热休克蛋白65－多表位乙型肝炎病毒核心抗原重组融合蛋白(HSP65－HBcAg)的利记博彩app

专利名称：热休克蛋白65－多表位乙型肝炎病毒核心抗原重组融合蛋白(HSP65－HBcAg)的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种基因工程重组融合蛋白，特别是涉及一种预防和/或治疗人乙型病毒肝炎的重组融合蛋白。本发明还涉及编码该重组融合蛋白的基因。
背景技术：
乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一种世界性疾病，在发展中国家的发病率较高。据统计，全世界无症状携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿，我国占1亿以上。在无症状感染者中，约有1/3的人出现肝损害的临床表现。其特点为起病较缓慢，以亚临床型及慢性型较为常见。无黄疸型HBsAg持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液及日常生活密切接触进行传播，另一传播方式为母婴垂直传播。乙型病毒肝炎疫苗是控制和预防乙型病毒肝炎的根本措施。而常规应用的乙型病毒肝炎疫苗主要侧重的是刺激机体产生中和性抗体，而这些抗体不能彻底清除掉潜伏在感染细胞中的乙型肝炎病毒，往往导致体内乙型肝炎病毒的藏匿，因此，研制出能有效地清除掉细胞中乙型肝炎病毒的疫苗尤为重要。
乙型肝炎病毒(HBV)的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA分子，长度为3.2kb。以不同毒株的HBV基因组DNA为模板转录的RNA均有4个开放阅读框(open readingframe，ORF)。已经确定的HBV基因组4个ORF分别为S、C、P、X。
S区段编码病毒的外膜蛋白，由S基因、前S1区段(Pre-S1)、前S2区段(Pre-S2)三部分构成。病毒颗粒的外膜含有3种蛋白，即主要蛋白、中蛋白和大蛋白。主要蛋白即S蛋白(HBsAg)由226个氨基酸组成，由S基因编码；外膜中蛋白由281个氨基酸组成，由Pre-S2和S基因编码，其中Pre-S2编码55个氨基酸；外膜大蛋白由Pre-S1、Pre-S2和S基因编码，由于Pre-S1在不同的亚型有差异，编码长度在108~119个氨基酸之间，故不同亚型的外膜大蛋白的肽链长度不等。
HBsAg能够刺激机体产生保护性抗体，同时HBsAg蛋白的28~39位氨基酸(S 28~39)还能诱生特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)。近年来随着对HBV表面抗原的结构和功能的深入研究发现，Pre-S区蛋白特异性决定簇比S区更丰富。前S1蛋白的21~47位氨基酸(Pre-S1 21~47)是前S1的优势表位，它不仅是B-细胞表位(Perit MAet al.Mol Immunol 1991 28517-521)，同时还可与人肝细胞受体结合，使HBV与肝细胞粘附(Petit MA et al.Virology，1992；187211~222)。Hui等用编码HBsAg和Pre-S121~47的质粒DNA注入小鼠体内，产生了强烈的CTL反应和抗-HBsAg、前S1抗体，并导致循环中HBsAg的清除(Hui JY，et al.Vaccine 1999，171711-18)。前S2蛋白的120~146位氨基酸(Pre-S2 120~146)是Pre-S2区的优势表位，PreS2 120~132是T细胞表位，PreS2132~145是B细胞表位(Lo-Man R et al.J Immunol 1994 1525660-5669)。
C区段编码HBV核心抗原(HBcAg)。不同亚型HBV的HBcAg长度为183~214个氨基酸，当羧基端精氨酸丰富区水解则转变为分泌性e抗原(HBeAg)。
Bertoletti等1993年证实，HLA-A2阳性者HBcAg特异性CTL最适识别点在HBcAg的第18~27位氨基酸(C 18~27)，并提出用此多肽作为疫苗进行免疫治疗以终止病毒感染的设想(Bertoletti A et al.J Virol.1993；672376~2380)。HBcAg的第141~151位氨基酸(C141~151)是CTL表位(Missal G et al.J Exp Med 1993 177751~762)。
从以上的论述中，我们可以看出HBcAg中存在CTL的表位，为其成为以HBcAg为攻击靶点的CTL疫苗奠定了基础。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族。在免疫应答的过程中，热休克蛋白可表现如下三种基本的功能1、协助抗原性物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞；2、协助抗原性物质进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性CTL；3、刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子。
近年的研究表明，HSP可使非共键结合的抗原在抗原提呈细胞内加工后和MHC I类分子结合并提呈在其表面，有效地激活CTL去高效杀伤表达特异性抗原的靶细胞。
CTL是人体免疫系统中最高效地清除病毒感染细胞的免疫细胞。若能有效地激活针对某一病毒感染细胞的CTL，则被激活的CTL去杀伤感染病毒的细胞进而达到清除病毒的目的。然而外源性的蛋白类抗原在免疫人体后，通常被抗原提呈细胞摄取、加工，进入MHC II类提呈途径，激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generationof heat shock protein-based vaccines by intracellular loading of gp96 withantigenicpeptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，而不能有效地激活CTL。因此，如何能够让外源性的多表位乙型肝炎病毒核心抗原进入MHC I类途径，赋予其激活CTL的性质，是成功构建乙型病毒肝炎CTL疫苗的关键。
热休克蛋白65能够携带外源抗原进入抗原提呈细胞，在抗原提呈细胞中协助外源抗原进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性CTL；同时热休克蛋白65还能刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子。
本发明创造性地将热休克蛋白65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合而构建了一种重组融合蛋白，即热休克蛋白65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原重组融合蛋白(HSP65-HBcAg)，该重组融合蛋白将有效地激活针对乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的CTL，CTL会杀伤感染乙型肝炎病毒的细胞，进而达到治疗和/或预防乙型病毒肝炎的目的。

发明内容
本发明的目的是提供一种重组融合蛋白，它是将热休克蛋白65(HSP65)和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合在一起而形成的、对人乙型病毒肝炎有预防和/或治疗作用的基因工程重组融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明重组融合蛋白的基因。
本发明提供了一种重组融合蛋白，它是由热休克蛋白65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的重组融合蛋白(HSP65-HBcAg)，其中，所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原是由选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的序列以数学上的组合方式相互连接而形成的。本发明所提供的多表位乙型肝炎病毒核心抗原是SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5按顺序相连接所形成的。本发明的重组融合蛋白中，热休克蛋白65位于该重组融合蛋白的氨基端，多表位乙型肝炎病毒核心抗原位于该重组融合蛋白的羧基端。本发明的重组融合蛋白中，所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列或其活性衍生物，其中活性衍生物包括下列多肽(1)其氨基酸序列与SEQ ID NO15所示序列的同源性大于80％；或者(2)其核苷酸编码序列能够在严谨条件下与编码SEQ ID NO15所示序列的核苷酸编码序列杂交；或者(3)对SEQ ID NO15所示序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列；上述多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg活性衍生物仍具有多表位乙型肝炎病毒核心抗原活性。
在本发明中所指的严谨杂交条件包括以5×SSC，20mmol/L磷酸缓冲液，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸匍聚糖及100μg/ml变性鲑精DNA片段，在65℃杂交8-16小时，并在2×SSC和0.5％SDS溶液中室温下清洗5分钟，接着于2×SSC和0.1％SDS溶液中室温下清洗15分钟，然后于0.1×SSC和0.1％SDS溶液中65℃下清洗30-60分钟，最后于0.1×SSC室温下稍稍漂洗滤膜。
本发明还提供了一种编码本发明的重组融合蛋白的基因。该基因可以具有SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
本发明的多表位乙型肝炎病毒核心抗原是由乙型肝炎病毒核心抗原分子中5个不同的抗原表位相连接而形成的多肽，序列可以如SEQ ID NO15所示，这种将5个不连续的抗原表位采用相互连续的形式进行重组所获得的多表位乙型肝炎病毒核心抗原目前尚无人设计和采用。将多表位乙型肝炎病毒核心抗原和热休克蛋白65融合形成的重组融合蛋白(序列可以如SEQ ID NO17所示)在进入人体后可激活针对乙型肝炎病毒的CTL，发动对乙型肝炎病毒感染细胞的攻击和杀伤，因而对乙型病毒肝炎有预防和/或治疗的作用。一个CTL表位可由8-9个氨基酸残基组成，因而SEQ ID NO14所示的多表位乙型肝炎病毒核心抗原可含有多个CTL表位。多表位乙型肝炎病毒核心抗原由乙型肝炎病毒核心抗原的五个肽段组成，它们的序列分别如SEQ ID NO1至SEQ ID NO5所示。
上述五个肽段以数学上的组合方式连接在一起构成的任何一个多表位乙型肝炎病毒核心抗原被称为一个拷贝的多表位乙型肝炎病毒核心抗原。我们将这五个肽段的编码基因以数学上的组合方式相连在一起所生成的任何一种新的基因，称为多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因，该基因编码的多肽即为多表位乙型肝炎病毒核心抗原。将多表位乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和热休克蛋白65(HSP65)融合形成的重组融合蛋白简称为HSP65-HBcAg。将HSP65和SEQ ID NO1融合所形成的重组融合蛋白简称为HSP65-FR；将HSP65和SEQ ID NO2融合所形成的重组融合蛋白简称为HSP65-SE；将HSP65和SEQ ID NO3融合所形成的重组融合蛋白简称为HSP65-TH；将HSP65和SEQ ID NO4融合所形成的重组融合蛋白简称为HSP65-FO；将HSP65和SEQ ID NO5融合所形成的重组融合蛋白简称为HSP65-FI。HSP65-HBcAg在进入人体后可刺激人体产生针对乙型肝炎病毒的CTL，攻击和消灭感染乙型肝炎病毒的细胞，因而对乙型病毒肝炎有预防和或治疗的作用。
热休克蛋白65是一种来源于卡介苗的蛋白质，它在与多表位乙型肝炎病毒核心抗原形成重组融合蛋白后，可以协助多表位乙型肝炎病毒核心抗原进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并进入MHC I类加工提呈途径，进而激活针对表达乙型肝炎病毒细胞的CTL。此外，热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子，这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可协助激活CTL。
本发明的重组融合蛋白具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码本发明的重组融合蛋白的基因。该基因具有SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种以本发明重组融合蛋白作为有效成分的药物组合物，将本发明的重组融合蛋白选择性地与药学上可接受的载体或赋形剂等结合，通过适当的给药途径施加于被施用者，从而达到治疗和/或预防乙型病毒肝炎的目的。
本发明的“药学上可接受的载体或赋形剂”是指当分子本体和组合物适当地给予被施用者时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本发明所指的“药学上可接受的载体或赋形剂”应当与本发明的重组融合蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或赋形剂的一些物质的具体例子有糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；片压剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据被施用者的种类、年龄、体重和给药方式等因素确定对被施用者有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射和其它治疗方式。
本发明的重组融合蛋白可通过已知的方法进行生产。
鉴于目前尚无培养乙型肝炎病毒(HBV)的细胞模型，也无感染HBV的动物模型，因此本发明创造性地采用了转染HBV核心抗原基因的B16细胞(一种黑色素瘤肿瘤细胞)模拟由HBV感染的、表达HBV特异性多肽的细胞。对表达HBV核心抗原基因的B16细胞的CTL反映了HBV特异性的CTL对感染HBV细胞的杀伤。本发明的重组融合蛋白抑制转染HBV核心抗原基因的B16细胞在小鼠体内生长反映了由本发明提供的重组融合蛋白诱生了HBV特异性的CTL，CTL杀伤了表达HBV特异性抗原的B16细胞，导致B16细胞数量减少。由B16细胞生长所形成的肿瘤较小，说明本发明中的重组融合蛋白HSP65-HBcAg在小鼠中能够诱生HBV特异性的CTL，这种CTL具有较强的杀伤乙型肝炎病毒感染细胞的能力。本发明的重组融合蛋白延长荷转染HBV核心抗原基因的B16细胞肿瘤小鼠的生存时间反映了由本发明提供的重组融合蛋白诱生了HBV特异性的CTL，这种CTL可杀伤表达HBV特异性抗原的乙型肝炎病毒感染细胞。


附图1热休克蛋白65(HSP65)编码基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
1marker(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；2通过PCR获得的热休克蛋白65(HSP65)编码基因(1638bp)。
附图2多表位乙型肝炎病毒核心抗原PCR产物琼脂糖凝胶电泳图1marker(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；2获得的多表位乙型肝炎病毒核心抗原PCR产物(276bp)。
附图3表达的HSP65-HBcAg重组融合蛋白的SDS-PAGE电泳图1marker(Takara)97KD；66KD；45KD；30KD；21KD；14KD；2表达的HSP65-HBcAg重组融合蛋白(67KD)。
附图4纯化后得到的HSP65-HBcAg重组融合蛋白的SDS-PAGE电泳图1纯化得到的HSP65-HBcAg重组融合蛋白(67KD)；2marker(Takara)97KD；66KD；45KD；30 KD；21KD；14KD。
附图5HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-FR重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较AHSP65-FR重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况；BHSP65-HBcAg重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况。
附图6HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-SE重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较AHSP65-SE重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况；BHSP65-HBcAg重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况。
附图7HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-TH重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较AHSP65-TH重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况；BHSP65-HBcAg重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况。
附图8HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-FO重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较
AHSP65-FO重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况；BHSP65-HBcAg重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况。
附图9HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-FI重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较AHSP65-FI重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况；BHSP65-HBcAg重组融合蛋白抑制转染多表位乙型肝炎病毒核心抗原的B16细胞生长情况。
具体实施例方式
实施例1 获取65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因1、卡介苗来源于长春生物制品研究所。采用苏通马铃薯培养基培养卡介苗，培养温度为37-39℃，生长出的卡介苗呈现干皱浅黄色的菌膜。收集菌膜，从中提取卡介苗基因组DNA。
2、提取卡介苗基因组DNA方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
3、分离HSP65结构基因采用PCR方法自卡介苗分离HSP65结构基因。采用的5’端引物和3’端引物分别如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示。
PCR操作程序在一500μl微量离心管中加入下列试剂模板cDNA(mmol/L) 5μl10× PCR缓冲液(含氯化镁) 5μldNTPs(10mmol/L)1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L) 各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl去离子水 加至终体积50μl混合后加入矿物油 3滴反应条件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10min。
4、克隆PCR产物采用TA克隆方法，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)5)。按常规方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。
获得的HSP65结构基因如SEQ ID NO8所示，PCR图谱如说明书附图1所示。
实施例2 多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因的获得采用二轮PCR合成多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因。
1、第一轮PCR采用的引物1和引物1’分别如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示。第一轮PCR获得的产物如SEQ ID NO11所示。
2、第二轮PCR采用的引物2和引物2’分别如SEQ ID NO12和SEQ ID NO13所示。第二轮PCR获得的产物如SEQ ID NO14所示，此序列代表乙型肝炎病毒核心抗原多表位基因。
PCR反应条件为94℃，30″；55℃，1’；72℃，4’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。
PCR图谱如说明书附图2所示。
实施例3 HSP65-HBcAg融合基因的构建1、将热休克蛋白65(HSP65)的编码基因用NcoI和EcoRI消化，多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因用EcoRI和HindIII消化，37℃，2小时。采用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。电泳条件是1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。
20×TAE缓冲液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸调pH至8.3。
2、在紫外灯下观察并将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置-70℃冷冻15分钟，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀，洗涤并干燥DNA。
3、将经限制性内切酶消化的热休克蛋白65KD(HSP65)的编码基因和多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因用连接酶连接。
连接反应热休克蛋白65(HSP65)基因DNA(0.5μg/μl)2μl多表位乙型肝炎病毒核心抗原基因DNA(50ng/μl)2μl10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μlT4DNA连接酶1μl用双蒸水调节体积至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小时。
实施例4 HSP65-HBcAg融合基因的克隆1、用NcoI和HindIII在37℃消化实施例3中得到的连接产物，时间为2小时。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳条件是1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。20×TAE缓冲液0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/LNa2EDTA，用冰醋酸调pH至8.3。
2、在紫外灯下观察并将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置-70℃冷冻15分钟，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀，洗涤并干燥DNA。
3、将回收的DNA片段克隆入经限制性内切酶NcoI和HindIII消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游。
质粒DNA的消化反应1μg质粒DNA1μl 10×缓冲液(见Promega Corporation产品说明书)。
1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)1μl限制性内切酶HindIII(10单位/μl)用双蒸水调节体积至10μl混合后37℃温育30-120分钟。
连接反应质粒DNA(0.5μg/μl)2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μlT4DNA连接酶1μl用双蒸水调节体积至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小时。
4、将含HSP65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合基因的重组质粒pET-28a(+)-HSP65-HBcAg转化大肠杆菌。
感受态细胞的制备a、将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；b、次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；c、取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时)；d、将菌液冰浴2小时，然后2,500×g，4℃离心20分钟收集菌体；e、加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；f、1,800×g，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；g、按每份200ul分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加终浓度为15％的甘油，置-70℃备用。
转化方法a、将200μl感受态细胞置冰上融化，然后加入3μl DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入3-5μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；b、42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；c、加入2ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；d、4,000×g离心10秒钟，弃上清，用200μl LB培养液重悬菌体；e、将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。
f、质粒和菌株的保存质粒冰冻保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。
5、HSP65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合基因的测序(采用双脱氧末端终止法，具体方法见文献于永利，麻彤辉，杨贵贞。TA克隆及双链DNA测序介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法。中国免疫学杂志，1994，10(1)5)。
结果表明所得到的HSP65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原融合基因和设计的完全一致。
实施例5 HSP65-HBcAg重组融合蛋白的表达将单菌落接种于50ml LB培养基中，于250ml三角瓶中，37℃水浴震荡培养至OD600值为0.6。加入IPTG使其终浓度为0.4mM，37℃水浴震荡培养2-3小时。置三角瓶于冰上5分钟，4℃离心5分钟(5000×g)。吸弃上清，收集菌体，立即使用或冻存。
HSP65-HBcAg重组融合蛋白表达图谱如说明书附图3所示。
实施例6 HSP65-HBcAg重组融合蛋白的纯化1、将大肠杆菌细胞(3g湿重)于室温下解冻，重悬于20ml结合液中，冰浴2小时后，离心20分钟(10000×g)，收集上清备用。
结合液的配制20mmol/L Tris·HCL(pH7.9)0.5mol/L NaCL5mmol/L咪唑6mol/L尿素2、将上清液加入镍亲和层析柱(1×10cm)上，洗涤后洗脱目的蛋白。
SDS-PAGE鉴定纯化蛋白图谱如说明书附图4所示。
实施例7 转染乙型肝炎病毒核心抗原基因的B16细胞模型的建立一、转染质粒的准备1、乙型肝炎病毒核心抗原基因片段克隆入转染载体pcDNA3-GFP(Invitrogen)，形成pcDNA3-GFP-乙型肝炎病毒核心抗原基因重组质粒，并经过序列测定确定乙型肝炎病毒核心抗原基因片段已克隆入转染载体中。GFP为绿色荧光蛋白，且GFP和乙型肝炎病毒核心抗原基因同在一个阅读框架中，若重组质粒pcDNA3-GFP-乙型肝炎病毒核心抗原基因成功转染入B16细胞中，则在荧光显微镜下可见绿色荧光。
2、准备非线性化质粒和酶切线性化质粒。
3、超净工作台中用无菌Eppendorf管，以无水乙醇沉淀质粒。
4、将质粒用无菌双蒸水或TE缓冲液(pH7-8)溶解成适当浓度，一般最低浓度为1μg/μl。
5、测定质粒浓度(紫外测定)。
二、转染前细胞的准备1、转染前一天将生长良好的B16细胞用3％胰酶和4mM EDTA消化1-2min(采用最短时间为好)，吸出胰酶，用完全培养基吹打细胞成单个细胞，将细胞悬液转移到新6孔培养板孔中，每孔4×105细胞，每孔2ml完全培养液。
2、37℃，5％CO2培养18-24小时。
三、转染操作规程用Lipofeetamine试剂(Invitrogen)进行细胞转染1、准备下列试剂溶液A用100μl无血清培养液稀释1-2μg质粒DNA。
溶液B用100μl无血清培养液稀释10-20μl Lipofectamine试剂。
2、将溶液A慢慢加到溶液B中，轻轻混合，室温(一般为20-25℃左右)孵育45min，此时混合液中可能出现絮状物为正常现象。
3、在混合液孵育期间，用2ml无血清培养液将细胞洗一次。
4、将0.8ml无血清培养液加到A/B混合液中，轻轻混合。
5、将A/B混合液轻轻加入细胞培养孔中，盖到细胞上。
6、37℃，5％CO2培养5小时。
7、直接向培养孔中加入1ml完全培养液/20％血清(注意不要将转染试剂移除)，继续培养18-24小时。
8、弃培养液，加入2ml含适当浓度抗生素(如G418)的新鲜培养液/10％血清，继续培养，用于稳定转染细胞系的多克隆和单克隆建立。
四、转染细胞的单克隆筛选1、收集在含抗生素G418培养液中生长良好的多克隆转染细胞(1×106)，采用有限稀释法筛选单克隆细胞株，用荧光显微镜进行观察，选择绿色荧光单克隆细胞株，并采用WesternBlot鉴定乙型肝炎病毒核心抗原基因的表达情况。
2、Western Blot鉴定后的单克隆转染细胞需经过流式细胞仪测定，鉴定其阳性细胞率后方可用于下述的功能试验。
实施例8 HSP65-HBcAg重组融合蛋白可诱生小鼠多表位乙型肝炎病毒核心抗原特异性的CTL1、方法设立实验组和对照组，每组10只C57BL/6小鼠。于第0天、14天和28天给实验组小鼠四肢向心端注射HSP65-HBcAg重组融合蛋白，每只小鼠给予10μg HSP65-HBcAg重组融合蛋白/200μl PBS，同时设立PBS对照组，每只小鼠给予PBS200μl，注射部位同实验组。最后一次免疫后3-7d处死小鼠，取脾和淋巴结，分离淋巴细胞，体外培养7d，其间用HSP65-HBcAg重组融合蛋白刺激淋巴细胞2-3次。靶细胞采用的是转染了HBV核心抗原肽基因(序列见SEQ ID NO14；SEQ ID NO15)的B-16细胞(来源于C57/BL6小鼠的黑色素瘤细胞)。转染细胞经Western Blot和RT-PCR鉴定，证明HBV核心抗原肽基因已成功转染入B16细胞。用51Cr标记靶细胞。采用常规细胞毒实验，效应细胞和靶细胞共孵育4h后离心收集上清。使用放射性测定仪测定上清中的放射性含量(cpm)。
2、结果实验组小鼠脾和淋巴结的T淋巴细胞杀伤效率显著高于PBS对照组。
3、结论HSP65-HBcAg重组融合蛋白在小鼠中可诱生多表位乙型肝炎病毒核心抗原特异性CTL。
实施例9 接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白免疫的小鼠可激活体内HBV特异性的CTL1、方法对照组于第0天、14天和28天，用PBS免疫C57BL/6小鼠三次，最后一次免疫后3-7d给小鼠右侧背部后肢注射用pcDNA3-GFP-HBcAg质粒稳定转染的B-16细胞，每只小鼠1.5×105个细胞。实验组于第0天、14天和28天，用10μgHSP65-HBcAg重组融合蛋白免疫C57BL/6小鼠三次，最后一次免疫后3-7d给小鼠右侧背部后肢注射用pcDNA3-GFP-HBcAg质粒稳定转染的B-16细胞，每只小鼠1.5×105个细胞。观察对照组和实验组小鼠的生存情况。
2、结果用HSP65-HBcAg重组融合蛋白免疫的小鼠接受转染HBcAg抗原表位的肿瘤细胞后，其存活时间显著延长。在接种B16细胞后的第29天，对照组小鼠全部死亡，而在第29天时免疫HSP65-HBcAg重组融合蛋白组小鼠的死亡率为35％。这一结果说明接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白免疫的小鼠激活了其体内较强的HBV特异性的CTL。
3、结论接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白免疫的小鼠激活了其体内较强的HBV特异性的CTL。
实施例10注射转染HBcAg抗原表位B16细胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白治疗后，在小鼠体内激活了HBV特异性的CTL1、方法对照组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射PBS，200μlPBS/只小鼠，注射部位是小鼠四只皮下向心端。实验组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μg HSP65-HBcAg重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。观察两组小鼠存活情况。
2、结果注射转染HBcAg抗原表位B16肿瘤细胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白治疗后，其生存时间明显长于对照组。在接种B16细胞后的第31天，对照组小鼠全部死亡，接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白治疗组小鼠的死亡率为41％。这一结果说明先注射转染HBcAg抗原表位B16肿瘤细胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白治疗后，激发了其体内较强的HBV特异性的CTL。
3、结论注射转染HBcAg抗原表位B16肿瘤细胞的小鼠接受HSP65-HBcAg重组融合蛋白后，激发了其体内较强的HBV特异性的CTL。
实施例11 HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-FR重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较1、方法设立对照组和实验组，每组8只小鼠。对照组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-FR重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。实验组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。观察两组小鼠体内B16细胞的生长情况。
2、结果HSP65-HBcAg注射的实验组小鼠体内B16细胞的生长显著慢于注射HSP65-FR重组融合蛋白小鼠体内B16细胞的生长。这一结果说明HSP65-HBcAg能够比HSP65-FR在小鼠体内激活较强的HBV特异性的CTL，结果比较如说明书附图5所示。
3、结论HSP65-HBcAg比HSP65-FR在小鼠体内所诱生的HBV特异性CTL高效而强烈。
实施例12 HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-SE重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较1、方法设立对照组和实验组，每组8只小鼠。对照组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-SE重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。实验组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。观察两组小鼠体内B16细胞的生长情况。
2、结果HSP65-HBcAg注射的实验组小鼠体内B16细胞的生长显著慢于注射HSP65-SE重组融合蛋白小鼠体内B16细胞的生长。这一结果说明HSP65-HBcAg能够比HSP65-SE在小鼠体内激活较强的HBV特异性的CTL，结果比较如说明书附图6所示。
3、结论HSP65-HBcAg比HSP65-SE在小鼠体内所诱生的HBV特异性CTL高效而强烈。
实施例13 HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-TH重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较1、方法设立对照组和实验组，每组8只小鼠。对照组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-TH重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。实验组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。观察两组小鼠体内B16细胞的生长情况。
2、结果HSP65-HBcAg注射的实验组小鼠体内B16细胞的生长显著慢于注射HSP65-TH重组融合蛋白小鼠体内B16细胞的生长。这一结果说明HSP65-HBcAg能够比HSP65-TH在小鼠体内激活较强的HBV特异性的CTL，结果比较如说明书附图7所示。
3、结论HSP65-HBcAg比HSP65-TH在小鼠体内所诱生的HBV特异性CTL高效而强烈。
实施例14 HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-FO重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较1、方法设立对照组和实验组，每组8只小鼠。对照组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-FO重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。实验组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。观察两组小鼠体内B16细胞的生长情况。
2、结果HSP65-HBcAg注射的实验组小鼠体内B16细胞的生长显著慢于注射HSP65-FO重组融合蛋白小鼠体内B16细胞的生长。这一结果说明HSP65-HBcAg能够比HSP65-FO在小鼠体内激活较强的HBV特异性的CTL，结果比较如说明书附图8所示。
3、结论HSP65-HBcAg比HSP65-FO在小鼠体内所诱生的HBV特异性CTL高效而强烈。
实施例15 HSP65-HBcAg重组融合蛋白和HSP65-FI重组融合蛋白激发HBV特异性CTL效力比较1、方法设立对照组和实验组，每组8只小鼠。对照组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-FI重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。实验组在第0天用pcDNA3-GFP-HBcAg重组质粒稳定转染的B-16细胞给小鼠注射，每只小鼠1.5×105个细胞，注射部位为小鼠背部右腿皮下。分别在第2、16天给小鼠注射10μgHSP65-HBcAg重组融合蛋白，注射部位是小鼠四只皮下向心端。观察两组小鼠体内B16细胞的生长情况。
2、结果HSP65-HBcAg注射的实验组小鼠体内B16细胞的生长显著慢于注射HSP65-FI重组融合蛋白小鼠体内B16细胞的生长。这一结果说明HSP65-HBcAg能够比HSP65-FI在小鼠体内激活较强的HBV特异性的CTL，结果比较如说明书附图9所示。
3、结论HSP65-HBcAg比HSP65-FI在小鼠体内所诱生的HBV特异性CTL高效而强烈。
序列表<110>北京迪威华宇生物技术有限公司<120>热休克蛋白65-多表位乙型肝炎病毒核心抗原重组融合蛋白<160>17<210>SEQ ID NO1<211>18<212>氨基酸<221>多肽<400>1Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu18<210>SEQ ID NO2<211>17<212>氨基酸<221>分子类型多肽<400>2Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu17<210>SEQ ID NO3<211>19<212>氨基酸<221>多肽<400>3Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser 19<210>SEQ ID NO4<211>17<212>氨基酸<221>多肽<400>4Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser 17<210>SEQ ID NO5<211>17<212>氨基酸<221>多肽<400>5Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln 17<210>SEQ ID NO6<211>20bp
<212>核酸<221>寡核苷酸<400>6CCATGGCCAA GACAATTGCG20<210>SEQ ID NO7<211>39bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>7ACCGAATTCG CTAGCCATAT GGAAATCCAT GCCACCCAT 39<210>SEQ ID NO8<211>1638bp<212>核酸<221>HSP65结构基因序列<400>8ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG 50GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG 100GCCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC 150GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA 200GATCGGCGCC GAGCTGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG 250CCGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC 300GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG 350CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG 400CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG 450GCGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT 500GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC 550AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG 600TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA 650CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC 700TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG 750GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG 800CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA 850AGGCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC 900GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA 950GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG 1000CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG 1050ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT 1100GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG 1150ACGTCGAACT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT 1200GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT 1250GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG 1300CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG 1350ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG 1400CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG 1450
ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG 1500CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT 1550CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG 1600ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GCGAATTC 1638<210>SEQ ID NO9<211>86bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>9GGTTGTTTCT TACGTTAACG TAAACATGGG TCTGAAAATC CGTCAGCTGG 50CTCCGATCCT GTCCACTCTG CCAGAAACTA CTGTTG86<210>SEQ ID NO10<211>85bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>10TAGAGGACAG ACGAGCAACG TAACGAGACA GACCGGAAGA ACCGATGCTA 50CGACCACGAC GACGAACAAC AGTAGTTTCT GGCAG85<210>SEQ ID NO11<211>152bp<212>核酸<221>第一轮PCR产物<400>11GGTTGTTTCT TACGTTAACG TAAACATGGG TCTGAAAATC CGTCAGCTGG 50CTCCGATCCT GTCCACTCTG CCAGAAACTA CTGTTGTTCG TCGTCGTGGT 100CGTAGCATCG GTTCTTCCGG TCTGTCTCGT TACGTTGCTC GTCTGTCCTC 150TA 152<210>SEQ IDNO12<211>82bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>12GAATTCGAAC TGCTGTCTTT CCTGCCGAGC GACTTCTTCC CGTCCGTTCG 50TGACCTGCTG CTGGTTGTTT CTTACGTTAA CG82<210>SEQ ID NO13<211>86bp<212>核酸<221>寡核苷酸<400>13
ACGCGTCGAC CTGTTTAGCC TGGATGCAAG CGTACAGCGG CATCAGAGCC 50GGGTAACCGC AAGAGTTAGA GGACAGACGA GCAACG 86<210>SEQ ID NO14<211>276bp<212>核酸<221>第二轮PCR产物/乙型肝炎病毒核心抗原多表位基因序列<400>14 GAAC TGCTGTCTTT CCTGCCGAGC GACTTCTTCC CGTCCGTTCG 50TGACCTGCTG CTGGTTGTTT CTTACGTTAA CGTAAACATG GGTCTGAAAA100TCCGTCAGCT GGCTCCGATC CTGTCCACTC TGCCAGAAAC TACTGTTGTT150CGTCGTCGTG GTCGTAGCAT CGGTTCTTCC GGTCTGTCTC GTTACGTTGC200TCGTCTGTCC TCTAACTCTT GCGGTTACCC GGCTCTGATG CCGCTGTACG250CTTGCATCCA GGCTAAACAG276<210>SEQ ID NO15<211>92<212>氨基酸<221>多表位乙型肝炎病毒核心抗原<400>15Glu Phe Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu 20Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Ala Pro Ile 40Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Ile Gly Ser Ser 60GIy Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met 80Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Lys Leu 92<210>SEQ ID NO16<21l>1944bp<212>核酸<221>HSP65-HbcAg重组融合蛋白基冈<400>16ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG50GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG100GCCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC150GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA200GATCGGCGCC GAGUrGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG250CCGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC300GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG350CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG400CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG450GCGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT500GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC550
AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG600TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA650CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC700TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG750GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG800CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA850AGCCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC900GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA950GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG1000CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG1050ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT1100GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG1150ACGTCGAaCT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT1200GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT1250GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG1300CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG1350ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG1400CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG1450ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG1500CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT1550CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG1600ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GC GA ACTGCTGTCT1650TTCCTGCCGA GCGACTTCTT CCCGTCCGTT CGTGACCTGC TGCTGGTTGT1700TTCTTACGTT AACGTAAACA TGGGTCTGAA AATCCGTCAG CTGGCTCCGA1750TCCTGTCCAC TCTGCCAGAA ACTACTGTTG TTCGTCGTCG TGGTCGTAGC1800ATCGGTTCTT CCGGTCTGTC TCGTTACGTT GCTCGTCTGT CCTCTAACTC1850TTGCGGTTAC CCGGCTCTGA TGCCGCTGTA CGCTTGCATC CAGGCTAAAC1900AG 1908<210>SEQ ID NO17<211>636<212>氨基酸<221>HSP65-HbcAg重组融合蛋白<400>17Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Gly Leu Asn20Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu40Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu60Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr80Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg100Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu120Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys140Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile160Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu G1u Ser Asn Thr180Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly200Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu220Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu260Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly280
Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser 300Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys 320Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile 340Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg 360Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly 380Ala Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn 400Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala 420Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val 440Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly 460Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala 500Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp 520Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 540His Met Ala Ser Glu Phe Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 560Arg Asp Leu Leu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln 580Leu Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser 600Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Cys Gly Tyr 620Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Lys Leu 63权利要求
1.一种重组融合蛋白，它是由热休克蛋白HSP65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg融合而形成的融合蛋白；其中，所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg是由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5以数学上的组合方式相互连接而形成。
2.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，其中多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg是由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5按顺序连接而形成的。
3.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，其中多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg包含SEQ ID NO15所示的氨基酸序列或其活性衍生物，所述活性衍生物包括下列多肽(1)其氨基酸序列与SEQ ID NO15所示序列的同源性大于80％；或者(2)其核苷酸编码序列能够在严谨条件下与编码SEQ ID NO15所示序列的核苷酸编码序列杂交；或者(3)对SEQ ID NO15所示序列进行人工点突变或插入其它序列、或以两侧连接其它序列的方式进行改造后所得到的序列；上述多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg活性衍生物仍具有多表位乙型肝炎病毒核心抗原活性。
4.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，其中热休克蛋白HSP65位于该融合蛋白的氨基端，多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg位于该融合蛋白的羧基端。
5.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，它具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
6.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，它由SEQ ID NO16所示的核苷酸序列编码。
7.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。
8.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg由SEQ ID NO14所示的核苷酸序列编码。
9.按照权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述的多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg可以是1至5个拷贝。
10.编码权利要求1至9中任意一项所述的重组融合蛋白的核苷酸序列。
11.一种重组质粒，其外源插入基因是由热休克蛋白65基因融合多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因所组成的。
12.按照权利要求11所述的重组质粒，其外源插入基因的表达产物中热休克蛋白65位于该表达产物的氨基端，多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg位于该表达产物的羧基端。
13.按照权利要求11所述的重组质粒，其外源插入基因中多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因的表达产物具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。
14.按照权利要求11所述的重组质粒，其外源插入基因中编码多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg的基因具有SEQ ID NO14所示的核苷酸序列。
15.按照权利要求11所述的重组质粒，其外源插入基因的表达产物具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
16.按照权利要求11所述的重组质粒，其外源插入基因具有SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
17.一种药物组合物，其包括有效量的权利要求1所述的重组融合蛋白和药学上可接受的载体和赋形剂。
18.一种药物组合物，其包括有效量的权利要求3所述的重组融合蛋白和药学上可接受的载体和赋形剂。
19.一种药物组合物，其包括有效量的权利要求9所述的重组融合蛋白和药学上可接受的载体和赋形剂。
全文摘要
本发明涉及一种重组融合蛋白HSP65－HBcAg，该重组融合蛋白由热休克蛋白65和多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg融合而成。在上述重组融合蛋白中，多表位乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg由5个不同的抗原表位以数学上的组合方式相互连接而成。该重组融合蛋白可以有效地激活针对乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg的特异性细胞毒性T淋巴细胞CTL，从而导致CTL杀伤感染乙型肝炎病毒的细胞，进而达到治疗和/或预防乙型病毒肝炎的目的。同时本发明还提供了编码该重组融合蛋白的核苷酸序列。
文档编号C07K14/435GK1737147SQ20041007008
公开日2006年2月22日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者王丽颖, 万敏, 邵明玉, 于永利 申请人:北京迪威华宇生物技术有限公司