专利名称：以商业规模制造t-20和t-1249肽的方法，和与其相关的t-20和t-1249组合物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及在固相合成中使用官能化低空隙空间聚合物树脂作为载体，制造T-20，T-1249，T-20类肽，和T-1249类肽的方法。
在本领域显著需要以商业规模制造上述肽的方法。尽管已知试验室规模下的各种技术，这些技术具有各种缺点。这些缺点包括高循环时间，昂贵试剂的浪费使用，规模下的收率差，规模下的负载效率差，规模下高容量昂贵溶剂的使用，再偶联(recouple)的需要，和规模下的纯度差。此外，降低循环时间或过量昂贵试剂的尝试导致更低的产物收率和纯度以及所要求的增加的再偶联。已经尝试循环本领域中已发现的常规CTC树脂(Harre等，反应性和官能聚合物(Reactive andFunctional Polymers)41(1999)111-114)。然而，由于采用现有技术树脂存在严重问题，这些尝试失败了。现有技术的树脂受损于聚合物的物理降解。
本发明的目的是解决面向本领域的这些和其它问题，和提供可以制造商业有用数量的T-20，和T-1249的方法。
发明概述在一个方面，本发明涉及制备T-20或T-1249组合物，或T-20或T-1249组合物片段的改进方法。改进包括使用非必要地负载氨基酸或氨基酸衍生物的低空隙空间树脂，以产生一个或多个T-20或T-1249片段。
在另一方面，该方法每当量增长肽链使用1.5当量氨基酸。
在仍然进一步的方面，制备T-20或T-1249组合物，或T-20或T-1249组合物片段的改进方法包括提供约15分钟-约30分钟的循环时间，和获得大于由常规方法获得的氨基酸负载效率。
在仍然进一步的方面，该方法包括循环低空隙空间树脂。
在仍然进一步的方面，本发明提供含有大于约10种或约15种氨基酸的T-20或T-1249片段的制备方法，其中该方法没有或基本没有再偶联物并使用基本更低数量的试剂。
在仍然另一个变化方案中，本发明提供一种T-20或T-1249组合物，其中一个或多个T-20或T-1249片段由在此所述的方法制备。
在仍然另一个方面，改进方法包括使用含有偏向树脂表面的官能度的树脂。在仍然另一个方面，改进方法包括使用含有偏向低空隙空间树脂表面的官能度的低空隙空间树脂。
本发明的这些和其它目的在说明书的其余部分中描述，包括但不限于发明详述。
发明详述本发明涉及制备T-20或T-1249组合物，或T-20或T-1249组合物片段的改进方法。该改进包括使用低空隙空间树脂和/或含有表面偏向官能度的树脂。该树脂非必要地负载氨基酸或氨基酸衍生物，以产生一个或多个T-20或T-1249片段。
可以与本发明中所述树脂一起使用，和负载在此处所述树脂上的例示“氨基酸”是由NH2--CHR--COOH表示的化合物，其中R是H、脂族基团、取代的脂族基团、芳族基团或取代的芳族基团。在自然界中发现“天然存在的氨基酸”。例子包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸。R是氨基酸的侧链。天然存在的氨基酸侧链的例子包括甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、仲丁基(异亮氨酸)、--CH2CH(--CH)2(亮氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、对羟基苄基(酪氨酸)、--CH2OH(丝氨酸)、--CHOHCH3(苏氨酸)、--CH2-3-吲哚基(色氨酸)、--CH2COOH(天冬氨酸)、--CH2CH2COOH(谷氨酸)、--CH2C(O)NH2(天冬酰胺)、--CH2CH2C(O)NH2(谷氨酰胺)、--CH2SH(半胱氨酸)、CH2CH2SCH3(蛋氨酸)、--(CH2)4NH2(赖氨酸)、--(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-[(CH)2]4NHC(.-dbd.NH)NH2(精氨酸)和--CH2-3-咪唑基(组氨酸)。丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸的侧链是脂族的，即仅包含碳和氢，并且这里每个称之为“天然存在的氨基酸的脂族侧链”。
可用于本发明的其它天然存在的氨基酸侧链包括含杂原子的官能团，如醇(丝氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸和苏氨酸)、胺(赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸和精氨酸)、硫醇(半胱氨酸)或羧酸(天冬氨酸和谷氨酸)。当改性含杂原子的官能团以包括保护基团时，侧链称为氨基酸的“保护的侧链”。
合适的保护基团的选择依赖于被保护的官能团，保护基团曝露于其中的条件和分子中可能存在的其它官能团。合适用于以上讨论的官能团的保护基团描述于Greene和Wuts，“有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)”，John Wiley &Sons(1991)，该文献的整个教导内容如在此完全说明的那样引入此申请中作为参考。只使用常规试验，熟练技术人员可选择用于公开的合成中的合适保护基团，以及用于施加和除去保护基团的条件，该保护基团不仅仅包括以下所描述的。
合适的醇保护基团的例子包括苄基、烯丙基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酸酯等。合适的氨基保护基团的例子包括苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔丁基、苄基和芴基甲氧基羰基(Fmoc)。叔丁氧基羰基是胺保护基团。合适的羧酸保护基团的例子包括叔丁基、三苯甲基、甲基、甲氧基甲基、三甲基甲硅烷基、苄氧基甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基等。叔丁基是羧酸保护基团。合适的硫醇保护基团的例子包括S-苄基、S-叔丁基、S-乙酰基、S-甲氧基甲基、S-三苯甲基等。
赖氨酸、天冬氨酸和苏氨酸是在本发明一个变化方案中优选被保护的氨基酸侧链的例子。脂族基团包括直链、支化C1-C8或环状C3-C8烃，该烃是完全饱和的或包含一个或多个不饱和单元。在一个例子中，脂族基团是C1-C4烷基。芳族基团包括碳环芳族基团如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基，杂环芳族基团如N-咪唑基、2-咪唑、2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、2-吡喃基、3-吡喃基、3-吡唑基、4-吡唑基、5-吡唑基、2-吡嗪基、2-噻唑、4-噻唑、5-噻唑、2-噁唑基、4-噁唑基和5-噁唑基。
芳族基团也包括稠合多环芳族环体系，其中碳环芳族环或杂芳基环稠合到一个或多个其它杂芳基环上。例子包括2-苯并噻吩基、3-苯并噻吩基、2-苯并呋喃基、3-苯并呋喃基、2-吲哚基、3-吲哚基、2-喹啉基、3-喹啉基、2-苯并噻唑、2-苯并噁唑、2-苯并咪唑、2-喹啉基、3-喹啉基、1-异喹啉基、3-喹啉基、1-异吲哚基、3-异吲哚基、和吖啶基。
芳族基团和脂族基团的合适取代基是与公开的反应相容的那些，即不显著降低反应收率和不引起显著量的副反应。合适的取代基一般包括脂族基团、取代的脂族基团、芳基、卤素、卤代烷基(三卤代甲基)、硝基、腈、--CONHR、--CON(R)2、--OR、--SR、--S(O)R、--S(O)2R，其中各R独立地是脂族基团、或芳基。尽管某些官能团可能不与一个或多个公开的反应相容，这些官能团可以被保护的形式存在。然后可除去保护基团以再生原始官能团。只使用常规试验，熟练技术人员能够选择与公开的反应相容的保护基团。
肽模拟物，或其组分也可用于本发明，如在此所述负载到树脂上，或由在此所述的方法产生。肽模拟物是具有对肽足够结构相似性的化合物，使得由模拟物保持肽的所需性能。例如，用作治疗HIV感染的蛋白酶抑制剂的肽模拟物，公开于Tung等，WO94/05639、Vazquez等，WO94/04491、Vazquez等，WO94/10134和Vazquez等，WO94/04493。这些公开文献的完全相关教导在此引入作为参考。为用作药物，肽模拟物应当保持肽的生物活性，但也具有一种或多种与被模拟的肽相比改进的性能。例如，一些肽模拟物在体内耐水解或降解。制备肽模拟物的一种策略是采用基团替换肽中的一个或多个氨基酸残基，该基团与被替换的氨基酸残基结构相关和可形成肽键。可用于替换肽中的氨基酸残基的新氨基酸衍生物的发展会促进新肽模拟物药物的开发。
例示的肽模拟物描述于Gabriel，Richard L.等2002年12月12日提交的，题目为“氨基酸衍生物及其制备方法”(“Amino acidderivatives and methods of making the same”)的美国专利申请系列No.20020188135。此专利申请如完全说明的那样在此引入作为参考。同样用于本发明的是这些化合物的生理可接受的盐。例如，可以通过与合适的有机或无机酸，如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等反应，获得包含胺或其它碱性基团的化合物盐。含有季铵基团的化合物也包含反阴离子(counteranion)如氯根、溴根、碘根、乙酸根、高氯酸根等。可以通过与合适的碱，例如氢氧化物碱反应制备包含羧酸或其它酸性官能团的化合物盐。酸性官能团的盐包含反阳离子(countercation)如钠、钾等。
本发明也用于治疗剂和生物活性物质的产生和制造，该治疗剂和生物活性物质含有一个或多个肽、肽衍生物、或肽模拟物作为其构件或组分。也可以由本发明产生由酯官能度终止的化合物或化合物片段。可以使用本发明制造或产生的治疗剂可随组合物的目的而广泛地变化。药剂可描述为单一实体或实体的结合。设计与具有高水溶性或低水溶性治疗剂一起使用的输送体系，以生产具有受控释放速率的输送体系。术语“治疗剂”和“生物活性物质”非限制性地包括药剂；维生素；矿物质补充物；用于治疗、预防、诊断的物质。
树脂制造实施例本发明的一个方面包括使用氯三苯甲基氯接头-树脂制备T-20或T-1249组合物，T-20或T-1249组合物片段的改进方法。CTC树脂是含有偏向树脂表面的官能度的树脂。官能度的表面偏向性将接头基团更接近于树脂表面放置，其可对增长肽链提供更好的趋近性。通过在受控溶胀条件下向树脂负载接头而产生表面偏向性。通过在未完全溶胀的状态下使官能化试剂与树脂接触，接头负载在珠粒的空间上更容易接近的区域中。此方法更详细地描述于Bohling等2002年8月16日提交的美国临时专利申请系列No.60/404,044，题目为“用于固相合成的树脂(RESIN FOR SOLID PHASE SYNTHESIS)(DN A01407)”，该文献如完全说明的那样在此引入作为参考。将树脂非必要地负载氨基酸或氨基酸衍生物，以产生一个或多个T-20或T-1249片段。
作为示例，本发明使用交联的聚合物珠粒，该聚合物珠粒当(i)由2-氯三苯甲基氯基团官能化；(ii)与Leu偶联到0.65mmol/g；和(iii)与Glu(t-Bu)偶联时，使得在1.5当量HOBT，1.5当量DIEA和1.5当量HBTU存在下，在不大于35分钟内完成1.5当量的FMOC-Lys(BOC)-OH的偶联，如由Kaiser测试所确定的。
本发明使用由包括如下步骤的方法生产的官能化交联聚合物珠粒(a)在第一溶剂或溶剂混合物中溶胀珠粒体积到干燥时的200％-310％；和(b)在能够溶胀珠粒体积到干燥时的200％-310％的第二溶剂或溶剂混合物中，将珠粒与官能化试剂接触。
本发明使用由如下方式生产的官能化交联聚合物珠粒在能够溶胀珠粒体积到干燥时的200％-400％的溶剂或溶剂混合物中，将体积为干燥时的100％-200％的珠粒与官能化试剂接触。到反应结束时，官能化树脂可溶胀到多至700％。
除非另外说明，百分比是重量百分比。在此使用的术语“(甲基)丙烯酸类”表示丙烯酸类或甲基丙烯酸类。术语“乙烯基单体”表示适于加聚和包含单一可聚合碳-碳双键的单体。术语“苯乙烯聚合物”表示从如下物质聚合的共聚物乙烯基单体或基于单体总重量，包含至少50wt％苯乙烯单体的乙烯基单体混合物，与至少一种交联剂。优选从至少含有75％苯乙烯，更优选至少含有90％苯乙烯的单体混合物，和最优选从主要由苯乙烯和至少一种乙烯基芳族交联剂组成的单体混合物制备苯乙烯聚合物。用作本发明中起始材料的聚合物珠粒包含来自至少一种含有一个可共聚合碳-碳双键的单体和至少一种交联剂的单体残基。衍生自交联剂的单体残基为0.5mol％-1.5mol％，基于所有单体残基的总量。优选交联剂的数量为0.7-1.3mol％，更优选0.7-1.2mol％，和最优选0.8-1.2mol％。
用作本发明中起始材料的聚合物珠粒优选是粒径不大于200微米(μm)，优选不大于170μm，更优选不大于150μm，更优选不大于125μm，和最优选不大于100μm的球形共聚物珠粒。优选，该珠粒不含有直径大于3μm的空隙空间，更优选不含有直径大于2μm的空隙空间，和最优选不含有直径大于1μm的空隙空间。典型地，在由如光学显微镜的技术进行表面检查时，空隙空间是非常明显的。
用作本发明中起始材料的聚合物珠粒优选由悬浮聚合生产。典型的珠粒制备，例如，可包括连续水相溶液的制备，该水相溶液包含典型的悬浮助剂，例如分散剂、保护性胶体和缓冲剂。优选，为有助于相对小的珠粒的生产，在水溶液中包括表面活性剂，优选烷基硫酸钠表面活性剂，和在聚合反应期间保持剧烈搅拌。将水溶液与包含至少一种乙烯基单体，至少一种交联剂和至少一种自由基引发剂的单体混合物结合。优选，总引发剂水平是0.25mol％-2mol％，基于总单体进料，优选0.4mol％-1.5mol％，更优选0.4mol％-1mol％，和最优选0.5mol％-0.8mol％。然后在高温下聚合单体混合物。优选，聚合持续足够的时间以降低未反应的乙烯基单体含量至小于起始量的1％。然后将获得的珠粒由常规措施分离，如脱水，采用非质子有机溶剂洗涤，并且干燥。
交联剂是每个分子含有2个或多个可共聚碳-碳双键的单体，如二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、三乙烯基苯、三乙烯基环己烷、二乙烯基萘、三乙烯基萘、二甘醇二乙烯基醚、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸三甘醇酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸烯丙酯、1，5-己二烯、1，7-辛二烯或1，4-双(4-乙烯基苯氧基)丁烷；可以理解每种上述交联剂的任何各种位置异构体是合适的。优选的交联剂是二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、三乙烯基苯或1，4-双(4-乙烯基苯氧基)丁烷。最优选的交联剂是二乙烯基苯。
可用于作为本发明中起始材料的珠粒制备的合适的单不饱和乙烯基芳族单体包括，例如，苯乙烯、α-甲基苯乙烯、(C1-C4)烷基取代的苯乙烯和乙烯基萘；优选一种或多种单不饱和乙烯基芳族单体选自苯乙烯和(C1-C4)烷基取代的苯乙烯。包括在合适的(C1-C4)烷基取代的苯乙烯中的是，例如，乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙烯、二甲基苯乙烯和乙烯基苄基氯的异构体；可以理解每种上述乙烯基芳族单体的任何各种位置异构体是合适的。
非必要地，除乙烯基芳族单体以外，也可以使用非芳族乙烯基单体，如脂族不饱和单体，例如，丙烯腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸的酰胺或C1-C6烷基酯。当使用时，作为聚合单元的非芳族乙烯基单体典型地占共聚物的0-20％，优选0-10％，和更优选0-5％，基于形成共聚物的单体总重量。
优选的乙烯基单体是乙烯基芳族单体，更优选苯乙烯、乙烯基苄基氯的异构体、和α-甲基苯乙烯。最优选的乙烯基单体是苯乙烯。
用于本发明的聚合引发剂包括可溶于单体的引发剂如过氧化物、氢过氧化物、过氧化酯和相关引发剂，例如过氧化苯甲酰、过氧化氢叔丁基、过氧化枯烯、过氧化四氢化萘、过氧化乙酰、过氧化己酰、过辛酸叔丁酯(也称为过氧-2-乙基己酸叔丁酯)、过辛酸叔戊酯、过苯甲酸叔丁酯、二过邻苯二甲酸叔丁酯、过氧二碳酸二环己酯、二(4-叔丁基环己基)过氧二碳酸酯和过氧化甲基乙基酮。同样有用的是偶氮引发剂如偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酰胺、2，2’-偶氮-双(2，4-二甲基戊腈)、偶氮-双(α-甲基丁腈)和二甲基-、二乙基-或二丁基偶氮-双(甲基戊酸酯)。优选的过氧化物引发剂是二酰基过氧化物，如过氧化苯甲酰，和过氧化酯，如过辛酸叔丁酯和过苯甲酸叔丁酯。
用于本发明的分散剂和悬浮剂是具有羟烷基纤维素主链，包含1-24个碳原子的疏水性烷基侧链，和以平均1-8个，优选1-5个环氧乙烷基团取代羟烷基纤维素主链每个重复单元的非离子表面活性剂，烷基侧链的存在水平为在羟烷基纤维素主链中每100个重复单元有0.1-10个烷基。羟烷基纤维素中的烷基可包含1-24个碳，并可以是线性、支化或环状的。更优选是每100个脱水葡萄糖单元包含0.1-10个(C16)烷基侧链和每个脱水葡萄糖单元由约2.5-4个环氧乙烷基团取代的羟乙基纤维素。分散剂的典型水平是约0.01-约4％，基于水相总重量。有用的分散剂的一个例子是从Hercules ofWilmington，Delaware可商购的Culminal MHEC 8000。
非必要地，珠粒的制备可包括酶处理以净化在聚合期间使用的分散剂和悬浮剂残基的聚合物表面。酶处理典型地包括在聚合期间、在聚合之后和在聚合物分离之后将聚合物相与酶材料接触(选自一种或多种纤维素分解酶和蛋白水解酶)。关于聚合物树脂制备期间酶使用的进一步一般性和具体细节，可以参考日本专利申请No.61-141704和No.57-98504。合适的酶包括，例如，用于纤维素类分散剂体系的纤维素分解酶，如β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水化酶、β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶、β-1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水化酶和β-1，4-葡聚糖-4-纤维二糖水化酶；和用于明胶类分散体体系的蛋白水解酶，如尿激酶、弹性蛋白酶和肠激酶。典型地，相对于聚合物使用的酶的数量为2-35％，优选5-25％和更优选10-20％，基于聚合物的总重量。
在本发明的方法中，控制交联聚合物珠粒的溶胀使得在官能化期间珠粒部分溶胀。不希望受理论的约束，官能化部分溶胀珠粒的效果是限制连接的官能团到相对接近珠粒表面的区域的定位。优选，当发生官能化时，珠粒溶胀到其干燥时体积的至少200％，更优选至少210％，更优选至少220％，更优选至少230％，和最优选至少240％。优选，珠粒溶胀到不大于其干燥时体积的310％，更优选不大于300％，更优选不大于290％，和最优选不大于280％。对于在官能化期间完成所需溶胀程度，存在不同的方法。
在本发明的一个实施方案中，在能够溶胀珠粒到其干燥时体积的至少200％，更优选至少210％，更优选至少220％，更优选至少230％，和最优选至少240％的溶剂或溶剂混合物中，将未预溶胀(即，在其干燥时体积的100％下)的珠粒，或预溶胀到不大于其干燥时体积的200％的珠粒与官能化试剂接触。优选，溶剂或溶剂混合物能够溶胀珠粒到不大于其干燥时体积的400％，更优选不大于370％，更优选不大于340％，和最优选不大于320％。优选，将珠粒预溶胀到不大于150％，更优选不大于100％，更优选不大于80％，更优选不大于60％，和最优选不大于40％。在一个实施方案中，使用干燥状态的珠粒而不预溶胀。到反应完成时树脂可溶胀到大于700％。
在本发明的另一个实施方案中，在溶胀珠粒到其干燥时体积的至少200％，更优选至少210％，更优选至少220％，更优选至少230％，和最优选至少240％的溶剂或溶剂混合物中预溶胀珠粒。优选，将珠粒溶胀到不大于其干燥时体积的310％，更优选不大于300％，更优选不大于290％，和最优选不大于280％。在预溶胀之后，在能够溶胀珠粒在上述范围内的溶剂或溶剂混合物中，将珠粒与官能化试剂接触。最优选，用于预溶胀和官能化的溶剂或溶剂混合物相同。
官能化试剂是以共价键连接官能团到包括珠粒的聚合物上的试剂。进一步精心确立官能团对最大化珠粒作为固相合成载体的功用可能是必须的。然而，官能团的初始连接决定官能化的珠粒区域并因此倾向于控制珠粒与固相合成底物反应的能力和允许合成产物的回收。对于苯乙烯聚合物，官能化典型地是在芳族环上的Friedel-Crafts取代，优选酰化、溴化、或卤甲基化。随后精心确立典型的初始官能团。例如，在由芳酰卤的酰基化之后在产物的羰基中加入芳基锂，以生产三芳基甲醇官能团，然后卤化该三芳基甲醇官能团以生产三苯甲基卤化物官能团。在本发明的一个优选实施方案中，2-氯苯甲酰氯，随后苯基锂，然后亚硫酰氯，生产2-氯三苯甲基氯官能团。典型地在溴化之后进行烷基锂试剂的处理和芳基锂产物与各种试剂的反应，以生产不同的官能团。卤甲基也可以与各种试剂反应以生产不同的官能团。
能够部分溶胀珠粒的溶剂包括，例如，C1-C6硝基烷烃、和相对非溶胀溶剂如烷烃与硝基苯或氯化烃的混合物。对于使用Friedel-Crafts化学的官能化，优选C3-C6硝基烷烃、和相对非溶胀溶剂如烷烃与硝基苯的混合物。
在此所述的表面官能化的珠粒用于，例如，固相有机合成、固相肽合成、和反应副产物的清除。典型地，在溶液中表面官能化珠粒和试剂之间的偶联反应比采用常规官能化聚合物珠粒发生得更快。例如，当在用于肽合成的典型偶联试剂存在下，在此所述的表面官能化珠粒上的2-氯三苯甲基氯官能团与给定浓度的保护氨基酸试剂反应时，典型地在相同的时间内或在比常规官能化珠粒观察到的时间更短的时间内完成反应，如以下实施例8和表4中所示。本发明表面官能化珠粒与保护的氨基酸残基反应的偶联效率大于常规珠粒的该效率，如以下由实施例6和表2中珠粒的重量增量所证明的，和由实施例7和表3中断裂氨基酸的HPLC测量所示。
采用或不采用肽合成中公知的典型保护基团，氨基酸在本发明表面官能化珠粒上的典型负载是0.2meq/g-1.0meq/g，基于未负载珠粒的重量。在本发明的一个实施方案中，负载至少0.25meq/g，更优选至少0.3meq/g，更优选至少0.5meq/g，和最优选至少0.6meq/g。优选，负载不大于0.9meq/g，更优选不大于0.8meq/g，和最优选不大于0.7meq/g。在本发明的另一个实施方案中，优选负载至少0.6meq/g，更优选至少0.7meq/g，更优选至少0.8meq/g，和最优选至少0.9meq/g。优选，负载不大于1.2meq/g，更优选不大于1.1meq/g，和最优选不大于1.0meq/g。
对比例预溶胀交联聚苯乙烯珠粒的内部和表面官能化装配有顶部搅拌器和含有上游压力释放的N2入口以及热电偶的1L圆底烧瓶采用略微正压的氮气净化(逆开口(open stopper)清扫同时进行加料)。将硝基苯(400mL)加入并在室温下保持。将聚苯乙烯树脂(40g，0.379mol)逆氮气清扫而加入并搅拌1/2小时。将氯苯甲酰氯(24.89g，0.142mol)加入到烧瓶中并搅拌15分钟。在填充氮气的手套箱中，将氯化铝(18.96g，0.142mol)称重入密封瓶中，然后将它逆氮气清扫而加入到反应烧瓶中。将烧瓶的内容物加热到30℃并保持4小时。将反应混合物倾入布氏过滤漏斗，并将反应烧瓶采用少量硝基苯洗涤以完成转移。将过滤器排液到树脂水平，加入硝基苯(280mL，1个床体积)，再次将过滤器排液。在树脂床的顶部加入四氢呋喃(“THF”)(2个床体积)，使该四氢呋喃排出。当THF替换硝基苯时，颜色失去。加入一个床体积的4∶1 THF∶H2O并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的THF并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂预部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的甲醇并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。施加最小真空以除去过量溶剂。将树脂在35℃真空烘箱中干燥到恒重。
实施例通过未溶胀珠粒官能化的交联聚苯乙烯珠粒的表面官能化装配有顶部搅拌器和含有上游压力释放的N2入口以及热电偶的1L圆底烧瓶采用略微正压的氮气净化(逆开口清扫同时进行加料)。将硝基苯(400mL)加入并在室温下保持。在填充氮气的手套箱中，将氯化铝(18.96g，0.142mol)称重入密封瓶中，然后将它逆氮气清扫而加入到反应烧瓶中。在氯化铝溶解之后(约5分钟)，将氯苯甲酰氯(24.89g，0.142mol)加入到烧瓶中并搅拌5分钟。将聚苯乙烯树脂(40g，0.379mol)逆氮气清扫而加入并搅拌1/2小时。将烧瓶的内容物加热到30℃和保持另外3.5小时。将反应混合物倾入布氏过滤漏斗，并将反应烧瓶用少量硝基苯洗涤以完成转移。将过滤器排液到树脂水平，加入硝基苯(280mL，1个床体积)，再次将过滤器排液。在树脂床的顶部加入四氢呋喃(“THF”)(2个床体积)，使该四氢呋喃排出。当THF替换硝基苯时，颜色失去。加入一个床体积的4∶1 THF∶H2O并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的THF并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的甲醇并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。施加最小真空以除去过量溶剂。将树脂在35℃真空烘箱中干燥到恒重。
实施例通过选择官能化溶剂的交联聚苯乙烯珠粒的表面官能化装配有顶部搅拌器和含有上游压力释放的N2入口以及热电偶的1L圆底烧瓶采用略微正压的氮气净化(逆开口清扫同时进行加料)。将硝基乙烷(400mL)加入并在室温下保持。将聚苯乙烯树脂(40g，0.379mol)逆氮气清扫而加入并搅拌1/2小时。将氯苯甲酰氯(24.89g，0.142mol)加入到烧瓶中并搅拌15分钟。在填充氮气的手套箱中，将氯化铝(18.96g，0.142mol)称重入密封瓶中，然后将它逆氮气清扫而加入到反应烧瓶中。将烧瓶的内容物加热到30℃和保持另外3.75小时。将反应混合物倾入布氏过滤漏斗，并将反应烧瓶用少量硝基苯洗涤以完成转移。将过滤器排液到树脂水平，加入硝基苯(280mL，1个床体积)，再次将过滤器排液。在树脂床的顶部加入四氢呋喃(“THF”)(2个床体积)，使该四氢呋喃排出。当THF替换硝基苯时，颜色失去。加入一个床体积的4∶1 THF∶H2O并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的THF并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的甲醇并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。施加最小真空以除去过量溶剂。将树脂在35℃真空烘箱中干燥到恒重。
实施例通过使用混合的官能化溶剂的交联聚苯乙烯珠粒的表面官能化装配有顶部搅拌器和含有上游压力释放的N2入口以及热电偶的1L圆底烧瓶采用略微正压的氮气净化(逆开口清扫同时保持进行加料)。将硝基苯(60mL)和庚烷(440mL)加入并在室温下保持。将聚苯乙烯树脂(40g，0.379mol)逆氮气清扫而加入并搅拌1/2小时。将氯苯甲酰氯(24.89g，0.142mol)加入到烧瓶中并搅拌15分钟。在填充氮气的手套箱中，将氯化铝(18.96g，0.142mol)称重入密封瓶中，然后将它逆氮气清扫而加入到反应烧瓶中。将烧瓶的内容物加热到30℃并保持4小时。将反应混合物倾入布氏过滤漏斗，并将反应烧瓶用少量硝基苯洗涤以完成转移。将过滤器排液到树脂水平，加入硝基苯(280mL，1个床体积)，再次将过滤器排液。在树脂床的顶部加入四氢呋喃(“THF”)(2个床体积)，使该四氢呋喃排出。当THF替换硝基苯时，颜色失去。加入一个床体积的4∶1 THF∶H2O并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的THF并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的THF。使过滤器排液到树脂水平。在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。加入一个床体积的甲醇并将树脂再悬浮，然后将过滤器排液到树脂水平并在树脂顶部加入一个床体积的甲醇。使过滤器排液到树脂水平。施加最小真空以除去过量溶剂。将树脂在35℃真空烘箱中干燥到恒重。
实施例交联珠粒最终官能化的一般过程在烘箱干燥的四颈圆底烧瓶(装配有搅拌器，冷凝器w/氮气鼓泡器，温度控制器，和隔膜)中装有THF和来自任何先前实施例的干燥珠粒(10∶1，体积∶重量)。将混合物搅拌15分钟。在10分钟内滴加苯基锂(1.25当量)。由冰/水浴将温度保持为＜30℃。然后将混合物在室温搅拌1小时。保持反应温度低于30℃，通过滴加10％的盐酸水溶液完成猝灭，将混合物搅拌1小时。然后将内容物转移到烧结玻璃漏斗并排液到床高度。然后将树脂在1个床体积的4∶1 THF/10％HCl(v/v)中再悬浮并使其缓慢排液到床高度。将树脂在1个床体积的4∶1 THF/水中再悬浮并使其排液。然后将床采用1个床体积的THF再悬浮和排液3次，随后由1个床体积的甲醇再悬浮/排液3次。采用1个床体积的甲醇进行整个床的最终清洗。施加真空以除去过量溶剂并将珠粒在35℃真空烘箱中干燥。
在烘箱干燥的四颈圆底烧瓶(装配有搅拌器，温度控制器，冷凝器w/氮气鼓泡器，和塞子)中加入二氯甲烷和来自先前步骤制得的干燥珠粒(10∶1)。滴加亚硫酰氯(5当量)，随后加入N，N-二甲基甲酰胺(基于亚硫酰氯的5mol％)。将混合物升温到回流(37℃)下4小时。在冷却到室温之后，将反应混合物转移到氮气净化的烧结玻璃漏斗中并排液到床高度。然后将床采用1个床体积的二氯甲烷再悬浮和排液两次。将它进一步采用1个床体积的无水己烷再悬浮/排液三次进行洗涤。采用氮气通过床净化以除去过量溶剂并将珠料放置在室温下的真空烘箱中。以此制备的三苯甲基氯官能化的珠粒是有用的，例如用于固相肽合成。
实施例在各种溶剂中交联聚苯乙烯珠粒的溶胀在溶剂中溶胀使用1％和大约1.5％二乙烯基苯作为交联剂制备的，干燥时的体积为1.65mL/g的交联聚苯乙烯珠粒，并在下表1中以mL/g给出结果。溶剂比是体积∶体积。
表1
实施例表面官能化交联珠粒由Fmoc-L-亮氨酸的负载将根据实施例4生产的2-氯三苯甲基氯树脂采用Fmoc-L-亮氨酸负载，采用甲醇处理以除去残余反应性氯化物并干燥。重量增量用于定量化负载。假定树脂的能力是1.3mmol/g。忽略甲氧基封端的相对小的分子量效果。将树脂采用1％TFA/DCM断裂，并由HPLC分析溶液以确定氨基酸的断裂收率(回收率)。
将每个树脂样品(1.0000+/-0.05g)称重入含有侧口和可除去盘的60mL玻璃合成器容器。采用二氯甲烷(DCM)预溶胀合成器中的树脂。排出DCM并向每个合成器中加入Fmoc-L-Leu-OH和二异丙基乙胺(DIEA)在10ml DCM中的溶液。开始缓慢的氮气搅拌。对于本发明的五种树脂，分别地以克计的Fmoc-L-Leu-OH数量是(3.181，0.597，0.358，0.299，0.239)和以mL计的DIEA数量是(1.568，0.294，0.177，0.147，0.118)。使每个混合物在室温下反应两小时，然后将溶液排出并以甲醇(9mL)中的DIEA(1mL)处理至少30分钟，以将任何剩余的三苯甲基氯端基封闭。将每个树脂样品采用5×10mL部分的DCM洗涤并转移到配衡的30mL多孔玻璃漏斗中，然后采用另外2×10mL部分的DCM洗涤。然后将每个负载的树脂采用4×10mL部分的异丙醇(IPA)解溶胀和由如下方式部分干燥采用真空通过滤饼拉动空气，然后在真空烘箱中在30℃下干燥过滤器和树脂过夜。然后将过滤器和树脂再称重和计算质量的差异。Leu的质量＝最终重量-(过滤器皮重+1.000g树脂)。负载效率＝(树脂上的Leu重量/加入的Leu重量)*100。对于本发明的五种树脂(RH1-RH5)和根据此实施例中给出的过程加工的三种对比树脂(CM1-CM3)，在表2中报导其重量增量和负载效率。在表3中报导相同树脂的断裂收率。氨基酸(AA)的数量以mmol计，重量增量(增量)以mmol计，和负载效率(eff.)以％计。
表2中本发明的5种树脂比任何对比树脂有更高的负载效率。表2中这种更高的负载效率比常规树脂提高约7.5-约28％。
表2.重量增量和负载效率比较
CM2是以名称2-氯三苯甲基氯树脂(100-200目)，1％DVB；Cat.No.01-64-0114购自Novabiochem的树脂CM3是以名称C1-Trt-Cl树脂(75-150微米)，1％DVB；PartNo.3473-2799购自Polymer Labs的树脂实施例Fmoc-L-亮氨酸从表面官能化珠粒的断裂将每个树脂样品(1.0000+/-0.05g)称重入多孔玻璃过滤器中。通过采用DCM(10mL)搅拌漏斗而预溶胀树脂，排出DCM，并将树脂以3×10mL的DCM洗涤。通过如下方式断裂树脂结合的Fmoc-L-Leu-OH采用9×10mL的1％TFA/DCM(v∶v)搅拌，排液到100mL容量瓶中，并采用DCM填充到标记。搅拌烧瓶的内容物以提供由HPLC分析的样品溶液。
将样品溶液注入能够产生二元溶剂梯度，和装配有样品注射器，可变波长检测器和电子数据采集系统的液相色谱(具有ChemStationTM软件的HP 1090)。柱YMC ODS-AQ，S-3，120A，50mm×4mm ID柱目录#AQ12SO30504WT。
条件流量1.5ml/min过程40％B，保持10.0min在2.5分钟内40％B-90％B，保持1分钟在2分钟内90％B保持10分钟直到下一次注射。
注射体积10uL检测光电二极管阵列检测器265nm带宽16nm，参比350nm，bw100nm，或在265nm下的可变波长UV检测器。
标准物制备将大约5.0mg的Fmoc-L-Leu-OH参考标准物称重入25mL容量瓶中。标准物溶于约10mL乙腈(通常要求超声处理)。加入水(12mL)，混合内容物，并使烧瓶达到室温。用水填充烧瓶到标记并混合内容物。
样品制备将样品溶液(5.00mL)量入25mL容量瓶中，并在室温下采用轻微氮气流减少其到干燥。将残余物溶于10mL乙腈中(通常要求超声处理)。加入水(12mL)，充分混合内容物，并使烧瓶达到室温。将烧瓶用水填充到标记并搅拌。
注射空白样(水∶乙腈3∶2)并开始梯度过程。
伴随地，注射样品和标准物。
由如下公式计算树脂上Fmoc-L-Leu的负载样品瓶中的Fmoc-L-Leu＝样品面积/标准物面积×标准物重量×标准物纯度/25.0mL×25.0mL/5.0mL树脂负载量(mmol/g干燥树脂)＝样品瓶中Fmoc-L-Leu-OH数量/负载树脂的重量×353.4[353.4是Fmoc-L-Leu-OH的分子量]在表3中报导对于每个氨基酸数量的以mmol计的断裂的Fmoc-L-Leu-OH(“AA”)数量结果，该氨基酸用于初始负载RH1-RH5和CM1材料的树脂。假定断裂的数量等于结合到树脂上的数量，也报导负载效率。
表3断裂的氨基酸收率比较
本发明树脂的断裂氨基酸收率比常规树脂大5-20％。可以理解断裂的肽片段收率将高于从对比树脂断裂相同的片段的收率。
实施例肽构建动力学效率比较此实施例描述已知为T-20的肽的九个肽片段的制备，该肽包含氨基酸17-26，并作为肽No.11，描述于美国专利No.6,015,881的表1中。通过在偶联期间周期性取树脂样和运行Kaiser测试以确定任何未反应的伯胺的存在，跟踪反应的动力学。将根据实施例4制得的树脂与两种对比树脂比较，一种对比树脂来自Novabiochem，另一种对比树脂来自Polymer Labs。
将根据实施例4制得的2-氯三苯甲基氯树脂采用Fmoc-L-亮氨酸负载，采用甲醇处理以除去残余的反应性氯化物并干燥。将树脂样品(1.0g)称重入含有侧口和可除去盘的60mL玻璃合成器容器中。将DCM(10mL)加入到容器中并采用氮气搅拌30分钟，然后排出。然后通过如下方式解保护亮氨酸衍生的树脂加入10mL哌啶在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的25％溶液，搅拌10分钟，排液并重复一次。通过采用7×10mL体积的NMP洗涤而除去解保护残余物。通过在室温下将1.5eq氨基酸(在此序列中首先加入Fmoc-glu(t-Bu)-OH，关于加入量和化学式量参见表)，1.5eq的1-羟基苯并三唑(HOBT)(0.149g)和1.5eq的DIEA(0.126g)溶于7.5mL NMP，制备序列中下一种氨基酸的活化酯。然后骤冷溶液并将1.5eq的六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)(0.370g)加入并搅拌30分钟。然后将DCM(2.5mL)加入到溶液中并使其静置30分钟。然后将活化的氨基酸溶液加入到排液后的树脂中并用氮气搅拌。每15分钟取样并分析样品(Kaiser测试)和记录结果。在反应完成时，将树脂排液并用NMP(3×10mL)洗涤。然后对于序列中的剩余氨基酸，从采用哌啶的解保护重复此过程。(Glu(tBu)，Lys(Boc)，Asn(trt)，Glu(tBu)，Gln(trt)，Glu(tBu)，leu，leu)。
以下在表4中给出三种树脂的结果，时间表达为阴性(negative)Kaiser测试的时间。
表4肽合成效率比较
加入到本发明珠粒增长链上的氨基酸完全反应所要求的时间等于或小于常规珠粒所要求的时间。
附录1AA使用
LeuCT-树脂(g)＝1.00总NMP 1035.5mL负载水平(mmol/g)＝0.65 总DCM 72.5mL样品数目＝1.00 总哌啶 32mL总树脂(g)＝1.00总HOBT 1.344g总mmol＝0.65 总DIEA 1.134g单体加料的eq.＝1.50总HBTU 3.328g每个步骤的偶联循环＝1.00单体使用/循环(mmol)＝0.975加入的AA9
附录2溶剂使用
可以理解改进的趋近性导致更有效的偶联和洗涤，其结果降低了商业规模下溶剂的使用量。通过实施例，NMP使用10％的降低将为每100kg肽产物提供其15500L的降低。
附录3 Kaiser测试方法Kaiser测试是对于伯胺的测试和用于确定肽偶联的程度。将负载树脂的样品(3-20mg)放入培养管并蒸发到干燥。然后将树脂用乙醇洗涤3次。加入五滴试剂1(在吡啶中的KCN)以及3滴试剂2(茚三酮溶液)和3滴试剂3(乙醇中的苯酚)。将溶液稀释到0.5mL，然后加热到75℃并持续10分钟。在10分钟之后，将管子在冷水浴中急冷。然后在白色背景前面观察珠粒。如果溶液是黄色和珠粒透明，指示阴性(negative)测试。蓝色或紫色指示游离胺的存在和不完全偶联。
在仍然另一个变化方案中，本发明提供一种使用非必要负载氨基酸或氨基酸衍生物的低空隙空间树脂，以产生一个或多个T-20或T-1249片段而制备T-20或T-1249组合物，或T-20或T-1249组合物片段的改进方法。
通过非限制性实施例，本发明使用包括聚合物的交联聚合物珠粒，该聚合物含有0.5mol％-2mol％交联剂，其中珠粒的直径不大于200μm，没有直径大于约5μm的空隙空间，和含有小于5wt％的有机可提取物。
本发明的树脂可以按照例示的方法制备。该方法包括如下步骤(a)在容器中制备悬浮聚合混合物，该混合物包括(i)包括至少一种乙烯基单体和至少一种交联剂的单体混合物，和(ii)0.25mol％-1.5mol％至少一种自由基引发剂；(b)通过引入惰性气体并持续足够的时间除去氧气，以在容器中产生包含不大于5％氧气的气氛；(c)使单体混合物聚合；和(d)采用非质子有机溶剂洗涤珠粒。当然，可以理解其它方法也可用于获得具有低空隙空间质量的用于本发明的树脂。
在此使用的术语“(甲基)丙烯酸类”表示丙烯酸类或甲基丙烯酸类。术语“乙烯基单体”表示适于加聚和包含单一可聚合碳-碳双键的单体。术语“苯乙烯聚合物”表示从如下物质聚合的共聚物乙烯基单体或基于总单体重量，包含至少50wt％苯乙烯单体的乙烯基单体混合物，与至少一种交联剂。优选从至少含有75％苯乙烯，更优选至少含有90％苯乙烯的单体混合物，和最优选从主要由苯乙烯和至少一种乙烯基芳族交联剂组成的单体混合物制备苯乙烯聚合物。本发明的轻微交联聚合物珠粒包含来自至少一种含有一个可聚合碳-碳双键的单体和至少一种交联剂的单体残基。衍生自交联剂的单体残基为0.5mol％-2mol％，基于所有单体残基的总量。
术语“有机可提取物”表示通过在引起珠粒溶胀的有机溶剂中洗涤从聚合物珠粒中可除去的低分子量有机物质。有机可提取物的例子包括，例如，未反应的单体或交联剂，或低分子量低聚物。优选，通过在四氢呋喃或二氯甲烷中悬浮珠粒两小时，以5倍于珠粒体积的溶剂量在柱中清洗，干燥和测定珠粒的重量损失以测量有机可提取物的数量。
优选，通过非质子有机溶剂处理从本发明的珠粒除去有机可提取物，该非质子有机溶剂优选是不为脂族烃的溶剂，例如，卤化烃、环醚、酮和芳族烃。特别优选的溶剂是二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、氯苯、邻二氯苯、四氢呋喃、二噁烷、乙腈、丙酮、二甲苯和甲苯。优选，本发明的珠粒包含小于4wt％的有机可提取物，更优选小于3wt％，更优选小于2wt％，更优选小于1wt％，和最优选珠粒基本没有有机可提取物。在本发明的一个实施方案中，珠粒包含小于3wt％的未反应单体，更优选小于2wt％，更优选小于1wt％，和最优选珠粒基本没有未反应的单体。典型地，在采用非质子有机溶剂洗涤之前，珠粒包含低水平的可提取物和未反应单体。当聚合物是由二乙烯基苯(“DVB”)交联的苯乙烯聚合物时，未反应的单体可包括未聚合的乙基乙烯基苯(“EVB”)，商业二乙烯基苯中的通常杂质，并可能也包括未反应的苯乙烯。商业二乙烯基苯典型地具有55％-80％的纯度，剩余部分主要由乙基乙烯基苯组成。优选，使用纯度至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，和最优选至少80％的二乙烯基苯。
用于本发明的聚合物珠粒一般是粒径不大于200微米(μm)，优选不大于170μm，更优选不大于150μm，更优选不大于125μm，和最优选不大于100μm的球形共聚物珠粒。优选，珠粒不含有直径大于3μm的空隙空间，更优选不含有直径大于2μm的空隙空间，和最优选不含有直径大于1μm的空隙空间。典型地，在由如光学显微的技术进行表面检查时，空隙空间是非常明显的。
用作本发明中的聚合物珠粒优选由悬浮聚合生产。典型的珠粒制备，例如，可包括连续水相溶液的制备，该水相溶液包含典型的悬浮助剂，例如分散剂、保护性胶体和缓冲剂。优选，为有助于本发明相对小的珠粒的生产，在水溶液中包括表面活性剂，优选烷基硫酸钠表面活性剂，并在聚合过程期间保持剧烈搅拌。将水溶液与包含至少一种乙烯基单体，至少一种交联剂和至少一种自由基引发剂的单体混合物结合。优选，总引发剂水平是0.25mol％-1.5mol％，基于总单体进料，优选0.4mol％-1mol％，更优选0.4mol％-0.8mol％，和最优选0.5mol％-0.7mol％。通过引入惰性气体清除混合物中大多数氧气，直到反应容器(顶部空间)中气氛的氧气水平小于5％，优选小于3％，更优选小于2％，和最优选小于1％。优选，将惰性气体引入水溶液和单体混合物，以及顶部空间。然后在高温下聚合单体混合物。优选，持续聚合足够的时间以降低未反应乙烯基单体含量到小于起始量的1％。然后将获得的珠粒由常规方法分离，如脱水，采用非质子有机溶剂洗涤，并干燥。
当一种或多种单体包含酚类阻聚剂，将悬浮聚合混合物的水相保持在9-11.5的pH值以尽可能多地从单体相萃取酚类阻聚剂。优选，水相的pH值是9.5-11。
交联剂是每分子含有2个或多个可共聚碳-碳双键的单体，如二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、三乙烯基苯、三乙烯基环己烷、二乙烯基萘、三乙烯基萘、二甘醇二乙烯基醚、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸三甘醇酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸烯丙酯、1，5-己二烯、1，7-辛二烯或1，4-双(4-乙烯基苯氧基)丁烷；可以理解每种上述交联剂的任何各种位置异构体也是合适的。优选的交联剂是二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、三乙烯基苯或1，4-双(4-乙烯基苯氧基)丁烷。最优选的交联剂是二乙烯基苯。
可用于本发明中的珠粒制备的合适单不饱和乙烯基芳族单体包括，例如，苯乙烯、α-甲基苯乙烯、(C1-C4)烷基取代的苯乙烯和乙烯基萘；优选一种或多种单不饱和乙烯基芳族单体选自苯乙烯和(C1-C4)烷基取代的苯乙烯。合适的(C1-C4)烷基取代的苯乙烯包括，例如，乙基乙烯基苯、乙烯基甲苯、二乙基苯乙烯、乙基甲基苯乙烯、二甲基苯乙烯和乙烯基苄基氯的异构体；可以理解每种上述乙烯基芳族单体的任何各种位置异构体也是合适的。
非必要地，除乙烯基芳族单体以外，也可以使用非芳族乙烯基单体，如脂族不饱和单体，例如，丙烯腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸的酰胺或C1-C6烷基酯。当使用时，非芳族乙烯基单体作为聚合单元典型地占共聚物的0-20％，优选0-10％，和更优选0-5％，基于用于形成共聚物的总单体重量。
优选的乙烯基单体是乙烯基芳族单体，更优选苯乙烯、乙烯基苄基氯的异构体、和α-甲基苯乙烯。最优选的乙烯基单体是苯乙烯。
用于本发明珠粒制备的聚合引发剂包括可溶于单体的引发剂如过氧化物、氢过氧化物、过氧化酯和相关引发剂，例如过氧化苯甲酰、过氧化氢叔丁基、过氧化枯烯、过氧化四氢化萘、过氧化乙酰、过氧化己酰、过辛酸叔丁酯(也称为过氧-2-乙基己酸叔丁酯)、过辛酸叔戊酯、过苯甲酸叔丁酯、二过邻苯二甲酸叔丁酯、过氧二碳酸二环己酯、二(4-叔丁基环己基)过氧二碳酸酯和过氧化甲基乙基酮。同样有用的是偶氮引发剂如偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酰胺、2，2’-偶氮-双(2，4-二甲基戊腈)、偶氮-双(α-甲基丁腈)和二甲基-、二乙基-或二丁基偶氮-双(甲基戊酸酯)。优选的过氧化物引发剂是二酰基过氧化物，如过氧化苯甲酰，和过氧化酯，如过辛酸叔丁酯和过苯甲酸叔丁酯。
用于本发明的分散剂和悬浮剂是具有羟烷基纤维素主链，包含1-24个碳原子的疏水性烷基侧链，和以平均1-8个，优先1-5个环氧乙烷基团取代羟烷基纤维素主链每个重复单元的非离子表面活性剂，烷基侧链的存在水平为在羟烷基纤维素主链中每100个重复单元有0.1-10个烷基。羟烷基纤维素中的烷基可包含1-24个碳，并可以是线性、支化或环状的。更优选是每100个脱水葡萄糖单元包含0.1-10个(C16)烷基侧链和每个脱水葡萄糖单元由约2.5-4个环氧乙烷基团取代的羟乙基纤维素。分散剂的典型水平是约0.01-约4％，基于水相总重量。
非必要地，珠粒的制备可包括酶处理以净化聚合物表面的在聚合中使用的分散剂和悬浮剂残基。酶处理典型地包括在聚合期间、在聚合之后和在聚合物分离之后将聚合物相与酶材料接触(选自一种或多种纤维素分解酶和蛋白水解酶)。关于聚合物树脂制备期间酶使用的进一步一般性和具体的详细情况，可以参考日本专利申请No.61-141704和No.57-98504。合适的酶包括，例如，用于纤维素类分散剂体系的纤维素分解酶，如β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水化酶、β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶、β-1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水化酶和β-1，4-葡聚糖-4-纤维二糖水化酶；和用于明胶类分散体系的蛋白水解酶，如尿激酶、弹性蛋白酶和肠激酶。典型地，相对于聚合物使用的酶数量为2-35％，优选5-25％和更优选10-20％，基于聚合物的总重量。
在优选的实施方案中，用于本发明的珠粒是不含有直径大于5μm的空隙空间的轻微交联聚合物珠粒，该珠粒由包括如下步骤的方法生产(a)在容器中制备悬浮聚合混合物，该混合物包括(i)包括至少一种乙烯基单体和至少一种交联剂的单体混合物，和(ii)0.25mol％-1.5mol％至少一种自由基引发剂；(b)通过引入惰性气体并持续足够的时间除去氧气，以在容器中产生包含不大于5％氧气的气氛；(c)使单体混合物聚合；和(d)采用非质子有机溶剂洗涤珠粒。优选，根据本方法制备的珠粒不含有直径大于4μm的空隙空间，更优选不含有直径大于3μm的空隙空间，和最优选不含有直径大于1μm的空隙空间。优选，珠粒含有小于5％，更优选小于3％，更优选小于2％，和最优选小于1％有机可提取物。优选，珠粒含有小于4％，更优选小于3％，更优选小于2％，和最优选小于1％残余单体。
不希望受理论约束，相信本发明的方法比先前已知的方法能促进更完全的聚合，并因此降低了珠粒中存在的有机可提取物数量，所以在非质子有机溶剂洗涤之后，减少了珠粒中空隙空间的形成。
树脂制备实施例将去离子(“DI”)水加入到圆底烧瓶中，在150rpm下搅拌并在氮气吹扫下加热到80℃。当达到温度时，向烧瓶中缓慢加入4.40g的QP-300(从Union Carbide Co.，Institute，WV获得的羟乙基纤维素分散剂)。将温度在80℃保持60分钟，其后将水溶液冷却到25℃-30℃。将如下物质加入到烧瓶中200g DI水和0.95g Marasperse N-22(从Borregaard LignoTech，Rothschild，WI获得的木质素硫酸钠分散剂)的溶液，2.4g的50％NaOH，2.5g硼酸，0.036g月桂基硫酸钠和0.1g硝酸钠。将烧瓶的内容物搅拌30分钟。在另一个实施例中，CulminalMHEC 8000(从Hercules，Wilmington，DE获得的羟乙基纤维素)可以替代QP-300，Marasperse N-22和盐。
在单独的烧杯中通过加入如下物质而制备单体混合物6.55g的80％DVB(二乙烯基苯)，440.0g苯乙烯，5.8g的Trigonox 21(从NouryChemical Corp.，Burt，NY获得的过氧-2-乙基己酸叔丁酯)。将混合物转移到加料漏斗中并采用氮气喷射40分钟。
在将单体混合物加入到烧瓶中之前，在包含水相的圆底烧瓶中将搅拌器速度调节到275rpm。停止搅拌器并将单体混合物加入到水溶液中，仔细放置加料漏斗以避免空气引入单体混合物中。在加入单体混合物后，恢复搅拌并在25℃下继续30分钟。将温度在1小时内升高到84℃并保持12小时。
将批次物冷却到45℃，并用HCl(37％)将pH调节到5.0。将Cellulase 4000(19.05g)(从Valley Research，South Bend，IN获得的纤维素酶)加入到批次物中，并在45℃搅拌2小时。在保持2小时后，将第二次Cellulase 4000加料加入并将温度保持在45℃ 2小时。在保持周期结束时，将批次物冷却到室温，从烧瓶中移出并用DI水洗涤。
典型地，聚合物珠粒的收率大约是90％，由于搅拌器结垢或在水相中的分散而损失一些聚合物。残余单体的水平随几个参数变化，该参数包括采用氮气惰性化的彻底性，DVB的纯度，和引发剂水平，如表中所示。除所述以外，不进行反应物或反应容器的惰性化。
表
1.过氧-2-乙基己酸叔丁酯典型地，根据以下过程洗涤聚合物。将直径4.4cm，长50cm的柱填充100mL共聚物。将共聚物以8个床体积的非质子有机溶剂，在0.5个床体积/小时的流量下以向下流方向洗涤。将床采用4个床体积的甲醇或水，在0.5个床体积/小时的流量下以向下流方向洗涤。将床在氮气流中干燥并在45℃下真空干燥18小时。
在本发明的一个变化方案中，使用的树脂包括含有聚合物的交联聚合物珠粒，该聚合物含有0.5mol％-2mol％交联剂。珠粒的直径不大于200μm，不含有直径大于5μm的空隙空间，并含有小于5wt％有机可提取物。在另一个变化方案中，聚合物含有0.5％-1.6％交联剂，珠粒的直径不大于170μm。在本发明的一个变化方案中，聚合物是含有二乙烯基苯交联剂的苯乙烯聚合物。聚合物可含有0.7％-1.2％交联剂，和珠粒不含有直径大于3μm的空隙空间，并含有小于3wt％有机可提取物。作为示例，交联聚合物珠粒的直径不大于150μm。
另一个生产用于本发明树脂的实施例使用如下方法(a)在容器中制备悬浮聚合混合物。该混合物包括(i)包括至少一种乙烯基单体和至少一种交联剂的单体混合物，和(ii)0.25mol％-1.5mol％至少一种自由基引发剂。该方法其次包括通过引入惰性气体并持续足够的时间而从悬浮聚合混合物和容器中除去氧气，以在容器中产生包含不大于5％氧气的气氛；使单体混合物聚合；和采用非质子有机溶剂洗涤珠粒。单体混合物非必要地包含0.5mol％-2mol％的至少一种交联剂，且容器中的气氛非必要地包含不大于2％的氧气。
非必要地，在一个变化方案中，珠粒包括至少一种含有至少90mol％苯乙烯的乙烯基单体。交联剂包括二乙烯基苯，且珠粒的直径不大于200μm。
T-20实施例此实施例描述已知为T-20的肽的九个氨基酸片段的制备，该肽含有氨基酸18-35，作为肽No.7，描述于美国专利No.6,015,881的表1中。美国专利.No.6,015,881在此如完全说明的那样引入作为参考。通过在偶联期间周期性取树脂样和运行Kaiser测试以确定任何未反应伯胺的存在，而跟踪反应的动力学。上述树脂用于负载树脂的生产，然后用于肽构建。以下的实施例显示例示的肽构建。此实施例的结果见表4。可以理解可以使用在此所述的技术，构成各种组合的肽构件。
可以理解在此所述的方法可用于肽，特别是T-20，和T-20类肽的非常低成本和有效的合成。这样的方法采用固相和液相合成过程以合成和结合具体的肽片段组，从而得到感兴趣的肽。在其它的变化方案中，也产生作为感兴趣肽(如T-20)合成中间体的单个肽片段。在仍然另一个方面，本发明提供这样肽中间体片段的组，该组可以被一起采用以生产全长型T-20和T-20类肽。本领域普通技术人员可以理解生产肽的循环时间总体显著降低，该肽包括但不限于包括许多更小片段组合体的T-20。不仅降低循环时间，而且极大地减少浪费，和极大地提高效率。
在另一方面，纯化由在此所述方法产生的肽或肽片段，和/或也纯化作为目标肽合成中间体的单个肽片段。
进一步理解本发明也可用于产生显示抑制融合相关活动能力的肽和肽片段，重要地，也显示潜在的抗病毒活性。这些肽和肽片段描述于美国专利.Nos.5,464,933、5,656,480和PCT公开No.WO96/19495，该文献在此如明确说明的那样引入作为参考。本发明提供在大规模数量下产生这些治疗剂的方法。
使用固相和液相合成过程制备T-20和T-20片段，以合成和结合具体肽片段组而得到感兴趣的肽。一般情况下，本发明的方法包括在此处所述本发明产生的固体载体上，合成T-20或T-20类肽具体侧链保护的肽片段中间体，在溶液中偶联保护的片段以形成保护的T-20或T-20类肽，随后进行侧链的解保护以得到最终的T-20或T-20类肽。本发明方法一个优选实施方案包括具有如美国专利No.6,015,881(“881专利”)所示氨基酸序列的T-20肽的合成。
本发明进一步涉及作为感兴趣肽(如T-20)合成中间体的单个肽片段。本发明的肽片段包括，但不限于如’881专利中所示的氨基酸序列。
可以理解本发明也可使用常规技术，使用CTC-树脂，产生一个或多个肽片段，和使用在此所述的技术，使用如下文献所述的醇类树脂，产生一个或多个肽片段Bohling等2003年2月12日提交的专利申请，题目为“氨基酸负载的三苯甲醇树脂，氨基酸负载的三苯甲醇树脂的生产方法，及由其生产的生物活性物质和治疗剂”，摘要No.DNA01485。其后可结合获得的肽以获得T-20肽或T-20类肽。
可以理解除T-20以外，本发明的方法，片段和片段组和用于选择片段和片段组的技术可用于合成T-20类片段。在此使用术语“T-20类”表示列于美国专利Nos.5,464,933；5,656,480或PCT公开No.WO96/19495的任何HIV或非HIV肽，每个文献在此全文引入作为参考。
除以上所述的T-20和T-20类肽以外，本发明的方法，片段和片段组可用于合成含有改性氨基和/或羧基端基的肽。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法用于合成结构式中X是乙酰基和Z是酰胺基团的肽。在一个优选的方法中，可以使用任何非二氧化硅类柱填料(用于负载能力的最大化)纯化T-20和T-20类肽和中间体，该填料包括但不限于锆类填料、聚苯乙烯、聚丙烯酸类或在高(大于＞7)pH范围下稳定的其它聚合物类填料。例如，在显示宽pH范围的非二氧化硅负载的柱填料中，该pH包括大于由Tosohaus(Montgomeryville，Pa.)销售的pH值。由这种材料填充的桂可以在低、中或高压色谱中运行。
本发明也提供如在’881专利的表1中所列的具有特定氨基酸序列的T-20和T-20类肽的肽片段中间体，以及’881专利的表2中所列的肽片段中间体组的大规模有效生产。这样的肽中间体，特别是’881专利的表2中所列的肽中间体组用于生产T-20和T-20类肽。
可以采用标准保护基团如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁氧基羰基(Boc)保护肽片段氨基酸残基的任意一个或多个侧链。t-Bu基团是氨基酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的优选侧链保护基团；trt基团是氨基酸残基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的优选侧链保护基团；和Boc基团是氨基酸残基Lys(K)和Trp(W)的优选侧链保护基团。
在片段的合成期间，优选采用三苯甲基(trt)保护基团保护组氨酸残基的侧链。如果不保护，用于从树脂断裂肽片段的酸可有害地与组氨酸残基反应，引起肽片段的降解。
采用三苯甲基(trt)基团保护本发明肽片段的谷氨酰胺残基。然而，可以在某些片段的羧基末端不保护谷氨酰胺残基。可以保护本发明每个肽片段的所有天冬酰胺残基。此外，采用Boc基团保护色氨酸残基。使用在此所述的固相合成技术制备一些单个肽片段，而结合使用固相和溶液相合成技术非必要地制备本发明的其它肽。或者可合成本发明的肽使得连接肽的氨基酸残基的一个或多个键是非肽键。这些另外的非肽键可以采用本领域技术人员公知的反应形成，可包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲、和偶氮键，这些键是列举但只是少数。
在本发明的仍然另一个实施方案中，可以采用在它们的氨基和/或羧基末端上存在的另外化学基团合成包括上述序列的T-20和T-20类肽，使得例如，肽的稳定性，反应性和/或溶解性增强。例如，可以将疏水性基团如苄氧羰基、丹磺酰基、乙酰基或叔丁氧基羰基加到肽的氨基末端。同样，可以在肽的氨基末端布置乙酰基或9-芴基甲氧基-羰基。另外，可以将疏水性基团，叔丁氧基羰基、或酰氨基加到肽的羧基末端。相似地，可以在肽的羧基末端布置对硝基苄基酯基团。
此外，可以合成T-20和T-20类肽使得它们的空间构型改变。例如，可以使用肽的一种或多种氨基酸残基的D-异构体，而不是通常的L-异构体。
仍然进一步，本发明肽的至少一个氨基酸残基可以由一种公知的非天然氨基酸残基取代。如可用于增加本发明肽的稳定性，反应性和/或溶解性的改变。
优选，使用标准FMOC方案由在此所述的固相肽合成(SPPS)技术合成本发明的一个或多个肽片段，参见如Carpino等，1970，J.Am.Chem.Soc.92(19)5748-5749；Carpino等，1972，J.Org.Chem.37(22)3404-3409。
除在此所述的新颖技术以外，或与在此所述的新颖技术结合，可以使用常规技术的树脂生产和负载的一般过程。可以使用例如，通过如下技术进行的树脂负载制备一些片段将树脂，优选超酸敏感性树脂如2-氯三苯甲基树脂加入到反应腔中。将树脂采用氯化溶剂如二氯甲烷(DCM)洗涤。将床排液和加入1.5当量氨基酸和2.7当量二异丙基乙胺(DIEA)在约8-10个体积的二氯乙烷(DCE)中的溶液。应当保护氨基酸的N-末端，优选采用Fmoc保护氨基酸的N-末端，且在必须或适当处应当保护氨基酸的侧链。将混合物采用氮气鼓泡搅拌2小时。在搅拌之后，将床排液并采用DCM洗涤。将树脂上的活性部位采用9∶1MeOH∶DIEA溶液封端约20-30分钟。将床排液，采用DCM洗涤4次并采用氮气净化干燥以得到负载的树脂。然后按照标准洗涤，解保护，偶联和断裂方案构建片段。使用在此所述的新颖技术制备其它片段。然后如所述结合由各种技术制备的片段。
Fmoc是氨基酸N-末端的优选保护基团。依赖于要负载的氨基酸，可以保护或不保护它的侧链。例如，当负载Trp时，应当采用Boc保护它的侧链。相似地，可以采用trt保护Gln的侧链。然而，当在1-16个肽片段合成的制备中负载Gln时，应当不保护它的侧链。不需要保护Leu的侧链。
用于负载树脂和用于肽合成的Fmoc保护的氨基酸可购自Senn或Genzyme，其含有或不含有如所要求的侧链保护基团。可以单独使用在此所述的新颖技术或与其它常规技术结合，制备描述于美国专利No.6,281,331(如完全说明的那样在此引入作为参考)的其它例示肽和片段。
T-1249实施例在此所述的方法和底物也可用于构建描述于美国专利No.6,469,136(“136专利”)的多肽，该专利如完全说明的那样在此引入作为参考。特别地，可以单独使用在此所述的新颖技术或与其它常规技术结合，构建在此称为T-1249和T-1249类肽的肽。这些方法采用固相和液相合成过程，以合成和结合特定肽片段的组，从而得到感兴趣的肽。
在此描述合成肽，特别是在此称为T-1249和T-1249类肽的新颖方法。这些方法采用固相和液相合成过程，以合成和结合特定肽片段的组，以得到感兴趣的肽。一般情况下，该方法包括在固体载体上合成T-1249或T-1249类肽的特定侧链保护的肽片段中间体，在溶液中偶联保护的片段以形成保护的T-1249或T-1249类肽，随后进行侧链的解保护以得到最终的T-1249或T-1249类肽。本发明方法的优选实施方案包括合成氨基酸序列如’136专利中所示的T-1249肽。
本发明进一步提供构建单个肽片段的低成本，高度有效的方法，该肽片段用作感兴趣的肽(如T-1249)合成中的中间体。本发明的肽片段包括，但不限于，氨基酸序列如’136专利的表1所示的那些。在此所述的固相液相合成反应的结合使得可大规模制造高纯度T-1249和T-1249类肽，其具有比现有技术中所述那些更高的产量和更高的收率。可以在一千克或更多千克的规模上合成T-1249和T-1249类肽。
全长型肽的产生本发明用于合成已知为T-1249的肽。T-1249是39个氨基酸残基多肽，它的序列衍生自HIV-1，HIV-2和SIV gp41病毒多肽序列。可以理解除T-1249以外，本发明的方法，片段和片段组和用于选择片段和片段组的技术可用于合成T-1249类片段。在此使用的术语“T-1249类”表示以下文献中所列的任何HIV或非HIV肽1999年5月20日提交的国际申请No.PCT/US99/11219，1999年11月25日公开的国际公开No.WO99/59615，该文献在此全文引入作为参考。
除上述T-1249和T-1249类肽以外，本发明的方法，片段和片段组可用于合成含有改性氨基和/或羧基端基的肽，或其它在高和低pH范围稳定的聚合物类填料。
肽中间体单独使用在此所述的新颖方法或与其它本领域方法结合，构建特定氨基酸序列如’136专利的表1中所列的T-1249和T-1249类肽的一个或多个肽片段中间体，和如’136专利的表2中所列的一个或多个肽片段中间体组。
肽合成优选使用固相合成技术制备单个肽片段，而非必要地使用固相和溶液相合成技术的结合制备本发明的其它肽。合成在T-1249或T-1249类肽的生产中达到极点。
可另外合成本发明的肽使得一个或多个连接肽的氨基酸残基的键是非肽键。这些另外的非肽键可以采用本领域技术人员公知的反应形成，且包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲、和偶氮键，这些键是列举但只是少数。此外，可以合成T-1249和T-1249类肽使得它们的空间构型改变。例如，可以使用肽的一种或多种氨基酸残基的D-异构体，而不是通常的L-异构体。仍然进一步，本发明肽的至少一个氨基酸残基可以由一种公知的非天然氨基酸残基取代。如这些的改变可用于增加本发明肽的稳定性，反应性和/或溶解性。可以合成任何T-1249或T-1249类肽以另外具有共价键连接到其氨基和/或羧基末端的大分子载体基团。这样的大分子载体基团可包括，例如，脂质-脂肪酸共轭物、聚乙二醇、碳水化合物或另外的肽。
使用在此所述的新颖技术制备氨基酸负载的树脂。在搅拌之后，将床排液并采用DCM洗涤。将床排液，采用DCM洗涤4次并采用氮气净化干燥以得到负载的树脂。
Fmoc是氨基酸N-末端的优选保护基团。依赖于要负载的氨基酸，可以保护或不保护它的侧链。例如当负载色氨酸(Trp)时，应当采用Boc保护它的侧链。然而，不需要保护亮氨酸(Leu)的侧链。优选，将谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)保护为叔丁基醚或叔丁基酯。将色氨酸(Trp)和赖氨酸(Lys)保护为叔丁氧基羰基氨基甲酸酯(Boc)。可以采用或不采用三苯甲基保护天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的酰胺侧链。
同时，将序列中要加入到树脂里的随后氨基酸在它的羧基末端活化用于反应。应当采用Fmoc保护每种氨基酸的胺末端。依赖于加入的氨基酸，可以保护或不保护它的侧链。优选，采用t-Bu保护tyr(Y)，Thr(T)，Ser(S)，Glu(E)和Asp(P)的侧链；采用trt保护Gln(Q)和Asn(N)的侧链，和采用Boc保护Lys(K)和Trp(w)的侧链。不需要保护Leu或Ile的侧链。
氨基酸可以按如下方式活化。在室温下，将Fmoc保护的氨基酸(1.5eq)，1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5eq)，和二异丙基乙胺(DIEA)(1.5eq)溶于极性，非质子溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(约7.5vol)。将溶液急冷到0-5℃，然后加入六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)或O-苯并三唑-1-基-四甲基四氟硼酸酯(TBTU)(1.5eq)，随后搅拌5-15分钟以溶解。重要的是在0-5℃下进行活化以最小化氨基酸的外消旋化。由于在其不存在下不能进行活化和外消旋化，HBTU是最后加入到冷溶液中的试剂。
将活化氨基酸的溶液加入到排液后的树脂中，采用DCM(大约2.5vol)洗涤。注意由于HBTU在DCM中不溶，在NMP中进行氨基酸的活化。然而，在此点将DCM加入到反应中以保持树脂珠粒的充分溶胀。在20-30℃下采用N2鼓泡约1小时而搅拌反应。
如果在偶联循环之间将树脂贮存过夜，可以将树脂床排液并在氮气保护下采用NMP覆盖。或者，可以将床排液，在氮气保护下贮存，然后在进行下一个偶联循环之前采用DCM洗涤调节。如果在断裂之前要将完成的片段贮存过夜，由于可以在NMP中发生显著的Fmoc解保护，应当将树脂床采用IPA洗涤到没有NMP。
在判断偶联完成之后，将树脂排液并采用3个NMP的等分试样(大约10vol)洗涤。对于肽片段的随后链节(即氨基酸)重复循环。在最终的偶联反应之后，将树脂采用4个NMP的等分试样(大约10vol)洗涤，然后采用2个等分试样(大约10vol)的DCM和2IPA洗涤。可以采用氮气净化或在烘箱中干燥树脂结合的肽。
例如，根据如下的非限制性技术，可以将通过固相合成技术合成的肽断裂和分离可以使用本领域技术人员公知的技术从树脂断裂肽。例如，1％或2％三氟乙酸(TFA)在DCM中的溶液或TFA在DCM中的1％和2％溶液的结合物可用于断裂肽。乙酸(HOAC)、盐酸(HCl)或甲酸也可用于断裂肽。断裂所要求的具体的断裂剂，溶剂和时间依赖于所断裂的特定肽。在断裂之后，将断裂级分进行标准加工过程以分离肽。典型地，将结合的断裂级分在真空下浓缩，随后采用极性非质子或极性质子溶剂如乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、异丙醇(IPA)、丙酮、乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、NMD、DMAC、DCM等重组，随后采用抗溶剂(antisolvent)如水或己烷沉淀或结晶，并由真空过滤收集。或者，可以在肽分离之后将产物采用有机溶剂或水研磨。
对于全长型T-1249肽的合成，可以将肽中间体偶联在一起以得到T-1249肽。例如，可以使用在此所述的一种或多种方法，将以上所述的肽中间体组偶联在一起以生产T-1249全长型肽。
在某些实施方案中，对于T-1249的合成，可以遵循三片段的途径。“三片段途径”合成表示以三个T-1249中间体肽片段开始的T-1249合成方案，使用固相和液相合成技术将该片段合成和偶联成全长型T-1249肽。
固相肽合成(SPPS)的方法，一般过程向SPPS腔加入FmocLeu-树脂(1eq)。将树脂在5％哌啶DCM(7.5vol)中用氮气净化15-30分钟而调节。将溶剂排出并将树脂在NMP的20％哌啶(5体积)中处理2次，每次30分钟，以除去Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理之后，将树脂采用NMP(5vol)洗涤5-7次达到阴性(negative)choranil测试。
同时，将随后的氨基酸(1.5eq)，HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)在3∶1NMP/DCM(10vol)中结合，使其室温下完全溶解并冷却到0℃。加入HBTU，将溶液搅拌10-15分钟以溶解固体，然后加入到树脂中。将悬浮液在氮气气氛下搅拌1-3小时。采用定性茚三酮测试监测偶联反应。如果反应在3h之后未完成(阳性(positive)茚三酮测试持续)，应当将反应器排液并采用活化氨基酸的新鲜溶液(0.5eq)进行再偶联。正常地在再偶联30min-1h之后，获得阴性(negative)茚三酮测试。对于片段中的剩余氨基酸重复此循环。当构建片段时，需要从5体积增加用于洗涤的溶剂体积。在最终偶联之后，将树脂采用5-8体积的NMP洗涤3次，然后采用10体积的DCM洗涤2次并在真空烘箱中在40℃下干燥到恒重。
从树脂断裂肽的优选方法以下的方法描述了肽AcAA1-12OH从树脂的断裂。然而，相同的方法可用于本发明其它肽片段的断裂。
方法AHOAc的使用将树脂(1g，0.370mmol)采用AcOH/MeOH/DCM(5∶1∶4，20vol，20mL)的混合物在氮气搅拌下处理1.5h并将溶液转移到圆底烧瓶，搅拌，并用水(20vol)处理。将获得的白色淤浆浓缩(旋转蒸发，40℃浴)以除去DCM并过滤收集产物。干燥到恒重提供87A％纯度的0.69g(74％)AcAA1-12OH。将以上树脂第二次处理提供另外的纯度较低(83A％)的0.08g(8.5％)AcAA1-12OH，建议所需反应时间稍大于1.5hr。
方法BTFA的使用将树脂(1wt，20g)采用1.7体积的DCM中1％TFA洗涤5-6次，每次洗涤3-5分钟。将1％TFA/DCM洗液在包含吡啶的烧瓶中收集(与洗液中TFA体积比1∶1)。结合包含洗液的产物(600mL，30vol)并蒸馏除去DCM到最小容器体积(约1/3原始体积)。调节真空以保持15-25℃的容器温度。加入乙醇(6.5vol)并继续蒸馏直到除去DCM(由馏出物的温度增加确定)。再次调节真空以保持15-20℃的容器温度。最终的容器体积应约为8-9个体积。将溶液冷却到5-10℃并在30分钟内加入水(6.5vol)以沉淀AcAA1-12OH。将固体真空过滤收集并用水(2-3vol)洗涤。将淤浆在0-5℃下搅拌30分钟，将固体真空过滤收集并干燥到恒重，以90％收率和84Area(A％)纯度得到16.80g的AcAA1-12OH。
FmocAA27-38OH的SPPS和从树脂的断裂如上所述以10g在0.75mmol/g下负载的FmocTrp(Boc)OR开始，进行FmocAA27-38OH的SPPS。使用断裂方法B(169/120/1，78％收率，87.9A％)。
HPLC条件Vydac C8，cat.No.208TP54，5u，300A，0.9mL/min.，280nm，A0.1％TFA/水，B80％I-PrOH/20％乙腈的混合物和0.1％TFA.60-80％B/30min。典型的样品制备在0.10mL NMP中溶解1mg，采用1mL乙腈稀释。向20μL回路中注入20mu.L。
AA当量降低使用的实施例在此所述的方法出乎意料地具有比常规方法使用较少试剂。可以理解包括各种氨基酸的试剂成本较高。本发明提供比常规技术显著降低的试剂使用和因此在放大时提供显著的成本节约。在一个变化方案中，每当量增长肽链使用小于约1.5当量的氨基酸。在一个变化方案中，每当量增长肽链使用小于约1.4当量的氨基酸。在仍然一个变化方案中，每当量增长肽链使用小于约1.3当量的氨基酸。在仍然不同的变化方案中，每当量增长肽链使用小于约1.2当量的氨基酸。在仍然进一步方面，每当量增长肽链使用小于约1.1当量的氨基酸。
遵循’881专利的方法采用氨基酸负载本发明的树脂，将本发明的负载效率与在’881专利中发现的负载效率比较。将加入的氨基酸数量与负载的数量比较并计算效率。
表
对于三种氨基酸的每一种，与在’881专利中所述的效率相比，使用本发明显著增加了负载效率。降低的偶联时间和增加的负载效率也与肽片段形成期间试剂使用的降低相关联。商业规模下的试剂使用降低导致显著的成本节约和试剂使用。
降低的再偶联实施例在此所述方法的另一个出乎意料的结果是如下事实极大降低或全部消除再偶联物(recouple)。常规方法导致大于约9种氨基酸的氨基酸片段再偶联物。在此使用的方法出乎意料的结果是含有大于约10种氨基酸的T-20或T-1249片段并不需要再偶联物。在规模上，这是此处所述方法的显著优点，并导致再加工的显著节约。在另一方面，生产含有大于约15种氨基酸的T-20或T-1249片段而没有再偶联物。
降低的循环时间实施例进一步确定本发明提供相对于常规方法显著降低的循环时间。在规模上，此特征允许能力受限的装置降低氨基酸负载和肽构建的循环时间。这允许具有设定能力的生产装置增加每个循环或切换的产量。作为示例，相对于常规方法循环时间可以降低多至50％。在本发明的一个变化方案中，可以达到每个循环的循环时间减少约15分钟到约30分钟。当合成更大的肽片段，如十倍体(decamer)时，循环时间可以降低150分钟-300分钟。可以理解在合成甚至更大的肽时，循环时间的节约是显著的。
表
循环实施例将本发明中所述的树脂通过使用标准条件除去肽而循环，然后采用氢氧化钠转化成氯三苯甲醇树脂。然后通过采用亚硫酰氯和催化量二甲基甲酰胺在甲苯中的处理，将氯三苯甲醇树脂转化成CTC。与本领域中目前发现的树脂相比，低空隙空间树脂增加的耐用性导致显著改进的完美珠粒数目和循环树脂的加工性能。
氨基酸收率比较实施例权利要求1的方法进一步包括对于在10mL二氯甲烷/克CTC树脂中的1eq(每克CTC)FMOC-Leu和1.35eq(每摩尔eq的FMOC Leu)二异丙基乙胺，获得大于约75％的负载效率，或对于在10mL二氯甲烷/克CTC树脂中的1eq(每克CTC)FMOC-Trp(boc)和1.35eq(每摩尔eq的FMOC-Trp(boc))二异丙基乙胺，获得60％的负载效率和对于在10mL二氯甲烷/克CTC树脂中的1eq(每克CTC)FMOC-Gln和1.35eq(每摩尔eq的FMOC Gln)二异丙基乙胺，获得75％的负载效率。
尽管以上仅描述了本发明少数优选的实施方案，本领域技术人员可以认识到可以改进和改变实施方案而不背离本发明的主要精神和范围。因此，以上所述的优选实施方案在所有方面解释为说明性的而不是限制性的，本发明的范围由所附的权利要求限定，而不是由上述的说明书限定，并希望在此包括权利要求同等意义和范围内的所有变化。
权利要求
1.一种使用氯三苯甲基氯接头-树脂制备T-20或T-1249组合物，或T-20或T-1249组合物片段的改进方法，其中所述改进包括使用非必要负载氨基酸或氨基酸衍生物的低空隙空间树脂，以产生一个或多个T-20或T-1249片段。
2.权利要求1的方法，其中每当量生长肽链使用小于1.5当量的所述氨基酸。
3.权利要求2的方法，进一步包括提供相对于常规方法约15分钟-约30分钟的循环时间降低。
4.权利要求1的方法，进一步包括获得相对于常规树脂大于约7.5％的氨基酸负载效率增加。
5.权利要求1的方法，进一步包括循环所述低空隙空间树脂。
6.权利要求1的方法，进一步包括制备含有大于约10种氨基酸的T-20或T-1249片段，该方法没有再偶联物。
7.权利要求1的方法，进一步包括制备含有大于约15种氨基酸的T-20或T-1249片段，该方法没有再偶联物。
8.权利要求1的方法，进一步包括循环所述低空隙空间树脂。
9.一种T-20或T-1249组合物，其中一个或多个T-20或T-1249片段由权利要求1的方法制备。
10.一种使用氯三苯甲基氯接头-树脂制备T-20或T-1249组合物，T-20或T-1249组合物片段的改进方法，其中所述改进包括使用含有偏向该树脂表面的官能度的树脂，和该树脂非必要地负载氨基酸或氨基酸衍生物，以产生一个或多个T-20或T-1249片段。
11.权利要求10的方法，进一步包括循环所述树脂。
12.一种T-20或T-1249组合物，其中一个或多个T-20或T-1249片段由权利要求10的方法制备。
13.一种使用氯三苯甲基氯接头-树脂制备T-20或T-1249组合物，T-20或T-1249组合物片段的改进方法，其中所述改进包括使用含有偏向该低空隙空间树脂表面的官能度的低空隙空间树脂，和该低空隙空间树脂非必要地负载氨基酸或氨基酸衍生物，以产生一个或多个T-20或T-1249片段。
14.一种T-20或T-1249组合物，其中一个或多个T-20或T-1249片段由权利要求13的方法制备。
全文摘要
本发明涉及制备商业数量T－20或T－1249组合物，或T－20或T－1249组合物片段的改进方法。该改进包括使用非必要地负载氨基酸或氨基酸衍生物的低空隙空间树脂和/或表面官能化树脂，以产生一个或多个T－20或T－1249片段。
文档编号C07K14/16GK1524873SQ20041000520
公开日2004年9月1日 申请日期2004年2月17日 优先权日2003年2月25日
发明者J·C·博林, M·K·金斯, J·J·迈克纳, W·J·扎布罗德斯基, W·A·齐亚诺, J C 博林, 扎布罗德斯基, 迈克纳, 金斯, 齐亚诺 申请人:罗姆和哈斯公司