专利名称：一种单甲氧基聚乙二醇－胰岛素复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单甲氧基聚乙二醇-胰岛素复合物及其制备方法，确切说，涉及一种单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。
背景技术：
胰岛素(INS)是胰岛β细胞合成和分泌的、由A和B两条多肽链借助两个二硫键连接而成的、含有51个氨基酸残基的蛋白质激素。具有生物活性的胰岛素单体的相对分子量为5.8KD。胰岛素是最早(1921年)发现的一种具有激素作用的蛋白质，也是最先结晶、确定氨基酸残基序列、人工化学合成以及采用基因工程技术批量生产并投放市场供临床应用的蛋白质(李元主编“基因工程药物”，化学工业出版社，2002年12月第一版P182)。胰岛素是维持人体代谢正常和生存所必需的激素，它主要用于糖尿病特别是I型糖尿病的治疗，此外还可调节糖、蛋白质和脂肪代谢以及促进细胞生长和分化。但胰岛素属蛋白质多肽类药物，很容易被体内的蛋白酶水解，导致物理化学性质不稳定和生物利用度降低；分子量较小，为5.8KD，容易被肾小球滤过而造成体内半衰期较短。如治疗I型糖尿病人的临床方案为0.5～1U/Kg，每日三次，长期这样注射用药，给病人带来了痛苦和不便；此外，胰岛素又具免疫原性，糖尿病人经长期、反复、高剂量注射胰岛素，会引起体内产生抗体，从而无法发挥胰岛素的正常生理功能，严重的甚至引起过敏和胰岛素抵抗。因此迫切需要研制新型的胰岛素产品。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提出一种单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物，其特征在于，该复合物由胰岛素即INS蛋白质和单甲氧基聚乙二醇衍生物组成，两者通过前者的游离氨基与后者的具有活性的丙醛基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于10.8～25.8KD。mPEG修饰胰岛素复合物，即mPEG-INS不但具有天然胰岛素的降血糖生物学活性，而且具有体内生物稳定性高、体内半衰期长和免疫原性减少的优点。
所述的胰岛素复合物的进一步特征在于，所述的游离氨基是赖氨酸的ε-NH2或N末端的α-NH2，所述的活性基团是mPEG-ALD上的丙醛基团。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是将含游离氨基的胰岛素蛋白质与含丙醛基团的单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG-ALD进行修饰反应，制得mPEG修饰胰岛素复合物粗品溶液，经离子交换层析、收集复合物部分、离心超滤浓缩、冷冻干燥，得mPEG修饰胰岛素复合物纯品。
现详细说明本发明的技术方案。一种单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法，其特征在于，操作步骤如下第一步 将500份重量的浓度为0.16％的胰岛素溶液与400份重量的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入0.68～27.2份重量的mPEG，混匀，所述的mPEG是mPEG-ALD，分子量介于5～20KD；第三步 向第二步溶液中加入100份重量的浓度为0.75％的NaBH3CN溶液，混匀成反应液；第四步 将上一步的溶液置于4～40℃下进行反应0.5～24h；第五步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物粗品溶液，取20ul反应液进行SDS-PAGE电泳检查修饰程度；第六步 用pH4.2的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的反应液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.0或pH4.6的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值；第七步 对第六步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰胰岛素复合物的多态性；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到单点修饰的单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量介于10.8～25.8KD。
本发明所述的胰岛素蛋白质为来源于猪或牛的胰岛素或为基因工程产品。mPEG-ALD修饰剂为含丙醛基团的单甲氧基聚乙二醇衍生物，NEKTAR公司有售。
上述方法制得的产物具有本发明提出的结构该产物由胰岛素即INS蛋白质和单甲氧基聚乙二醇衍生物组成，两者通过前者的游离氨基与后者的丙醛基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于10.8～25.8KD。
本发明的优点是mPEG修饰胰岛素复合物中的酰胺键极为稳定，使mPEG修饰胰岛素复合物性质稳定，不易被水解分离；修饰剂mPEG-ALD为高亲水性的线性无毒的高分子化合物，与胰岛素蛋白质稳定结合后，能在胰岛素的蛋白质分子表面形成屏障，使mPEG修饰胰岛素复合物不易被体内的蛋白酶降解，提高了其生物稳定性；mPEG修饰胰岛素复合物在体内的半衰期长，提高了mPEG修饰胰岛素复合物的生物利用度。
图1为用本发明方法制得的mPEG-INS的SDS-PAGE电泳图谱，其中，1是INS对照，2是蛋白质分子量标准，3是分子量为5KD的mPEG-ALD与INS反应混合物电泳图谱，显示修饰产物的多态性既含单点修饰产物，也含多点修饰产物。
图2为用本发明方法制得的mPEG-INS的CM Sepharose FF层析分离纯化图，其中，5是穿透峰，6是第一洗脱峰，7是第二洗脱峰，8是第三洗脱峰。mPEG-INS复合物中的mPEG的分子量为5KD。穿透峰5是未参与修饰反应的mPEG-ALD，第一洗脱峰6是多点修饰的mPEG-INS产物，第二洗脱峰7是单点修饰的mPEG-INS产物，第三洗脱峰8是未修饰的INS。
图3为与图2中各洗脱峰纯化产物的SDS-PAGE电泳图谱，其中，9是蛋白质分子量标准，10是INS对照，11是mPEG-ALD与INS反应混合物电泳图谱，12是图2中第一洗脱峰6多点修饰的mPEG-INS产物，13是图2中第二洗脱峰7单点修饰的mPEG-INS产物，14是图2中第三洗脱峰8未修饰的INS产物。
图4为mPEG-INS的降血糖作用结果图。图中结果显示经PEG化的INS保持了天然INS降血糖的生物学活性，且作用时间延长。
具体实施例方式
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。所有的实施例均按照上述的制备方法进行操作。
实施例1 mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG是mPEG-ALD，分子量为5KD。
第一步 将0.75ml的浓度为0.16％的胰岛素溶液与0.6ml的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入0.96mg分子量为5KD的mPEG-ALD，混匀；第三步 向第二步溶液中加入0.15ml的浓度为0.75％的NaBH3CN溶液，混匀成反应液；第四步 将第三步所得的反应液置于4～40℃下反应0.5～24h；第五步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得mPEG修饰胰岛素复合物粗品溶液，取20ul反应液进行SDS-PAGE电泳，检查修饰程度，结果见图1；第六步 用pH4.0的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的粗品溶液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.0的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值，结果见图2；第七步 对第六步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰胰岛素复合物的多态性，结果见图3；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.17～0.21mg的单点修饰的mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量为10.8KD。
实施例2 mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG是mPEG-ALD，分子量为5KD。
第一步 将0.75ml的浓度为0.16％的胰岛素溶液与0.6ml的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入3.84mg分子量为5KD的mPEG-ALD，混匀；第三步至第七步按实施例1中相应操作步骤进行；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.30～0.35mg的单点修饰的mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量为10.8KD。
实施例3 mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG是mPEG-ALD，分子量为5KD。
第一步 将0.75ml的浓度为0.16％的胰岛素溶液与0.6ml的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入9.6mg分子量为5KD的mPEG-ALD，混匀；
第三步至第七步按实施例1中相应操作步骤进行；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.27～0.31mg的单点修饰的mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量为10.8KD。
实施例4 mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG是mPEG-ALD，分子量为20KD。
第一步 将0.75ml的浓度为0.16％的胰岛素溶液与0.6ml的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入9.6mg分子量为20KD的mPEG-ALD，混匀；第三步 向第二步溶液中加入0.15ml的浓度为0.75％的NaBH3CN溶液，混匀成反应液；第四步 将第三步所得的反应液置于4～40℃下反应0.5～24h；第五步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得mPEG修饰胰岛素复合物粗品溶液，取20ul反应液进行SDS-PAGE电泳，检查修饰程度；第六步 用pH4.6的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的粗品溶液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.6的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值；第七步 对第六步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰胰岛素复合物的多态性；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.13～0.15mg的单点修饰的mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量为25.8KD。
实施例5 mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG是mPEG-ALD，分子量为20KD。
第一步 将0.75ml的浓度为0.16％的胰岛素溶液与0.6ml的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入19.2mg分子量为20KD的mPEG-ALD，混匀；第三步至第七步按实施例4中相应操作步骤进行；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.25～0.30mg的单点修饰的mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量为25.8KD。
实施例6 mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法。在本实施例中，mPEG是mPEG-ALD，分子量为20KD。
第一步 将0.75ml的浓度为0.16％的胰岛素溶液与0.6ml的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入19.2mg分子量为20KD的mPEG-ALD，混匀；第三步至第七步按实施例4中相应操作步骤进行；第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到0.25～0.30mg的单点修饰的mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量为25.8KD。
实施例7 mPEG-INS复合物的降血糖作用。在本实施例中，用于修饰的mPEG修饰剂为PEG的衍生物-mPEG-ALD，其分子量为5KD。
实验材料与方法雄性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；pH7.0磷酸缓冲液，INS；血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)；雄性健康昆明小鼠禁食过夜，分为3组(n＝6)。第1组，生理盐水对照组；第2组，胰岛素给药组；第3组，mPEG-INS给药组，所述的mPEG-INS是实施例1的制备产物。
第1组腹腔注射100ul pH7.0磷酸缓冲液；第2组腹腔注射0.33U的胰岛素；第3组腹腔注射0.33U的mPEG-INS。记此时为零时刻。分别于60、120、360、600分钟进行小鼠尾静脉取血10ul，用血糖测试仪测定血糖浓度。
结果如图4所示，所示数值均为给药组6只小鼠的血糖平均值与对照组的比值。与生理盐水组小鼠相比，在给药后120分钟之内，INS给药组和mPEG-INS给药组均能降低小鼠血糖，说明按本发明方法制备出的mPEG-INS复合物保留了INS的生物学活性。360分钟后，INS组小鼠与对照组小鼠的血糖值没有区别，提示INS已代谢完，不再具有降血糖作用，而mPEG-INS给药组的小鼠血糖低于对照组，说明按本发明方法制备出的mPEG-INS复合物降血糖时间延长，从而有效地控制了血糖浓度。
本实施例中所用的mPEG-INS也可是实施例2至实施例6所制备得到的产物。它们按照本实施例的方法进行活性测定，均得到了类似的实验结果。
权利要求
1.一种单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物，其特征在于，该复合物由胰岛素即INS蛋白质和单甲氧基聚乙二醇衍生物组成，两者通过前者的游离氨基与后者的具有活性的丙醛基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于10.8～25.8KD。
2.根据权利要求1所述的单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物，其特征在于，所述的游离氨基是赖氨酸的ε-NH2或N末端的α-NH2，所述的活性基团是mPEG-ALD上的丙醛基团。
3.权利要求1或2所述的单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物的制备方法，其特征在于，操作步骤如下第一步 将500份重量的浓度为0.16％的胰岛素溶液与400份重量的pH7.4的200mM硼酸-硼砂缓冲液混和；第二步 向第一步溶液中加入0.68～27.2份重量的mPEG，混匀，所述的mPEG是mPEG-ALD，分子量介于5～20KD第三步 向第二步溶液中加入100份重量的浓度为0.75％的NaBH3CN溶液，混匀成反应液；第四步 将上一步的溶液置于4～40℃下进行反应0.5～24h；第五步 用冰醋酸调节pH4.2终止反应，制得单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物粗品溶液，取20ul反应液进行SDS-PAGE电泳检查修饰程度；第六步 用pH4.2的20mM醋酸缓冲液将第四步制得的反应液稀释10倍，上CM Sepharose FF层析柱，用含0～1M NaCl的pH4.0或pH4.6的20mM醋酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.1～1ml/min，280nm紫外检测吸收峰值；第七步 对第六步收集得到的各吸收峰洗脱液进行SDS-PAGE电泳，检查mPEG修饰胰岛素复合物的多态性；1.第八步 将第七步收集到的单点修饰吸收峰溶液用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管超滤浓缩，冷冻干燥，得到单点修饰的单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物纯品，分子量介于10.8～25.8KD。
全文摘要
一种单甲氧基聚乙二醇衍生物，即mPEG修饰胰岛素复合物及其制备方法，属肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。该复合物由胰岛素即INS蛋白质和单甲氧基聚乙二醇衍生物组成，两者通过前者的游离氨基与后者的具有活性的丙醛基团连结成的酰胺键连接在一起，分子量介于10.8～25.8KD。所述的游离氨基是赖氨酸的ε－NH
文档编号C07K17/00GK1651463SQ200410089050
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月2日 优先权日2004年12月2日
发明者郁正艳, 吴自荣, 黄静, 楼旻 申请人:华东师范大学