专利名称：一种重组人干扰素α1b的纯化工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种重组人干扰素的纯化工艺。
背景技术：
干扰素作为一种广谱的抗病毒药物越来越广泛的应用于临床上，具有很大的市场价值。自从人α1b干扰素通过基因工程的办法获得高效表达成功以后，为了保证高纯度，该蛋白的纯化工艺一直都采用以单抗亲和层析柱为主结合其他层析柱的方法进行分离纯化，(专利申请号93114639.9)，这类方法具有高选择性的特点，通过一个柱子即可达到较高的纯度。但是该工艺存在层析介质价格昂贵、单抗容易脱落造成蛋白药物污染、介质使用寿命短等这些单抗亲和层析自身不可回避的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于在纯化工艺中避开单抗亲和层析柱，并使操作环节的衔接更为简便，同时保证相应的高纯度和收率。本工艺包括细菌裂解，包涵体变性和复性等过程，其特征在于还包括以下步骤(1)疏水柱层析；(2)阳离子柱层析；(3)体积排阻层析。
上述3种柱层析使用的层析介质可从多家公司购买，每一种介质都有多种选择。仅以Amersham Biosciences公司为例，其出售的疏水介质有PhenylSepharose FF、Butyl Sepharose FF、Qctyl Sepharose FF等；阳离子介质有CMSepharose FF、SP Sepharose FF、S Sepharose FF等；体积排阻层析介质有Sepharose、Sephacryl、Sephadex、Superdex等。本发明的主要内容在于将上述不同种类的柱层析相互组合，从而达到纯化人干扰素α1b的目的。本领域的普通技术人员很容易做到将同一种类的介质互相替换，以达到相同的纯化效果，所以这种同一类型纯化介质之间的简单替换，仍然包括在本发明的保护范围之内。
上述纯化工艺中，疏水柱层析使用Phenyl Sepharose FF，其中洗脱液使用10-40％(v/v)的乙二醇溶液，优选20％的乙二醇溶液；阳离子柱层析使用CMSepharose FF，其中平衡液使用pH4.4-5.0的醋酸缓冲液；体积排阻柱层析使用Sephacryl S-100。
本发明应用到实际生产中能产生以下的积极意义本发明涉及的工艺没有采用单抗亲和层析柱，而采用了疏水柱层析和阳离子交换层析为主的分离方法，节约了生产成本并避免了单抗脱落带来的污染问题。
本发明采用疏水柱层析作为柱层析的第一步，无需将蛋白液进行大体积的透析，简便了操作过程，节约了时间。同时疏水柱具有高结合量、能承受较高流速的优点，作为第一步柱层析能起到很有效的浓缩效果。此外，更重要的是，经过这一步就能使目的蛋白纯度达到90％以上。
CM柱层析能使目的蛋白纯度达到95％以上，同时进一步浓缩了目的蛋白。
采用本工艺，重组人干扰素α1b的收率、纯度和比活性不低于单抗亲和层析的方法，相应于10％目的蛋白表达量的菌种，每1克菌最终可收获1mg干扰素纯品。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1(1)超声波裂解取40g工程菌菌体，按菌体的质量每克用20-40ml的TE溶液(pH8.0)悬浮菌体，超声波的输出功率设置为600W以上、破碎时间为10分钟以上。12,000rpm，4℃离心20分钟收集包涵体沉淀，用TE溶液或Tris-HCl溶液(pH8.0)洗涤一次，12,000rpm，4℃离心20分钟收集沉淀。
(2)包涵体的变性按照包涵体的质量，每克包涵体加入10ml的6N盐酸胍充分溶解，室温下变性2小时以上。
(3)包涵体的复性4,000rpm离心收集上清，蛋白的变性液用0.15M硼酸溶液(pH9.0)稀释100倍，4℃过夜复性。
(4)Phenyl Sepharose疏水柱层析将复性后的蛋白液对0.44μm的膜抽滤以去除不溶性杂质颗粒，向抽滤液中加入适量体积的浓(NH4)2SO4溶液使蛋白液中最终的(NH4)2SO4浓度至1.5mol/L。用1.5M浓度的(NH4)2SO4溶液平衡好层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用10％(v/v)的乙二醇溶液洗脱，收集洗脱峰组分。
(5)CM Sepharose FF阳离子交换柱层析将上一步收集的洗脱组分对5mM醋酸缓冲液(pH4.4)透析后上样到用80mM醋酸缓冲液(pH4.4)平衡好的CM层析柱上，用50mM NaCl/80mM醋酸缓冲液(pH4.4)洗脱，收集洗脱峰组分。
(6)Sephacryl S-100柱层析用0.1N NaOH将上一步洗脱组分的pH值调至7.0，上样到用PBS(pH7.0)平衡好的层析柱上，用PBS(pH7.0)洗脱，收集洗脱峰组分即为重组人α1b干扰素纯品。
40g菌体经上述处理，共得到39mg干扰素α1b纯品，SDS-PAGE电泳检测，纯度为98％，经常规WISH-VSV系统测定，比活性为1.3×107IU/mg。整个工艺过程共用28个小时。
实施例2将Phenyl Sepharose疏水柱层析中10％的乙二醇溶液换成20％的乙二醇溶液，将CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析各缓冲液的pH值调成4.6，其余步骤同实施例1。
40g菌体经上述处理，共得到45mg干扰素α1b纯品，SDS-PAGE电泳检测，纯度为98％，经常规WISH-VSV系统测定，比活性为1.2×107IU/mg。整个工艺过程共用28个小时。
实施例3将Phenyl Sepharose疏水柱层析中10％的乙二醇溶液换成40％的乙二醇溶液，将CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析各缓冲液的pH值调成5.0，其余步骤同实施例1。
40g菌体经上述处理，共得到48mg干扰素α1b纯品，SDS-PAGE电泳检测，纯度为96％，经常规WISH-VSV系统测定，比活性为1.1×107IU/mg。整个工艺过程共用28个小时。
对照实施例超声波裂解、包涵体变性和复性同实施例1，然后按以下步骤处理(1)DEAE Sepharose FF阳离子交换柱层析复性液用25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)透析，用Tris-HCl溶液(pH7.5)平衡好层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用0.2M NaCl/25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)洗脱，收集洗脱峰组分。
(2)单克隆抗体亲和层析将上一步收集的洗脱组分对25mM pH7.0PB缓冲液透析后上样到用25mM pH7.0PB缓冲液平衡好的亲和层析柱上，用PBSpH7.0缓冲液冲洗，用50mM pH2.5的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，立即调pH至7.0。
(3)Sephacryl S-100柱层析将上一步洗脱组分上样到用PBS(pH7.0)平衡好的层析柱上，用PBS(pH7.0)洗脱，收集洗脱峰组分即为重组人α1b干扰素纯品。
40g菌体经上述处理，共得到42mg干扰素α1b纯品，SDS-PAGE电泳检测，纯度为98％，经常规WISH-VSV系统测定，比活性为1.2×107IU/mg。整个工艺过程共用38个小时。
以上结果表明，使用本发明纯化工艺的实施例1、2、3与对照实施例相比，没有使用传统的单克隆抗体亲和层析，获得的干扰素α1b纯品的质量相当，而工艺过程明显缩短。
权利要求
1.一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，包括以下步骤(1)疏水柱层析；(2)阳离子柱层析；(3)体积排阻柱层析。
2.如权利要求1所述的工艺，其中疏水柱层析为Phenyl Sepharose FF。
3.如权利要求2所述的工艺，其中疏水柱层析的洗脱液是10％-40％的乙二醇溶液。
4.如权利要求1所述的工艺，其中阳离子柱层析是CM Sepharose FF。
5.如权利要求4所述的工艺，其中阳离子柱层析的平衡液是pH 4.4-5.0的醋酸缓冲液。
6.如权利要求1所述的工艺，其中体积排阻柱层析是Sephacryl S-100。
全文摘要
本发明涉及一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，包括疏水柱层析、阳离子柱层析、体积排阻柱层析。该工艺无需采用单抗亲和层析柱，避免了单抗脱落造成的污染，产品纯度、收率及活性与传统亲和层析方法相当，同时各纯化步骤之间的衔接更为合理，缩短了工艺过程。
文档编号C07K1/00GK1724568SQ20041006939
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者杨大军, 梁天凤, 刘金毅, 刘永全, 孙俭波, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司, 北京毕艾欧科技发展有限公司