整数。](2)上述通式(I)中的水溶性基团优选磺酸基。
(3)上述赛安宁类化合物优选分子内至少具有2个水溶性基团的用通式(II)表示的物质。
通式(II) [式中，J1和J2可以各自相同也可以各自不同，表示碳原子数为1～5的亚烷基，R、R3、R4、L1～L6、Z1、Z2、m、n、p以及X与通式(I)中的定义相同。](4)上述赛安宁类化合物优选分子内的磺酸基数至少为3个，更为优选至少为4个。
(5)上述赛安宁类化合物，优选用通式(III)表示的物质。
通式(III) [式中，R5、R6分别表示用水溶性基团取代的碳原子数为3～5的磺基烷基，R、R3、R4、L1～L6、m、n、p以及X与上述通式(I)中的定义相同，R10～R17可以各自相同也可以各自不同，分别表示氢原子或∏值比0.3小的取代基。](6)上述∏值用下式表示∏＝logP(phX)-logP(phH)(式中，P是指化合物对辛醇/水的分配系数，logP(phX)表示具有取代基X的苯(phX)的logP值，logP(phH)表示苯(phH)的logP值)。
(7)本发明涉及的造影方法是一种荧光成像方法，该方法包括将上述近红外光造影剂导入生物体的步骤；对该生物体照射激发光的步骤；以及检测来自该近红外荧光造影剂的近红外荧光的步骤。
具体实施例方式
本发明的赛安宁类化合物通过激发光照射而放出荧光，该近红外荧光对生物体组织的透过优异。因此，含有赛安宁类化合物的近红外荧光造影剂实现识别病变组织和正常组织的析像性能的造影力优异，可以检测出生物体内的病灶。另外，本发明的赛安宁类化合物为水溶性，而且，排出性高，因此，可以安全地使用。
下面，对本发明的赛安宁类化合物以及含有该化合物构成的近红外荧光造影剂进行详细说明。所谓本发明涉及的近红外荧光造影剂，是指在近红外区域发出荧光的造影剂。
赛安宁类化合物本发明的赛安宁类化合物用下述通式(I)表示。
通式(I)
[式中，R表示氢原子、低级烷基或芳香族基团，R1及R2可以各自相同也可以各自不同，表示被水溶性基团取代的脂肪族基团，R3及R4可以相同也可以各自不同，表示低级烷基或芳香族基团，或者，表示R3和R4可以结合而形成碳环的非金属原子团；n为1或2时，表示L6可以和R3或R4结合而形成碳环的非金属原子团；n为0时，表示L4可以和R3或R4之间可以结合而形成碳环的非金属原子团。
L1～L6分别表示相同或不同的次甲基。
Z1和Z2可以相同也可以不同，表示对于结合在杂5员环上而形成5员或6员的稠环而必需的非金属原子团。
X表示中和分子电荷所必需的反离子，p表示中和分子全体的电荷所必需的X的数目。
m表示2～4的整数，n表示0～2的整数。]在通式(I)中，R表示氢原子、低级烷基或芳香基。
低级烷基是碳原子数为1～5的直链状或支链状的烷基，具体地，可以举出，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基等。它们也可以具有取代基，作为具有取代基的低级烷基，可以举出，例如，2-羟基乙基、3-氨磺酰丙基、3-羧基丙基等。
芳香族基团是含有取代、未取代的碳芳香环基团或杂芳香环基团的基团，可以举出，例如，苯基、间羟基苯基、对羟基苯基、噻嗯基、吡啶基、嘧啶基等。
在通式(1)中，R1和R2可以各自相同也可以各自不同，表示用水溶性基团取代的脂肪族基团。作为该脂肪族基团，可以举出，烷基、烯基、环烷基、炔基等。
作为烷基，优选碳原子数1～5的直链状或支链状的低级烷基。具体地，可以举出，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、2-甲基丙基、1，1-二甲基丙基等。
烯基优选碳原子数3～5的直链状或支链状的低级烯基，具体地，可以举出，烯丙基、2-丁烯基、异丁烯基等。
作为环烷基，优选碳原子数3～6的低级环状烷基，具体地，可以举出，环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
作为炔基，优选碳原子数3～5的直链状或支链状的低级炔基，具体地，可以举出，2-丙炔基、2-丁炔基等。
另外，作为水溶性基团，可以举出，例如，氨基甲酰基、磺酸基、羧酸基、羟基、磷酸基等。
“被水溶性基团取代的脂肪族基团”可以举出，例如，2-羟基乙基、2-羟基-3-磺基丙基、3-羟基丙基、羧甲基、羧乙基、羧丁基、2-膦酰基(ホスフオノ)乙基、3-膦酰基丙基、磺基甲基、2-磺基乙基、3-磺基丙基、4-磺基丁基、3-磺基丁基、2-羟基-3-磺基丙基等。其中，R1和R2优选是用磺酸基取代的碳原子数为1～5的低级烷基，优选使用例如，2-磺基乙基、3-磺基丙基、4-磺基丁基、3-磺基丁基、2-羟基-3-磺基丙基等。
在通式(I)中，R3和R4可以各自相同也可以各自不同，表示低级烷基或芳香族基团。作为低级烷基、芳香族基团，可以举出，与上述低级烷基、上述芳香族基团同样的基团。
或者，R3和R4表示可以在R3和R4之间结合形成碳环的非金属原子团；n为1或2时，表示L6可以和R3或R4结合形成碳环的非金属原子团；n为0时，表示L4可以和R3或R4结合形成碳环的非金属原子团。
作为R3和R4结合形成的碳环，可以举出，例如，环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环等。
作为L6与R3或R4之一结合而形成的碳环，或者L4与R3或R4之一结合而形成的碳环，可以举出，例如，环丁烯环、环戊烯环、环己烯环等。这些碳环可以用取代或未取代的低级烷基、磺酸基、羧基、羟基、氰基、氨基或取代氨基(例如，二甲基氨基、乙基-4-磺基丁基氨基、二(3-磺基丙基)氨基等)等取代基取代。即使是结合了非金属原子团Z1的吡咯环，也可以形成类似R3或R4之一与L6或L4之一结合而形成的碳环这样的碳环。形成这样的碳环具有以下优点，不会使化合物结构不稳定化，也不会导入对提高组织的亲和力不利的疏水性共轭结构，并且可以谋求吸收的长波长化。另外，这样的碳环的导入在生物体系统内是非活性的，并且有助于实现荧光特性良好的化合物。
在通式(I)中，Z1和Z2可以相同也可以不同，表示结合在含氮的杂5员环上而形成5员或6员的稠环所必需的非金属原子团。
作为由这样的非金属原子团形成的环，可以举出，5员环、6员环、由2个或2个以上的环构成的稠环、杂5员环、杂6员环、由2个或2个以上的环构成的杂稠合环等。在这些环中，可以在任意位置用取代基取代。
作为这样的取代基，可以举出，例如，磺酸基、羧基、羟基、氰基、取代氨基(例如，二甲基氨基、乙基-4-磺基丁基氨基、二(3-磺基丙基)氨基等)或者直接或通过2价连接基团结合在环上的取代或非取代烷基等。作为2价的连接基团，优选例如-O-、-NHCO-、-NHSO2-、-NHCOO-、-NHCONH-、-COO-、-CO-、-SO2-等。作为直接或通过2价连接基团结合在环上的非取代的烷基可以举出，甲基、乙基、丙基、丁基，优选甲基、乙基。另外，在被取代的烷基中，上述烷基的任意位置都可以被取代基取代，作为取代基，优选磺酸基、羧基、羟基，其中，优选磺酸基。
作为由上述非金属原子团形成的环，特别优选用亲水性基团取代的碳环或含氮杂环。
在通式(I)中，L1～L6分别表示相同或不同的次甲基，次甲基可以被任意的取代基取代。作为这样的取代基，可以举出，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、2-苯氧基乙基、2-磺基乙基等取代或未取代的烷基；氯、氟、溴、碘等卤原子；苯基、磺酸取代的苯基、甲氧基取代的苯基、萘基等取代或未取代的芳基；呋喃基、噻嗯基、吡咯基、咪唑基、吡咯烷基、吗啉基等杂环基；甲氧基、乙氧基等低级烷氧基；二甲基氨基、2-磺基乙基氨基等取代氨基或氨基等。用L1～L6表示的次甲基的上述取代基中优选的是，烷基、氨基、杂环基。
另外，用L1～L6表示的次甲基的取代基之间也可以结合而形成含有3个次甲基的环，该环还可以与其它含有次甲基的环形成稠环。
作为用L1～L6表示的次甲基的取代基之间结合而形成的含有3个次甲基的环，具体地，可以举出，4-氧代-2-羟基环丁烯环、环戊烯环、环己烯环以及4，4-二甲基环己烯环等，在本发明中，特别优选环戊烯环。
通式(I)的pX中，X表示中和分子的电荷所需要的反离子，p表示中和分子全部电荷所需要的X的数量。p的值只要可以中和分子全体的电荷即可，没有特别的限定，但通常为1～10。
作为反离子，可以举出，阳离子、阴离子，也可以是形成无毒性的盐的任意物质。作为阳离子的具体例，可以举出，钠、钾等碱金属的离子；镁、钙等碱土金属的离子；铵、三乙基铵、三丁基铵、吡啶等有机铵离子；赖氨酸盐、精氨酸盐的氨基酸的铵离子等。作为阴离子的具体例，可以举出，氯、溴、碘等卤素离子；硫酸根离子；醋酸、柠檬酸等有机羧酸的离子；甲苯磺酸离子等。作为反离子，特别优选可以进一步减少对生物体的毒性的钠离子或氯离子。
作为这样的用通式(I)表示的赛安宁类化合物，优选用下述通式(II)表示的、分子内至少具有2个水溶性基团的赛安宁类化合物。
通式(II) [式中，J1和J2可以各自相同或各自不同，表示碳原子数为1～5的亚烷基，R、R3、R4、L1～L6、Z1、Z2、m、n、p以及X分别与通式(I)中的定义相同]。
作为上述J1和J2表示的碳原子数为1～5的亚烷基，可以举出，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、2-甲基亚丙基等，尤其优选亚乙基。另外，作为用通式(II)表示的赛安宁类化合物，优选用下述通式(III)表示的赛安宁类化合物。
通式(III) [式中，R5、R6分别表示用水溶性基团取代的碳原子数为3～5的磺基烷基，R、R3、R4、L1～L6、m、n、p以及X与上述通式(I)中的定义相同，R10～R17可以相同也可以不同，分别表示氢原子或∏值比0.3小的取代基。]
上述R5、R6可以采用的基团是“用水溶性基团取代的碳原子数为3～5的磺基烷基”，作为该水熔化基团，除在上述通式(I)中定义的基团，也表示亲水性的非离子性基团。作为亲水性的非离子性基团，可以举出，例如，氨甲酰基、氨磺酰基、乙酰胺基、磺酰胺基、甲磺酰胺基等。
作为“用水溶性基团取代的碳原子数3～5的磺基烷基”，具体地，可以举出，2-羟基-3-磺基丙基、2-氨甲酰基甲基-4-磺基丁基、2-乙酰胺基-4-磺基丁基、2-氨磺酰基-3-磺基丙基、3-甲磺酰胺基-5-磺基戊基、3-甲磺酰基-4-磺基丁基、2-羧基-4-磺基丁基、3-膦酰基氧基-5-磺基丁基等，特别优选2-羟基-3-磺基丙基。
在通式(III)中，R10～R17可以各自相同也可以各自不同，表示氢原子或∏值比0.3小的取代基。对R10～R17的取代基的定义中使用的∏值进行说明。
∏值是表示取代基给化合物分子的亲水性·疏水性带来的影响的参数，用下式定义式∏＝logP(phX)-logP(phH)在上述式中，P是指化合物对辛醇/水体系的分配系数，具有取代基X的苯(phX)的logP值与苯(phH)的logP值的差以取代基X的∏值分配。
logP值可以用下述文献(a)的方法进行实测而求出，另外，也可以通过文献(a)记载的片断法(フラグメント法)或使用文献(b)记载的程序包计算求出。实测值和计算值不一致时，原则上使用实测的∏值。
(a)C.Hansch，A.J.Leo著《Substituent Constants for Correlation Analysis inChemistry and Biology》、John Wiley & Sons社、New York，1979年刊(b)Medichem程序包(由Pomona College，Claremont，California开发并出售的第3.54版)这样求出的每个取代基的∏值在文献(a)中整理为一览表。选取∏值为0.3或0.3以下的主要的取代基如下取代基∏值OSO3H-4.76OH-0.67CN-0.57COCH3-0.55COOH -0.32
OCH3-0.02COOCH3-0.01H 0.00F 0.14N(CH3)20.18作为∏值小于0.3的优选的取代基，可以举出，磷酸基、磺酸基、羧基、羟基、氰基、取代氨基(例如，二甲基氨基、乙基氨基等)或者通过∏值小于0.3的2价连接基团结合在环上的、∏值为0.3或0.3以下的取代或未取代的甲基或乙基等。
作为∏值小于0.3的2价连接基团，可以举出，例如，-O-、-NHCO-、-NHSO2-、-NHCOO-、-NHCONH-、-COO-、-CO-、-SO2-等。
作为∏值为0.3或0.3以下的取代或非取代的甲基或乙基，可以举出，例如，甲氧基、2-磺基乙基、2-羟乙基、甲基氨基羰基、甲氧羰基、乙酰基、乙酰胺基、ポロピオニルアミノ基、脲基、甲磺酰氨基、乙磺酰氨基、乙基氨基羰基氧基、甲磺酰基等。作为∏值小于0.3的取代基的优选的基团为磺酸基。
为在生物体内使用赛安宁类化合物作为荧光造影剂，而特别需要的性质为水溶性。在本发明的近红外荧光造影剂中，通过在赛安宁类化合物中至少导入3个磺酸基，可以发现对该化合物的水溶性的显著改善效果。为使赛安宁类化合物为水溶性，磺酸基优选的数目为4个或4个以上。
磺酸基在通式(I)中优选导入到R1、R2、Z1和/或Z2的位置上，在通式(II)中，优选导入到Z1和/或Z2的位置上，在通式(III)中，优选导入到R5、R6以及R10～R17的任意位置上。另外，该磺酸基优选通过亚烷基等2价的基团导入到共轭次甲基链L4上。
在通式(I)、通式(II)和通式(III)中，m表示2～4的整数，n表示0～2的整数。特别优选n为1的物质。
本发明涉及的赛安宁类化合物是用通式(I)～通式(III)表示的化合物，优选分子中至少具有3个或3个以上的磺酸基，更为优选具有4个或4个以上者。作为本发明的赛安宁类化合物，特别优选用上述通式(III)表示的、R5和R6为被非离子性的水溶性基团和磺酸基取代的碳原子数为3～5的低级烷基且分子内具有3个或3个以上的磺酸基的化合物的钠盐。
在本发明中使用的用上述通式(I)表示的化合物(包括用通式(II)和通式(III)表示的化合物)的具体例示于以下，但本发明并不限定于此。







本发明涉及的赛安宁类化合物，该化合物可以按照F.M.Hamer in theCyanine Dyes and Related Compounds，John Wiley and Sons，New York，1964、Cytometry，10(1989)3-10、Cytometry，11(1990)418-430、Cytometry，12(1990)723-730、Bioconjugate Chem.4(1993)105-111、Anal.Biochem.217(1994)197-204、Tetrahedron 45(1989)4845-4866、欧洲专利申请说明书0591820A1、欧洲专利申请说明书0580145A1、日本公开专利平4-147131号、日本公开专利2003-48891号、日本公开专利2003-64063号、日本公开专利2003-261464号等记载的已知的赛安宁类化合物的制造方法来合成，另外，也可以由市售的赛安宁化合物通过适当的已知方法合成。更为具体地说，可以通过赛安宁化合物和杂环季盐的反应合成。
对于本发明的用通式(I)表示的赛安宁类化合物的制造方法，例如，化合物(11)可以通过下面简图所示的方法来合成。其它化合物也可以同样合成。
由于本发明的赛安宁类化合物在生物体内使用，因此，最终不会蓄积在体内而是迅速排出体外是重要的，因此要求其基本上是水溶性的。作为提高赛安宁类化合物的水溶性的方法，优选阴离子类的羧酸或磺酸的盐类。本发明的赛安宁类化合物可以通过导入3个磺酸基而显著改善水溶性。为得到这样优异的水溶性，优选磺酸基的数目为3个或3个以上，更为优选4个或4个以上。但是，为容易地进行赛安宁类化合物的合成，磺酸基的数目优选10个或10个以下，更加优选8个或8个以下。
对于赛安宁类化合物，其水溶性的程度可以通过测定各化合物的分配系数，例如，由丁醇等脂肪族醇和水的二相体系测定分配系数来调节。例如，在导入了3个或3个以上的磺酸基的赛安宁类化合物中，正丁醇/水的分配系数logPo/w为-1.00或-1.00以下。即使在生物体内也是水溶性这一点可以通过将赛安宁类化合物溶解在生理盐水中，在36℃下放置，调查随时间的推移没有沉淀或析出来判断。
允许进入生物体的盐只要是与式(I)的化合物形成非毒性的盐的物质即可。作为它们的例子，可以举出，钠盐、钾盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土金属盐；色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、精氨酸等的盐这样的氨基酸盐。赛安宁类化合物特别优选在生物体内毒性低的钠盐。
近红外荧光造影剂本发明的近红外荧光造影剂含有上述赛安宁类化合物。本发明的赛安宁类化合物毒性低且显示出优异的水溶性，由于放射可以透过生物体组织的近红外区域的荧光，因此，含有该化合物的造影剂可以进行肿瘤和/或血管的非侵袭造影。近红外荧光造影剂可以将本发明的赛安宁类化合物溶解于注射用蒸馏水、生理盐水、林格氏液等溶剂中调制。在近红外荧光造影剂中，也可以溶解作为其它成分的基于制剂技术的各种制剂用助剂。具体地，可以举出，在生理学上允许的各种缓冲剂、电解质、螯合剂、视需要的渗透压调节剂、稳定剂、粘度调节剂、α-生育酚等抗氧化剂、对羟基苯甲酸甲酯这样的防腐剂等。
各种缓冲剂包括水溶性胺类缓冲剂、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。作为螯合剂，可以举出，制剂学上认可使用的EDTA、EDTA-Na2-Ca(乙二胺四乙酸二钠钙)、六偏磷酸等。
为得到等渗的溶液或悬浊液，可以以提供等渗液的浓度将造影剂溶解或悬浊在介质中。为形成等渗溶液，还可以将其它的非毒性的水溶性物质，例如，氯化钠这样的盐类、甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇等糖类添加到水性介质中。
本发明的近红外荧光造影剂可以通过向血管(静脉、动脉)内、口服内、腹腔内、皮下、皮内、膀胱内、(支)气管内等注射、注入、喷雾或涂布等方法向生物体内给药。本发明的荧光造影剂的给药量只要是可以最终检测出诊断部位的量即可，没有特别的限定，可以根据使用的发出近红外荧光的赛安宁类化合物的种类、给药的对象的年龄或身体大小以及目标脏器等适当增减，但通常赛安宁类化合物可以在0.1～100mg/kg(体重)、优选0.5～20mg/kg(体重)的范围内给药。
作为本发明的近红外荧光造影剂也可以作为动物用造影剂，其给药形态、给药途径、给药量等可以根据作为给药对象的动物的体重或状态适当选择。
本发明的近红外造影剂具有超过某浓度时聚集在肿瘤组织、在某浓度以下时容易排出体外的性质。利用其特性，可以作为选择性且特异性地对肿瘤组织进行造影的荧光造影剂使用。另外，本发明的化合物一旦注入到血管内，不易扩散到血管壁外，留在血管内的性质高，也可以作为血管造影剂使用。本发明的荧光造影方法的特征在于使用上述荧光造影剂。其测定方法采用本领域技术人员已知的方法进行，为获得最高的析像能力，激发波长、用于检测的荧光波长等最适条件可以根据给药的赛安宁类化合物的种类、给药的对象等适当决定。将本发明的荧光造影剂给药于测定对象时，使用本发明的荧光造影方法开始测定所需要的时间也根据给药的荧光造影剂的种类、给药的对象等而有所不同，但在例如以肿瘤或癌造影为目的给药时优选选择给药后10分钟～6小时左右的推移时间。推移时间过短时，荧光分散于整体，难以识别目标部位和其以外的部位，过长时，该造影剂会排泄出体外。以血管造影为目的时，优选在给药之后～1小时的推移时间内进行测定。
将本发明的荧光造影剂对测定对象体给药后，由激发光源对测定对象照射激发光，用荧光检测器检测通过该激发光产生的来自荧光造影剂(赛安宁类化合物)的荧光。激发波长根据使用的赛安宁类化合物而有所不同，只要本发明的化合物高效地发出荧光即可，没有特别的限定，优选使用生物体透过性优异的近红外光。通常用600～1000nm，优选700～850nm的波长的激发光激发，用高灵敏度荧光检测器检测荧光。此时，作为荧光激发光源，可以使用各种激光光源，例如，离子激光、色素激光、半导体激光等或卤素光源、氙光源等通常的激发光源，为得到最适的激发波长，优选使用各种光学滤光器。同样，即使在检测荧光时，通过使用仅仅选择来自荧光造影剂的荧光的各种光学滤光器，可以提高荧光的检测灵敏度。
实施例下面，基于实施例更为详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
化合物(11)的合成在参照Tetrahedron 27，pp5631-5639，1971合成的4.0g的杂环季盐化合物Q-1中，加入20ml乙酸、3g的三乙胺、1.5g赛安宁化合物D-1以及3g乙酸酐，在室温下搅拌6小时。过滤反应溶液，除去不溶物，再在室温下将滤液减压蒸馏进行浓缩。向浓缩了的上述滤液中加入溶解了2g乙酸钠的甲醇溶液15ml，在室温下搅拌1小时后，滤取生成的结晶，用少量的甲醇洗净。将得到的粗结晶3.2g溶解于15ml水中，添加1g乙酸钠后，加入甲醇30ml，搅拌1小时。过滤生成的结晶，用少量甲醇洗净，干燥，得到2.4g化合物(11)。化合物(11)的吸收最大波长(MeOH)为792nm，摩尔吸光系数(MeOH)为257000。
[实施例2]与实施例1同样地合成通式(I)的化合物2。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物4。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物5。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物6。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物12。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物20。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物32。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物37。
与实施例1同样地合成通式(I)的化合物39。
<化合物的水溶性试验>
在药典级(グレ一ド)的生理盐水1ml中溶解0.5mg染料(即，作为试验化合物的赛安宁类化合物)，制成溶液，将其溶液在42℃下静置放置1周，确认到析出或沉淀物的产生。完全未发现析出或沉淀物的产生的水平评价为◎，发现稍有浑浊，但通过搅拌消失的水平评价为○，出现浑浊，但搅拌也不消失的水平评价为△，发现析出或沉淀物的产生的水平评价为×。
<乳腺癌发病试验小鼠的制备>
为使老化促进小鼠，即所谓的SAM体系的一个系统的SAMP6/Ta体系小鼠发生乳腺癌，对其投药致癌物质7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)，制备乳腺癌发病试验小鼠。小鼠的致癌方法按照特开2003-033125号的记载进行。对SAMP6/Ta体系小鼠各20只，将DMBA以0.5mg/鼠/周计给药6次。作为饲料，给予固态高蛋白高卡路里的CA-1(日本クレア社制造)。将该致癌物质给药第6次后，从第1次给药算起到第20周作为停药期间。在病理组织学上检索乳腺癌以及乳腺癌的肺转移。将这样发生乳腺癌的小鼠(乳腺癌发生率75％)使用于以下的荧光造影试验。
<荧光造影试验>
将上述乳腺癌小鼠的肿瘤组织切片(2mm×2mm见方)移植到BALB/c裸鼠(5周岁，クレアジャパン社)的左胸部的乳房皮下。10天后，在肿瘤成长为直径约5mm时，将上述小鼠供给荧光造影试验。使用钛·蓝宝石激光作为荧光激发光源。为使照射的分散控制在2％或2％以内，使用环型光导(住田光学グラス社)，对进入暗箱的试验用小鼠均匀照射激光。照射输出功率调整为在小鼠皮肤表面附近约38μW/cm2。荧光用各化合物的最大激发波长激发，使用CCD照相机(C4880，滨松フオトニクス社)，用短波长截止滤波器截止入射光的反射，来对来自小鼠的荧光放射进行检测以及造影。另外，各照射时间通过各化合物的荧光强度进行调整。另外，对肿瘤部分的皮肤表面重新进行标记后，将用白光观察的图像和取除标记后在暗处照射激光得到的图像重合，评价在肿瘤部分是否发出荧光。
将表1记载的各试验化合物溶解于生理盐水(0.5mg/ml)，通过输乳管和腺叶(線葉)向小鼠给药。用量按照使各试验化合物为3mg/kg来使用。化合物给药30分钟后、12小时后、24小时后，用二乙醚将各个小鼠麻醉，进行小鼠全身的荧光图象造影，用以下基准评价肿瘤部分的荧光。
A.肿瘤部分可以清晰观察到荧光。
B.正常部分也可以观察到荧光，但可以分辨出肿瘤部分。
C.正常部分和肿瘤部分都发出微弱荧光，但可以大致分辨出肿瘤部分。
D.全身发出微弱荧光，不能辨别肿瘤部分和正常部分。
E.不能观察到荧光。
造影剂物质的赛安宁类化合物的体外排出量，是通过将造影剂给药后的赛安宁类化合物的体内量作为100，在小鼠的尿道上安装导尿管，合计给药后1周的排出量，用其比求出。另外，赛安宁类化合物的排出量使用液相色谱仪2010A(岛津制作所社制造)算出。
结果示于表1。另外，作为比较用造影剂，使用将特开2000-95758中记载的下述吲哚赛安宁绿(C-1)和列举化合物NO.29(C-2)分别溶解于生理盐水中得到的溶液(0.5mg/ml)。
C-1


权利要求
1.一种近红外造影剂，该造影剂含有以通式(I)表示的赛安宁类化合物通式(I) 式中，R表示氢原子、低级烷基或芳香族基团，R1及R2可以各自相同也可以各自不同，表示用水溶性基团取代的脂肪族基团，R3及R4可以各自相同也可以各自不同，表示低级烷基或芳香族基团，或者，可以表示R3和R4相结合而形成碳环的非金属原子团；n为1或2时，表示L6可以和R3或R4结合而形成碳环的非金属原子团；n为0时，表示L4可以和R3或R4结合而形成碳环的非金属原子团，L1～L6分别表示相同或不同的次甲基，Z1和Z2可以相同也可以不同，表示对于结合在杂5员环上而形成5员或6员的稠环所必需的非金属原子团，X表示中和分子电荷所必需的反离子，p表示中和分子全体的电荷所必需的X的数目。m表示2～4的整数，n表示0～2的整数。
2.按照权利要求1所述的赛安宁类化合物，该通式(I)中的水溶性基团为磺酸基。
3.按照权利要求1所述的赛安宁类化合物，其用通式(II)表示、且分子内至少具有2个水溶性基团，通式(II) 式中，J1和J2可以各自相同也可以各自不同，表示碳原子数为1～5的亚烷基，R、R3、R4、L1～L6、Z1、Z2、m、n、p以及X与通式(I)中的定义相同。
4.按照权利要求1～3中任意一项所述的赛安宁类化合物，其中，分子内的磺酸基的数目至少为4个。
5.按照权利要求3所述的赛安宁类化合物，其用通式(III)表示，通式(III) 式中，R5、R6分别表示用水溶性基团取代的碳原子数为3～5的磺基烷基，R、R3、R4、L1～L6、m、n、p以及X与上述通式(I)中的定义相同，R10～R17可以各自相同也可以各自不同，分别表示氢原子或∏值比0.3小的取代基。
6.按照权利要求5所述的赛安宁类化合物，该∏值用下式表示∏＝logP(phX)-logP(phH)式中，P是指化合物对于辛醇/水的分配系数，logP(phX)表示具有取代基X的苯(phX)的logP值，logP(phH)表示苯(phH)的logP值。
7.一种荧光造影方法，该方法包括将权利要求1所述的近红外光造影剂导入生物体内的步骤；对该生物体照射激发光的步骤；以及检测由该近红外荧光造影剂发出的近红外荧光的步骤。
全文摘要
本发明涉及近红外荧光造影剂以及使用其的造影方法，所述近红外荧光造影剂造影力优异，不易在生物体内蓄积，并含有具有水溶性基团的用上图通式表示的赛安宁类化合物。
文档编号C07D403/14GK1894212SQ20048003764
公开日2007年1月10日 申请日期2004年12月15日 优先权日2003年12月19日
发明者香川宣明, 羽生武, 上田荣一, 中岛彰久 申请人:柯尼卡美能达医疗印刷器材株式会社