专利名称：一种高效分离制备高纯度紫杉醇半合成前体的方法
技术领域：
本发明涉及紫杉醇半合成前体的分离方法。
背景技术：
紫杉醇(Taxol)是60年代美国化学家Wall和Wani首先从太平洋紫杉(短叶红豆杉Taxus brevifolia)树皮中分离出的一种天然二萜类化合物。它由四个环组成，分子中具有11个手性中心和多个取代基团，在13位羟基上还带有一个氨基醇类的侧链，其化学式如式1所示。
式1由于紫杉醇是一种高效细胞毒素，具有抑制癌细胞的生物活性，且作用机理与一般抗癌药物不同，近年来倍受药物化学领域的关注，并且作为一种疗效显著的抗癌药物在临床上的使用越来越广泛。但是目前紫杉醇仅靠从红豆杉树皮中提取，不仅含量较低，仅约0.01％，每提取1kg紫杉醇就要砍伐1000～2000棵树，且红豆杉生长较缓慢，资源有限，即便将全部天然资源采伐，也只能满足短期需要。因此，人们长期以来一直在研究获取紫杉醇的其它途径。概括起来，大致有以下四种途径①全合成紫杉醇结构复杂，母核中有9个手性中心，侧链有2个手性中心，因此应有2048个非对应异构体，它的合成对有机化学家是一种挑战。虽然经过20多年的努力全合成最终获得了成功，并具有很重要的学术价值，但是由于合成路线复杂，步骤烦琐，大约有30多步，因此目前用全合成的方法提供药源不太可能。②组织培养该方法是一个有前途的方法。但总的来说，组织培养法还处于研究开发阶段，要实现工业生产关键在于想办法提高细胞产率。③真菌发酵在附生于红豆杉树皮的真菌中发现紫杉醇，是近年来紫杉醇研究的重要进展。就目前的技术水平而言，从真菌培养液中仅能获得纳克级的紫杉醇，若要达到商业生产，必须达到毫克级水平。因此，若干技术问题尚需解决。④半合成法紫杉醇的半合成主要是将红豆杉植物中的紫杉烷成分进行结构改造，得到紫杉醇或具有生物活性的紫杉醇衍生物。较为成功的即是以如式2所示的10-deacetylbaccatinIII(又简称为“10-DAB”)为前体进行的紫杉醇半合成首先将10-deacetylbaccatinIII的C7位羟基保护，C10位羟基乙酰化；再在C13位羟基上引入被保护的侧链；最后水解去除侧链上的保护基和C7位上的保护基而得到紫杉醇。
式2 10-deacetylbaccatinIII在多种红豆杉植物的可再生枝叶中含量较高，具有紫杉烷的基本母核，作为半合成前体是非常适合的。普遍认为半合成方法最有希望在不久的将来批量生产，从而缓解紫杉醇资源紧张，以至最终将替代现有植物提取方法。另外，利用半合成方法，还可以对紫杉醇及其衍生物进行化学修饰，使其具有更好的制剂性和生物活性。
作为紫杉醇半合成前体，近年来有关10-deacetylbaccatinIII的分离方法的研究也倍受科学家的关注。如法国Rhone-Poulenc Rorer的Margraff R.等报导了用水处理紫杉的适用部位后，得到的水溶液再用适当的有机溶剂萃取，然后选择性结晶得到75％-90％HPLC纯度的10-deacetylbaccatinIII，或用甲醇对该植物进行提取，然后以一定比例的甲醇/水对萃取物处理，最后通过选择性结晶得到75％-93％HPLC纯度的10-deacetylbaccatinIII，该方法较为简单，但是得到的目标产物纯度有限。除此之外，其它报导大都采用柱色谱分离方法，如硅胶柱等，最后以制备HPLC为精制手段。且绝大部分都以紫杉醇为分离对象，10-deacetylbaccatinIII是在预先去除紫杉醇后经进一步分离得到的副产品，所用原料主要为紫杉树皮，所以有些条件并不适合从紫杉枝叶中直接分离提取10-deacetylbaccatinIII。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效分离制备高纯度紫杉醇半合成前体的方法，可以用于从紫杉枝叶的提取物中直接分离制备10-deacetylbaccatinIII。
请参考图1，为实现上述目的，本发明采取以下方案A.拌样将紫杉枝叶的提取物用甲醇溶解，与纤维素拌样，拌样均匀后挥干溶剂，碾磨均匀；B.用C8柱填料填充层析柱层析，用氮气瓶加压，体积百分比为30-50％的乙腈水溶液洗脱，用馏分收集器收集各馏分；C.将含有10-DAB的级分合并，浓缩后，用步骤A的方法再次拌样；D.用C18柱填料填充层析柱层析，用氮气瓶加压，体积百分比为20-30％的乙腈水溶液洗脱，用馏分收集器收集各馏分；E.将含有10-DAB的级分合并、减压浓缩、真空干燥后，用高速逆流色谱进行进一步地分离，根据紫外检测器谱峰，收集目标级分；在本步骤中，优选卤代烃-脂肪醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱分离；其中，卤代烃可以是氯仿、二氯甲烷或四氯化碳，最优选为氯仿；脂肪醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇，最优选为甲醇。
必要时溶剂体系中还可以含有正己烷。
进行高速逆流色谱分离时，洗脱方式是上相为固定相，下相为流动相的正向洗脱方式。
F.目标级分经浓缩干燥后，用乙腈或甲醇重结晶即可得到高纯度的10-DAB单体。
在步骤B和D中，优选粒径在30-80μm之间的C8柱和C18柱。
本发明的优点是该方法步骤简单，效率高，易于重复。高效液相色谱分析表明，采用该方法分离制备的10-deacetylbaccatinIII纯度可达99％以上。
图1为本发明的工艺流程2为实施例1中经过C8柱后的1#样的HPLC图。
图3为实施例1中经过C18柱后的2#样的HPLC图。
图4为10-DAB标准参考物的定量工作曲线。
图5为实施例2中经过二次柱分离后所得2#样的HSCCC分离谱图。
图6为实施例2中经HSCCC分离得到的含10-DAB部分(3#样)的HPLC分析谱图。
图7为实施例3中3#样一次重结晶得到的10-DAB结晶的HPLC分析图。
图8为实施例3中3#样一次重结晶母液的HPLC分析图。
图9为实施例3中二次重结晶得到的10-DAB结晶的HPLC图。
具体实施例方式
实施例1紫杉枝叶醇提物的二次柱层析分离将紫杉枝叶的提取物用甲醇溶解，与纤维素拌样，拌样均匀后挥干溶剂，碾磨均匀；由于醇提物粗样成分比较复杂，采用了两步柱分离过程，用氮气瓶加压，第一步用C8柱和45％(v/v)乙腈水溶液洗脱，第二步采用C18柱和25％(v/v)乙腈水溶液洗脱，用HPLC对分离过程进行监控，收集目标级分，浓缩干燥，并用参考物对其中10-DAB含量进行定量分析。
40g粗样经过第一个C8柱后，平均可得约10g含10-DAB样；合并四次所得共得约40g样(1#样)。再经过第二个C18柱分离后，平均可得约15g含10-DAB样(2#样)。图2和图3分别为1#样和2#样的HPLC分析谱图，图4为10-DAB标准参考物的定量工作曲线。经定量分析，1号样含10-DAB约0.57％，2#样含10-DAB约1.5％。
实施例2柱层析分离后含10-DAB级分的高速逆流色谱纯化如图3所示，经过两次柱净化过的样品仍然相当复杂，其中10-DAB含量也只有百分之一左右。此时，可以用柱子继续纯化下去，但是考虑到其纯化效率较低，不过C18柱后样品中10-DAB含量仅比过柱前提高约2.5倍。因此，接下来采用高速逆流色谱纯化。
此时，所用溶剂体系为正己烷-氯仿-甲醇-水(15∶35∶17∶8)。图5为其中一个500mg样品的分离谱图。图6给出了逆流色谱纯化得到的含10-DAB部分(3#样)的HPLC分析谱图。经定量分析，经过HSCCC纯化可平均得到含10-DAB约24％的纯化样。可以看出，其纯化效率要比柱色谱高的多。
实施例3含10-DAB样品的最终重结晶经HSCCC纯化后，10-DAB含量有了明显提高。经试验发现，乙腈重结晶可以起到惊人的纯化效果，经HSCCC纯化后的样品经一次或两次重结晶即可得到高纯度的10-DAB。图7和图8分别为3#样经重结晶得到的10-DAB结晶和母液的HPLC分析图。可以看出，绝大部分干扰物都留在了母液里。图9为经二次结晶最终得到的高纯度10-DAB的HPLC维分析图。定量分析表明，其纯度可达99％以上。
为了确认所得产物为10-DAB，对上述结晶粉末进行了快原子轰击质谱FAB-MS，氢谱1HNMR，碳谱13CNMR和KBr红外IR谱鉴定。
质谱鉴定说明所得产物的分子量为544，与10-DAB分子量相同。
氢谱鉴定结果显示，δ(CDCl3)8.09(2H，dd，J＝1.8，8，OBz)，7.61(1H，m，J＝1.2，7.3，OBz)，7.48(2H，t，J＝7.6，OBz)，5.64(1H，d，J＝6.7，2-H)，5.25(1H，s，10-H)，4.98(1H，dd，J＝1.8，9.8，5-H)，4.89(1H，t，J＝7.3，13-H)，4.32(1H，d，J＝8，20-H)，4.28(1H，m，7-H)，4.17(1H，d，J＝8，20-H)，4.01(1H，d，J＝6.7，3-H)，2.62(1H，m，6-αH)，2.29(3H，s，OAc)，2.27(2H，m，14-αH，14-βH)，2.07(3H，d，J＝1.2，18-CH3)，1.83(1H，m，6-βH)，1.74(3H，s，19-CH3)，1.09(6H，s，16-CH3，17-CH3)。这些数据与文献报道的10-DAB数据基本一致。δ为2.0的最高峰为包夹在结晶中的乙腈CH3CN上质子。
13CNMR分析结果表明，除了δ为77.0和39.5的峰分别为氘代试剂CDCl3和DMSO中C外，δ为211ppm的峰为分子中唯一的酮基，160～170ppm之间的两峰为两个酯基，150～130ppm之间的七个峰代表九个不饱和o，其中两个双键C，六个苯环C，还有一个CH3CN的叁键C。其它十八个为饱和C。共二十九个C与10-DAB相符。
红外谱图显示，在3444cm-1和1706cm-1两处有强吸收。
以上结构鉴定数据均证实，所得到的产物确为10-deacetylbaccatinIII。
权利要求
1.一种紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于以乙腈和水的混合物为流动相，先采用C8柱、然后采用C18柱，对紫杉枝叶的提取物进行两次粗分离；然后对粗分离后的目标级分采用高速逆流色谱进行进一步分离和纯化；最后采用重结晶的方法进行精制，得到高纯度的10-DAB。
2.根据权利要求1所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于，由以下步骤组成A.拌样将紫杉枝叶的提取物用甲醇溶解，与纤维素拌样，拌样均匀后挥干溶剂，碾磨均匀；B.用C8柱填料填充层析柱层析，用氮气瓶加压，体积百分比为30-50％的乙腈水溶液洗脱，用馏分收集器收集各馏分；C.将含有10-DAB的级分合并，浓缩后，用步骤A的方法再次拌样；D.用C18柱填料填充层析柱层析，用氮气瓶加压，体积百分比为30-50％的乙腈水溶液洗脱，用馏分收集器收集各馏分；E.将含有10-DAB的级分合并、减压浓缩、真空干燥后，用高速逆流色谱进行进一步地分离，根据紫外检测器谱峰，收集目标级分；F.目标级分经浓缩干燥后，用重结晶的方法进行精制，即可得到高纯度的10-DAB单体。
3.根据权利要求2所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于所述的C8柱和C18柱的粒径在30-80μm之间。
4.根据权利要求2所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于所述的步骤E中，优选卤代烃-脂肪醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱分离；其中，卤代烃可以是氯仿、二氯甲烷或四氯化碳；脂肪醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇。
5.根据权利要求4所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于所述的步骤E中，用氯仿-甲醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱分离。
6.根据权利要求4或5所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于溶剂体系中还含有正己烷。
7.根据权利要求2所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于所述的步骤E中，进行高速逆流色谱分离时，其洗脱方式是上相为固定相，下相为流动相的正向洗脱方式。
8.根据权利要求2所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于所述的步骤F中，采用乙腈或甲醇进行重结晶。
9.根据权利要求2所述的紫杉醇半合成前体10-DAB的分离方法，其特征在于所述的步骤F中，采用乙腈进行重结晶。
全文摘要
本发明公开了一种高效分离制备高纯度紫杉醇半合成前体的方法。以乙腈和水的混合物为流动相，先采用C
文档编号C07D305/00GK1560042SQ20041000697
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月3日 优先权日2004年3月3日
发明者曹学丽, 田宇, 董银卯, 赵华, 陆辛玫 申请人:北京工商大学