专利名称：胞苷－5′－一磷酸的制备方法
涉及领域本发明涉及一种核苷酸的制备，尤其涉及“胞苷-5’-一磷酸”的制备方法，特别涉及以胞苷为原料采用化学合成的方法制备“胞苷-5’-一磷酸”。
背景技术：
核糖核酸(RNA)是一种生物高分子化合物，是构成生物细胞的主要成份。从结构上看，RNA由许多重复单元构成，这些重复单元便是核苷酸。因此，核苷酸及其衍生物具有多种生物活性物质，可以直接或间接地作为药物使用，其系列化合物主要用于医药领域，用途十分广泛，新产品层出不穷，应用范围也不断扩大，对治疗多种疾病起到了极其重要的作用。
本发明所涉及的“胞苷-5’-一磷酸”是构成RNA的一种基本核苷酸，又称为“5’-胞苷酸”、“5’-单磷酸胞苷”或“5’-CMP”，其分子式为C9H14N3O8P，结构如式I所示。
(式I) (式II)5’-CMP不仅可以与其它核苷酸搭配使用而生产营养补充剂、营养食品添加剂或化妆品，更重要的是，它可以作为中间体用来制备胞二磷胆碱、胞苷三磷酸、阿糖胞苷、聚肌胞等生化药物，其中胞二磷胆碱能够增加脑血流量，促进脑损伤和中风的恢复，在治疗帕金森氏症、老年痴呆症、抑郁症及心脑血管疾病等方面有很好疗效；胞苷三磷酸是一种抗病毒药物，其作用类似于盐酸环胞苷、ATP(三磷酸腺苷)；阿糖胞苷也有抗病毒作用，是治疗急性白血病的常用药；聚肌胞是人工合成的双链核糖核酸，可诱生低水平干扰素，具有抗病毒作用，能调节肌体免疫功能，促使人体非特异性免疫功能和某些特异性免疫功能的增强，起到抗细胞坏死和抗肿瘤作用，常用于治疗慢性病毒性肝类疾病、单纯疱疹及扁平疣等。这些生化药物临床上需求量比较大，目前国内有几十家药厂生产，但由于其起始生产原料——5’-CMP比较缺乏，使得每年需要从国外大批量高价进口。
现有技术中，制备5’-CMP的方法主要有核酸降解法、酶合成法和化学合成法三大类。
核酸降解法是利用核酸酶P1的核心核酸降解水酵母RNA，得到5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-尿苷酸和5’-CMP等核苷酸，然后用离子交换色谱柱分离，再经过精制而制得5’-CMP。这是我国目前生产5’-CMP的主要方法，但这种方法生产周期长，分离与精制工序复杂，产量小，加工成本高。
酶合成法是采用微生物酶为基础的生产技术，以聚核苷酸磷酸化酶和核苷磷酸化酶为酶源，经过多次发酵加工，最终转化为目的产品。该方法的缺点是反应时间长，易染菌，转化率较低。
化学合成法的路线是，先由胞嘧啶与四乙酰核糖(α、β-混合四乙酰-D-核糖)在四氯化锡等缩合剂的作用下进行缩合反应，制得胞苷(分子式为C9H13N3O5，其结构式见式II)。然后将胞苷与保护试剂2’、3’-O-异丙叉胞苷反应，使胞苷分子内2’、3’位置上的羟基先保护起来，再与磷酸化剂进行酸化反应，最后脱除保护剂便可制得5’-CMP。
很明显，化学合成比其它两种方法更具有优点，其开发前景也最为看好。一方面，胞嘧啶是生产核苷酸产品当中最为廉价的原料，另一方面，胞苷的合成工艺日趋成熟，因此，人们逐渐将研究重点转移到以胞苷为原料合成5’-CMP上来，研究探索更好的工艺路线和条件，以便克服现有技术那种先保护、再酸化、最后脱保护的缺陷，从而简化工艺过程，使得制备高纯度的胞苷-5’-一磷酸的工艺过程更为经济、高效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以胞苷为原料制备胞苷-5’-一磷酸的方法，该方法工艺过程短、转化率高、产品纯度高、能够大规模工业化生产。
本发明的目的通过以下技术解决方案来实现一种制备胞苷-5’-一磷酸的方法，以胞苷为起始原料，依次包括以下操作步骤①将胞苷溶于有机溶剂，加入磷酸化剂，在-15℃至-5℃、常规大气压力下进行酸化反应，磷酸化剂与胞苷的摩尔用量之比为1/1～1/1.5；②当胞苷的酸化转化率≥85％时，加入冰水终止反应，并在-5℃～5℃温度下水解1～3小时；③加入萃取剂进行萃取，静置分层，分离后分别得到有机相和水相；④用稀碱溶液中和水相，直至PH值为3～4，然后在10℃～0℃下冷冻结晶，固液分离得胞苷-5’-一磷酸粗品；⑤精制所得粗品，干燥，即得胞苷-5’-一磷酸成品。
本发明的目的还可通过以下技术解决措施来进一步实现前述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步骤⑤精制过程的工序是，将粗品加入纯水中，加热溶解，加入活性炭脱色，过滤，冷却后向滤液中加入乙醇，析出白色晶体，离心分离，真空干燥后得到胞苷-5’-一磷酸成品；或者是，用乙醇洗涤粗品，然后加入纯水，用稀碱溶液调节PH值为5～6，加热溶解后加入活性炭脱色，过滤，冷却后再用稀酸溶液调节PH值为3～4，在10℃～0℃下冷冻结晶，固液分离即得胞苷-5’-一磷酸成品。
前述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步骤①中所述磷酸化剂是氧氯化磷，所述有机溶剂是卤代烷烃、有机腈、二甲基甲酰胺或磷酸酯。
前述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步骤①酸化反应过程中温度优选-10℃至-5℃，参加酸化反应所有物料原料当中的含水量均应不超过0.1Wt％。
前述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步骤③所用萃取剂为卤代烷，更优选氯代烷。
前述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其中可以将步骤③萃取分离之后得到的有机相进行蒸馏，回收其中所含有的萃取剂和酸化反应有机溶剂，并重复使用。
本发明的突出的实质性特点和显著的进步体现在以下几方面首先，胞嘧啶是生产核苷酸产品的最为廉价的原料，国内每年现有上百吨的产量，原料来源广、价格低，制得的胞苷价格也较为便宜。与核酸降解法、酶合成法相比，本发明优势十分明显，不仅原料来源丰富、生产周期短、产品收率高、加工成本低，而且生产过程不会染菌，产品质量可靠。
其次，与现有技术所采用的化学合成方法相比，本发明通过对酸化反应溶剂的选择、反应条件的优化、反应终点的控制，使胞苷与磷酸化剂反应生成5’-CMP的过程一次性完成，简化了制备工艺，进一步降低了生产成本。
第三，本发明给出了胞苷在完成酸化反应之后中和过量酸及脱除溶剂的最佳工艺条件，对于粗品的精制，本发明给出了两种技术方案，能够很好地去除反应生成的大量盐、副产物以及未反应的胞苷，制得的产品用高效液相色谱分析含量在98％左右，纯度很高。
此外，本发明可以有效防止和克服现有技术常发生的物料糖浆化现象，研究结果表明本发明所采用的技术方案工艺过程稳定，各工序均能有效控制，可靠性强。
总之，本发明提供了一种更为经济、高效的制备5’-CMP的方法，该方法对于开发5’-CMP成套生产技术、实行从胞嘧啶→胞苷→胞苷酸→生化药品等系列化加工与衔接都具有非常重要的积极意义。这种方法可以大幅度降低生产成本，为大规模生产胞苷酸产品奠定了基础。
本发明的目的、优点和特点，将通过下面优先实施例的非限制性说明进行图示和解释，这些实施例是参照附图仅作为例子给出的。
图1为本发明工艺流程示意图。
具体实施例方式
如图1所示，本发明以胞苷为起始原料，在有机溶剂中、-15℃至-5℃温度下，与氧氯化磷等磷酸化剂按照1/1～1/1.5摩尔用量的比例进行反应，制得胞苷-5’-一磷酸。反应方程式可简化为 当胞苷的酸化转化率≥85％时，加入冰水终止反应，并在0℃～5℃温度下水解1～3小时；然后加入卤代烷等萃取剂进行萃取，静置分层，分离后分别得到有机相和水相；有机相经蒸馏回收，得到萃取剂和酸化反应有机溶剂，可以重复使用；水相用NaOH等稀碱溶液中和，至PH值为3～4时冷冻结晶，固液分离得到5’-CMP粗品；粗品经过精制和干燥处理，即得5’-CMP成品。
上述精制及干燥工序可以采用以下两种方法之一其一，将粗品加入纯水中，加热溶解，加入活性炭脱色，过滤，冷却后向滤液中加入乙醇，析出白色晶体，离心分离后真空干燥；其二，用乙醇洗涤粗品，然后加入纯水，用稀碱溶液调节PH值为5～6，加热溶解后加入活性炭脱色，过滤，冷却后再用稀酸溶液调节PH值为3～4，冷冻结晶后离心分离，真空干燥。
长对产品收率有影响，当转化率达到85％以后，随着时间延长，反应液中5’-CMP的含量反而呈下降趋势。其原因可能是由于在强酸环境下，5’-CMP分子中的苷键发生断裂。因此在酸化反应过程中，可以每隔半小时取一次样品，用上述“电泳法”进行分析，当确定胞苷的转化率达到85％以后，即可加入冰水终止反应。
为防止苷键断裂影响产品收率，酸化反应应当在较低温度下进行。通过研究发现，反应温度在-15℃至-5℃之间，收率比较稳定；温度大于-5℃时，收率开始下降。一般地，以-10℃至-5℃之间比较适宜。
酸化反应结束后，经水解、萃取、中和、结晶，5’-CMP与大量的盐和副反应产物一起同时析出，其中5’-CMP的重量比例只占40～50％左右，因此，接下来的精制过程非常重要。前面已给出了精制的两种方法，精制后的5’-CMP成品纯度很高，高效液相色谱(HPLC)分析结果在98％左右，紫外光谱(UV)分析结果在96％左右，说明两种精制方法的效果都很好。
精制过程中加入活性炭的目的在于脱色，使制得的产品更白。
实施例1在干燥、洁净的合成反应瓶中加入140ml磷酸三乙酯，投入20克胞苷，搅拌，降温到-5～-10℃。缓慢滴加12ml氧氯化磷，维持反应温度在-5～-10℃之间，加毕，在.此温度下保温反应。两小时后每隔半小时取样，进行电泳分析。当胞苷转化率达85％以上，向反应体系中加入80ml冰水终止反应，保持温度在0～5℃之间，水解1小时，然后用二氯乙烷萃取，静置分层。有机层经蒸馏回收，得到二氯乙烷和磷酸三乙酯，可重复使用；水层用30％重量浓度的NaOH中和，直到PH值为3～4，然后降温至10℃～0℃进行冷冻结晶，离心分离后得到粗产品。
向粗产品中加入3～10倍量纯水，加热溶解，用活性炭脱色，过滤，冷却后向滤液中加入95％乙醇，析出晶体，离心分离后母液套用，晶体经真空干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。产品外观白色结晶或粉末；纯度HPLC分析结果为97.8％，UV分析结果为95.7％；总收率81.75％，其中酸化反应转化率85％，精制收率96.17％。
实施例2在干燥、洁净的合成反应瓶中加入30ml磷酸三丁酯，投入40克胞苷，搅拌，降温到-5～-10℃。缓慢滴加30ml氧氯化磷，，维持反应温度在-5～-10℃之间，加毕，在此温度下保温反应。两小时后每隔半小时取样，进行电泳分析。当胞苷转化率达85％以上，向反应体系中加入200ml冰水终止反应，保持温度在0～5℃之间，水解1小时，然后用三氯甲烷萃取，静置分层。有机层经蒸馏回收，得到三氯甲烷和磷酸三丁酯，可重复使用；水层用30％重量浓度的NaOH中和，直到PH值为3～4，然后降温至10℃～0℃进行冷冻结晶，离心分离后得到粗产品。
用80％乙醇按3倍用量洗涤粗产品两次，然后再加热溶解于3倍用量的纯水当中，用活性炭脱色，过滤，冷却后向滤液中加入95％乙醇，析出晶体，离心分离后母液套用，晶体经真空干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。产品外观白色结晶或粉末；纯度HPLC分析结果为98.2％，UV分析结果为96.1％；总收率80％，其中酸化反应转化率86％，精制收率93％。
实施例3在干燥、洁净的合成反应釜中加入560克磷酸三乙酯，投入80克胞苷，搅拌，降温到-5～-10℃。缓慢滴加48L氧氯化磷，维持反应温度在-5～-10℃之间，加毕，在此温度下保温反应。两小时后每隔半小时取样，进行电泳分析。当胞苷转化率达85％以上，向反应体系中加入80L冰水终止反应，保持温度在0～5℃之间，水解1小时，然后用二氯乙烷萃取，静置分层。有机层经蒸馏回收，得到二氯乙烷和磷酸三乙酯，可重复使用；水层用30％重量浓度的NaOH中和，直到PH值为3～4，然后降温至10℃～0℃进行冷冻结晶，离心分离后得到粗产品。
用80％乙醇按3倍用量洗涤粗产品两次，然后将醇洗后的粗产品溶于纯水，用10％NaOH调节PH值为5～6，加热溶解，加活性炭脱色，过滤，冷却后再用稀浓度HCL调节PH为3～3.5，冷冻后析出结晶，离心分离，母液套用，晶体经真空干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。产品外观白色结晶或粉末；纯度HPLC分析结果为98.5％，UV分析结果为96.3％；总收率82.5％，其中酸化反应转化率86％，精制收率96％。
除上述实施例外，本发明还可以有其它具体实施方式
。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
权利要求
1.一种制备胞苷-5’-一磷酸的方法，以胞苷为起始原料，依次包括以下操作步骤①将胞苷溶于有机溶剂，加入磷酸化剂，在-15℃至-5℃、常规大气压力下进行酸化反应，磷酸化剂与胞苷的摩尔用量之比为1/1～1/1.5；②当胞苷的酸化转化率≥85％时，加入冰水终止反应，并在-5℃～5℃温度下水解1～3小时；③加入萃取剂进行萃取，静置分层，分离后分别得到有机相和水相；④用稀碱溶液中和水相，直至PH值为3～4，然后在10℃～0℃下冷冻结晶，固液分离得胞苷-5’-一磷酸粗品；⑤精制所得粗品，干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。
2.按权利要求1所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于所述步骤⑤精制工序是，将粗品加入纯水中，加热溶解，加入活性炭脱色，过滤，冷却后向滤液中加入乙醇，析出白色晶体，离心分离，真空干燥后即得胞苷-5’-一磷酸成品。
3.按权利要求1所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于所述步骤⑤精制工序是，用乙醇洗涤粗品，然后加入纯水，用稀碱溶液调节PH值为5～6，加热溶解后加入活性炭脱色，过滤，冷却后再用稀酸溶液调节PH值为3～4，在10℃～0℃下冷冻结晶，固液分离即得胞苷-5’-一磷酸成品。
4.按权利要求1或2或3所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于步骤①中所述磷酸化剂是氧氯化磷，所述有机溶剂是卤代烷烃、有机腈、二甲基甲酰胺或磷酸酯。
5.按权利要求4所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于步骤①酸化反应过程中温度为-10℃至-5℃，参加酸化反应所有物料原料当中的含水量不超过0.1Wt％。
6.按权利要求1或2或3所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于步骤③所用萃取剂为卤代烷。
7.按权利要求6所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于所述卤代烷为氯代烷。
8.按权利要求1所述的制备胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于将步骤③萃取分离以后得到的有机相进行蒸馏，回收其中所含有的萃取剂和酸化反应有机溶剂，重复使用。
全文摘要
本发明涉及化学合成法制备“胞苷－5’－一磷酸”。以胞苷为原料，在－15～－5℃、常压条件下，与氧氯化磷等磷酸化剂反应，当酸化转化率≥85％时，加入冰水终止反应，然后在0～5℃下水解，再加入卤代烷进行萃取，静置分层，分离后得到有机相和水相。有机相经蒸馏得到萃取剂和酸化反应有机溶剂，可以回收使用；水相经中和至pH为3～4时冷冻结晶，得到5’－CMP粗品。粗品再经过进一步的精制和干燥处理，即得5’－CMP成品。该技术方案原料来源丰富，胞苷与磷酸化剂反应生成5’－CMP的过程一次性完成，简化了工艺过程，生产周期短、产品收率高、加工成本低，并且生产过程不会染菌，产品纯度经HPLC分析达到98％。
文档编号C07H19/00GK1616475SQ20041006471
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者周景康 申请人:苏州工业园区赛康德万马化工有限公司