专利名称：Il－17产生的抑制的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用白介素-23的拮抗剂(IL-23)来抑制T细胞产生促炎细胞因子白介素-17(IL-17)。本发明还涉及IL-23的拮抗剂在治疗特征在于存在升高水平的IL-17的炎性疾病中的用途。
相关技术描述IL-17是来自T细胞的促炎分子，其刺激上皮、内皮和成纤维细胞来生产其它的炎性细胞因子和趋化因子，包括IL-6，IL-8，G-CSF，和MCP-1(S.Aggarwal，A.L.Gurney，J Leukoc Biol 71，1(2002)；Z.Yao等，Immunity 3，811(1995)；J.Kennedy等，J Interferon Cytokine Res 16，611(1996)；F.Fossiez等，JExp Med 183，2593(1996)；A.Linden，H.Hoshino，M.Laan，Eur Respir J 15，973(2000)；X.Y.Cai，C.P.Gommoll，Jr.，L.Justice，S.K.Narula，J.S.Fine，Immunol Lett 62，51(1998)；D.V.Jovanovic等，J lmmunol 160，3513(1998)；和M.Laan等，J Immunol 162，2347(1999))。
IL-17也与其它细胞因子，包括TNF-α和IL-1β协同作用来进一步诱导趋化因子的表达(Jovanovic等，见上，和M.Chabaud，F.Fossiez，J.L.Taupin，P.Miossec，J Immunol 161，409(1998))。在以下情况中发现IL-17水平显著提高类风湿性关节炎(RA)滑膜中(S.Kotake等，J Clin Invest 103，1345(1999)；和M.Chabaud等，Arthritis Rheum 42，963(1999))，同种异体(allograft)移植排斥过程中(M.A.Antonysamy等，Transplant Proc 31(1999)；M.A.Antonysamy等，J Immunol 162，577(1999)；C.C.Loong，C.Y.Lin，W.Y.Lui，TransplantProc 32(2000)；和H.G.Hsieh，C.C.Loong，W.Y.Lui，A.Chen，C.Y.Lin，Transpl Int 14，287(2001))，和其它慢性炎性疾病，包括多发性硬化(multiplesclerosis)(K.Kurasawa等，Arthritis Rheum 43，2455(2000))和牛皮癣(C.Albanesi等，J Invest Dermatol 115，81(2000)，和B.Homey等，J Immunol164，6621(2000))。尽管IL-17由激活的T细胞产生是清楚的，以前的报告并没有提供它在以Th1和Th2为两极的(polarized)细胞因子图谱(profile)范例内的明确分类。
IL-23是异源二聚体细胞因子，它与白介素-12(IL-12)共享亚基p40，该亚基与独特的亚基p19结合(B.Oppmann等，Immunity 13，715(2000))。已经报道IL-23促进T细胞，特别是记忆T细胞的增殖(D.M.Frucht，Sci STKE2002 Jan 82002(114)PE1)。近来描述转基因p19小鼠显示了复杂的全身性炎症(profound systemic inflammation)和中性白细胞增多症(neutrophilia)(M.T.Wiekowski等，J Immunol 166，7563(2001))。
至今还没有建立细胞因子IL-17和IL-23的表达和生物作用之间的相关性。
发明概述本发明一方面涉及抑制T细胞产生白介素-17的方法，其包括用白介素-23(IL-23)的拮抗剂处理T细胞。
本发明另一方面涉及治疗哺乳动物受试者中的炎性疾病的方法，所述疾病特征在于白介素17(IL-17)的表达提高，其包括给药所述受试者有效量的白介素-23的拮抗剂(IL-23)。
本发明另一方面涉及鉴定抗炎制剂的方法，其包括如下步骤(a)在存在或缺无候选分子时，保温(incubate)T细胞培养物与IL-23；(b)监测(monitor)所述培养物中IL-17的水平；并(c)如果在所述候选分子存在时IL-17的水平比该候选分子缺无时的IL-17水平低，鉴定所述候选分子为抗炎制剂。
本发明另一方面涉及诱导在哺乳动物受试者中产生IL-17的方法，其包括给药所述受试者IL-23的激动剂。
所有方面，拮抗剂或激动剂都优选是抗IL-23抗体或抗IL-23受体的抗体，其包括抗体片段。炎性疾病优选是慢性炎性疾病，如例如类风湿性关节炎(RA)，可导致同种异体排斥的移植物抗宿主反应，多发性硬化(MS)或牛皮癣。IL-17产生的诱导通常用于患细菌感染诸如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的病人。
附图简述
图1不同细胞种类中的IL-17产生(A)从C57/BL-6小鼠制备单个脾细胞悬液，并通过密度梯度离心从悬浮的脾细胞分离单个核细胞(mononuclear cell)。在存在或缺无微生物脂肽(microbiallipopeptide)LBP(100ng/ml)，LPS(100ng/ml)或LTA(100ng/ml)时，培养2×106细胞/ml 3天，之后收集所述细胞并用ELISA分析IL-17。(B)从鼠脾细胞获得纯化的T细胞，之后筛选经FACS分选的、CD90标记的细胞中的阳性细胞。在平板结合的抗CD3(5μg/ml)，或来自活化的树突细胞(LPS-处理的)的上清存在或缺无时培养这些细胞(1×106细胞/ml)3天，收集培养物上清并用ELISA试剂盒分析IL-17水平。所述树突细胞来自巨噬细胞(从脾细胞悬液作为粘附性细胞群(adherent population)获得)，该过程是通过用rmGM-CSF(2ng/ml)和rmIL-4(1000U/ml)处理巨噬细胞4天，用LPS(0.5μg/ml)洗涤并重新活化(re-activating)实现的。显示3个独立试验的代表性(Representative)结果。
图2IL-23刺激IL-17的产生A.用100U/ml重组IL-2培养从脾细胞分离的单个核细胞(2×106细胞/ml)并在存在或缺无各种浓度的IL-23(0.1-1000ng/ml)时保温6天。用ELISA测定在培养物上清累积的IL-17水平。B.用定量RT-PCR测定应答于IL-23处理的IL-17mRNA水平变化。图中显示的(Plotted)是PCR反应Ct(循环阈值(cycle threshold))的相对变化。每个样本的数据相对于存在于每个样本中的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)mRNA水平取准，然后再次在样品间相对于零时间(time zero)未刺激状况时存在的IL-17 mRNA水平取准。因为每个Ct对应一个PCR循环，一个Ct约等于mRNA丰度(abundance)变化的2倍。在括号中注明5Ct和10Ct变化的大致mRNA倍数差异。用来自4只小鼠的脾细胞做试验，用x代表单个数据点并用条型柱(bar column)表示Ct变化的均值。C.如图2B的说明，用定量RT-PCR测量IL-17家族成员IL-17F应IL-23处理的mRNA水平变化。
图3IL-23作用于记忆T细胞来刺激IL-17产生用(a)CyC-CD4+PE-CD44或(b)CyC-CD4+PE-CD62L对从鼠脾细胞单个细胞悬液分离的单个核细胞进行染色，并分选具有以下性质的CD4+细胞CD44高/CD62L低或CD44低/CD62L高，前者是记忆表型，后者是原初表型。在存在或缺无IL-23(或其煮制物(boiled prep)作为对照)、平板结合的抗CD3(5μg/ml)和抗CD28(1μg/ml)的条件下，用100U/ML的重组IL-2培养所分选的细胞5天，洗涤并用抗CD3的抗体再刺激(re-stimulate)另外24小时。收集上清并用ELISA测量IL-17水平。
图4IL12 p40抗体阻断IL-23依赖性IL-17产生(A)用IL-23(100ng/ml)在37℃预保温浓度渐增加的p40抗体或不相关的同种型(isotype)-匹配的对照抗体1小时，然后在重组IL-2存在时，与从小鼠的脾分离的单个核细胞(2×106细胞/ml)再保温5-6天。收获上清并用ELISA测量IL-17水平(左边的组(panel))。将最适浓度的IL-12p40抗体或不相关的同种型匹配的-对照抗体与经LPS刺激的树突细胞(10％v/v)的经调节的(conditioned)培养基在37℃预保温1小时，然后在重组IL-2存在时，与从小鼠的脾分离的单个核细胞(2×106细胞/ml)另外保温5天。收获上清并用ELISA测量IL-17水平(右边的图)。(B)在存在ConA时培养从脾细胞分离的单个核细胞3天，并用ELISA测量上清中的IL-17水平，所述脾细胞来自野生型小鼠(C57/BL6)或缺少IL-12组分之一，即IL12a-/-(p35敲除)或IL12b-/-(p40敲除)的小鼠。
图5IL-12对IL-17产生的效果。(A)在存在纯化的IL-23(1nM)及指定浓度的IL-12时，保温从脾细胞培养物分离的单个核细胞5天，然后洗涤并用ConA再刺激另外24小时。用ELISA试剂盒测量细胞上清中的IL-17水平。(B)在存在或缺无纯化的IL-23(1nM)时，保温从脾细胞培养物分离的单个核细胞5天，然后洗涤并用ConA再刺激另外24小时，所述脾细胞培养物来自野生型或缺乏IL-12Rβ2(IL-12Rβ2-/-ko)的小鼠。用ELISA试剂盒测量细胞上清中的IL-17和IFN-γ水平。
图6IL-23p19基因座的靶向。A除非另外用双斜线标出的位置，按比例(to scale)描绘了天然的IL-23p19基因座(顶部)，靶向型(targeting)构建体(中间)，及正确靶向的基因座(底部)，。空心方块(Open box)指示出编码型外显子，阴影方块代表编码所得到的信使RNA(mRNA)的5′和3′未翻译区的外显子。对p19基因的四个编码外显子编号。带箭头的方块指示了新霉素(neo)的启动子区和胸苷激酶(thymidine kinase)(tk)选择性盒子，标记有EGFP的空心方块指示了增强的绿色荧光蛋白报道基因的位置。用于克隆和臂分析的限制性位置被如下标记B，BamHI；S，Sac II；E，Eco RI；Bg，Bgl II；X，XhoI。用来扩增短臂的反义引物的位置用字母P和箭头指示。在野生型(WT)和突变型(MUT)基因座中标出用Bam HI和Eco RI消化所得的限制性片段大小，并且用粗线显示用于通过southern印迹来检测这些片段的两个探针的位置。B和C分别为用探针I检测的Bam HI消化产物和用探针II探测的Eco RI消化产物的Southern印迹分析。从野生型(WT)胚胎干(ES)细胞，从ES克隆1c5，并从野生型、杂合的(HET)、和敲除(KO)小鼠提取DNA。在印迹左侧指明带的名称(identity)，而在右侧给出带的大小。
图7IL-23 p19-/-小鼠的总血清免疫球蛋白水平。用同种型特异性ELISA确定16只野生型(实心圆)和IL-23p19-/-(空心圆)小鼠的免疫球蛋白同种型血清水平。在图底端指出免疫球蛋白的同种型。
图8IL-23 p19-/-小鼠的体液免疫反应。A-G用卵清蛋白(OVA)免疫一次(1st)和两次(2nd)后IgG1(A)，IgG2a(B)，IgG2b(C)，IgG3(D)，IgE(E)，和IgA(F)的OVA特异性水平。实心圆，野生型小鼠；空心圆，IL-23p19-/-小鼠，灰色圆，IL-12p40-/-小鼠。如方法和材料部分所述计算任意单位(Arbitraryunit)。在图底端用黑色水平条和数值指出每组均值。用星号标记小于0.05的统计学显著的P值。
图9T非依赖性B细胞反应在IL-23 p19-/-小鼠是正常的。用ELISA确定用TNP-LPS(I型，左)或TNP-Ficoll(II型，右)免疫的小鼠的TNP特异性IgM血清水平。实心圆，野生型小鼠；空心圆，IL-23 p19-/-小鼠。
图10记忆性T细胞功能。在第0日用卵清蛋白免疫野生型(实心圆)和IL-23 p19-/-小鼠(空心圆)，并在第21天用TNP-OVA攻击。在第0，14和26天收获血清，并用ELISA检验TNP-特异性IgG1(A)和IgG2a(B)的存在。对于IgG1，使用可购买的标准品(standard)。对于IgG2a，如方法和材料部分所述计算任意单位。
图11迟发型超敏(DTH)反应(Delayed type hypersensitivity(DTH)reaction)。抗原特异性肿胀用足垫厚度相对于攻击前刚测定的足垫厚度的增加百分比来计算。取每组的所有六只小鼠的结果的均值，用误差条(error bar)代表标准偏差。将未致敏的第二个野生型组用作单独被抗原诱导的肿胀的对照。各种符号内的星号表明对应组和野生型小鼠之间的差别是统计学显著的(P＜0.05)。WT，野生型；p19 ko，IL-23 p19-/-小鼠；p40 ko，IL-12 p40-/-小鼠。
图12IL-23 p19-/-抗原递呈细胞的T细胞引发正常但产生的IL-17水平降低。Abalb/c T细胞与野生型(黑色条)或IL-23p19-/-(白色条)树突细胞的联合体外异源刺激(allostimulation)实验。通过FACS分离原初CD4+T细胞和CD8-/CD11c+/MHC-II+细胞，并在存在或缺无细菌脂肽(BLP)时保温它们。保温5天后，确定上清中的增殖和细胞因子水平。APC，抗原递呈细胞。B体内T细胞反应。分离来自用KLH免疫的野生型(黑色条)或IL-23 p19-/-(白色条)小鼠的淋巴结细胞悬液，并在体外用25μg/ml的KLH再刺激。培养5天后测量增殖和IL-17水平。
优选实施方案详细描述A.定义除非另外限定本文所用技术和科学术语与本发明领域技术人员通常理解的同义。见例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，X Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(ColdSprings Harbor，NY 1989)。为本发明目的，如下限定如下术语。
本文术语“拮抗剂”以最广义使用。IL-23“拮抗剂”是无论机制如何，部分或完全阻断，抑制，中和，预防(prevent)或干扰IL-23生物活性的分子。为本发明目的，所述生物活性优选是诱导活化的T细胞产生IL-17的能力。鉴定IL-23的拮抗剂，例如可基于它们抑制，阻断，或逆转IL-23介导的、由活化(例如记忆)T细胞群产生IL-17的能力。例如可在被试化合物(testcompound)存在或缺无时保温活化的T细胞培养物与IL-23，并例如通过ELISA，监测细胞培养物上清的IL-17水平。如果IL-17的水平在所述被试化合物存在时比其缺无时低，那么所述被试化合物是IL-23的拮抗剂。或者，在用被试化合物处理前后，可用实时RT-PCR监测组织中的IL-17mRNA表达，该组织也表达IL-23。所述被试化合物存在时IL-17的mRNA水平下降指示该化合物是IL-23的拮抗剂。IL-23拮抗剂的例子包括但不限于抗天然序列的IL-23多肽亚基，例如p40亚基的中和性抗体，包含与免疫球蛋白恒定区序列融合的IL-23亚基的免疫粘附素(immunoadhesin)，小分子，能抑制编码天然序列的IL-23多肽亚基的基因的翻译和/或转录的反义寡核苷酸，引诱物(decoy)，例如IL-23基因的遗传引诱物等。类似地，IL-23的拮抗剂包括但不限于抗天然IL-23受体的亚基，例如IL-23Rβ1或IL-23R亚基的中和性抗体，包含与免疫球蛋白恒定区序列融合的IL-23受体亚基的免疫粘附素，小分子，能抑制编码天然序列IL-23受体多肽亚基的基因的翻译和/或转录的反义寡核苷酸，引诱物，例如IL-23受体基因的遗传引诱物等。
本文术语“激动剂”以最广义使用。IL-23的激动剂是无论机制如何，模拟天然序列IL-23介导的生物活性的任何分子。为本发明目的，所述生物活性优选是诱导活化的T细胞产生IL-17的能力。IL-23的激动剂的例子包括但不限于抗亚基，例如天然IL-23受体的IL-12Rβ1或IL-23R亚基的激动剂抗体，肽和有机小分子。
“反义寡脱氧核苷酸”或“反义寡核苷酸”(所述术语互换使用)被限定为能以序列特异性方式抑制靶基因的转录和/或翻译的核酸分子。术语“反义”指的是核酸与所述靶基因的编码(“有意义(sense)”)遗传序列互补的事实。通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对，反义寡核苷酸与新生(nascent)mRNA以反向平行定向(antiparallel orientation)杂交。通过结合靶mRNA模板，反义寡核苷酸阻断被编码的蛋白的成功翻译。该术语特异地包括叫做“核酶”的反义制剂(agent)，通过加入有天然自身剪接活性的序列，它已经被设计来诱导靶RNA的催化裂解(Warzocha和Wotowiec，″Antisensestrategybiological utility and prospects in the treatment of hematologicalmalignancies.″Leuk.Lymphom24267-281 )。
本文术语“抗体”以最广义使用，并且特异性包括单克隆抗体(包括拮抗剂，例如中和性抗体和激动剂抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段。所述单克隆抗体特异性包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与来自具体物种(species)或属于具体抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其它部分与来自其它物种或属于其它抗体类或亚类的抗体、以及这种抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出了所需的生物活性(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855 )。所述单克隆抗体还包括“人源化”抗体或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其它抗原结合型的亚序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况(For themost part)，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自所述受者CDR的残基被具有理想的特异性、亲合力和载量(capacity)的非人物种(供者抗体)的CDR的残基所取代，所述非人物种诸如小鼠、大鼠或兔。有时，人免疫球蛋白Fv FR残基被对应的非人残基所取代。另外，人源化抗体可包含不存在于受者抗体也不存在于引入的(imported)CDR或框架序列发现的残基。做这些修饰来进一步改进(refine)抗体并使其性能(performance)达到最大化。通常，人源化抗体基本包含所有的至少一个、通常两个可变区，其中所有或基本所有的CDR区对应于那些非人免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本所有的FR区是那些人免疫球蛋白序列的FR区。所述人源化抗体也最适地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，其通常来自人免疫球蛋白。更多细节见Jones等，Nature，321522-525(1986)；和Reichmann等，Nature，332323-329(1988)。所述人源化抗体包括PRIMATIZED抗体，其中抗体的抗原结合区源自用感兴趣的抗原免疫恒河猴(macaque monkey)产生的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2，和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体(Zapata等，Protein Erg 8(10)1057-1062(1995))；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
本文术语“炎性疾病”或“炎性病症(disorder)”指导致炎症的病理状态，其通常由中性粒细胞趋化作用(neutrophil chemotaxis)造成。此种疾病的例子包括炎性皮肤病(inflammatory skin disease)，其包括牛皮癣和特应性皮炎(atopic dermatitis)；全身性硬皮病(systemic scleroderma)和硬化(sclerosis)；与炎症性肠病(inflammatory bowel disease)(IBD)(如克隆氏病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎)相关的反应；缺血再灌注疾病(ischemic reperfusion disorder)，其包括外科手术组织再灌注损害(surgical tissue reperfusion injury)，心肌缺血性疾病(condition)如心肌梗塞，心脏停搏，心脏手术后再灌注和经皮经血管冠状动脉血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty)后的狭窄(constriction)，中风，和腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm)；继发于中风的脑水肿；颅创伤(cranial trauma)，低血容量性休克；窒息；成人型呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome)；急性肺损伤；白塞病(Behcet′sdisease)，皮肌炎；多发性肌炎；多发性硬化(MS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；眼色素层炎(uveitis)；骨关节炎；狼疮肾炎；自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(RA)，干燥综合征(Sjorgen′s syndrome)，血管炎；涉及白细胞渗出(leukocyte diapedesis)的疾病；中枢神经系统(CNS)炎症性疾病，继发于败血症(septicaemia)或创伤的多器官损伤综合征(multiple organ injury syndrome)；酒精性肝炎；细菌性肺炎；抗原抗体复合体介导的疾病，其包括肾小球肾炎；脓毒病(sepsis)；结节病(sarcoidosis)；对组织/器官移植的免疫病理性反应；肺的炎症，其包括胸膜炎，肺泡炎，血管炎，肺炎，慢性支气管炎，支气管扩张，弥散性全细支气管炎(panbronchiolitis)，超敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis)，特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF)，和囊性纤维化等。优选的适应征包括但不限于慢性炎症，自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)，类风湿性关节炎(RA)，类风湿性脊椎炎(rheumatoidspondylitis)，痛风性关节炎(gouty arthritis)，及其它关节炎疾病(arthriticcondition)，多发性硬化(MS)，哮喘，系统性红斑狼疮(systhemic lupuserythrematosus)，成人型呼吸窘迫综合征，白塞病，牛皮癣，慢性肺炎性疾病(pulmonary inflammation disease)，移植物抗宿主反应，克隆氏病，溃疡性结肠炎，炎症性肠病(IBD)，阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)，和发热(pyresis)，以及涉及炎症和病症的任何疾病或紊乱。
术语“治疗”指治疗性治疗和预防(prophylactic or preventative)的措施，其中目的是为了预防或减缓(减轻(lessen))不希望的生理改变或紊乱。为本发明目的，有益或理想的临床结果包括但不限于，症状的减轻(alleviation)，疾病范围(extent of disease)的缩小(diminishment)，疾病状态的稳定(即未恶化)，疾病进展的迟发或减慢，疾病状态的改善或缓和(palliation)，及症状缓解(remission)(无论部分或整体)，而无论其可检测与否。“治疗”也指与未接受治疗时的预期存活期相比延长的存活期。需要治疗的对象包括已患所述疾病，和易于患所述疾病，或有待预防所述疾病的那些对象。
“慢性”给药指以与急性方式相对的持续方式来给予一或多种制剂，从而维持理想效果延长的(extended)一段时间。
“间歇”给药不是连续无间断的治疗，而是循环的(cyclic in nature)。
“联用”一或更多其它治疗制剂给药包括以任何顺序同时(共同(concurrent))和连续给药。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选是人。
本文术语“哺乳动物”指任何被分类为哺乳动物的动物，其包括但不限于人，家养(domestic)和饲养(farm)动物，和观赏动物(zoo animal)，竞技动物(sports animal)或宠物动物，如绵羊，狗，马，猫，母牛等。优选，本文哺乳动物是人。
“有效量”是足够实现有益或理想治疗性(包括预防性)结果的量。可以通过一或更多给药来给予有效量。
B.本发明实施方式除非另外指出，本发明实践使用本领域内的分子生物学(包括重组技术)，微生物，细胞生物学，生物化学和免疫学的常用技术。文献中详细解释了这些技术，如″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2ndedition(Sambrook等，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；″Methods inEnzymology″(Academic Press，Inc.)；″Handbook of Experimental Immunology″，4th edition(D.M.Weir & C.C.Blackwell，eds.，Blackwell Science Inc.，1987)；″Gene TransferVectors for Mammalian Cells″(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；″CurrentProtocols in Molecular Biology″(F.M.Ausubel等eds.，1987)；″PCRThePolymerase Chain Reaction″，(Mullis等，eds.，1994)；和″Current Protocols inImmunology″(J.E.Coligan等，eds.，1991)。
如前述，本发明是基于如下认识IL-23诱导活化T细胞，特别是记忆细胞产生IL-17，并且IL-23的拮抗剂能抑制此进程。因此，IL-23的拮抗剂是治疗炎症状况的有希望的侯选药物(promising drug candidate)，所述炎症状况的特征为IL-17水平升高。相反，IL-23的激动剂可用于诱导对多种感染的保护性免疫反应，包括分枝杆菌感染，如例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染。
1.鉴定IL-23的拮抗剂或激动剂的筛选试验本发明包括鉴定IL-23的拮抗剂的筛选试验，所述拮抗剂具有治疗特征为存在水平升高的IL-17的炎症性状况的功效。本发明还包括鉴定IL-23的激动剂的筛选试验，所述激动剂具有刺激对感染如结核分枝杆菌感染的保护性免疫反应的功效。
候选拮抗剂药物的筛选试验可被设计用来鉴定化合物，其与IL-23(包括亚基或它的其它片段)或IL-23受体(包括亚基或它的其它片段)结合或复合，或另外干预IL-23与其它细胞蛋白的相互作用，从而干预IL-23产生或起作用。本文提供的筛选试验包括适合高通量(high-throughput)筛选化学文库的试验，使它们特别适合鉴定小分子候选药物。通常，结合试验和活性试验是已知的。
可以多种形式进行所述试验，其包括但不限于本领域公知的蛋白-蛋白结合试验，生物化学筛选试验，免疫测定，和基于细胞的试验。
对于拮抗剂和激动剂的所有试验都是常用的，因为它们需要在一定条件下使候选药物与IL-23多肽，或和IL-23受体多肽，或所述多肽的片段(特别是包括IL-23和IL-23受体亚基)接触足够长的时间来使这两种组分相互作用。例如，所述人IL-23p19亚基是189个氨基酸的多肽，其序列以登录号AF301620可得自EMBL数据库(NCBI 605580；GenBank AF301620；Oppmann等，如上述)。IL-23多肽亚基p40的序列也已知(也称为IL-12p40亚基；NCBI161561)。IL-23所结合的IL-12Rβ1的序列以登录号NCBI 601604可得。制备结合所述多肽的抗体或小分子对本领域技术人员公知。
结合试验中，所述相互作用是结合，并且形成的复合体可被分离或在反应混合物中被检测。具体实施方案中，IL-23或IL-23受体多肽或所述候选药物通过共价或非共价连接(attachment)被固定在固相上，例如在微量滴定板上。非共价连接通常通过用IL-23或IL-23受体多肽的溶液包被固体表面并干燥来完成。或者，可使用对待固定的IL-23多肽或IL-23受体多肽具有特异性的固定化抗体，例如单克隆抗体来将其锚定(anchor)到固体表面。进行所述试验是通过将可以使用检测标签来标记的未固定组分，加入到固定的组分，例如含有所述被锚定组分的被包被的表面。当所述反应完成时，例如通过洗涤来去除未反应组分，再检测锚定到固体表面的复合体。当原来未固定的组分携带检测标签时，检测到固定在表面的标签表明出现了复合。当原来未固定的组分不携带标签时，可例如通过使用特异性结合所述固定化复合体的经标记的抗体来检测所述复合。
如果候选化合物是与IL-23或IL-23受体相互作用但不与之结合的多肽，可用已知检测蛋白-蛋白相互作用的方法来测定其与各自的多肽的相互作用。此试验包括传统途径，如例如交联，共免疫沉淀和用梯度或层析柱共同纯化。另外，可用基于酵母的遗传系统监测蛋白-蛋白相互作用，其如Fields及其合作者描述(Fields和Song，Nature(London)，340245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))如Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)公开。很多转录活化物(activator)，如酵母GAL4，其由两个物理上不连续的模块区(physically discretemodular domain)组成，一个作为DNA结合区，另一个用作转录活化区(activation domain)。在上述文献中描述的酵母表达系统(通常指“双杂合体(two-hybrid)系统”)利用这个性质，并使用两个杂合蛋白(hybrid protein)，其中之一是靶蛋白，其与GAL4的DNA结合区融合，并且另一个是候选活化蛋白，其与活化区融合。受GAL4-活化的启动子控制的GAL1-lacZ报道基因的表达依赖于经蛋白-蛋白相互作用的GAL4活性重建。包含相互作用的多肽的集落(Colonies)用β-半乳糖苷酶的(chromogenic)产色底物来检测。用双杂合体技术鉴定两个特异性蛋白间的蛋白-蛋白相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)从Clontech可购。此系统也能扩展到定位(map)涉及特异性蛋白相互作用的蛋白结构域并精细到(pinpoint)对这些相互作用关键的氨基酸残基。
可如下测定干预IL-23与其它细胞内或细胞外组分，具体是IL-17的相互作用的化合物。通常制备包含IL-23和细胞内或细胞外组分(例如IL-17)的反应混合物，在一定条件下允许两个产物相互作用足够长的时间。为测定候选化合物抑制IL-23和IL-17相互作用的能力，在被试化合物缺无和存在时进行该反应。另外，可将安慰剂加入反应混合物来作为阳性对照。既然IL-23已经显示诱导了IL-17的产生，可例如通过在被试化合物缺无和存在时测量IL-17的量来测定被试化合物抑制IL-23/IL-17相互作用的能力。如果IL-17的量在候选化合物缺无时比在其存在时低，那么所述候选化合物是本发明限定的IL-23的拮抗剂。
基于它们抑制IL-23诱导IL-17产生的能力来鉴定的IL-23拮抗剂是治疗炎性疾病的候选药物，所述疾病的特征是存在水平提高的IL-17。
基于它们促进IL-23诱导IL-17产生的能力来鉴定的IL-23激动剂是候选药物，其诱发或支持对感染，如结核分枝杆菌感染的保护性免疫反应，结果治疗了传染病(infectious disease)，如结核病。
强调这里特异性讨论的筛选试验仅仅是为了解释。根据所筛选的候选拮抗剂种类(例如多肽，肽，非肽的小有机分子，核酸等)选择的多项其它试验对本领域技术人员公知并且同等适用本发明目的。
2.抗IL-23和抗IL-23受体的抗体具体实施方案中，IL-23的拮抗剂或激动剂是IL-23(例如IL-23亚基)的单克隆抗体，包括抗体片段。其它具体实施方案中，IL-23的拮抗剂和激动剂包括IL-23受体(例如IL-23受体的亚基)的单克隆抗体。上面已经讨论了IL-23，包括其亚基。IL-23的受体包含两个亚基IL-12Rβ1，和近来被讨论叫做IL-23R的亚基(Parham等，J.Immunol.1685699-5798(2002))。对任一亚基的抗体都特异地在本发明范围内。对于拮抗剂的情况，具体优选特异性结合IL-23R亚基的抗体，因为它们特异性阻断了IL-23介导的生物活性。
生产单克隆抗体的方法本领域公知。因此，可用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)描述的那些。杂交瘤方法中，通常用免疫制剂免疫小鼠、豚鼠或其它合适的宿主动物，来激发(elicit)产生或能产生会特异性结合到免疫制剂的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外免疫淋巴细胞。
所述免疫制剂通常包括IL-23或IL-23受体多肽或其融合蛋白。一般来说，如果需要人源的细胞那么使用外周血淋巴细胞(″PBL″)，或如果需要非人哺乳动物来源那么使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用合适的融合制剂，如聚乙二醇将所述淋巴细胞与固定细胞系融合来形成杂交瘤细胞[Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103]。固定的细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，具体是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。所述杂交瘤细胞可能被培养在合适的培养基中，其优选包含一或更多可抑制未融合的固定化细胞的生长或存活的物质。例如如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(guanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶(″HAT培养基″)，所述物质防止HGPRT-缺陷的细胞生长。
优选的固定细胞系是高效融合的，其支持由所选择的产生抗体的细胞稳定高水平地表达抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感。更优选的固定细胞系是鼠骨髓瘤系，其例如可得自the Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California和美国典型培养物保藏中心(the AmericanType Culture Collection，Manassas，Virginia)。也描述了产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63]。
也可测定用于培养所述杂交瘤细胞的培养基中抗IL-23或IL-23受体的单克隆抗体的存在。优选，所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性用免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。所述技术和试验本领域已知。所述单克隆抗体的结合亲合力可例如，用斯卡查德分析(Scatchard analysis)，Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)确定。
鉴定了理想的杂交瘤细胞后，可用限制性稀释方法亚克隆所述克隆并用标准方法使其生长[Goding，如上述]。适合此目的培养基包括，例如Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)和RPMI-1640培养基。或者，所述杂交瘤细胞可在体内如在哺乳动物的腹水(ascite)内生长。
可用常规免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水分离或纯化由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，所述方法如例如，蛋白A-琼脂糖凝胶(Sepharose)，羟基磷灰石(hydroxylapatite)层析，凝胶电泳，透析或亲和层析。
也用重组DNA方法，如美国专利4,816,567所述的那些来生产单克隆抗体。用常规方法可容易地分离并测序编码本发明单克隆抗体的DNA(例如，通过使用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。用本发明的杂交瘤细胞作为所述DNA的优选来源。一旦分离，可将所述DNA置入表达载体，然后将其转染到不会另外产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞，如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，来在重组细胞中合成单克隆抗体。也可修饰所述DNA，例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列[美国专利4,816,567；Morrison等，如上述]或通过使免疫球蛋白编码序列与所有的或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列共价连接。所述非免疫球蛋白多肽可以被本发明抗体恒定区取代、或可被本发明抗体一个抗原结合位点的可变区取代来产生嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法本领域公知。例如，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和被修饰的重链。通常在Fc区的任何点截短所述重链来避免重链交联。或者，通过相关的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代或缺失来避免交联。体外方法也适合制备单价抗体。
本发明抗IL-23和抗IL-23受体的抗体还可以是人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，和F(ab′)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)，其包含来自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者互补决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性、亲合力和载量的来自非人物种(供者抗体)的CDR残基取代，所述非人物种如小鼠、大鼠或兔。有时，所述人免疫球蛋白Fv FR框架残基被对应的非人残基取代。人源化抗体还可包含不在受者抗体和输入的CDR或框架序列发现的残基。通常，所述人源化抗体基本包含所有的至少一个、通常两个可变区，其中所有或基本所有的CDR区对应于那些非人免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本所有的FR区是那些人免疫球蛋白共有序列的FR区。所述人源化抗体也最适包含免疫球蛋白通常是人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)]。
人源化非人抗体的方法本领域公知。通常人源化抗体具有由非人来源引入它的一或更多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变区。人源化基本用Winter及合作者的方法进行[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature.332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)]，它是将啮齿动物的CDR或CDR序列取代为人抗体的对应序列。因此，此“人源化的”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上不足完整(less than intact)的人可变区已经被来自非人物种的对应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中类似位置(analogous site)的残基取代。
也可用多种本领域公知技术生产人抗体，所述技术包括噬菌体显示文库(phage display libraries)[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。也可用Cole等和Boerner等的技术来制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(186-95(1991)]。同样，可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物来生产人抗体，所述转基因动物例如内源性免疫球蛋白基因已被部分或全部失活的小鼠。攻击后观察人抗体产生，它与在人中见到的所有方面十分类似，包括基因重排(rearrangement)，装配(assembly)和抗体库(repertoire)。此方法的描述例如见美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及如下科学文献Marks等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 21826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
Mendez等(Nature Genetics 15146-156(1997))进一步改进了技术并产生了名为“Xenomouse II”的转基因小鼠系，用抗原攻击它时会产生高亲和力的完全人抗体。通过将巨碱基(megabase)人重链和轻链基因座种系整合(germ-line integration)到如上缺失内源性JH节段的小鼠中来实现它。所述Xenomouse II容纳(harbor)了1,020kb的人重链基因座，其包含大约66个VH基因，完全的DH和JH区，以及三个不同的恒定区(μ，δ和χ)，它还容纳了800kb的人κ基因座，其包含32个Vκ基因，Jκ节段和Cκ基因。这些小鼠产生的抗体十分类似在人见到的所有方面，包括包括基因重排，装配和抗体所有组成成分。所述人抗体优选表达超过内源性抗体，因为内源性JH节段的缺失避免了鼠基因座上的基因重排。
或者，可使用噬菌体显示技术(McCafferty等，Nature348，552-553(1990))，用未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成成分在体外产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V区基因克隆到如M13或fd的丝状噬菌体(filamentous bacteriophage)的主要或次要外壳蛋白(major orminor coat protein)基因编码框内(in-frame)，并在噬菌体颗粒表面上显示为有功能的抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于所述抗体功能性质进行选择也就选择了编码表现出那些性质的抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟了B细胞的一些性质。可用多种形式进行噬菌体显示有关它们的综述见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3，564-571(1993)。可用各种V-基因节段来源来作噬菌体显示。Clackson等，Nature352，624-628(1991)分离了抗噁唑酮(oxazolone)抗体的多样性阵列(array)，所述抗体来自源自免疫小鼠脾脏的V基因的小随机组合文库(random combinatorial library)。可构建来自未免疫的人供者的V基因的所有组成成分，并且可基本依据如Marks等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J12，725-734(1993)所述的技术分离抗多种抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。天然免疫反应中，抗体基因以高速(at a high rate)累积突变(体细胞高变(somatic hypermutation))。一些引入的变化会使亲和力更高，并且在随后的抗原攻击中优选使显示高亲和力的表面免疫球蛋白的B细胞复制并分化。可通过使用“链改组(chain shuffling)”的技术来模拟此天然过程(Marks等，BiolTechnol.10，779-783 )。此方法中，要提高通过噬菌体显示获得的“第一(primary)”人抗体的亲合力，可通过用从未经免疫的供者获得的V区基因的天然存在变体库(库)取代重链和轻链V区的基因。此技术可产生亲合力在nM范围的抗体和抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)已描述了制造非常大的噬菌体抗体所有组成成分的策略。
已经开发了产生抗体片段的多种技术。传统上通过蛋白水解消化完整抗体来得到这些片段(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science 22981(1985))。然而现在可直接由重组细胞产生这些片段。例如，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联来形成F(ab′)2片段(Carter等，Biol Technology 10163-167(1992))。另一个实施方案中，用亮氨酸拉链(zipper)GCN4形成F(ab′)2，从而促进F(ab′)2分子的装配。根据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离Fv，Fab或F(ab′)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域试验人员明显可知。
本发明范围也包括由两个共价连接的抗体组成的异偶联(Heteroconjugate)抗体。此抗体已例如，被建议用来使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)，并用来治疗HIV感染(PCT申请公开号WO91/00360和WO 92/200373)。可使用任何方便的交联方法，用公知、可购的交联制剂来制备同种异型偶联抗体。
更多涉及产生单克隆抗体的信息也见Goding，J.W.，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，3rdEdition，Academic Press，Inc.，London，San Diego，1996；Liddell和WeeksAntibody TechnologyA ComprehensiveOverview，Bios Scientific PublishersOxford，UK，1995；Breitling和DubelRecombinant Antibodies，John Wiley&Sons，New York，1999；和PhageDisplayA Laboratory Manual，Barbas等，editors，Cold Springs HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，2001。
3.靶疾病IL-17涉及多种炎性疾病，包括类风湿关节炎(RA)。RA的主要特征之一是关节周围骨的侵蚀(erosion)。破骨细胞在骨的重吸收中起主要作用，但破骨细胞从祖细胞形成的机制并未被完全理解。近来，Kotake等，(J.Clin.Invest.1031345(1999))报道，在共培养小鼠造血细胞和初级(primary)破骨细胞时白介素17(IL-17)可诱导破骨细胞样细胞形成。由IL-17诱导的破骨细胞生成(osteoclastogenesis)显示被环加氧酶(cyclooxygenase)-2(COX-2)的选择性抑制物吲哚美辛(indomethacin)抑制。与骨关节炎(OA)病人相比发现，RA病人的滑液(synovial fluid)包含特别高水平的IL-17。另外，使用免疫染色，在RA病人的滑膜组织但没有在OA病人的组织内检测出IL-17阳性的单个核细胞。这些发现现被解释为表明IL-17有助于RA的骨侵蚀和关节损害，因此可以是被抑制的靶。
与健康受试者相比，白塞病的病人已经显示IL-17的血清水平惊人提高。Hamzaoui等，Scand.J.Rheumatol.31(4)205-10(2002)。
在哮喘性气道(asthmatic airway)内已发现IL-17的水平提高，并且提示IL-17可能通过释放其它促炎介质，如α-趋化因子来放大炎症性反应。Molet等，J.Allergy Clin.Immunol.108(3)430-8(2001)；和Wong等，Clin.Exp.Immunol.125(2)177-83(2001)。
在患系统性红斑狼疮的病人已报道了IL-17水平提高。Wong等，Lupus9(8)589-93(2000)。
已描述IL-17在牛皮癣中起作用。Homey等，J.Immunol.164(12)6621-32(2000)。
已报道IL-17mRNA在多发性硬化的血和CSF单个核细胞中被放大(augment)。Matusevicius等，Mult.Scler.5(2)101-4(1999)。
基于这些以及诸多类似报道，抑制了IL-23诱导IL-17产生的能力从而降低了IL-17的水平的IL-23拮抗剂，是治疗多种(慢性)炎症状况和疾病的有价值的候选物。所述疾病的例子包括但不限于慢性炎症，自身免疫性糖尿病，类风湿性关节炎(RA)，类风湿性脊椎炎，痛风性关节炎，及其它关节炎状况，多发性硬化(MS)，哮喘，系统性红斑狼疮，成人型呼吸窘迫综合征，白塞病，牛皮癣，慢性肺炎性疾病，移植物抗宿主反应，克隆氏病，溃疡性结肠炎，炎症性肠病(IBD)，阿尔茨海默病，和发热。
已知IL-17是通过促进IFN-γ产生并因此诱导细胞介导的免疫反应来在对某些传染病，如肺结核产生保护性反应中起重要作用的。因此，IL-23的激动剂，包括激动剂抗体，对诱导针对多种感染(如结核分枝杆菌引起的肺结核)的细胞介导的免疫反应有效，并且是治疗每年全球杀死三百万人以上的传染病的有希望的候选药物。
4.药物组合物可以以药物组合物形式给药由上文披露的筛选试验鉴定的、特异性结合IL-23或IL-23受体的抗体，以及其它IL-23的拮抗剂或激动剂分子，来治疗多种疾病，特别是炎性疾病或由于诱导细胞介导的免疫反应造成的疾病。
使用抗体片段时，优选特异性结合到靶蛋白结合区的最小抑制性片段。例如，基于抗体可变区序列，可设计保持结合靶蛋白序列的能力的肽分子。可化学合成和/或用重组DNA技术生产此肽。见例如，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。
也可以例如用团聚(coacervation)技术或界面聚合(interfacialpolymerization)，将所述活性组分包载(entrapped)在制备的微胶囊(microcapsule)中，例如羟甲基纤维素酯(hydroxymethylcellulose)或明胶-微胶囊和聚-(methylmethacylate)微胶囊可分别在胶体药物传递系统(例如，脂质体，微球白蛋白(albumin microsphere)，微乳状液(microemulsion)，纳米颗粒(nano-particle)，和纳米胶囊(nanocapsule))或在大分子乳状液(macroemulsion)中。这些技术披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，如上述。
用于体内给药的剂型(formulation)必须是无菌的。这可通过滤过无菌滤过膜来容易地实现。
可以制备缓释(Sustained-release)制备物。缓释制备物的适当例子包括包含抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质为成型(shaped)颗粒，例如膜(film)或微胶囊的形式。缓释基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如，聚羟乙基甲基丙烯酸酯(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))，或聚乙烯醇(poly(vinylalcohol))，多乳酸化合物(polylactide)(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸(glutamate)的共聚物，非降解的(non-degradable)乙烯-醋酸乙烯(ethylene-vinyl acetate)，降解的乳酸-羟基乙酸(glycolic acid)共聚物如LUPRON DEPOTTM(注射的微球，其由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-羟基乙酸使分子释放超过100天，某些水凝胶释放蛋白的时间段却较短。当被囊化的(encapsulated)抗体在体内长时间保持，由于在37℃暴露于湿气(moisture)，它们可变性或聚集，导致失去生物活性并可能改变免疫原性。根据所涉及的机制可设计稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫互换(interchange)形成的分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基，在酸性溶液超低温冻干(lyophilizing)，控制湿度含量，使用合适添加剂，并开发特异性聚合物基质组合物，来进行稳定化。
本文制剂也可包含一种以上对要治疗的特定适应症必要的活性化合物，优选具有互补活性但不负面影响彼此的那些。所述分子适合以达到目的的有效量联合物存在，或可分别制剂(formulate)，并合并或以任何顺序连续给药。
例如，本发明IL-23的拮抗剂可与现在用于治疗靶疾病和状况的抗炎制剂和其它活性化合物联合给药。所述化合物包括皮质类固醇；非类固醇(non-steroidal)的抗炎药物(NSAID)，如阿司匹林，布洛芬(ibuprofen)，和COX-2抑制物，例如Celebrex和Vioxx；可改善疾病的(disease-modifying)抗类风湿药物(DMARDs)，如氨甲喋呤，来氟洛米(leflunomide)，柳氨磺吡啶(sulfasalazine)，硫唑嘌呤(azathioprine)，环孢菌素(cyclosporine)，羟氯喹啉(hydroxychloroquine)，和D-青霉胺；和生物反应调节物(modifier)(BRM)，如TNF和IL-1的抑制物。
提供如下实施例是为了阐述，而不是从任何一方面限制本发明范围。
所有本说明书引用的专利和参考文献都全文引入作为参考。
实施例实施例1白介素-23(IL-23)促进以白介素-17(IL-17)产生为特征的独特的CD4T细胞活化状态尽管IL-17由激活的T细胞产生是清楚的，以前的报告并没有提供它在以Th1和Th2为两极的细胞因子图谱范例内的清楚分类。此实施例描述最初的试验是为了检查应答于与Th1或Th2反应相关的信号不同的(distinct from)信号来表达IL-17的可能性。
实验步骤细胞培养物-从C57/BL-6小鼠制备单个脾细胞悬液，并通过密度梯度离心从悬浮的脾细胞分离单个核细胞。在多种刺激存在或缺无时(如图说明所指的时间)用IL-2(100单位/ml)培养2×106细胞/ml，之后收集细胞并用ELISA(R & D Systems，Mineapolis，MN)分析IL-17。所述树突细胞来自巨噬细胞(从脾细胞悬液以粘附性细胞群获得)，获得它是通过用rGM-CSF(2ng/ml)和rIL-4(1000单位/ml)处理巨噬细胞4天，用LPS(0.5μg/ml)洗涤并重新活化。分离记忆和原初T细胞是如下进行用CyC-CD4+PE-CD44或CyC-CD4+PE-CD62L染色从鼠脾细胞的单个细胞悬液分离的单个核细胞，并并分选CD4+细胞，CD44高/CD62L低是记忆表型或CD44低/CD62L高是原初表型。
体外诱导T细胞分化-用抗CD4的磁珠(Miltenyi Biotech)从野生型C57/BL6小鼠的脾纯化CD4+细胞。通过在包被了5μg/ml抗CD3和1g/ml抗CD28的抗体的平板上划线来活化纯化的T细胞(2×106细胞/ml)3天。所述培养物补充了IL-2，并用IL-12(20mM)+抗IL4(0.5μg/ml)(为了Th1分化)或IL-23(10nM)(为产生IL-17)来处理。在最初的活化后，充分洗涤所述细胞培养物并用抗CD3(1μg/ml)再刺激另外24小时，之后用ELISA分析细胞上清中的多种被分泌的细胞因子。
IL-12 p40抗体抑制IL-17诱导-将抗IL-12抗体(R & D Systems，目录号(cat.no.)AF-419-NA)或无关的对照抗体(抗FGF-8b(R & D Systems，目录号AF-423-NA)与IL-23(100ng/ml)或LPS-刺激的树突细胞(10％v/v)的条件培养基在37℃预保温1小时，再与从小鼠脾分离的单个核细胞(2×106细胞/ml)保温另外5-6天。收集上清并用ELISA测量IL-17水平。
纯化IL-23-鼠IL-23-通过在人胚胎肾细胞(293个细胞)中共表达羧基末端His-标记的p19和FLAG0标记的p40来产生IL-23组分，并用镍亲合树脂纯化分泌的蛋白。低于0.2内毒素单位/μg的内毒素水平不可检测。
结果首先，检测多种微生物产物刺激IL-17产生的能力。近来Infante-Duarte等J Immunol 165，6107(2000)观察到IL-17应答于致莱姆病(Lyme disease)螺旋菌(spirochete)B.burgdorferi的微生物脂肽反应而增加。存在多种微生物肽包括LPS(革兰氏阴性细菌)，LTA(革兰氏阳性细菌)或LBP(细菌脂肽)时，脾细胞培养物会产生IL-17(图1)。纯化的T细胞自身，或纯化的巨噬细胞自身都不产生IL-17。在用平板结合的抗CD3与受体交联，并用来自活化巨噬细胞/树突细胞的上清处理后，纯化的T细胞产生的IL-17增加，这表明存在由这些细胞释放的未被鉴定的一或多种因子，该因子作用于T细胞上来促进IL-17产生。
在绘图(profile)可能负责促进IL-17活性的候选分子的表达时，用实时RT-PCR观察到在活化的树突细胞中，IL-23组分p19和p40的mRNA表达增加了100-1000倍(B.Oppmann等，Immunty 13，715(2000))(未示)，从而检查了IL-23的效果。
通过在人胚胎肾细胞(293个细胞)中共表达羧基末端的His-标签的p19和FLAG-标记的p40来产生鼠IL-23组分，并用镍亲合树脂来纯化分泌的蛋白。低于0.2EU/μg的内毒素水平不可检测。在存在IL-2(100U/ml)和ConA(2.5μg/ml)时，在Th1诱导条件下(IL-12+抗IL-4)、Th2诱导条件下(IL-4+抗IFN-γ)，或与纯化的IL-23(100ng/ml)保温脾细胞培养物3-4天，之后洗涤所述培养物并用ConA再刺激另外24小时。用ELISA测量多种细胞因子的水平。低于ELISA试剂盒标准曲线范围的最低稀释度水平被记录为‘不可检测的(N.D.)’。如下结果代表三个独立进行的试验。
在IL-12-刺激的Th1诱导条件下培养脾细胞导致勉强在检测限以上的(marginal)IL-17生成，而在Th2诱导条件下IL-17的产生不超过对照。结果见下表1所示。
表1
培养物中存在的IL-23以剂量依赖方式导致高水平IL-17产生的(图2)。IL-23也使GM-CSF水平高于在Th1诱导条件下观察到的水平。相反，IFN-γ水平显著低于在Th1诱导条件得到的水平。TNF-α水平与Th1条件类似。单独的IL-12 p40不会使IL-17产生(数据未示)。IL-23促进IL-17mRNA水平升高(图2B)。暴露于IL-23六小时以内，IL-17mRNA的水平增加数百倍，并在IL-23持续存在时保持升高。存在抗IL-17的抗体不抑制此效果，这提示IL-17自身对此过程(process)没有帮助(未示)。另外，近来鉴定的IL-17家族成员IL-17F的mRNA，也被发现应答于IL-23而上调(图2C)。
已经报道IL-23促进记忆的但非原初T细胞的增殖(D.M.Frucht，如上述)。因此，检查了相对于IL-23对记忆T细胞群的影响而言，IL-23对原初T细胞群IL-17产生的影响。通过荧光活化细胞分选法(FACS)从脾细胞分离纯化的CD4+T细胞。选择记忆细胞群为CD4+CD44高(R.C.Budd等，J Immunol138，3120(1987)，或CD4+CD62低(T.M.Jung，W.M.Gallatin，I.L.Weissman，M.O.Dailey，J Immunol 141，4110(1988))，并选择原初细胞群为CD4+CD44低或CD4+CD62L高。如图3所见，IL-23只在记忆细胞群(CD44高和CD62L低)而不在原初细胞(CD44低或CD62L高)中刺激IL-17的产生。
存在中和型IL-12抗体时，IL-23介导的IL-17产生被完全阻断，该中和抗体与和IL-23共享的p40亚基相互作用(图4A，左组)。因为存在无关抗体时IL-17的产生无变化，所以此效果不是由于Fc受体连接到抗原递呈细胞上。此抗体也抑制应答与来自LPS刺激的树突细胞的条件培养基时观察到的IL-17产生诱导的＞50％(图4A，右图)。缺乏IL-12 p40组分的小鼠(品系B6.129S1-IL12btmlJm)与野生型小鼠或缺乏IL-12 p35组分的小鼠(品系B6.129S1-IL12a)相比，前者脾细胞培养物应ConA刺激可见IL-17的产生明显下降但不是完全缺无(abrogation)(图4B)。
为了检测IL-12在IL-17产生中的作用，将增加量的(0.001-1nM)鼠IL-12加入包含IL-23(1nM)的培养物。如图5A所见，IL-12以剂量依赖方式降低IL-17的水平。
另外，用纯化的IL-23处理脾细胞，该脾细胞来自缺乏IL-12受体β链2(IL-12Rβ2)的小鼠(Wu等，J Immunol 165，6221(2000))，所述IL-12受体β链2为IL-12的特异性受体组分(A.O.Chua，V.L.Wilkinson，D.H.Presky，U.Gubler，J Immunol 155，4286(1995))。IL-12Rβ2-/-小鼠的脾细胞应IL-23刺激，IL-17产生增多超过了未经刺激的对照(图5B)，但是该刺激并不影响IFN-γ水平。令人惊异的是，这些小鼠的IL-17背景水平与野生型小鼠相比超过10倍，这表明IL-12可能负向(negative)调节IL-23诱导的IL-17产生。然而，与IL-12Rβ2敲除小鼠相反，我们未在IL-12p35敲除小鼠的脾培养物观察到IL-17增加。此不同的原因未知，但可能与p35缺无时IL-12p40的功能改变、或遗传背景或病原体暴露不同有关。
讨论总而言之，这些数据提示了IL-23在促进独特T细胞活化状态中的作用，所述T细胞表达IL-17作为效应(effector)细胞因子。已描述Th1和Th2作为促进细胞介导的免疫反应相对于体液的免疫反应的示例。这些反应分别提供了针对细胞内和细胞外病原体的重要防御，并且这些反应任一中的缺陷都与对具体病原体的易感性增加有关。相反，IL-23可用来促进对病原体的获得性免疫反应，该病原体的特征为严重地依赖被认为主要用作先天免疫反应介质(mediator)的细胞。作为此反应的主要效应细胞因子，IL-17能够通过诱导趋化因子产生来促进单核细胞和中性粒细胞更迅速地募集(recruitment)。另外，对IL-23的反应中观察到高水平的GM-CSF产生，这可证明有另外的髓样细胞(myeloid cell)产生。由局部IL-17刺激的基质细胞(stromal cell)的G-CSF产生会使其进一步增加。然而，此获得性反应的特征并非仅依赖于髓样谱系(lineage)反应的吞噬细胞，因为已知IL-17促进IL-17诱导ICAM，从而为进一步的T细胞反应提供重要的共刺激。
近来数项研究指出了p35缺陷的小鼠和p40缺陷的小鼠之间的显著差别(Decken等，Infect Immun.664994-5000(2002)；Cooper等，J Immunol.1681322-1327(2002)；Elkins等，Infection & Immunity 701936-1948；Holscher等，J.Immunol.1676957-6966(2001))。这些研究都发现，通常在多种生物体模型(model organism)的免疫介导的清除(clearance)中缺失p40比缺失p35更有害。
IL-17的表达与数项严重炎性疾病相关提示IL-23的拮抗剂可以是治疗这些疾病的有希望的候选药物。
实施例2白介素-23(IL-23)缺陷的小鼠为进一步研究IL-23与IL-17的体内关系，比较IL-23缺陷的小鼠和IL-17缺陷的动物的表型。
实验步骤小鼠在无特殊病原体(specific pathogen free)条件饲养(house)所有小鼠。从the Jackson laboratory(Bar Harbor，MA)获得IL-12 p40-/-小鼠，并从CharlesRiver laboratories(San Diego，CA)获得C57BL/6小鼠。
试剂除非另外指出，从如下供应商购买试剂从BD Pharmingen(SanDiego，CA)获得抗体和ELISA试剂，从R & D systems(Minneapolis，MN)获得细胞因子，从Biosearch Technologies(Novato，CA)获得TNP-偶联的抗原，从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得组织培养试剂。
IL23 p19缺陷的小鼠的产生。用Genome Systems(Incyte Genomics，PaloAlto，CA)自基因组BAC文库的克隆198a3分离包含鼠IL23 p19基因座的基因组DNA。用标准分子克隆技术，从如下DNA片段构建靶载体，该载体被设计为用EGFP报道基因来取代整个IL23 p19编码区胸苷激酶选择盒；由分别在远端和近端的内源性SacII和Bgl II位点限定的5403碱基对的5′同源性臂；用BamHI(5′末端)和AflIII(3′末端)从pEGFP-1切割的EGFP表达盒(BD Clontech，Palo Alto，CA)；PGK-neo抗性盒；和由在近端的内源性XhoI位点和在远端的引物5′-GCTTGGTGGCCCACCTATGAT-3′(SEQ ID NO1)限定的1203个bp的短臂(图6A)。将此构建体电穿孔到129/SvEv胚胎干(ES)细胞(Huang等，Science 2591742(1993))，用G418和Gancyclovir选择后在600个克隆中的9个出现同源重组。为确认正确靶向所述基因座，用southern印迹分析ES细胞和动物的基因组DNA。用BamHI消化之后，使膜与探针1(用寡聚物(oligo)5′-AGACCCTCAAAGTTCATGAC-3′(有义)(SEQ ID NO2)和5′-CTGACGGCGCT TTCTCTACC-3′(反义)(SEQ ID NO3)通过PCR获得的831bp的基因组DNA片段)杂交，产生了对于野生型等位基因7027bp的片段和对于正确靶向的突变等位基因11788bp的片段。类似地，用EcoRI消化基因组DNA之后，膜与探针2(用寡聚物5′-TTTTGCCAGTGGGATACACC-3′(有义)(SEQ ID NO4)和5′-AACTGCTGGGGCTGTTACAC-3′(反义)(SEQ ID NO5)通过PCR获得的390bp的基因组DNA片段)杂交，野生型等位基因产生了9197bp的片段，正确靶向的突变等位基因产生了6211bp的片段。将两个ES细胞克隆(lc5和3h6)注射到胚泡(blastocyst)，并获得在其种系中传递了突变等位基因的嵌合动物。对于常规基因分型(genotyping)，我们所用的基于PCR的方法使用了常用反义引物(5′-GCCTGGGCTCACTTTTTCTG-3′)(SEQ ID NO6)，和对野生型特异的有义引物(5′-GCGTGAAGGGCAAGGACACC-3′)(SEQ ID NO7)以及敲除-特异性有义引物(5′-AGGGGGAGGATTGGGAAGAC-3′(SEQ ID NO8))。此引物三联体(triplet)对于野生型等位基因扩增了210bp的片段，并对于突变等位基因扩增了289bp的片段。在Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)进行PCR，其条件如下1个循环，94℃，60″；35个循环，94℃，30″，58℃，30″，72℃，60″；1个循环，72℃，7″。
血细胞亚型(subset)FACS分析从6-8周龄小鼠分离脾，胸腺和淋巴结，并用标准方法制备单个细胞悬液。通过心脏穿刺取外周血并用EDTA处理来避免凝固，用ACK裂解缓冲液(lysing buffer)(Biosource，Camarillo，CA)裂解红细胞。所有细胞在冰上在补充了2％的热灭活的胎牛血清的Hanks平衡的盐溶液(HBSS)中保温30分钟。然后用偶联了藻红蛋白，生物素或CychromeTM的各种抗体以1μg/百万细胞在相同的缓冲液中对细胞进行染色。使用生物素化的抗体时，用偶联了链霉抗生物素蛋白(streptavidin)的PE-TR偶联物(Caltag，Burlingame，CA)来检测。用相同的缓冲液洗涤两次后，用Epics-XL流式细胞仪(flow cytometry)系统(Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA)检测荧光。
刺激同种异型(allotypic)T细胞从6-8周龄balb/c小鼠的脾用两步分离法分离CD4和CD62L双阳性T细胞。首先，用阴性磁选择(magneticselection)(Miltenyi，Auburn，CA)除尽(deplete)其它细胞类型的T细胞。然后用抗CD4和CD62L的抗体标记这些细胞并在MoFlo分选仪(sorter)(DakoCytomation，Fort Collins，CO)上用FACS分选。用两步分离法分离均在C57BL/6背景中的野生型或IL-29 p19-/-小鼠的树突细胞。用磁分离(magnetic separation)(Miltenyi，Auburn，CA)阳性选择CD11c阳性脾细胞后，用抗CD11c，II类MHC，和CD8的抗体标记所述细胞。然后用FACS，再用MoFlo分选仪分选CD11c+/MHC-II+/CD8-细胞。所有实验中使用的群是纯度至少98％。为诱发同种异型刺激(allostimulatory)反应，在补充了青霉素-链霉素和10％热灭活胎牛血清(clone，Logan，UT)的总共200μl IMDM中一式双份保温了104个树突细胞和105个T细胞。有些情况下，加入100ng/ml的细菌脂肽来刺激树突细胞产生细胞因子。保温5天后，取出120μl的上清来通过ELISA测量细胞因子，并置换为含有每孔1μCi3H-胸苷的新鲜培养基。16小时后用Top Count液体闪烁计数器(liquid scintillationcounter)(Packard Instruments，Meriden，CT)根据生产商的说明书确定胸苷掺入。
体内T细胞分化将75μg的匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)(KLH)(Sigma，St.Louis，MO)诸如每组的四只雄和四只雌的小鼠左后足垫用于免疫，其中所述匙孔血蓝蛋白在30μlCFA(BD Biosciences，SanDiego，CA)和PBS1∶1乳状液中。5天后收获引流的(Draining)腹股沟(inguinal)和腘窝(popliteal)淋巴结并在补充了青霉素-链霉素，10％的热灭活胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，和25μg/ml KLH的IMDM中再刺激。就增殖试验而言，一式三份接种200μl的5×105个细胞到96孔板，使其增殖112小时，并在保温阶段的最后18小时每孔加入1μCi3H-胸苷。用Top Count液体闪烁计数器(Packard Instruments，Meriden，CT)根据生产商的说明书确定胸苷掺入。就细胞因子分泌而言，在48孔板中保温2.5×106个细胞1ml，并在72小时后收获上清。通过ELISA测定细胞因子分泌。所示数据是三个完整试验的一个代表。
迟发型超敏反应在每组6只小鼠的腹部三个位置经皮下注射200μg甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)(Sigma，St.Louis，MO)，所述血清白蛋白混合在总量为200μl的CFA(BD Biosciences，San Diego，CA)和PBS的1∶1乳状液中。在免疫后第8天，通过注射20μl 5mg/ml PBS中的mBSA到一个后(rear)足垫来攻击所述小鼠，而给予另一后足垫20μl PBS。在攻击后18，42，66小时用一系列装了7根弹簧(7spring-loaded)的卡尺(caliper)(Mitutoyo，City ofIndustry，CA)测量足垫肿胀。通过注射了抗原和PBS的足垫之间的足垫厚度差别确定DTH反应的强弱(magnitude)。
T依赖性体液反应和免疫球蛋白分析为测量总免疫球蛋白水平，从8只雄的和8只雌的6-9周龄、各个基因型的未经免疫的小鼠获得血清。用Luminex珠试验(Upstate，Lake Placid，NY)测量总免疫球蛋白同种型的水平。为估计OVA特异性体液免疫反应，在第0日(day 0)用CFA中的OVA免疫每种基因型的7只小鼠(4只雄的和3只雌的)，并在第21和42天用不完全福氏佐剂(IFA)(Sigma，St.Louis，MO)中的相同抗原对其加强免疫。为作血清分析，在免疫前和免疫后第14，28和49天通过眶后放血(retro-orbital bleeding)取血。以OVA作为俘获制剂(capture agent)和检测用的同种型特异性第二抗体，通过ELISA检测OVA特异性免疫球蛋白同种型。为了在ELISA的线性范围内，如下稀释血清样本对于IgG1为1∶3125000，对于IgG2a为1∶25000，对于IgG2b为1∶625000，并且对于IgG3，IgM，IgA和IgE为1∶1000。因为纯化的OVA特异性同种型不可购，用得自以前实验的OVA-免疫小鼠的连续稀释的血清作为标准品。结果用任意单位(arbitrary unit)表示，其中最后放血(last bleed)的野生型组的均值被设为100。为评估记忆T细胞对于体液反应的作用，在第0日用CFA中的OVA免疫任一基因型的5-6只小鼠的组，并在第21天用IFA中的TNP11-OVA对其加强免疫。为作血清分析，在免疫前和免疫后第14和28天通过眶后放血来取血。通过ELISA，用TNP28-BSA作为俘获制剂和检测用的同种型特异性第二抗体来检测TNP特异性免疫球蛋白同种型。对于TNP-特异性IgG1，使用可购标准品。对于TNP-特异性IgG2a，使用从以前实验中的TNP免疫小鼠获得的连续稀释的血清，并如上述计算结果。样本稀释度对于IgG1为1∶31250并且对于IgG2a为1∶1250。
T非依赖性体液反应用PBS中的50μg TNP1-LPS或100μgTNP20-AECM-Ficoll经腹膜内免疫每个基因型的6只小鼠的组。10天后收获血清，并通过ELISA，用TNP28-BSA作为俘获制剂和检测用的IgM特异性第二抗体来分析TNP-特异性IgM。用TNP特异性IgM抗体作为ELISA的标准品样本稀释度对于Ficoll为1∶1280，对于LPS为1∶5120。
结果缺失IL-23 p19基因。为确定IL-23的非丰余(non-redundant)体内效应，产生了IL-23缺失但能够产生IL-12的小鼠。构建靶向载体，其中4个外显子组成的p19完整编码区被增强的GFP(eGFP)报道基因和新霉素抗性盒取代(图6)。在两个正确靶向的ES细胞克隆1c5和3h6得到种系传递，并用每个染色体3个标记物高速同类系法(speed congenics)以将突变回交(backcross)到C57BL/6背景中。基于此分析，只选择来自129背景的遗传污染对于实验而言少于5％的实验的小鼠。eGFP表达的模式与内源性p19 mRNA(数据未示)可比。
IL-23 p19-/-小鼠无明显表型。如IL-23/IL-12双缺陷的IL-12 p40-/-小鼠的表型那样，IL-23 p19-/-动物不表现任何明显表型，其出生符合孟德尔频率(mendelian frequencies)。经组织病理检查未发现器官异常，并且进一步分析临床化学和血液参数发现野生型和敲除动物之间无差异。另外，IL-23 p19-/-小鼠的大小和体重正常，并且两性都是完全可育的。通过流式细胞术分析胸腺细胞，脾细胞和外周血白细胞的多种细胞表面标记物表明，野生型和IL23 p19-/-动物之间无任何显著不同(表2)。因为已知IL-23作用于记忆T细胞，我们测定了每个亚型的记忆细胞(CD44高CD62L-)与原初(CD62L+)细胞的比率，但野生型和IL-23 p19-/-小鼠之间未发现不同。在整个分析中，两个基因型之间唯一可见的不同在于树突细胞亚群略偏向CD8+表型。在此效应不明显(minor)时，由于数据的紧密性(tightness)它具有统计学显著意义，这与近来观察到的IL-23对抗原递呈细胞有作用是一致的。总而言之，正常发育没有显示需要IL-23，并且引入eGFP盒不会对任何所检验的细胞类型有毒性作用。
表2胸腺 野生型 敲除 P(diff.)CD4+ 5.7 +/- 0.55.5 +/- 0.0 0.504CD8+ 3.3 +/- 0.13.1 +/- 0.3 0.397DN25.0 +/- 4.217.0 +/- 8.0 0.202.
DP65.9 +/- 3.774.3 +/- 8.0 0.174脾野生型 敲除 P(diff.)CD4+2 4.3 +/- 0.822.5 +/- 2.7 0.342％naive 69.0 +/- 1.367.5 +/- 2.1 0.090％memory 29.1 +/- 1.231.0 +/- 1.9 0.029CD8+ 15.2 +/- 1.212.3 +/- 2.0 0.101％naive 64.1 +/- 5.467.0 +/- 2.8 0.199％memory 18.1 +/- 1.818.3 +/- 1.4 0.0841-A(b)+/CD11c +2.0 +/- 0.22.2 +/- 0.2 0.041％CD8+12.8 +/- 0.916.3 +/- 1.7 0.000％CD8-87.2 +/- 0.983.6 +/- 1.8 0.000CD19+ 52.4 +/- 2.055.2 +/- 6.5 0.512B220+ 52.0 +/- 2.055.5 +/- 5.3 0.360NK1.1+3.2 +/- 0.12.8 +/- 0.1 0.055外周血野生型 敲除 P(diff.)CD3+ 47.9 +/- 2.644.9 +/- 3.6 0.053CD4+ 28.2 +/- 2.326.9 +/- 2.5 0.270CD8+ 16.5 +/- 0.815.6 +/- 1.7 0.150CD19+ 43.2 +/- 3.245.2 +/- 3.6 0.215B220+ 44.9 +/- 3.546.4 +/- 4.8 0.466DX5+ 9.9 +/- 3.09.7 +/- 5.0 0.929CD16+ 8.0 +/- 0.98.6 +/- 1.5 0.3021-A(b)+ 44.0 +/- 1.945.4 +/- 4.9 0.428IL-23 p19-/-小鼠的体液免疫反应。为确定IL-23在产生体液免疫反应中的作用，首先测量任何基因型的16只小鼠血清中的所有免疫球蛋白同种型总水平。野生型和IL-23 p19-/-小鼠之间没有显著的统计学意义上的不同(图7)，这表明IL-23不是保持正常的免疫球蛋白水平必需的。另外，我们确定了IL-23是否参与产生针对在佐剂中递送的蛋白抗原的T依赖性体液反应。至此为止，用卵清蛋白(OVA)免疫每组7只小鼠，，并在两次连续免疫的每一次之后(图8)估计前血清(preserum)中OVA-特异性免疫球蛋白同种型(都为阴性，数据未示)。初次免疫后，所有组的OVA特异性IgG1，IgG2b，IgG3，和IgE都无显著不同。然而，初次免疫后观察到IL-23 p19-/-和IL-12 p40-/-动物的OVA特异性IgG2a和IgA水平显著下降。如预期那样，再次免疫后所有同种型的水平都急剧升高。此时，IL-23 p19-/-和IL-12 p40-/-小鼠显示所有被检测的同种型明显下降。这两个基因型之间的不同通常并不显著，这表明内源性IL-12在IL-23缺无的体液反应中不起主要作用。
因为体液免疫反应依赖于B和T细胞的适当功能，随后我们意图确定是什么机制使IL-23起刺激作用。为确定B细胞功能是否直接受IL-23缺无的影响，我们测定了IL-23缺陷的小鼠启动(mount)抗T非依赖性(TI)抗原的B细胞反应的能力。TI-1抗原三硝基苯基-(TNP-)LPS导致经由CD14和TLR4激活B细胞，而TI-2抗原TNP-Ficoll通过表面B细胞受体簇集(clustering)激活B细胞。IL-23 p19-/-小鼠启动了对两种抗原的正常B细胞反应(图9)，表明IL-23在T非依赖性B细胞反应中不起作用。另外，IL-23 p19-/-小鼠的B细胞应LPS，抗IgM，和抗CD40在体外正常增殖，并且应IL-4经历正常同种型转换(switching)(未示)。IL-23刺激B细胞不使增殖或同种型转换增加(未示)，因此我们得出结论IL-23不直接影响B细胞功能。
因为体液免疫反应主要在再次免疫阶段被削弱(compromise)，并因为B细胞功能在IL-23 p19-/-小鼠表现正常，我们假设可能由于抗原特异性辅助性T细胞的低效(inefficient)再活化而造成此表型。为更直接说明这个问题，我们在第0天用OVA免疫了数个5-6只小鼠的组，之后用TNP偶联的OVA在第14天再次免疫。用此免疫方案(regimen)，经由再次免疫再次活化对OVA特异的记忆T细胞，但在第二个时间点只有新的一组对TNP有特异性的B细胞被活化。因此，所述OVA特异性记忆B细胞亚型不对TNP-特异性免疫球蛋白的形成起作用。增强(booster)后7天，我们测定了血清中的TNP特异性IgG1和IgG2a，并且发现两种同种型都在IL-23 p19-/-小鼠显著降低(图10A，B)。此结果进一步说明了IL-23在T依赖性B细胞反应中的重要性。
IL-23 p19-/-小鼠中的迟发型超敏(DTH)反应。为进一步调查记忆CD4+细胞在IL-23 p19+/-小鼠的作用，评估这些动物启动DTH反应的能力。DTH反应为强T细胞依赖性，过去报道它在IL-12 p40-/-小鼠是缺陷的(defective)，但在缺无IL-12 p35的小鼠中呈正常，这提示它们可能被IL-23介导。针对此问题，我们用完全福氏佐剂(CFA)中的甲基化BSA(mBSA)使野生型，IL-23p19-/-，和IL-12 p40-/-组(每组6只)的动物致敏，并在7天后通过注射mBSA到足垫来诱发DTH反应。为作非特异性肿胀的对照，我们也攻击了一组未致敏化的野生型小鼠。攻击后18，42，和66小时测量特异性足垫肿胀，发现与野生型小鼠相比，特异性足垫肿胀可在IL-12 p40-/-和IL-23 p19-/-小鼠以类似程度被抑制(图11)。动力学也是类似的，在IL-12 p40-/-和IL-23 p19-/-小鼠都显示在42和66而不是18小时的时间点有力地减轻肿胀。因此，IL-23是DTH反应的主要介质，并且IL-23缺陷导致记忆CD4+T细胞反应低效。
IL-23 p19-/-树突细胞刺激T细胞的能力。为排除在IL-23 p19-/-小鼠观察到的缺陷是由于IL-23缺陷抗原递呈细胞的低效T细胞引发造成的可能性，我们又观察了IL-23 p19-/-DC刺激分离自balb/c小鼠脾的同种型原初CD4+T细胞的能力。缺无DC时，这些T细胞既不增殖也不分泌可观察量的细胞因子(图12A)。加入任一种基因型的DC使得两种基因型强(robust)增殖并产生IL-2。我们已经显示IL-23是IL-17的有效(potent)诱导物，之后我们又用细菌脂肽诱导DC产生IL-23，所述细菌脂肽是有效的Toll-样受体-(TLR-)2激动剂和产生IL-23的诱导物。所以这种情况下，wt DC有力地诱导T细胞产生IL-17(图12A，底组)，而用IL-23 p19-/-DC刺激的T细胞产生明显更少的IL-17。为在更生理化的设置(more physiological setting)中确认这些观察数据，我们又用完全福氏佐剂(CFA)中的匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫数个8只小鼠的组来诱发体内T细胞反应。5天后收获引流的淋巴结细胞(LNC)并用KLH在体外再刺激。我们又观察到从IL-23 p19-/-小鼠收获的LNC产生明显更少的IL-17(图12B，底组)。两个基因型中的LNC增殖是可比的(图12B，顶组)，这表明wt和IL-23 p19-/-小鼠启动了针对所述抗原的强T细胞反应。因此，IL-23缺陷不严重(grossly)损害树突细胞的刺激能力，但使T细胞产生IL-17减少。
讨论用IL-23 p19缺陷的小鼠评估IL-23的并不丰富体内功能，发现IL-23缺陷使T细胞依赖性免疫反应，如体液免疫反应和DTH反应减弱。
在IL-23 p19-/-小鼠观察到显著降低的体液免疫反应，它影响到所有的免疫球蛋白同种型。同样(in parallel)，IL-12 p40-/-小鼠的反应被抑制到类似或稍高水平。我们的结果支持如下结论即有效的体液反应绝对需要IL-23，而仍需要通过使用IL-12 p35-/-小鼠来确定是否IL-23对于IL-12缺无时的正常体液反应是足够的。
总而言之，IL23 p19-/-小鼠的体内T细胞反应减弱，其明显表现为DTH和体液免疫反应减弱，并且在表型上类似IL-17缺陷的小鼠。我们的结果表明，临床给药IL-23或其激动剂可能有益于在免疫方案和免疫受损的病人中支持T细胞。
虽然已经参考被认为是具体的实施方案描述了本发明，仍应理解本发明不限于所述实施方案。相反，本发明应包括在所附权利要求的精神和范围内的多种修改和等同替代。
序列表<110>Gurney，Austin<120>IL-17产生的抑制<130>39766/0125<140>未知<141>2003-10-30<150>60/423,090<151>2002-10-30<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gcttggtggc ccacctatga t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2agaccctcaa agttcatgac 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgacggcgc tttctctacc 20
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ttttgccagt gggatacacc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5aactgctggg gctgttacac 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gcctgggctc actttttctg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gcgtgaaggg caaggacacc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8agggggagga ttgggaagac 20
权利要求
1.抑制T细胞产生白介素-17(IL-17)的方法，其包括用白介素-23(IL-23)的拮抗剂处理所述T细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述T细胞是经活化的T细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述T细胞是记忆细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述处理在体内进行。
5.权利要求1的方法，其中所述处理在哺乳动物受试者中进行。
6.权利要求5的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。
7.权利要求6的方法，其中所述拮抗剂是抗IL-23抗体或抗IL-23受体抗体。
8.权利要求7的方法，其中所述抗体是抗体片段。
9.权利要求8的方法，其中所述抗体片段选自Fv，Fab，Fab′，或F(ab′)2。
10.权利要求7的方法，其中所述抗体是全长抗体。
11.权利要求7的方法，其中所述抗体是嵌合的抗体。
12.权利要求7的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。
13.权利要求7的方法，其中所述抗体是人抗体。
14.治疗哺乳动物受试者中的炎性疾病的方法，所述炎性疾病特征在于白介素17(IL-17)的表达升高，所述方法包括给药所述受试者有效量的白介素-23(IL-23)的拮抗剂。
15.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。
16.权利要求15的方法，其中所述炎性疾病选自慢性炎症，自身免疫性糖尿病，类风湿性关节炎(RA)，类风湿性脊椎炎，痛风性关节炎，及其它关节炎疾病，多发性硬化(MS)，哮喘，系统性红斑狼疮，成人型呼吸窘迫综合征，白塞病，牛皮癣，慢性肺炎性疾病，移植物抗宿主反应，克隆氏病，溃疡性结肠炎，炎症性肠病(IBD)，阿尔茨海默病，或发热。
17.权利要求16的方法，其中所述炎性疾病是慢性炎性疾病。
18.权利要求17的方法，其中所述慢性炎性疾病选自类风湿性关节炎(RA)，移植物抗宿主反应，多发性硬化(MS)，或牛皮癣。
19.权利要求15的方法，其中所述拮抗剂是抗IL-23抗体或抗IL-23受体抗体。
20.权利要求19的方法，其中所述抗体是抗体片段。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体片段选自Fv，Fab，Fab′，或F(ab′)2。
22.权利要求19的方法，其中所述抗体是全长抗体。
23.权利要求19的方法，其中所述抗体是嵌合的抗体。
24.权利要求19的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。
25.权利要求19的方法，其中所述抗体是人抗体。
26.权利要求15的方法，其中所述拮抗剂与另外的治疗剂联用给药。
27.权利要求26的方法，其中所述另外的治疗剂是抗炎分子。
28.权利要求27的方法，其中所述抗炎分子选自皮质类固醇或非类固醇抗炎药(NSAID)。
29.鉴定抗炎制剂的方法，其包括如下步骤(a)在存在或缺无候选分子时，将T细胞培养物与IL-23保温；(b)监测所述培养物中IL-17的水平；以及(c)如果在所述候选分子存在时的IL-17水平比该候选分子缺无时的IL-17水平低，将所述候选分子鉴定为抗炎制剂。
30.权利要求29的方法，其中所述候选分子是非肽小有机分子。
31.权利要求29的方法，其中所述候选分子是肽。
32.权利要求29的方法，其中所述候选分子是多肽。
33.权利要求29的方法，其中所述候选分子是抗体。
34.权利要求29的方法，其中所述T细胞是活化的T细胞。
35.权利要求29的方法，其中所述T细胞是记忆细胞。
36.权利要求29的方法，其中所述IL-17的水平用ELISA监测。
37.抗炎制剂，其用权利要求29的方法鉴定。
38.诱导在哺乳动物受试者中产生IL-17的方法，其包括给药所述受试者IL-23的激动剂。
39.权利要求38的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。
40.权利要求39的方法，其中所述人受试者已经暴露于细菌感染。
41.权利要求40的方法，其中所述人受试者已经暴露于由结核分枝杆菌造成的感染。
42.权利要求39的方法，其中所述IL-23的激动剂是抗体。
43.权利要求42的方法，其中所述抗体是抗IL-23抗体或抗IL-23受体抗体。
44.权利要求43的方法，其中所述抗体是抗体片段。
45.权利要求44的方法，其中所述抗体片段选自Fv，Fab，Fab′或F(ab′)2。
46.权利要求43的方法，其中所述抗体是全长抗体。
47.权利要求43的方法，其中所述抗体是嵌合的抗体。
48.权利要求43的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。
49.权利要求43的方法，其中所述抗体是人抗体。
全文摘要
本发明涉及用白介素－23(IL－23)的拮抗剂来抑制T细胞产生促炎细胞因子白介素－17(IL－17)。本发明还涉及IL－23的拮抗剂在治疗炎性疾病中的用途，所述疾病的特征是存在升高水平的IL－17。IL－23的拮抗剂包括但不限于，特异性结合亚基或IL－17或IL－17受体的抗体。本发明另外涉及通过使用IL－23的激动剂来诱导IL－7的产生。
文档编号C07K16/24GK1711282SQ200380102707
公开日2005年12月21日 申请日期2003年10月29日 优先权日2002年10月30日
发明者奥斯汀·L·格尼 申请人:健泰科生物技术公司