专利名称：对蛋白制剂中的表面活性剂进行定量的方法
技术领域：
本发明涉及从表面活性剂制剂中去除组分的方法，以及测定制剂中表面活性剂的方法。
蛋白制剂比如人血清白蛋白(HAS)和重组人白蛋白(rHA)，加热处理后形成颗粒是已知的问题(EP 0 341 103)。颗粒被认为是通过在空气/液体界面和其他疏水性表面的蛋白变性而形成的(Manning，M.C.，Patel，K.和Borchart，R.T.(1989)，Pharmaceutical Research，6，903-918；Thurow，H.和Geisen，K.(1984)，Diabetologia，27，212-218.)。颗粒的形成能够通过向所述蛋白制剂中加入表面活性剂而被抑制。
可以使用10～20μg.mL-1或更大浓度的聚山梨酯80作为对rHA最终产品的formulant以防止颗粒形成。EP 0 341 103讨论了使用至多50mg.L-1浓度的不同表面活性剂来稳定人白蛋白溶液。很多其他药物蛋白制剂包含表面活性剂。例如，OrthocloneTMOKT3(Janssen-Cilag GmbH，Germany)含有大约0.2mg.mL-1的聚山梨酯80；ActivaseTM50(Genentech，Inc.，CA.，USA)在每小瓶50mL总体积中含有≤4mg的聚山梨酯80；VepesidTMJ 100(BristolLaboratories NJ，USA)在其他成分中含有400mg的聚山梨酯80；以及NovoSevenTM240(Novo NordiskA/S，Denmark)在其他成分中含有0.65mg的聚山梨酯80。
因此，表面活性剂能够代表包括药物蛋白制剂在内的蛋白制剂中的显著formulant。如此，就需要有对最终产品中的表面活性剂进行测定的规定要求。测定的准确度对于药物制剂尤其重要。然而，在蛋白的存在下准确地评价表面活性剂的含量是不可能的，因为对于表面活性剂所采用的检测技术比如光谱法、高效液相色谱法、界面张力测定术、毛细管电泳、总有机碳(TOC)滴定法和TLC等也检测蛋白。因此该蛋白含量导致对表面活性剂含量的过度估算。
Garewal(Anal.Biochem.，54，319-324，1973)提供了测定蛋白水溶液中表面活性剂含量的方法。该方案教导，作为第一步，加入乙醇以破裂胶束，随后加入硫氰酸钴铵(ACT)。被Garewal例证的方法使用了Triton X-100表面活性剂水溶液，ACT连接到该表面活性剂上并且形成蓝色络合物。然后Garewal加入了不互溶的但ACT-Triton X-100可溶于其中的有机相(二氯化乙烯)。将该络合物移入有机相并将该有机相与水相相分离。最后，通过记录该有机相580nm～700nm的光谱来测定有机相中TritonX-100的含量；认为在622nm和687nm处吸光度的差值与存在的Triton表面活性剂的量成比例。
Garewal研究了向Triton X-100的水溶液中引入蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，对该方法有效性的影响。对至多666μg.mL-1的BSA浓度进行了考察。使用较低的BSA浓度例如267μg.mL-1，引起提取效率降低到大约85％，但是将蛋白的浓度提高到666μg.mL-1时没有发现在提取效率上引起任何进一步的显著降低。Garewal总结是因为与ACT反应的聚(氧乙烯)基团在生物学组分(例如蛋白)中稀少，因此可期望最小的干扰并且此处说明的该方法适合于生物化学测定。
Garewal的方法在过去的30年中是生物制品中表面活性剂定量所选择的方法。经过微小的修改，Garewal的方法出现在WCBP 2002，第六届关于Regulator and Analytical Sciences for Biotechnology Health Products的会议上(2002年1月27～30日)的由美国马萨诸塞州剑桥Biogen公司的，Lanteigne，D.和Kobayashi，K.所做题目为“Quantitative Determination of Polysorbate inFormulated Protein-Based Biopharmaceuticals by a Direct Colorimetric Method”的展板中。发表说明了对52mg.mL-1单克隆抗体制剂中聚山梨酯80(以商标″Tween 80″销售)的测定。Lanteigne和Kobayashi指出，当样品中含有“高”浓度的蛋白(例如52mg.mL-1)时，就需要使用“蛋白去除步骤来清除活性药物物质(即蛋白)的可能干扰”。Lanteigne和Kobayashi用乙醇沉淀制剂中的蛋白来陈述该步骤，包括在零下30℃将样品孵化过夜(离心和分离上层清液)，然后加入ACT来络合表面活性剂并使用二氯甲烷作为有机液相提取该ACT-表面活性剂络合物。
然而，随着研究我们惊奇地发现，与他们的教导相反，该Lanteigne和Kobayashi法不能提供对蛋白溶液中表面活性剂含量的准确测定。这个方法的准确度以及基本Garewal法的准确度在较高蛋白浓度时尤其差。例如，如下面所说明的(见对比实施例1)，当对表面活性剂溶液中蛋白含量大于50mg.mL-1的样品进行测定时，Garewal法给出了令人误解的结果。不期望Garewal法对含有200mg.mL-1蛋白的溶液提供准确的表面活性剂测定。这是因为这些方法没有从所要分析的表面活性剂样品中除去蛋白组分。而且，我们证明被Garewal和被Lanteigne和Kobayashi建议的乙醇加入步骤导致表面活性剂不可接受的高度损失，并且因此提供了不可信的数据。我们也证明当用Lanteigne和Kobayashi说明的ACT/二氯甲烷方法提取表面活性剂时，去除表面活性剂制剂中的蛋白含量导致不可接受的表面活性剂损失。
为了克服这些不期望的问题，我们设计了从给定的样品中将蛋白和其他组分与表面活性剂分离的新方法，据此提供更完全的表面活性剂制剂，当其被分析时，提供的结果更代表它所取自的原始样品中表面活性剂的真实含量。而且，本发明的方法不要求为了去除蛋白而将样品孵化过夜的时间消耗步骤，并因此是比Lanteigne和Kobayashi所说明的方法实行起来更为有效的方法。
据此，在本发明的第一个方面，提供从液相表面活性剂制剂中去除蛋白组分的方法，其包括(a)提供一种含有蛋白组分的液相表面活性剂制剂；(b)向步骤(a)的制剂中加入络合剂并且让该络合剂与该表面活性剂形成络合物；(c)与步骤(b)同时或随后，分别向步骤(a)的制剂或步骤(b)的产物中加入可混溶的沉淀剂，以形成液相反应混合物并且让该可混溶的沉淀剂沉淀该液相反应混合物内的蛋白组分；和(d)从步骤(c)的产物中将所述络合物与沉淀的蛋白组分相分离以提供纯化了的液相表面活性剂制剂；其中该络合物保留在所述液相反应混合物之内的溶液中，并且步骤(d)将该络合物保留在该液相中。
任何表面活性剂类型都能够通过本发明第一方面的方法来纯化。表面活性剂是能够起降低液体表面张力作用的分子。表面张力是作用在液体表面的力，趋向于将表面的面积最小化；在数量上，它是作用在表面上单位长度切线方向的力。水的表面张力在室温(20℃)用张力计测量时是72dyne/cm；表面活性剂能将该值降低到典型地不超过50dyne/cm的表面张力，例如大约30～50dyne/cm。
典型地，表面活性剂为非离子的，即具有不带电的亲水性头基。非离子表面活性剂的实例包括具有聚(氧化烯)基团的表面活性剂，比如聚(氧乙烯)基团、醇基或另外的极性基团。适合的非离子表面活性剂可以具有疏水基和活泼氢原子，比如具有氧化烯尤其是只具有氧乙烯或还具有氧丙烯的脂族醇、酸、酰胺或烷基酚。因此，该非离子表面活性剂可以是烷基酚和环氧烷的缩合物；聚氧化烯失水山梨糖醇油酸酯；或聚氧化烯二醇(polyoxyalkyleneglycol)。
具体的非离子表面活性剂化合物包括烷基(C6-C22)酚环氧乙烷缩合物、脂族(C8-C18)初级或次级直链或支链醇与环氧乙烷的缩合产物，以及环氧乙烷与环氧丙烷和乙二胺的反应产物的缩合制备的产物。其他非离子表面活性剂化合物包括长链叔胺氧化物、长链叔膦氧化物和二烷基亚砜。非离子表面活性剂也可以是糖酰胺，比如多糖酰胺，比如在US 5,389,279中说明的乳糖酸酰胺(lactobionamide)或在US 5,009,814中说明的糖酰胺。这种类型的其他典型表面活性剂包括Igepal DM 730、Igepal DM 530、Igepal DM 210、Igepal CO880、Igepal CO 530、聚乙二醇，包括以商标Brij销售的化合物(比如聚氧乙烯(4)月桂醇醚(Brij 30)，月桂醇醚(Brij 35)，聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚(Brij 58)，聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(Brij 78)和聚氧乙烯(20)油醇醚(Brij 92))，和聚氧乙烯脂肪酸酯，包括以商标Myrj销售的化合物(比如Myrj51)。典型的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯辛基酚(比如TritonX-100)；烷基苯氧基聚乙氧基(3)乙醇，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween40)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween60)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三硬脂酸酯(Tween65)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯(Tween80)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三油酸酯(Tween85)，聚氧乙烯(20)棕榈酸酯(G2079)，聚氧乙烯(20)月桂醇醚；聚氧乙烯(23)、聚氧乙烯(25)氢化蓖麻油(G1292)和聚氧乙烯(25)氧丙烯单硬脂酸酯(G2162)。
适合用于本发明第一方面方法的其他表面活性剂可以为阴离子的，具有负电荷头基。阴离子表面活性剂的实例包括长链脂肪酸、磺基琥珀酸盐、烷基硫酸盐、磷酸盐和磺酸盐，比如十二烷基硫酸钠、胆酸钠、去氧胆酸钠、和牛磺胆酸钠。
阳离子的，具有正电荷头基。阳离子表面活性剂包括质子化了的长链胺和长链季胺类化合物，比如十六烷基三甲基溴化铵(Cetavlon)、鲸蜡基三甲基溴化铵和N-十六烷基氯化吡啶。
两性的，具有两性离子的头基。两性表面活性剂的实例包括甜菜碱和某些卵磷脂。
表面活性剂可以有一个或多个氧化烯基团。任何氧化烯基团都可以出现，比如氧乙烯、氧丙烯、氧丁烯等。在商业可获得的表面活性剂中氧乙烯基团是常见的。多氧化烯基团可以以聚合物(例如均聚物、共聚物或嵌段共聚物)出现，即作为聚(氧化烯)基团，比如均聚体的聚(氧乙烯)基团。对于表面活性剂来说含有六个或更多个氧化烯基团是通常的，尽管本方法对具有较少比如5、4、3、2、或1个氧化烯基团的表面活性剂也是适用的。表面活性剂可以为具有一个或多个聚(氧乙烯)基团的非离子表面活性剂，比如聚山梨酯、辛基酚基环氧乙烷缩合物、环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物、聚氧化烯二醇、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯烷基烯丙基醚等。
聚山梨酯(也叫做聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，以注册商标Tween销售)是衍生于失水山梨糖醇酯的非离子表面活性剂(Becher，P.″Polyol Surfactants″inNonionic Sulfactants，Schick，M.J.Ed.(Dekker，New York，1967)，247-299页；Chislett，L.R.和Walford，J.(1976)Int Flavours Food Addit.，7，61；Varma，R.K.等(1985)Arzneimittel-Forsch，35,804)。优选的聚山梨酯包括聚山梨酯20、21、40、60、65、80、81、85等。尤其优选的表面活性剂为聚山梨酯80，它的通式(I)为 w、x、y、z的总和是20辛基苯氧聚乙氧基乙醇(也叫做辛苯聚醇，以商标Triton X、Igepal CA和Polytergent G销售)是非离子表面活性剂，可以通过将异辛基酚与环氧烷比如环氧乙烷反应来制备。通常商业可获得的辛苯聚醇的每个分子中的氧乙烯单元的平均数目(n)典型地在5～15之间。所述通式用下面式(II)代表 在以Triton X-100销售的典型的这种表面活性剂中，n是大约9.5。
聚乙烯聚丙烯乙二醇(亦称为泊洛沙姆，以注册商标Pluronic销售)是具有下面式(III)代表的通式的一系列非离子表面活性剂HO(CH2CH2O)a(CH-(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH (III)其中，b至少是15，并且(CH2CH2O)a+(CH2CH2O)c在20～90％重量变化。该分子量范围在1,000～16,000g.mol-1或更多。关于泊洛沙姆的综述，见Schmolka，I.R.(1967)Am.Perfumer Cosmet.，82(7)，25-30。泊洛沙姆的具体实例包括“Pluronic L62LF”，其中a＝7，b＝30，c＝7；“Pluronic F68”其中a＝75，b＝30，c＝75；和“PluronicL101”其中a＝7，b＝54，c＝7。
用于本发明第一方面方法的表面活性剂可以还含有一个或多个直链或支链烃链。在商业可获得的表面活性剂中典型可见的烃链包括脂肪酸。脂肪酸通常在烃骨架中具有至少六个碳原子，并且较大的骨架是通常的，比如C16和C18。据此，所述烃链可以是油酸(即C16脂肪酸)基团。该表面活性剂可以含有聚(氧化烯)基团和烃链二者。例如，聚山梨酯含有聚(氧乙烯)基团和油酸基团二者；辛苯聚醇包含支链烃链和聚(氧乙烯)基团。
蛋白组分可以包括由原料制备的任何纯化了的表面活性剂制剂中不期望的任何蛋白分子。具体地该组分可以为干扰任何后续表面活性剂定量准确度的组分。如果组分包含肽、多肽或蛋白或由这些所组成，那么它就是蛋白组分。短语“肽、多肽或蛋白”包括天然存在的或人造的氨基酸的任何聚合物，优选以肽键连接的。优选肽、多肽或蛋白在长度上至少是10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。该蛋白组分可以是天然存在的或重组产生的蛋白，比如白蛋白、白蛋白融合蛋白比如WO 01/77137(作为参考在此引入)中提到的、单克隆抗体、依托泊苷、血清蛋白(比如凝血因子)、antistasin、壁虱抗凝肽(tick anticoagulant)或在WO 01/77137中公开的任何一种或多种白蛋白“融合配偶体(fusion partners)”，如从白蛋白中分离的个体蛋白。
不象现有技术方法，本发明第一方面的方法是能够有效地将表面活性剂与高度浓缩的蛋白组分相分离，例如，在步骤(a)的液相表面活性剂制剂中蛋白组分可以以至少50、75、100、150、200mg/ml的浓度存在，其中组分的水平以每表面活性剂制剂体积中的重量计。
测量步骤(a)的液相表面活性剂制剂中表面活性剂与蛋白组分的比例是恰当的。据此，当以存在于步骤(a)的液相表面活性剂制剂中每蛋白组分分子质量中的表面活性剂分子质量来表达时(即ppm)，表面活性剂与蛋白组分的比例可以小于4,800ppm，比如小于4,500ppm、4,000ppm、3,500ppm、3,000ppm、2,500ppm、2,000ppm、1,500ppm、1,000ppm、900ppm、800ppm、700ppm、600ppm、500ppm、400ppm、300ppm、200ppm、110ppm、100ppm、90ppm、80ppm、75ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、18ppm、17ppm、16ppm、15ppm、14ppm、13ppm、12ppm、11ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm或更少。
术语“液相表面活性剂制剂”包括包含有表面活性剂的任何液相制剂。该制剂可以是含水的。
所说的“提供”，在提供液相表面活性剂制剂的上下文中，我们包括取整体样品、取较大制剂中的等分部分或由同一基本批(basic lot)制备的一批样品。
术语“络合剂”包括因具有与一个或多个表面活性剂分子形成弱键的能力而能来改变表面活性剂疏水特征的化合物。上述定义的表面活性剂是本方法条件下的。典型地络合剂是含有多价金属离子比如过渡金属离子的化合物。例如，所述金属离子可以是VI、VII、VIII、IX或X过渡金属离子，比如钇、镐、铌、钼、锝、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、汞，但优选过渡金属离子是第三过渡金属离子比如钴、铁、铜、锌、镍、锰、铬、钒、钛和钪。钴化合物可以用作络合剂。据此，该络合剂可以是硫氰酸钴铵(ACT)。ACT是用于络合具有氧化烯或聚(氧化烯)(例如氧乙烯或聚(氧乙烯))基团的表面活性剂的适合的络合剂。相似地，离子化合物比如离子(III)硫氰酸盐可以用作络合剂。
不象现有技术方法，本发明的方法不依赖有色络合物的形成来确定表面活性剂的存在。因此，在本发明中使用的络合剂不一定需要形成有色的络合物。
将有效量的络合剂加入到液相表面活性剂制剂中。换句话说，加入络合剂的量足够基本上络合该液相表面活性剂制剂中全部的表面活性剂。典型地是过量添加。基本上络合该液相表面活性剂制剂中全部的表面活性剂所需的络合剂的量能够采用该表面活性剂的来污染溶液通过络合剂的经验测试来确定。
所说的“让络合剂与表面活性剂形成络合物”，我们是指该络合剂的至少一部分与表面活性剂的至少一部分络合。典型地，在将络合剂加入到液相表面活性剂制剂中后，对该制剂进行混合以将该络合剂分散在制剂中。让络合发生的最适宜条件将依赖于表面活性剂的性质和络合剂的性质，并且典型地包括对该液相的温度、压力、pH和/或离子强度的改变。对于络合有用的条件可以包括中性pH和低离子强度(Crabb和Persinger，1961，Journal of theAmerican Oil Chemist′s Society，41，752-755)。例如，当表面活性剂是聚山梨酯80并且络合剂是ACT时，适合于让络合剂与表面活性剂形成络合物的条件在下面的实施例中列出。
络合物在形成之后保留在液相内的溶液中。因此在让络合剂与表面活性剂形成络合物所使用的条件下(但是没有任何蛋白存在)，基本上没有络合物形成沉淀。如果在于47,800g 4℃条件下将该液相离心15分钟得到的片状沉淀物中能够收集的表面活性剂的量，小于在下列实施例中说明的采用HPLC测定的离心后从上清液中收集的表面活性剂的20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％重量，该络合物就能被说成是保留在溶液中了。较低的百分数值是优选的。
“沉淀剂”是引起除了表面活性剂以外的其他组分沉淀的任何试剂。为了起到它的作用该沉淀剂必须在液相表面活性剂制剂中是“可混溶的”。换句话说，在所用的条件下，该沉淀剂不能形成与该液相表面活性剂制剂不可混溶的液相或固相。优选沉淀剂是在含水液相表面活性剂制剂中可混溶的。为了是水可混溶的，沉淀剂通常具有极性区域。典型地沉淀剂是有机的水可混溶溶剂。水可混溶的沉淀剂实例包括极性质子溶剂和极性非质子溶剂比如醇、氰基烷基、胺、酰胺、羧酸、醛、酮、乙二醇、醚、烷基卤化物和芳香烃。优选的沉淀剂包括丙酮、乙腈、异丙醇、甲醇和乙醇。乙腈提供较好的在表面活性剂产量和污染物携带之间的平衡。而且，乙腈具有优于丙酮的优点包括(a)丙酮的使用要求使用玻璃器皿进行上清液操作，这可能由于清洗而被去污剂污染，而乙腈的使用允许使用用完就扔掉的塑料容器，因此将污染的风险最小化；并且(b)丙酮具有-18℃的闪点，低于典型的离心温度，为了安全最好使用乙腈，其闪电为+13℃。
沉淀剂的加入是在络合剂加入到液相表面活性剂制剂的同时、或更一般地是之后，但不是之前。这是本发明与现有技术的一个很重要的差别。Garewal(op.cit.)与Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)都是在络合剂(ACT)加入之前将沉淀剂(乙醇)加入到表面活性剂制剂中的。这引起一些表面活性剂由于被代入到了沉淀中而从溶液中损失。因此，所得的上清液中表面活性剂的定量是对起始制剂中表面活性剂量的不准确的测量。不用联系理论，可以相信通过在加入络合剂的同时或更一般地在其之后而不是之前加入沉淀剂，蛋白组分去除的效率得到改进。络合剂将全部的该表面活性剂基本上保留在溶液中而蛋白组分被沉淀了。
在一些情况下，沉淀剂的后续加入可以提高络合剂的作用并且导致表面活性剂和络合剂更大程度的形成络合。不用联系理论，我们相信这是因为沉淀剂进一步将表面活性剂与蛋白组分分离，因此使表面活性剂被络合剂更好的络合。
当“让可混溶的沉淀剂在该液相反应混合物内沉淀蛋白组分”时，该液相反应混合物可以在利于蛋白组分沉淀而基本上不扰乱络合物的条件下孵化。所用的实际条件将依赖于所谈论系统内的具体组分的性质。本领域的技术人员能够凭经验试验来决定对于系统组分的任何给定组合的适当条件。
络合物保留在液相反应混合物内的溶液中。在此上下文中，如果在于47,800g 4℃条件下将该液相反应混合物离心15分钟得到的片状沉淀物中能够收集的表面活性剂的量，小于在下列实施例中说明的采用HPLC测定离心后从上清液中收集的的表面活性剂的20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％重量，则络合物“保留在溶液中”。较低的百分数值是优选的。
所说的“从步骤(c)产物中将所述络合物与沉淀的蛋白组分相分离”的步骤能够采用本领域中已知的用于从溶液中分离沉淀的任何适合方法来完成，只要它“将该络合物保留在液相中”。基本上全部的络合物都被保留在步骤(c)的液相产物中。毫无疑问，如果该络合物分配到分离的不可混溶的液相中，它就不被保留在液相中了。这是本发明方法与Garewal(op.cit.)与Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)方法的又一重要差别。Garewal(op.cit.)与Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)方法通过加入不可混溶的有机相(二氯化乙烯或二氯甲烷)来从水性溶液中分离络合的表面活性剂。不用联系理论，我们相信表面活性剂络合物分配进入分离的液相导致巨大的污染物携带。与此对照，我们不依赖络合物分离的这种形式，并且因此实现了蛋白组分的更大去除。
分离步骤典型地是通过将反应混合物离心，这样使沉淀的蛋白组分形成片状沉淀物并且络合物被保留在上清液中，并将上清液从片状沉淀物中分离来进行。最佳的离心参数比如g和持续时间将根据形成的沉淀的性质而变化。从以下实施例中能够得到指导，尽管本领域的技术人员能凭经验测验决定适当的条件。
然而，本领域的技术人员应该意识到在本领域中可以有多数其他方法来将液相制剂与沉淀分离，比如过滤。
分离步骤的产物是纯化了的液相表面活性剂制剂。所说的“纯化了的液相表面活性剂制剂”包括基本上不含沉淀的蛋白组分的液相表面活性剂制剂的意义。在此上下文，如果液相表面活性剂制剂能在下面实施例中定义的条件下应用于疏水固相萃取柱，不堵柱子或在SPE纯化后不显著影响表面活性剂的纯度，那么该液相表面活性剂制剂就是基本上不含沉淀的蛋白组分。
本发明第一方面的方法可以包括一个或多个附加的纯化步骤来对该纯化了的液相表面活性剂制剂中的表面活性剂进一步进行纯化。任何适合的方法都可使用。
在一个实施方案中，本发明第一方面的方法包括将纯化了的液相表面活性剂制剂中的络合物非共价结合地结合到固相上。典型地是使用疏水固相，因为它吸附表面活性剂。或者，可以使用亲水固相，它吸附保留在该纯化了的液相表面活性剂制剂中的蛋白组分，而不保留表面活性剂组分，因此使表面活性剂作为洗出液被收集。
如果络合物在暴露于固相之前解体可能是有帮助的。技术人员熟知使络合物解体的方法。具体细节依赖于表面活性剂和络合剂的性质。例如，可以使用鳌合剂。典型地鳌合剂将与表面活性剂竞争来结合到络合剂的多价金属离子上。据此，当络合物剂是ACT(即该多价金属离子是钴)时，解体该络合物的适合方法为在该纯化了的液相表面活性剂中加入鳌合剂比如乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一个实施方案中，在附加步骤中使用的固相是固相萃取(SPE)柱或盘。
固相萃取(SPE)柱或盘可以是疏水的。疏水固相萃取(SPE)柱或盘的实例包括聚苯乙烯二乙烯基苯(例如下面例举的Bakerbond SDB1柱，Merck提供的Licrolut EN PDBV柱或Phenomenex提供的StrattaX)或C2-24烷基柱。
在本发明第一方面的方法中，表面活性剂是非共价地结合到固体基质上的，该固体基质可以用使结合的表面活性剂保持结合在基质上而任何保留的蛋白组分都被洗掉的液体来洗涤。适合的洗涤液体是本领域熟知的并且可商业获得的。适合的洗涤液体包括异丙醇、己烷和乙腈。如果洗涤液体是酸性或碱性的可能有帮助。例如，乙酸能够以适当浓度的比如0.1％(v/v)存在于己烷中以提供酸性洗涤液体。能够以适当浓度的铵或三乙胺比如0.5％(v/v)铵或1％(v/v)三乙胺存在于己烷中以提供碱性洗涤液体。所述适当的洗涤条件能够被技术人员根据表面活性剂和固相的性质来决定。
基质可以用不从基质中去除表面活性剂的液体洗涤。典型地，适当的洗涤液体可以是足够亲水性的以不扰乱表面活性剂与基质的相互作用，或者可以是足够疏水性的以沉淀溶液中的表面活性剂。确定适合的洗涤液体的方法能够按照如下进行。如果表面活性剂(例如聚山梨酯80)的至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或基本上100％能够被在下列条件下从基质(例如聚苯乙烯二乙烯基苯SPE柱，比如下面例举的Bakerbond SDB1柱，Merck提供的Licrolut EN PDBV柱，或Phenomenex提供的StrattaX，或其等价物)上去除，该液体就被认为是会沉淀表面活性剂的(a)柱子是根据下面实施例(2)的步骤2(v)(a)制备的。
(b)柱子负载10mL的15μg.mL-1表面活性剂水溶液(大约0.5mL.min-1)。
(c)柱子用3×1mL的所述的洗涤液体洗涤。通过在真空下让空气通过该柱子至少30秒来使其完全干燥。
(d)按照实施例2的步骤(v)(d)-(g)洗脱每个柱子上的表面活性剂并且收集，根据实施例2中步骤(vii)-(ix)所列出的方案用按照实施例2的步骤2(vi)设定的HPLC装置测定表面活性剂的回收率。
(e)回收率应该由提取计算而得不用该考察溶剂洗涤。
因此技术人员能够依据表面活性剂的性质和所用固体基质的性质选择适合的洗涤液体。适合的洗涤液体可以为足够强到沉淀固相上的表面活性剂或足够弱到最小化或防止表面活性剂的洗脱。典型地该洗涤液体为水不溶性有机溶剂或水溶性有机溶剂。
适合的洗涤液体，尤其是在具有聚(氧化烯)(比如聚(氧乙烯))基团(例如聚山梨酯80)的表面活性剂的情况下，可以包括己烷等，比如氯仿或甲苯。适合的洗涤液体，尤其是在具有与固相牢固结合的基团比如去水山梨糖醇基团(例如聚山梨酯80)的表面活性剂的情况下，能够是不洗脱表面活性剂的弱的洗涤液体，比如乙腈、异丙醇和/或三乙胺。技术人员应当理解，适当的话这些方式可以结合。例如，聚山梨酯80含有聚(氧乙烯)基团和去水山梨糖醇基团二者，因此强的和弱的洗涤液体都能使用。例如，我们发现下列洗涤液体对于聚山梨酯80是适合的30％(v/v)乙腈然后是异丙醇、含有1％(v/v)三乙胺的己烷最后是己烷。
根据表面活性剂的性质、基质的性质和要被去除的蛋白组分的性质可以采用进一步的洗涤步骤。
在洗涤步骤之后，典型地是表面活性剂从基质上洗脱并且作为洗出液收集。任何适合的洗脱液都能使用。我们发现甲苯∶乙醇(1∶1)混合物在实施例系列中提供了好的结果。
能够将纯化了的液相表面活性剂制剂或从其衍生的洗出液进行分析以测定表面活性剂的含量。技术人员熟知测定溶液中表面活性剂含量的方法。例如，如果表面活性剂含有至少六个氧乙烯基团，那么该表面活性剂能够用ACT来络合并且表面活性剂浓度可以用分光光度法测定，例如如Garewal(op.cit.)所说明的。或者，表面活性剂含量能够用HPLC或水性GPC来测定，比如在下面实施例中说明的。
由于在被测样品中蛋白组分的低水平，相比于根据现有技术方法进行的分析，该分析结果与初始液相表面活性剂制剂中实际的表面活性剂含量更紧密地相关。优选地，当用下面举例的方法进行HPLC测定时，被测样品中蛋白组分的水平在可检测水平以下。
据此，当所用液相表面活性剂制剂是较大制剂的等分部分或一批制剂中的一个样品时本发明方法能够是有用的，并且该方法包括使纯化了的表面活性剂制剂中或来源于此的更进一步的洗出液中如此测定的的表面活性剂含量与该较大制剂的或批中的其他样品的表面活性剂含量相关的附加步骤。
进行了该相关后，使用者就能够适当地标识该较大制剂或该批中的其他样品，或者能够提供适当的质量控制报告来反应如此测定的表面活性剂的含量。
既然本发明的方法提供比现有技术方法更准确的测定表面活性剂含量的方法，因此旨在用本发明方法分析并且用如此测定的表面活性剂含量标识的制剂将与现有技术制剂在其标签或其他相关的数据上区分，它更准确地并且更精确地反应其含有的表面活性剂的水平。据此，这样的产品更能够顺应控制要求。
据此，在本发明的第二个方面，提供了按照上述定义方法能得到的标识了的液相表面活性剂制剂。在优选的实施方案中，该液相表面活性剂制剂包括蛋白组分，比如上述讨论的。优选该组分在步骤(a)中的液相表面活性剂制剂中以至少50、75、100、150、200mg/ml或更大的浓度存在，其中组分水平以每表面活性剂制剂体积中的重量计。
测量步骤(a)的液相表面活性剂制剂中表面活性剂与蛋白组分的比例是恰当的。据此，当以存在于步骤(a)的液相表面活性剂制剂中每蛋白组分分子质量中的表面活性剂分子质量来表达时(即ppm)，表面活性剂与蛋白组分的比例可以小于4,800ppm，比如小于4,500ppm、4,000ppm、3,500ppm、3,000ppm、2,500ppm、2,000ppm、1,500ppm、1,000ppm、900ppm、800ppm、700ppm、600ppm、500ppm、400ppm、300ppm、200ppm、110ppm、100ppm、90ppm、80ppm、75ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、18ppm、17ppm、16ppm、15ppm、14ppm、13ppm、12ppm、11ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm或更少。
对于有技术的读者，上述说明的方法在对含有表面活性剂的药物制剂批的质量控制中是有用的是显然的。质量控制是通过测试制造过程中产品的样品典型地是小批或批样品是否违反标准规格来维持制造产品的标准的体系，以此确保输出产品符合标准的要求。这在需要符合控制要求的药物产品的制造中是尤其重要的。因此，表面活性剂测定上下文中的“组分”一般是期望的药学活性化合物。因此，该制剂的表面活性剂含量的质量控制可以采用上述定义的方法通过测定制剂样品中的表面活性剂含量来进行。
据此，在本发明的第三方面，提供采用上述定义的方法进行质量控制的含有表面活性剂的药物制剂。
本发明将通过参照下列图和实施例进行更详细地说明，其中
图1显示如对比实施例1中说明的采用金属离子络合形成物和溶剂提取物进行的聚山梨酯80的测定结果。
图2显示如实施例1中说明的不同白蛋白提取物的HPSEC色谱。
图3显示实施例2中使用的HPLC装置。
图4A显示校准数据。
图4B显示实施例2中产生的线性标准曲线。
图5显示计算理论塔板数的色谱图。
图6显示计算峰拖尾的色谱图。
图7显示计算分离度的色谱图。
对比实施例1下面的实施例是基于Garewal(op.cit.)方法进行的。
向5％和25％(w/v)的rHA制剂样品中加入聚山梨酯80(Sigma的“Tween80”)达到终浓度为15μg.mL-1，并将其200μL的等分部分与2mL的ACT试剂(100mL Milli Q水中含17.8g硫氰酸铵和2.8g硝酸钴)混合。
然后该混合物用2mL的氯仿于室温混合15分钟来提取。然后收集氯仿并且用再用4个1mL等分部分的氯仿进行重复提取。
于600nm处测定每份氯仿提取物的吸光度并且计算每份样品的总吸光度(即在上述定义的条件下提取的总ACT络合物)。
对用超纯水(Millipore Corp.的Milli QTM水)和rHA(5％w/v)制备的标准聚山梨酯80溶液(0、0.5、5.0和50.0mg.mL-1)也重复该提取操作。
结果显示于表1。
表1
当ACT试剂与聚山梨酯80在水溶液中混合时，导致能被提取入有机缓冲液的有色(蓝色)不溶性盐的形成。rHA的ACT试剂-溶剂提取产生比水得到的高的背景吸收(图1)。这表明rHA含有聚山梨酯80以外的其他物质，该物质与ACT试剂反应产生比该法所期望的吸光度更高的吸光度。
用这种方法对rHA最终产品中聚山梨酯80的估算比已知浓度多了超过4000倍(表1)，这表示该方法是不准确的。在未加样的rHA样品中的高吸光度与测定的变异性结合大概是这一结果的解释。用未加样的rHA得到的高并且变化的干扰响应使得该方法不适合rHA最终产品中聚山梨酯80的直接测定。
对比实施例2为了克服当使用对比实施例1方法时出现的污染物问题，对包括使用C18SPE柱的附加纯化步骤的效果进行了评价。
制备聚山梨酯80在超纯水中最终浓度为50mg.mL-1，在rHA中为15μg.mL-1。向每份200μL的这些样品中加入800uL的乙醇，再加入2mL的ACT试剂。然后向该混合物中加入5mL的氯仿于室温混合15分钟来提取。然后移取该氯仿提取物并在C18SPE柱上按照如下提取
采用离心蒸发法将SPE洗出液干燥并再悬浮于1mL(水提取物)或0.5mL(rHA提取物)的四氢呋喃(THF)中。然后测定每份重悬洗出物在600nm处的吸光度。
采用上述说明的步骤，对作为对照的不含聚山梨酯80的rHA的200μL等分部分也进行了提取。结果显示于表2。
表2
“ND”指没有测定。因为未加样的rHA的吸收相当于50mg.mL-1标准，因此没有计算这些样品的回收率。即rHA样品有很高的背景吸收。
由水得到的ACT-聚山梨酯80络合物的回收率超过80％(表2)。用0.25～1.0mL的SPE洗脱体积来保持ACT-聚山梨酯80络合物的该回收率(表2)。使用低洗脱体积可在减少重悬前洗出液干燥时间上是有益的。
采用形成ACT络合物来从rHA中对聚山梨酯80的提取、溶剂提取和SPE导致含有或不含有聚山梨酯80的样品基本上相同的吸光度(表2)。这表明在这些提取物中产生的颜色不完全归因于聚山梨酯80的存在，并且可以由rHA污染物、赋形剂或该蛋白本身所产生。
因此，尽管使用C18SPE色谱能够提取聚山梨酯80-ACT络合物，也会产成很高的背景响应。
对比实施例3Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)所说明的对含有“高”浓度蛋白(例如52mg.mol-1)的溶液中表面活性剂水平进行测定的方法，涉及蛋白的乙醇沉淀，包括在加入ACT来络合该表面活性剂以及使用二氯甲烷作为有机液相来对ACT-表面活性剂络合物进行提取之前，将样品于-30℃孵化过夜(加离心和分离上清液)。
我们发现Lanteigne和Kobayashi所建议的最初的乙醇沉淀步骤导致不可接受水平的表面活性剂损失。
用40mL的冷乙醇处理rHA(5％w/v)+10μg.mL-1聚山梨酯80的等分部分(10mL)。样品在Sorval RC5C离心机中(转子＝SS34)于20,000rpm.离心20分钟。用旋转蒸发干燥上清液(至大约2mL)，然后在C18SPE柱上提取。
用乙醇沉淀和之后的C18SPE对rHA的去除，并没有使聚山梨酯80的回收率超过35％(没有显示数据)。这表明该蛋白沉淀导致了聚山梨酯80的损失，因为该C18SPE回收率比由水提取物(即没有蛋白)得到的低。
Garewal(op.cit.)方法也包括，作为第一步，加入乙醇，尽管没有如Lanteigne和Kobayashi说明的那样还要将样品在-30℃孵化过夜。我们发现Garewal建议的最初的乙醇加入步骤，或替代地加入相似的溶剂(在这种情况下可以是甲醇或异丙醇)，也导致不可接受水平的表面活性剂损失。
制备rHA(5％w/v)+10μg.mL-1聚山梨酯80并且取其10mL等分部分与5mL的甲醇、异丙醇或乙醇混合。然后将该处理过的样品(15mL)按照上述在C18SPE柱上提取，洗出液如前述实施例1进行聚山梨酯80的测定。在C18SPE之前用30％异丙醇、甲醇或乙醇对rHA最终产品进行的预处理导致聚山梨酯80的回收率分别为7、25和51％。这些回收率对于控制测定来说是不可接受的低，并且将导致错误的结果。
对比实施例4在使用对比实施例3中说明的Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)法时，除了观察到的作为乙醇沉淀的结果表面活性剂损失之外，我们还证明加入ACT来络合表面活性剂的步骤和使用二氯甲烷作为有机液相进行的ACT-表面活性剂络合物提取步骤也引起表面活性剂的损失。
对10mL等分部分的rHA(5％w/v)+10μg.mL-1Tween80和10mL等分部分的超纯水+10μg.mL-1聚山梨酯80中聚山梨酯80的回收率进行了比较。在与5mL的二氯甲烷混合之前向每份样品中加入70mL的ACT试剂(100mL超纯水中含17.8g硫氰酸铵和2.8g硝酸钴)。将样品孵化过夜。混合物以3000rpm离心5分钟，弃去上层水相。加入一些无水硫酸铵晶体并且将该样品混合并按照上述再离心。然后将二氯甲烷转移到干净的管中并且于氦气流中干燥。然后将残渣重悬于1mL甲醇中并在重悬于100mLTHF之前以离心蒸发干燥。然后将这些重悬的样品按照实施例1中说明的进行聚山梨酯80的测定。
由水样品得到的聚山梨酯80的回收率是82％。由rHA样品得到的聚山梨酯80的回收率仅为21％。这表明Lanteigne和Kobayashi的表面活性剂回收率方案在有蛋白污染物存在时不能有效地提取表面活性剂。
实施例1对对比实施例1中所用方法进行的显著修改包括·在ACT加入之后，而不是之前，加入蛋白沉淀剂；和·用离心而不是溶剂提取的方法将ACT-聚山梨酯80络合物最初地与蛋白组分分离。
对六批(“A”～“F”)rHA进行了检查。F批故意加入了15μg.mL-1聚山梨酯80。向10mL等分部分的rHA(250mg.mL-1)中加入2mL的ACT然后加入18mL的丙酮。
然后样品涡旋混合并于4℃以47,800g离心15分钟。取上清液并用含100mM EDTA的0.5MTris/HCl的pH 8.0缓冲液30mL(在Bakerbond SDB200mg/3mL柱上预提取过)稀释。这些稀释样品然后采用50mg BakerbondSDB1柱进行如下固相萃取
然后该SPE洗出液用旋转蒸发干燥，再悬浮于200μL四氢呋喃(THF)中，并用HPSEC分析，如下
在两批(E和D)中只观察到有轻微的污染(图2)。然而，为了便于通过使用峰高而不是峰面积定量和/或使用未配方的rHA标准曲线(即该标准曲线能够在加入聚山梨酯80之前采用rHA制备)来进行准确和精确的测定，该污染可忽略。
实施例2
1.受试药物制剂OrthocloneTMOKT3OrthocloneTMOKT3((莫罗单抗-CD3)-Janssen-CilagGmbH，德国)的产品说明中指定每5mL安瓿在其他组分之中含有1mg的聚山梨酯80。对于分析，1.25mL的该产品用于测定，相当于0.25mg的聚山梨酯80。
VepesidTMJ 100((依托泊苷)-Bristol Laboratories NJ，美国)在其他组分中含有400mg的的聚山梨酯80。对于聚山梨酯80的分析，采用5μL的产品来测定。
NovoSevenTM240((凝固因子VIIa重组体)Novo Nordisk A/S，丹麦)在其他组分中含有0.65mg的聚山梨酯80。重构是按照该产品说明书说明的加入8.5mL美国药典无菌注射用水来进行的。对于聚山梨酯80的分析，采用3mL的重构产品来测定。
2.聚山梨酯80的提取和分析聚山梨酯80的分析按照如下进行(i)使用下列装置1mL，50mg Bakerbond SDB1 SPE柱(Mallinckrodt BakerB.V.)；3mL，200mg Bakerbond SDB 1SPE柱(Mallinckrodt Baker B.V.)；分析HPLC系统，具有适合50μL样品环的自动进样器，系统控制器和积分仪；适合上述HPLC系统的反射指数检测器；Phenomenex Phenogel 50 5μm柱(300×7.8mm)；Phenomenex Phenogel 505μm保护柱(50×7.8mm)；HPLC柱加热器和控制模块(Waters，没有插件)；Sterilin容器(70mL)；具有帽的玻璃螺帽小瓶(2mL，12mm×46mm)；具有转子的适合12mm×46mm小瓶的Univap旋转蒸发浓缩器；具有波纹顶密封的250μL玻璃HPLC样品小瓶。
(ii)使用下列试剂硫氰酸铵，AR级(Fisher Chemicals)；六水合硝酸钴，AR级(Fisher Chemicals)；乙腈，远紫外级(Fisher Chemicals)；乙二胺四乙酸(二钠盐)，SigmaUltra级(Sigma)；三(羟甲基)氨基甲烷，Sigma级(Sigma)；盐酸(浓的)，SLR级(Fisher Chemicals)；己烷，Distol级(Fisher Chemicals)；四氢呋喃，GPC级(Fisher Chemicals)；三乙胺，AR级(Fisher Chemicals)；异丙醇，HPLC级(Fisher Chemicals)；甲醇，HPLC级(Fisher Chemicals)；氯仿，HPLC级(Fisher Chemicals)；水，实验室级；甲苯，GPC级(Fisher Chemicals)；乙醇，AR级(Fisher Chemicals)；聚山梨酯80，CAPP Raw原料34(Surfachern)；十六酸，SigmaUltra级(Sigma)。
(iii)使用下列溶液(a)OrthocloneTMOKT3、VepesidTMJ 100和NovoSevenTM240如上述所定义，用实验室级水配到10mL；(b)含有15μg.mL-1聚山梨酯80的重组人白蛋白25％(w/v)水溶液(10mL)。
(c)ACT试剂(71.2g的硫氰酸铵和11.2g的六水合硝酸钴溶于20mL的实验室级水中，体积配到100mL).
(d)EDTA缓冲溶液(37.22g的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和60.55g的三(羟甲基)氨基甲烷溶解于大约900mL的实验室级水中，通过加入浓盐酸将pH调整到8.0，体积配到1L)。该溶液按照如下使用固相萃取来纯化·使6mL的THF然后是6mL的实验室级水在重力下流过3mL 200mgBakerbond SDB1 SPE柱来对其进行洗涤。
·使用Pharmacia P1泵让6mL的所述EDTA缓冲液以大约4mL.min-1速度通过该SPE柱并弃去该溶液。
·将剩下的EDTA缓冲液以大约4mL.min-1速度通过该SPE柱并收集溶液用于测定。
(e)30％(v/v)乙腈(30mL的乙腈与70mL的实验室级水混合)；(f)含1％(v/v)三乙胺的己烷(200μL的三乙胺溶解于19.8mL的己烷中)；(g)甲苯∶乙醇(1∶1)(10mL的甲苯与10mL的乙醇混合)；(h)聚山梨酯80标准溶液(将0.5000±0.0005g的聚山梨酯80在A级容量瓶中溶解于最终体积为50mL的实验室级水中)。最终浓度＝10mg.mL-1；和(i)“系统适应性”标准溶液(将0.10g的十六酸和0.10g的聚山梨酯80在容量瓶中溶于最终体积10mL的四氢呋喃中最终浓度＝聚山梨酯80是10mg.mL-1，并且十六酸是10mg.mL-1；以200μL等分部分于-20℃储存在玻璃瓶中)。
(iv)蛋白沉淀和去除按照如下进行(a)向所有的试管(标准的和受试的)中都加入4mL的ACT试剂，并将该混合物温和地搅拌混合。
(b)向所有的试管(标准的和受试的)中都加入20mL的乙腈。将试管盖盖，并剧烈振摇以打碎粘性沉淀并涡旋混合至少1分钟。试管在室温孵化15分钟。
(c)孵化后，每份样品再涡旋混合1分钟，然后于4℃以47,800g(SorvallRC5C离心机和SS34转子以20,000r.p.m.)离心20分钟。
(d)向10个Sterilin pots(70mL)中加入17mL的EDTA缓冲溶液。
(e)离心后，将每个试管的全部上清液转移到EDTA缓冲溶液中(上述制备的)的分离的等分部分(17mL)。
(f)每个离心试管再用17mL的EDTA缓冲溶液漂洗，其被加入到适当的Sterilin pot中。这代表纯化了的表面活性剂制剂。
(v)将纯化了的表面活性剂制剂通过固相萃取(SPE)进一步纯化。SPE按照如下进行(a)按照生产商的说明，将10个1mL 50mg Bakerbond SDB 1SPE柱安装到SPE多支管中，并且每个管用2mL的氯仿然后是2mL的甲醇最后是2mL的30％乙腈洗涤。
(b)用上述列出的纯化了的表面活性剂制剂负载每个柱子(大约0.5mL.min-1)。
(c)每个柱子用2mL的30％乙腈然后是1mL的异丙醇、含1％(v/v)三乙胺的己烷1mL以及最后是1mL的己烷洗涤。最后于真空下让空气穿过每个柱子至少30秒使SPE柱完全干燥。
(d)将玻璃螺帽2mL瓶装到SPE多支管中用于洗出液的收集。
(e)每个柱子用2等分部分的1000mL的甲苯∶乙醇(1∶1)以大约0.5mL.min-1的速度洗脱。每个等分部分之后，通过将注满空气的10mL注射器推过该SPE柱来将该洗出液放到收集试管中。
(f)所有的洗出液在真空下于50℃用离心蒸发干燥，然后重悬于200μL的THF中。
(g)将每个样品转移到250μL的玻璃HPLC小瓶中并用波纹顶盖密封。
(vi)HPLC装置如图3所示建立。将含有2L的四氢呋喃(THF)流动相存储器放置在设定于25℃恒温控制水浴中。吸滤器与HPLC泵进口管连接，流动相注入连到用于排气的保护柱上(the mobile phase primed the line up tothe guard column placed to expel air)。自动进样器与保护柱连接然后连到分析柱上。保护柱和分析柱被放到如Waters HPLC恒温器控制模块中设定的25℃恒温控制箱中。在安装完柱子之后让温度平衡1小时。分析柱的出口连接到折射率检测器进口，折射率检测器参考是指定的，出口连到废液容器。泵的流速设定到1.0mL.min-1并且折光率检测器设定到灵敏度256和时间常数10秒。检测器箱设定到35℃。该HPLC系统控制器和积分仪根据制造商的说明来设定以收集和积分色谱数据。在分析之前，进行系统适应性试验(见下面)。
(vii)下列操作用于HPLC分析折光率检测器在使用之前清洗至少1小时并监测稳态基线；制备EDTA缓冲溶液并开始它的提取；制备所有其他测定缓冲液；开始受试液和标准液的提取；启动HPLC系统并平衡；检查HPLC的基线制备受试溶液；进行系统适应性试验；当样品通过SPE时，检查HPLC系统以确保该系统适应性试验是可接受的；当提取完成后并且系统适应性是可接受的时，进行样品试验。
(viii)聚山梨酯80的提取标准曲线是由将0.00、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50mg的聚山梨酯80溶于10mL的实验室级水中制备而得。
(ix)用HPLC对聚山梨酯80按照如下进行纯化(a)在进行完系统适应性试验后立即将每个样品50μL于上述说明的标准条件下注入到HPLC中。
(b)在所有样品的色谱和聚山梨酯80峰的积分完成之后，建立聚山梨酯80峰高对标准浓度(mg.mL-1)的标准曲线以作为标准，通过线性回归来计算标准曲线的斜率(m)和x-轴上的截距(cc)。这些回归数据用于按照如下来计算受试样品中聚山梨酯80的浓度最适合于标准曲线的线是受试的聚山梨酯80的峰高＝mx+c其中x＝聚山梨酯80浓度(μg.mL-1)因此聚山梨酯80浓度(μg.mL-1)＝(受试的聚山梨酯80峰高-c)/m然后计算该受试样品中聚山梨酯80的平均浓度(μg.mL-1)。
3.结果提取标准曲线产生回归线R2为0.999并且标准化峰高CV百分比为3.4％的线性标准曲线(图4)。使用该标准曲线测得的聚山梨酯80的量与所述的配方量相比较，显示出与白蛋白、NovoSevenTM和VepesidTM很接近(表3)。
表3
按照上述说明的对rHA最终产品中聚山梨酯80定量的方法显示出它本身就适合于所有产品的定量而不需对该方法做修改。
系统适应性试验操作1.将50μL系统适应性标准溶液注射到在标准条件下运行的HPLC上。
2.通过计算理论板数、拖尾和聚山梨酯80与十六酸的分离度(见下面)来对受试样品进行评价。
3.如果这些参数中任意一个比期望值低，不管是聚山梨酯80的还是十六酸的，就用一套新柱子代替这些柱子。
受试样品的评价1.采用方程1来计算聚山梨酯80(第一个洗脱峰)和十六酸(第二个洗脱峰)峰的理论塔板数，参照图5。
期望值聚山梨酯80＞650理论塔板数十六酸＞6200理论塔板数2.采用方程2来计算聚山梨酯80和十六酸峰的峰拖尾，参照图6。
期望值聚山梨酯 80＜3.5十六酸 ＜3.03.采用方程3来计算聚山梨酯80和十六酸的分离度，参照图7。
期望值分离度＞2.0
权利要求
1.一种从液相表面活性剂制剂中去除蛋白组分的方法，其包括(a)提供一种含有蛋白组分的液相表面活性剂制剂；(b)向步骤(a)的制剂中加入络合剂并且让该络合剂与该表面活性剂形成络合物；(c)与步骤(b)同时或随后，分别向步骤(a)的制剂或步骤(b)的产物中加入可混溶的沉淀剂，以形成液相反应混合物并且让该可混溶的沉淀剂沉淀该液相反应混合物内的蛋白组分；和(d)从步骤(c)的产物中将所述络合物与沉淀的蛋白组分相分离以提供纯化的液相表面活性剂制剂；其中该络合物保留在所述液相反应混合物之内的溶液中，并且步骤(d)将该络合物保留在该液相中。
2.根据权利要求1的方法，其中所述表面活性剂含有一种或多种氧化烯基团。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述表面活性剂是非离子的，并且优选是烷基酚与环氧烷的缩合物；聚氧化烯失水山梨糖醇油酸酯；或聚氧化烯二醇。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述络合剂包括多价金属离子，优选过渡金属离子。
5.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述沉淀剂是水性有机可混溶溶剂，比如醇、氰基烷基、胺、酰胺、羧酸、醛、酮、二醇、醚、烷基卤化物或芳香烃，例如丙酮、乙腈或乙醇。
6.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述蛋白组分包括肽、多肽或蛋白。
7.根据权利要求6的方法，其中所述蛋白组分包括白蛋白、含有白蛋白的融合蛋白、单克隆抗体、依托泊苷或凝血因子。
8.根据任一项前述权利要求的方法，其中权利要求1的步骤(a)液相表面活性剂制剂中蛋白组分的蛋白浓度至少是50mg/ml。
9.根据任一项前述权利要求的方法，其中权利要求1的步骤(a)液相表面活性剂制剂中存在的表面活性剂相对于蛋白组分少于4800ppm。
10.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述的提供纯化了的液相表面活性剂制剂的步骤包括将反应混合物离心以使该沉淀的蛋白组分形成片状沉淀并且络合物保留在上清液中，以及使该上清液与片状沉淀分离。
11.根据任一项前述权利要求的方法，其包括将络合物非共价地结合到固相上的附加后续步骤，优选固相萃取(SPE)介质。
12.根据权利要求11的方法，其中在表面活性剂非共价地结合到固相上的步骤之前将络合物解离。
13.根据权利要求12的方法，其中通过向该纯化了的液相表面活性剂中加入鳌合剂来使络合物解离。
14.根据权利要求11～13中任一项的方法，其中所述固相为疏水性SPE介质。
15.根据权利要求14的方法，其中所述SPE介质是聚苯乙烯二乙烯基苯或C2～24烷基介质。
16.根据权利要求11～15中任一项的方法，其中将结合到固相的表面活性剂进行洗涤以去除残留蛋白组分。
17.根据权利要求16的方法，其中所述基质用水溶性有机溶剂洗涤，比如乙腈、异丙醇和/或三乙胺。
18.根据权利要求16的方法，其中所述固相用能够沉淀表面活性剂的液体洗涤，如果表面活性剂存在于溶液中。
19.根据权利要求18的方法，其中所述固相用水不溶性有机溶剂洗涤，比如己烷、氯仿或甲苯。
20.根据权利要求11～19中任一项的方法，其中表面活性剂从固相上洗脱并且作为洗出液被收集。
21.根据任一项前述权利要求的方法，其包括测定纯化了的液相表面活性剂制剂中的或来源于此的更进一步的部分中的表面活性剂含量的附加步骤。
22.根据权利要求21的方法，其中步骤(a)的液相表面活性剂制剂是较大制剂的等分部分或一批制剂中的一个样品，并且该方法包括将如此测定的纯化了的液相表面活性剂制剂中或来源于此的更进一步的部分中的表面活性剂含量与该较大制剂中或批中的其他样品制剂中的表面活性剂含量进行相关的附加步骤。
23.根据权利要求22的方法，其包括对该较大制剂或批中的其他样品制剂进行适当标识以反映如此测定的表面活性剂含量的附加步骤。
24.一种标识的液相表面活性剂制剂，其通过根据权利要求23的方法得到。
25.一种对含有表面活性剂的药物制剂进行批质量控制的方法，其包括采用根据权利要求1～23任一项的方法测定该制剂样品中表面活性剂的含量。
26.一种含有表面活性剂的药物制剂，其采用根据权利要求25的方法进行质量控制。
全文摘要
本发明提供一种从液相表面活性剂制剂中去除蛋白组分的方法，其包括(a)提供一种含有蛋白组分的液相表面活性剂制剂；(b)向步骤(a)的制剂中加入络合剂并且让该络合剂与该表面活性剂形成络合物；(c)与步骤(b)同时或随后，分别向步骤(a)的制剂或步骤(b)的产物中加入可混溶的沉淀剂，以形成液相反应混合物并且让该可混溶的沉淀剂沉淀该液相反应混合物内的蛋白组分；和(d)从步骤(c)的产物中将所述络合物与沉淀的蛋白组分相分离以提供纯化了的液相表面活性剂制剂；其中该络合物保留在所述液相反应混合物之内的溶液中，并且步骤(d)将该络合物保留在该液相中。
文档编号C07K1/00GK1816741SQ200480019339
公开日2006年8月9日 申请日期2004年5月7日 优先权日2003年5月7日
发明者菲利普·H·莫顿, 贾森·卡梅伦 申请人:达尔塔生物技术有限公司