肿瘤特异性抗原ta48及其在癌症诊断中的应用的利记博彩app

专利名称：：肿瘤特异性抗原ta48及其在癌症诊断中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种新的肿瘤特异性抗原，具体地说涉及一种在常见肿瘤中有广泛表达的肿瘤特异性抗原TA48。本发明还涉及抗TA48抗原自身抗体在癌症早期诊断和预后评价中的应用。
背景技术：
：(一)癌症的早期诊断1.癌症是危害人类健康的主要疾病之一。据国内外调查报告，由癌症导致的死亡病例已占因疾病死亡人数的首位。这主要是因为癌症不容易被早期发现；临床上确诊的大多数病例已届疾病的中晚期。虽然数十年来，癌症的治疗采用了化学疗法，放射疗法和手术切除等各种手段，但这些治疗方法对中晚期的癌症病人疗效有限。而用这些方法进行早期治疗则效果显著。因此，治疗癌症的最佳途径之一就是要能够早期诊断。现今采用的诊断方法，如医学影像检查(CT，B超X-光等)和病理活检都要等到癌细胞发展到一定程度时方能发现，为时已晚。从上世纪六十年代起，科研和医务人员就在寻找一种对病人既无损害又能早期发现癌症的生化标志物作为癌症诊断的手段。这种生化标志物可由癌症在发生和发展过程中由癌细胞产生或由身体对癌症产生免疫反应而产生的生化物质，又称之为肿瘤标志物。癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)就是最早发现的肿瘤标志物，可测定其在血液或其它体液中浓度是否增高来诊断病人是否患有癌症。并且这两个肿瘤标志物至今仍在临床上广泛地使用。(AbelevGI，ProvaSD，KhramkovaNI，PostnikovaZA，IrlinIS.Productionofembryonalalphaglobulinbytransplantablemousehepatomas.Transplantation1963；1174-80.和GoldP，FreemanSO.Specificcarcinoembryonicantigensofthehumandigestivesystem.JExpMed1965；122467-8.)。但是，这些肿瘤标志物，包括后来三十多年来所发现的其他肿瘤标志物如beta-绒毛膜促性腺激素(beta-HCG)，前列腺特异性蛋白(PSA)，CA125等等，不仅在癌症病人增高，而且在良性肿瘤患者或其他非肿瘤疾病情况下亦可能增高。如CEA在肠炎，胰腺炎和肝脏疾病，AFP在肝炎，肝硬化，beta-HCG在妊娠，PSA在前列腺肥大，CA125在子宫内膜炎，盆腔炎，胰腺炎和肝脏疾病有时也会增高。因而缺乏高度的肿瘤特异性(KvinnslandS.Serumtumormarkersinclinicalpractice，somegeneralaspects.ScandJClinLabInvest(suppl)1991；2066-11.)。测定这些肿瘤标志物只能作为癌症诊断的辅助手段。进一步讲，要检测到这些肿瘤标志物是否增高也要等到肿瘤长到一定程度后方能达到。所以，测定这些肿瘤标志物是不能作为癌症早期普查方法的(DuffyMJ.Canmolecularmarkersnowbeusedforearlydiagnosisofmalignancy？(Reviews)ClinChem1995；1410-3.)。身体对发生癌变的细胞会产生免疫反应去排斥和消灭这些细胞(GreenbergPDMechanismoftumorimmunology.InBasicandClinicalImmunology.EdtbyStitesDPandTerrAI，7thedition，Appleton&Lange，Norwalk，California.pp588-587.)。身体的免疫反应包括体液免疫和细胞免疫两种。根据大量研究结果证明，癌变的细胞之所以能引起身体免疫反应是因为细胞在癌变的发展和发展过程会才产生一些特异性的肿瘤相关抗原，包括1)癌症-睾丸抗原，2)黑色素细胞分化抗原，3)基因突变产物，4)自身抗原的过量表达和5)引起细胞癌变的病毒抗原(JagerD，JagerE，KnuthA.Immuneresponsetotumorantigensimplicationsforantigenspecificimmunotherapyofcancer.JClinPathol2001；54669-74.)。分析癌症病人对这些肿瘤相关抗原的免疫反应，特别是测定是否存在着抗这些抗原的自身特异性抗体，将为肿瘤的免疫治疗提供清晰的目标。另一方面，因为身体的免疫反应一般都发生在疾病的早期，测定这些自身特异性抗体能够帮助癌症的早期普查和早期诊断，而成为一种肿瘤标志物(TanEM.Autoantibodiesasreportersidentifyingaberrantcellularmechanismsintumorigenesis.JClinInvest2001；1081411-5.)。对测定抗肿瘤自身抗体的研究早在上世纪70年来就开始了。但直到90年代由于分子生物学的发展，多肽合成工艺和测定技术的发展，才有一些进展(CanevariS，PupaSM，MenardS.1975-1995revisedanti-cancerserologicalresponsebiologicalsignificanceandclinicalimplications.AnnOncol1996；7227-32.)。但研究虽多，现今能够应用于临床的仅以测定抗p53的自身抗体一个指标(SoussiT.P53Antibodiesintheseraofpatientswithvarioustypesofcancerareview.CancerRes2000；601777-88.)。p53蛋白是一种抑癌基因的产物，在该基因发生突变后其半衰期延长而积聚在肿瘤组织和血液中，引起身体的免疫系统产生抗p53的自身抗体。测定该自身抗体的肿瘤特异性为96％，但敏感性仅30％(SoussiT.P53Antibodiesintheseraofpatientswithvarioustypesofcancerareview.CancerRes2000；601777-88.)，不能作为临床普查的指标。因此，寻找一种具有高度敏感性能够应用于癌症早期普查的抗肿瘤相关抗原的自身抗体是势在必行。(二)肿瘤抗原的筛选方法用癌症血清学方法进行肿瘤相关抗原的筛选是癌症免疫学研究的一个重要的领域。基本方法有两个一是用肿瘤组织免疫动物，然后用动物的抗血清来筛选肿瘤组织中肿瘤相关抗原(AbelevGI，ProvaSD，KhramkovaNI，PostnikovaZA，IrlinIS.Productionofembryonalalphaglobulinbytransplantablemousehepatomas.Transplantation1963；1174-80.GoldP，FreemanSO.Specificcarcinoembryonicantigensofthehumandigestivesystem.JExpMed1965；122467-8.)。二是把肿瘤组织的RNA提出来，建成cDNA文库。再把cDNA文库在细菌里表达出来。最后用癌症病人的血清来筛选文库中哪些蛋白质能与癌症病人的血清中的自身抗体反应。称之为SEREX(OldLJ，ChenYT.Newpathsinhumancancerserology.JExpMed1998；1871163-7.)。前者不涉及抗肿瘤的自身抗体。后者相当敏感。一次能够筛选出很多肿瘤相关抗原，也涉及抗肿瘤的自身抗体。但这些抗肿瘤的自身抗体能不能作为肿瘤标志物则需进一步的筛选。相当耗时耗力。该方法的另一个缺点是采用细菌表达的重组蛋白，其性质可能与自然蛋白不同。就很难确定用该方法筛选出来的肿瘤相关抗原和抗肿瘤相关抗原的自身抗体的肿瘤特异性。因此有必要发明一种新的肿瘤抗原筛选方法使癌症病人血清中的自身抗体和癌细胞中的自然抗原起反应，便能确定哪一个抗原能引起癌症病人免疫反应。也可直接研究抗该抗原的自身抗体能否用做肿瘤标志物。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种新的肿瘤特异性抗原，采用液相层析分离法结合癌症血清学的抗体捕获酶联免疫测定方法，从癌细胞系和肿瘤组织中分离获得本发明的肿瘤特异性抗原TA48。本发明的另一个目的在于提供一种体外早期诊断癌症的方法。通过测定样本中抗肿瘤特异性抗原TA48的自身抗体的量，而判断肿瘤的发生、发展和预后情况。本发明的再一个目的在于提供肿瘤特异性抗原TA48在肿瘤诊断中的用途，以本发明TA48为抗原，制备测定人血清或组织中抗TA48的自身抗体的量的酶联免疫诊断试剂或试剂盒。根据本发明的一方面，新的肿瘤特异性抗原TA48是从癌细胞系或肿瘤组织中分离并筛选鉴定。采用液相层析方法分离癌细胞株和癌组织的蛋白质，结合癌症血清学的抗体捕获酶联免疫测定方法来筛选肿瘤特异性抗原。用SDS-PAGE和WESTERBLOT的方法初步鉴定了筛选出的一种肿瘤特异性抗原，分子量为48KD，暂时命名为肿瘤抗原48(TA48)。该抗原在所有常见的癌细胞株均见有表达，而在相应的正常组织则不表达或表达低下。在本发明的一个实施方案中，以用离子交换层析经逐步梯度洗脱法将从肿瘤组织或细胞系中提取的蛋白质分离纯化。再用癌症病人血清作为抗血清对分离纯化获得的各分部的蛋白有无能和血清中自身抗体结合的抗原进行筛选。具体方法是将分离纯化的蛋白分别包被在酶标板上，用抗体捕获酶联免疫测定法确定每部收集液有无与癌症病人血清发生免疫反应的抗原。然后将有肿瘤抗原部份合并，用分子截留容器离心浓缩(3000rpm，4℃，30min)。所获得的浓缩肿瘤抗原用SDS-PAGE和WESTERNBLOT方法进行初步鉴定。SDS-PAGE方法用以分析其分子量大小。WESTERNBLOT用癌症病人血清作为特异性自身抗体的抗血清鉴定肿瘤抗原的特异性。在上述分离方法中，将组织匀浆后，离心获得蛋白，经离子交换层析柱分离，所采用的离子交换试剂为阳离子SEPHAROSE试剂。经用PBS膨胀后装拄，用0.005MPBSPH＝7平衡。再将提取的蛋白上柱与离子交换试剂结合。然后用下述的梯度洗脱液逐步分离纯化。洗脱液用分步收集仪收集。洗脱液流速对离子交换层析影响较小。该方法采用3-5ml/min的流速。每步洗脱液的容积为离子交换试剂的10倍。所有的操作均在室温下进行。梯度洗脱液1).0.005MPBS(pH＝7)2).0.028M磷酸二氢钠溶液3).0.05M磷酸二氢钠溶液4).0.175M磷酸二氢钠溶液5).0.3M磷酸二氢钠溶液6).1.0M磷酸二氢钠溶液7).1.0M磷酸溶液每1ml分部收集各洗脱液，测定各洗脱液的蛋白浓度，再将各分部的洗脱液与癌症病人的血清进行酶联免疫反应，确定反应阳性的分部。进一步将有阳性反应的洗脱液分部作SDS-PAGE，并将电泳分离的蛋白转移至醋酸纤维膜，用癌症病人混合血清为“抗血清”做WesternBlot。经测定，在第7步洗脱液的69至71段收集液存在着较强的抗原-抗体反应，Western印渍鉴定其分子量约为48KD。进一步的实验表明，该抗原不仅在乳腺癌细胞表达，也在其他癌组织表达，而在正常组织中其表达量很低，因此是一种具有普遍性的恶性肿瘤特异性抗原，TA48在肿瘤的诊断上具有价值。根据本发明的另一方面，鉴于TA48在肿瘤组织中的特异性，本发明进一步发展了以在待测样本中存在的抗TA48的抗体量为标准，评估肿瘤发生、发展和后的方法。根据本发明的又一方面，以本发明分离的TA48作为抗原，通过酶联免疫法测定血液、体液或组织中抗TA48自身抗体的含量，本发明因而还包括了应用TA48进行肿瘤发生或预后评估的检测试剂。在本发明的一个实施方案中，提供了一种测定血清中抗该肿瘤特异性抗原的自身抗体的酶联免疫测定法。用该检测方法发现血清抗TA48自身抗体(ATA)在所有常见癌症病人比正常健康人群增高。该检测方法有95％的特异性，平均67.6％的敏感性，能够用于各种不同类型癌症的普查。该检测方法是测定身体对癌变的免疫反应。因为对癌症的免疫反应一般都出现在疾病的早期，因此该检测方法能帮助癌症的早期诊断。该检测方法能够帮助癌症病人预后的判断。癌症病人血清ATA增高表明预后较差。本发明通过采用液相层析分离法结合癌症血清学的抗体捕获酶联免疫测定方法，从癌细胞系和肿瘤组织中成功地分离获得了一种新的肿瘤特异性抗原TA48，该抗原在所有常见的癌细胞株均见有表达，而在相应的正常组织则不表达或表达低下。因此本发明建立了以抗TA48的抗体ATA的含量为标准评价肿瘤的发生、发展和预后的检测试剂和检测方法，该检测方法有95％的特异性，平均67.6％的敏感性，能够用于各种不同类型癌症的普查。可早期检测到在肿瘤的发生，并可对肿瘤的发展情况和预后作出评估。具有临床应用的良好前景。图1A示出了MCF-7细胞株细胞裂解上清液经阳离子琼脂糖交换层析后的洗脱曲线和抗体捕获酶联免疫测定方法筛选的结果；用离子交换层析分离培养的乳腺癌细胞株(MCF-7)的细胞裂解液；然后用一个包括各种类型癌症病人的血清池作为“抗血清”，以抗体捕获酶联测定方法来检测每一段层析收集液是否存在着能引起身体产生特异性自身抗体的肿瘤相关抗原。在第69至71段收集液存在着较强的抗原-抗体反应。图1B示出用同样的离子交换层析分离正常的乳腺组织裂解液的结果；离子交换层析分离后用同样的癌症病人的血清池作为“抗血清”，以抗体捕获酶联测定方法来检测每一段层析收集液是否存在着能引起身体产生特异性自身抗体的肿瘤相关抗原。在所有各段收集液中没有发现较强的抗原-抗体反应。图2为分离的肿瘤特异性抗原的Western印渍分析结果；乳腺癌细胞株(MCF-7)的细胞膜提取液以及与癌症病人的血清有较强的抗原-抗体反应的离子交换层析后的细胞裂解液。先用SDS-PAGE分离并转移至醋酸纤维膜上，然后用一个包括各种类型癌症病人的血清池进行抗原-抗体反应。1＝蛋白分子量标准；2＝细胞膜提取液3＝离子交换层析收集液第31段，4＝离子交换层析收集液第38段，5＝离子交换层析收集液第71段。图3为Western印渍分析各种癌细胞株和相应正常组织的细胞裂解液。证明该分离纯化的抗原具有高度的恶性肿瘤特异性。图4为癌症病人血清中抗TA48的自身抗体浓度与正常人比较。(T检验，p＜0.0001)。图5为正常血清ATA浓度与各种不同类型的癌症病人血清ATA浓度的比较。1正常对照，2乳腺癌，3食道癌，4头颈癌，5肝胆癌，6肺癌，7子宫/卵巢癌，8鼻咽癌，9结肠-直肠癌，10胃癌。所有类型的癌症病人血清中的ATA值均有显著性地高于正常人血清ATA值(秩和方差分析H＝111，P＜0.001)。SerumATAConcentrations(unit/ml)血清ATA浓度；ATAcutoffvalueATA参考值。图6为本发明试剂盒的ATA酶联免疫测定标准曲线；图7为本发明试剂盒的抗人抗体稀释试验结果具体实施方式下面结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明但并不限制本发明。实施例1细胞株特异性肿瘤抗原的分离纯化和筛选材料和方法(1)乳腺癌细胞株(MCF-7)培养MCF-7细胞株购自美国ATCC，储存于液氮。培养时，37℃迅速解冻细胞，用10％FCS的RPMI1640培养基在培养皿中，37℃，5％CO2培养，直至细胞长满。培养中每三天更换一次培养基。(2)细胞裂解和组织匀浆细胞长满后吸去培养基，各加1ml裂解液(0.5％NP40，0.15MNaCl，5mMEDTA，50mMTris，1mMPMSF)。细胞裂解物转至1.5ml离心管，4℃，12000rpm离心30分钟，合并上清。将正常的组织在裂解液用组织匀浆器匀浆。然后4℃，12000rpm离心30分钟，合并上清。(3)离子交换层析分离肿瘤抗原将阳离子琼脂糖SEPHAROSE交换层析试剂装入2.5×11cm的层析柱，试剂体积2毫升。用20ml0.05MPBSPH＝7离子交换缓冲液进行柱平衡。再将细胞裂解上清液或组织匀浆上清液上柱。室温下用离子交换缓冲液梯度洗脱，梯度洗脱液为1).0.005MPBS(pH＝7)2).0.028M磷酸二氢钠溶液3).0.05M磷酸二氢钠溶液4).0.175M磷酸二氢钠溶液5).0.3M磷酸二氢钠溶液6).1.0M磷酸二氢钠溶液7).1.0M磷酸溶液每1ml分部收集各洗脱液。测定各洗脱液的蛋白浓度。(4)肿瘤抗原的筛选将收集的各洗脱液的蛋白包被到酶标板上，10μg/ml，每孔50μl，4C过夜。然后将包被的酶标板作封闭处理。加入1∶100的癌症病人的混合血清，每孔50μl，室温下孵化1小时。洗板4次后，加入1∶10000的抗人抗体-HRP复合物，室温下孵化1小时。再次洗板4次后，加入TMB显色。(5)肿瘤抗原的鉴定将有阳性反应的洗脱液作SDS-PAGE，并将电泳分离的蛋白转移至醋酸纤维膜，用癌症病人混合血清为“抗血清”做WesternBlot。(6)纯化将洗脱液用过滤离心浓缩。再将浓缩的洗脱液经分子筛层析柱进一步纯化。测定蛋白质浓度，贮存于液氮备用。结果用酶联免疫测定的间接法证明在癌细胞的细胞内蛋白提取液中有与癌症人血清中自身抗体反应的抗原(表1)。表1酶联免疫测定法证明癌细胞存在着与癌症病人血清反应的肿瘤抗原。图1A显示MCF-7细胞株细胞裂解上清液经阳离子琼脂糖交换层析后的洗脱曲线和抗体捕获酶联免疫测定方法筛选的结果。在第7步洗脱液的69至71段收集液存在着较强的抗原-抗体反应。图1B显示用同样的离子交换层析分离正常的乳腺组织裂解液；然后用同样的癌症病人的血清池作为“抗血清”，以抗体捕获酶联测定方法来检测每一段层析收集液是否存在着能引起身体产生特异性自身抗体的肿瘤相关抗原。在所有各段收集液中没有发现较强的抗原-抗体反应。Western印渍鉴定乳腺癌细胞株(MCF-7)的细胞膜提取液以及与癌症病人的血清有较强的抗原-抗体反应的离子交换层析后的细胞裂解液结果见图2。初步鉴定该肿瘤抗原为一种分子量为48kD的蛋白质。暂时命名为肿瘤抗原48(TumorAntigen48或TA48)。讨论上述结果证明采用离子交换层析分离纯化癌细胞株或癌组织蛋白，然后用癌症病人混合血清，以抗体捕获酶联免疫测定方法筛选层析洗脱液中有无肿瘤特异性抗原是一种有效的肿瘤特异性抗原筛选方法。用该方法如果能在癌组织发现有与癌症病人血清发生免疫反应的蛋白而在相应的正常组织无表达或表达低下，便可证明该蛋白是一种肿瘤相关抗原。在本研究用阳离子琼脂糖交换层析试剂从乳腺癌细胞株MCF-7至少分离出一种能与癌症病人血清发生特异性免疫反应的抗原。该抗原正常的乳腺组织则不表达或表达低下。证明该抗原可能是具有乳腺癌组织特异性的抗原。WESTERNBLOT进一步分析证明为分子量为48KD的蛋白质。该蛋白质能与异体的癌症病人混合血清发生反应以及在其他种类的癌细胞株也发现表达(图3)，表明该抗原可能不仅在乳腺癌细胞表达，也在其他癌组织表达，是一种具有普遍性的恶性肿瘤特异性抗原。实施例2抗TA48自身抗体(Anti-TA48Autoantibody，ATA)是具有高度肿瘤特异性并普遍存在于各种常见癌症病人的肿瘤标志物材料和方法(1)病人和对照本研究共收集了各种癌症病人血清94例.其中有25例患有结肠癌，17例肺癌，11例食道癌，8例胃癌，9例子宫/卵巢癌，7例乳腺癌，6例肝癌，3例前列腺癌和9例其他癌症。这些癌症病人56例为男性，38例女性，年龄26-87岁。同时收集了94例健康人的血清作为对照。(2)测定方法将纯化TA48蛋白质包被在酶标板上，4℃过夜。洗涤两次后对包被的酶标板作封闭处理。然后加入1∶100稀释的血清样品，在室温下孵化1小时，让血清中抗TA48的特异性自身抗体与TA48结合。洗涤4次后，再加入1∶10000的抗人抗体HRP复合物，室温下孵化1小时。结合到TA48的特异性自身抗体通过的抗人抗体HRP复合物的HRP催化酶底物显色。显色程度与血清中与TA48特异性结合的自身抗体(ATA)浓度相关。ATA浓度则通过与标准血清比较计算确定。(3)统计方法用检验比较癌症病人与健康对照血清ATA浓度的差异。结果正常对照组和各种类型的癌症病人血清ATA浓度见表1。癌症病人血清中平均抗TA48的抗体浓度明显高于正常人(癌症病人平均为1.88unit/ml，正常对照组为1.14unit/ml)，统计学处理有极显著性的意义。(T检验，p＜0.0001，图4＝从表1还可见除白血病外，所有癌症病人血清中抗TA48的抗体均高于正常对照组。表2、正常人与各种癌症病人血清ATA浓度的比较。癌症例数ATA中位数范围(25-75％)正常对照941.140.97-1.88结肠-直肠癌252.161.83-2.20食道癌111.891.64-2.08胃癌82.702.00-3.53肝癌62.642.2.17-3.08胰腺癌11.771.77卵巢/子宫癌91.981.61-2.27乳腺癌72.271.64-3.05肺癌172,191.77-2.82前列腺癌32.702.48-2.90甲状腺癌22.801.56-4.04头颈癌12.702.70白血病41.581.82-1.94讨论从实施例1的研究结果可以肯定癌症病人的免疫系统对TA48产生抗该抗原的特异性自身抗体。本实验则证明该抗体浓度在所有常见类型的癌症病人比正常健康对照增高。一方面进一步间接证明TA48是一种可能在所有常见的癌症组织都出现表达或表达增高的肿瘤特异性抗原，另一方面表明测定血清中该自身抗体的变化有可能作为一种肿瘤标志物。因为一般来讲，身体的免疫反应可能会出现在疾病的临床症状之前。又因为酶联免疫测定法是一种灵敏和特异的方法，检测抗肿瘤特异性抗原的自身抗体有可能用于癌症的早期诊断和普查。检测血清中自身抗体变化在一定程度上能反应癌症病人身体免疫系统的变化，有可能帮助对病人的预后作出较为准确的判断和对病人的化疗和放疗进行监测。但临床应用测定的方法需要有较高的临床特异性和敏感性。也就是说检测的假阳性较低，真阳性率要高。因此需要大样本的临床实验来证明测定抗TA48的自身抗体是否可作为一种临床应用的肿瘤标志物。实施例3ATAELISA试剂盒的临床应用材料和方法(1)测试对象收集744例健康人血清样品作为该临床研究正常对照。这些正常人中男性有561例，年龄从17-82岁，平均28岁；女性有182例，年龄从17-70岁，平均28岁。有833例各种类型的癌症病人，172例良性肿瘤病人或其他非肿瘤病人，共计1005例参加了这项临床研究。(2)测定方法一、试剂盒组成二、检测方法和步骤1.样品处理取病人全血2ml室温(25℃)离心800转20分钟。分离血浆(或血清)，当日稀释测定或-20℃储存备用。2.ELISA操作步骤●阴性对照，标准血清和病人血清(血浆)用样品稀释液100倍；阳性对照稀释10倍●在96孔包被板中以复管方式分别加入阴性对照稀释样品，阳性对照稀释样品，标准血清和病人稀释样品，每孔100μl●室温25℃摇震1小时●用双蒸水稀释20x洗涤液为洗涤工作液稀释20倍，用洗涤工作液洗板4次●抗人抗体-HRP复合物用样品工作液稀释成1∶10000●向每孔加稀释抗人抗体-HRP复合物100μl●室温25℃摇震1小时●用洗涤工作液洗板4次●依次加入TMBA液和B液各一滴(50ul)，室温25℃显色10分钟●每孔加终止液50μl，终止显色反应●以450nm波长，630nm参考波长在酶标仪上读取ELISA结果3.质量控制●每次测定时应做阴性，阳性对照和标准血清测定，以便对所有试剂和操作做出评价●为了得到有效的测定结果，须满足下列要求1)阳性对照的光密度值＞0.2，而阴性对照值＜0.22)标准血清的光密度应大于阴性对照两倍以上4.结果计算先计算各复管测定值的平均光密度，然后计算各样品中ATA的浓度。即样品O.D值除以ATAELISA标准血清的平均O.D值，将结果乘以标准血清的标定值(1.68U/ml)样品值(U/ml)＝(样品O.D/ATA标准血清O.D)×2.55-0.51(U/ml)5.本方法测定ATA参考值正常人参考值为0.3-1.42，平均值为1.326.注意事项1)采样应当日分离血清(或血浆)。如不当日测定样品应储存于-20℃2)准确加入阴阳性对照稀释样品，标准血清和病人稀释样品3)使用前配置TMB工作液4)每次显色时间应严格定为10分钟三、试剂盒各组成成分的来源和制备1、特异性肿瘤抗原TA48按照实施例1的方法制备并鉴定2、标准血清制备将一癌症病人的混合血清中的抗TA48的特异性自身抗体经用纯化的TA48制备的亲和层析柱分离纯化。然后测定其蛋白浓度。以纯化的抗TA48自身抗体为标准，用酶联免疫间接法鉴定另一癌症病人混合血清内抗TA48自身抗体的滴度，然后作为试剂盒的标准血清(图6)。3、阳性对照和阴性对照样品的制备●根据测定的若干ATA为阳性的癌症病人血清样品混合配制成阳性对照血清。除菌过滤后储存-20度。●根据测定的若干ATA为阴性的正常健康人血清混合配制成阴性对照血清。除菌过滤后储存-20度。4、抗人抗体-辣根过氧化酶复合物购至美国Sigma公司。将其稀释成不同浓度用以测定，结果发现稀释度1∶10000便可得到理想的结果(图7)5、其他试剂包被微孔板(条)选择选择GreinerLabortechnik公司(德国)生产的酶标板。该酶标板具有结合力高(结合度＝600ng/cm2)，背景低和板内孔间误差低的优点。TMBA液PH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液配制的过氧化氢溶液B液用二甲桠枫配制TMB洗涤液0.01MPBS/0.5％tweenPH7.2样品稀释液1％Caseinin0.01MPBSPH7.2终止液1MHCl(3)统计方法在分析时，首先按癌症的类型分类，将各种类型癌症病人的ATA值与正常值比较，以确定血清ATA的浓度在患癌症时是否有显著性的变化；是否检测血清中的ATA可用作一个新的肿瘤标志物。并根据参考值计算各种类型癌症病人ATA阳性检出率，以确定ATA酶联免疫测定试剂盒的敏感性。同时也将非癌症的病人按病情分类，计算其ATA阳性出现率，以确定该试剂盒的特异性。再结合其特异性和敏感性分析该试剂盒是否可用于癌症的普查和诊断。最后提取相关的临床病历，将测定的数据与病历记录中的相关指标进行统计学分析，以确定该项测定是否能用于癌症的预后判断和治疗指导。结果(1)正常男性血清ATA平均浓度为1.11unit/ml，而女性为1.16unit/ml。在统计学上有显著性差异(次和T检验，T＝75595，p＝0.002)，即正常女性血清中ATA的.浓度略高于男性。从年龄来讲17-25岁的ATA平均值为1.14unit/ml；26-30岁为1.139unit/ml；31-40岁为1.102unit/ml；41-50岁为1.097unit/ml；大于50岁为1.075unit/ml，有随年龄增加而降低的趋势。统计学处理有显著性意义(方差分析，F＝2.735，p＝0.019)。整个正常人血清ATA值为正态分布。因此，取95％上限值为参考值，高于参考值视为阳性。(2)各种类型的癌症病人血清ATA的中位值均显著性地高于正常人群的血清ATA值(秩和方差分析H＝111，P＜0.001)。说明血清ATA浓度在癌症病人的增高是肿瘤病理学里的一个普遍现象(图5)。(3)各类癌症病人血清ATA的阳性检出率从57.1％到81.3％，均具有显著的统计学意义(卡方检验p＜0.001)。在常见的癌症肺癌阳性检出率为65.4％，肝癌为72.5％，胃癌为69.6％，食道癌为65.2％，结肠-直肠癌为65.9％，乳腺癌为58.2％，鼻咽癌为70.9％和卵巢/子宫癌为62.3％，说明该测定方法有较高的敏感性(表3)。表3检测血清ATA与同时检测ATA和生存素癌症阳性检出率的比较例数ATA癌症阳性检出率癌症乳腺癌6958.2％食道癌11165.2％头颈癌1972.2％喉癌1681.3％肝胆癌3972.5％肺癌16565.4％淋巴瘤3957.1％子宫/卵巢癌7967.5％鼻咽癌6370.9％结肠-直肠癌9565.9％胃癌5669.6％其它生殖/泌尿系统癌2663.0％其它肿瘤5663.0％(4)在正常对照组，高于1.32参考值的为5％，在良性肿瘤和非肿瘤的其他疾病的血清ATA阳性出现率为5.1％。也就是说该测定方法具有很高的肿瘤特异性(95％)。(5)在肺癌，有癌转移的病人其血清ATA阳性检出率为72.5％，而无转移的为58％，统计学上有显著性意义(卡方检验，χ2＝4.15，P＝0.0417)。(6)在乳腺癌，有癌细胞侵润的病例有96.9％血清ATA为阳性，有转移的为60％，有复发的为60％.而三者皆无的为48％.统计学上有显著差异(卡方检验χ，2＝8.00，P＝0.0461)。(7)在胃癌，有癌转移或有复发的病例其血清ATA的阳性率均为83.3％，其余为56％，统计学上有显著差异(卡方检验χ2＝4.43，P＝0.0353)。(8)在结肠-直肠癌，有复发的病人血清ATA阳性检出率为87％，而无复发的为67％，有显著的统计学意义(卡方检验χ2＝4.15，P＝0.0415)。(9)在临床追踪的病人中有24例死亡，45例好转出院。死亡病人的ATA平均值为1.516，而好转出院病人为1.28，统计学上有显著性差异(次和T检验，T＝1009，p＝0.034)。死亡病人的ATA阳性检出率为58.3％，而好转出院病人的阳性率为28.8％，统计学上有显著性差异(卡方检验，χ2＝9.528，p＝0.033)。讨论从上述研究的结果可得到如下结论(1)血清中抗TA48肿瘤相关抗原的自身抗体在各种类型的癌症病人都较正常人群和其他非癌症病人显著性地增高，因此，测定该特异性自身抗体能作为一个广泛应用的新肿瘤标志物。(2)ATA酶联免疫测定试剂盒其特异性为95％，敏感性从57.1％到81.3％，平均为67.6％。因此，能帮助癌症的诊断。又因为身体免疫系统对癌变细胞相关抗原的反应一般发生在疾病的早期，也就是说血清抗肿瘤相关抗原特异性自身抗体浓度增高会先于临床症状出现。因此，测定血清中ATA的变化能用于癌症的普查。(3)ATA的阳性检出率与肺癌病人有无癌转移，乳腺癌病人有无癌细胞侵润.，癌转移和有无复发，胃癌病人有无癌转移或复发，以及结肠-直肠癌病人有无复发密切相关。因此，检测血清ATA能帮助这些癌症病人预后的判断和治疗的指导。(4)血清ATA的浓度和阳性率与癌症病人的生存率密切相关。因此测定ATA能作为癌症病人预后一个相当重要的指标。本发明不限于以上实施方式，本领域技术人员可以根据本发明的描述作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。权利要求1.一种肿瘤特异性抗原，其特征在于它由以下方法制备a)将癌细胞系或肿瘤组织进行细胞裂解并匀浆，离心取上清液；b)获得的上清液经离子交换层析柱分离，梯度洗脱并分步收集洗脱的蛋白部分；c)将分步收集的每一分部的洗脱液与癌症病人的血清进行酶联免疫反应，确定反应呈阳性的分部；d)将有阳性反应的分部进行进一步纯化和鉴定，获得肿瘤特异性抗原。2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性抗原，其特征在于步骤a)中所述癌细胞系为乳腺癌细胞株MCF-7；所述细胞裂解和匀浆在0.5％NP40，0.15MNaCl，5mMEDTA，50mMTris，1mMPMSF溶液中进行，12000rpm离心30分钟。3.根据权利要求1所述的肿瘤特异性抗原，其特征在于步骤b)中所述离子交换层析柱的离子交换试剂为阳离子琼脂糖SEPHAROSE，层析柱大小为2.5×11cm，所述离子交换试剂体积2毫升；用20ml0.05MPBSPH＝7离子交换缓冲液进行柱平衡；再将细胞裂解上清液或组织匀浆上清液上柱后，室温下用离子交换缓冲液梯度洗脱，洗脱液用分步收集仪收集，每步洗脱液的容积为所述离子交换试剂的10倍，所有的操作均在室温下进行；所述每步梯度洗脱液组成为1).0.005MPBS(pH＝7)2).0.028M磷酸二氢钠溶液3).0.05M磷酸二氢钠溶液4).0.175M磷酸二氢钠溶液5).0.3M磷酸二氢钠溶液6).1.0M磷酸二氢钠溶液7).1.0M磷酸溶液在分步收集中每1ml分部收集洗脱液。4.根据权利要求1所述的肿瘤特异性抗原，其特征在于所述肿瘤特异性抗原存在于第7步洗脱液的69至71段收集液。5.根据权利要求4所述的肿瘤特异性抗原，其特征在于所述肿瘤特异性抗原的分子量约为48KD，命名为TA48。6.一种检测方法，包括下述步骤测定待测样本中抗TA48特异性肿瘤抗原的抗体的含量；以所测定的样本中的抗TA48抗体量的高低评估提供待测样本个体的肿瘤发生、发展或预后情况。7.根据权利要求所述的检测方法，其中所述测定抗体含量的方法为酶联免疫法。8.含有权利要求1所述的肿瘤特异性抗原的诊断试剂。9.一种诊断试剂盒，包括下述组成一反应载体，为经肿瘤特异性抗原TA48包被的微孔板；一阴性对照，由测定的若干抗TA48抗体为阴性的正常健康人血清混合配制成；一阳性对照，由根据测定的若干抗TA48抗体为阳性的癌症病人血清样品混合配制成；标准血清，为已知抗TA48抗体滴度的癌症病人血清；以及酶联免疫反应所需的酶反应底物和试剂。全文摘要本发明涉及一种新的肿瘤特异性抗原TA48，采用液相层析分离法结合癌症血清学的抗体捕获酶联免疫测定方法，从癌细胞系和肿瘤组织中分离获得。该抗原在所有常见的癌细胞株均有表达，而在相应的正常组织则不表达或表达低下。本发明还提供一种体外早期诊断癌症的方法。通过测定样本中抗肿瘤特异性抗原TA48的自身抗体的量，而判断肿瘤的发生、发展和预后情况。该检测方法有95％的特异性，平均67.6％的敏感性，能够用于各种不同类型癌症的普查。可早期检测到在肿瘤的发生，并可对肿瘤的发展情况和预后作出评估。具有临床应用的良好前景。文档编号C07K14/435GK1657538SQ20041002184公开日2005年8月24日申请日期2004年2月17日优先权日2004年2月17日发明者叶尚勉,叶尚蓉申请人:叶尚勉,叶尚蓉