专利名称：一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体及其制备方法与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物领域中的一种免疫球蛋白及其制备方法与应用，特别是涉及一种抗大肠杆菌鸡卵黄抗体及其制备方法与应用。
背景技术：
仔猪大肠杆菌性腹泻是由猪致病性大肠杆菌引起的一种常见传染病，常常导致仔猪死亡或发育缓慢，严重危害养猪业发展。由于大肠杆菌血清型复杂，免疫缺乏针对性，所以，以往大都使用抗生素和疫苗免疫母猪的方法防治此病。但因致病性大肠杆菌对抗生素容易产生耐药性，主动免疫效果也不理想，因此防治仔猪大肠杆菌病就成为养猪生产中的突出问题之一。
鸡卵黄抗体(IgY)是鸡的一种免疫球蛋白(Ig)，其结构与IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象。研究表明，IgY具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境具有优良的耐受性。利用鸡生产特异性免疫抗体，具有可规模化生产、成本低、特异性抗体含量高、安全性好等优点，较实验室条件下通过实验动物制备有限的高免血清更有实用性。目前国内已成功地研制和应用鸡新城疫、传染性腔上囊病、鸭病毒性肝炎等禽病毒性传染病的卵黄抗体，但对细菌性畜禽传染病的卵黄抗体研究较少。
发明创造内容本发明的目的是提供一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体及其制备方法。
本发明所提供的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体，可用下述方法得到(1)收集大肠杆菌菌毛抗原；(2)用大肠杆菌菌毛抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，从卵黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。
所述收集大肠杆菌菌毛抗原的具体步骤是收集菌体，提取抗原，将其溶于PBS缓冲溶液，加入佐剂，得到大肠杆菌菌毛抗原；所述佐剂优选为弗氏佐剂，一般首免用弗氏完全佐剂，二免用弗氏不完全佐剂；步骤(2)中从卵蛋黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的方法可为用灭菌蒸馏水或灭菌生理盐水，优选为用蒸馏水稀释卵黄，调pH至5.0-7.1，优选为pH7.0，4℃静置2-6小时，优选为静置2小时，6000转/分钟水平离心30分钟，除去大量脂类，收集上清，通过0.45μm膜过滤除菌，喷雾干燥或冷冻干燥得到抗大肠杆菌鸡卵黄抗体粉。所述抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的分子量约为180KD。
本发明的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的制备方法适用范围广泛，可用于制备各种大肠杆菌的抗体，所得到的抗体可用于制备预防和/或治疗大肠杆菌感染引起的相关疾病的药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂，也可用于制备检测大肠杆菌感染引起的相关疾病的制剂。
本发明所提供的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体由大肠杆菌抗原免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治动物大肠杆菌感染引起的消化道疾病具有良好效果。本发明的抗体采用母鸡所产卵为载体，安全无毒，易于产业化。
具体实施例方式
实施例1、抗大肠杆菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的制备抗大肠杆菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的工艺流程为细菌培养→抗原提取→免疫产蛋鸡→收集鸡蛋→分离卵黄抗体→冷冻干燥→原料成品，具体步骤如下1、菌毛抗原的制备大肠杆菌(Escherichia cold)K88、K99、987P菌株，在TSB液体培养基中培养至对数生长期，4℃条件下，3000r/min水平离心15分钟，沉淀溶于PBS缓冲溶液中，然后在同样条件下离心15分钟，收集菌体，将其灭活后，在冰浴中高速(8000r/min)搅拌10min，再在4℃条件下，10000g水平离心15分钟，收集含有菌毛抗原的上清液，用0.45μm滤器过滤上清液，将滤液调至pH为4.7-4.9后，在4℃条件下10000g水平离心15分钟，收集沉淀溶于PBS缓冲溶液中，即为菌毛抗原溶液，浓度约为2.25mg/ml，于-20℃冷冻保存。部分抗原溶液按体积比1∶1加入已灭菌的完全弗氏佐剂(首免用)，部分抗原溶液按体积比1∶1加入已灭菌的不完全弗氏佐剂(二免用)，乳化得菌体抗原。以上所有操作均在无菌条件下进行。
2、抗大肠杆菌(Escherichia coli) K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的制备(1)对产卵母鸡的免疫A.基础免疫选用健康产卵非免疫产蛋鸡隔离饲养。进行鸡皮下多点注射步骤1中制备的完全弗氏佐剂菌体抗原1ml/只。
B.强化免疫基础免疫两周后，进行强化免疫，注射步骤1制备的不完全弗氏佐剂菌体抗原1ml/只。
于两周后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。
(2)抗大肠杆菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的提取从免疫鸡卵中分离蛋黄，以蒸馏水稀释8倍，调至pH至5.0-7.1，优选为pH7.0，4℃静置2-6小时，优选为静置2小时，6000转/分钟水平离心30分钟，除去大量脂类，收集上清，通过0.45μm膜过滤除菌，喷雾干燥或冷冻干燥得到抗大肠杆菌鸡卵黄抗体粉。
实施例2、抗大肠杆菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的检测(1)分子量的测定及纯度分析用SDS-PAGE电泳检测实施例1中得到的抗大肠杆菌(Escherichia coli)K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的纯度，具体过程如下SDS-PAGE电泳，分离胶浓度8％，浓缩胶浓度5％，稳流电泳4小时，Marker采用低相对分子质量标准蛋白质电泳结束后，取下凝胶用考马斯亮兰染色，结果显示只出现一条电泳带，说明抗体纯度高，其分子量约为180KD。
(2)浓度测定用Bradford蛋白浓度测定法测定实施例1中得到的抗大肠杆菌(Escherichiacoli)K88、K99、987P菌株鸡卵黄抗体的浓度。
(3)活性检测①ELISA间接试验每孔加100μl实施例1中制备的抗原溶液包板，37℃温浴2小时；倒掉包被液，用PBST溶液洗板5次，拍干；每孔加100μl封闭液(1％牛血清白蛋白溶液)，37℃静置1小时，用PBST溶液洗板5次，拍干；每孔加100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY(工作稀释度为1∶5000)，37℃静置1小时，用PBST溶液洗板5次，拍干；每孔加100μl含有过氧化氢的TMB，反应15分钟后，每孔加入100μl的2MH2SO4终止反应，显黄色，用DG3022型酶联免疫检测仪测吸光值OD450nm。
结果显示，用酶联免疫吸附试验测得抗大肠杆菌鸡卵黄抗体效价为1∶14000-16000。
②琼脂扩散法A.琼脂板的准备100ml生理盐水加1.2克琼脂粉，加热融化，倒入玻璃平皿，制成2-3mm厚的琼脂板，室温凝固后，4℃倒置保存待用。
B.抗体的稀释采用二倍稀释法用生理盐水连续稀释卵黄抗体，其稀释倍数分别为2×、4×、8×、16×、32×、64×及更高稀释倍数。
C.琼脂扩散反应用打孔器将琼脂板打成七孔梅花型孔，酒精灯加热封底。测样时，在中央孔加入实施例1中得到的抗原溶液，外围孔按一定顺序分别加入不同稀释倍数的抗体，每孔加入20μl样品；倒置平皿于37℃密闭湿盒24至72小时，直至沉淀线产生，观察抗体效价，以出现沉淀线的最大稀释倍数为该卵黄抗体的效价。
结果显示，本发明的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体用琼脂扩散法测得抗体效价在1128以上。
实施例3、动物实验仔猪攻毒和治疗试验取1日龄未吃初乳仔猪12头，随机分成两组，采用人工哺乳法每隔两小时饲喂一次牛奶，观察仔猪适应环境后攻毒，攻毒剂量为1.0×109CFU/头，待仔猪刚开始出现腹泻症状时，治疗组饲喂精制卵黄抗体溶液4ml，每日两次；对照组喂等量生理盐水，观察卵黄抗体治疗效果，以粪便指数和死亡率为指标反映治疗组和对照组差异显著性。
试验结果显示，攻毒后12-24h所有仔猪均出现不同程度的腹泻，治疗组在口服卵黄抗体液24h后腹泻症状减轻，48h后粪便变为粘稠，72h后基本恢复正常；而对照组腹泻呈水样喷射，死亡主要出现在48-72h，之后症状趋于缓和，死亡率为36％-65％。
权利要求
1.一种抗大肠杆菌鸡卵黄抗体，可用下述方法得到(1)收集大肠杆菌菌毛抗原；(2)用大肠杆菌菌毛抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，从卵黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体，其特征在于所述收集大肠杆菌菌毛抗原的具体步骤是收集菌体，提取抗原，将其溶于PBS缓冲溶液，加入佐剂，得到大肠杆菌菌毛抗原；所述佐剂为弗氏佐剂。
3.根据权利要求1或2所述的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体，其特征在于步骤(2)中所述从卵蛋黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的提取方法为从免疫鸡卵中分离蛋黄，以蒸馏水稀释8倍，调至pH至5.0-7.1，优选为pH7.0，4℃静置2-6小时，优选为静置2小时，6000转/分钟水平离心30分钟，除去大量脂类，收集上清，通过0.45μm膜过滤除菌，喷雾干燥或冷冻干燥得到抗大肠杆菌鸡卵黄抗体粉。所述抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的分子量约为180KD。
4.一种制备抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的方法，包括以下步骤(1)收集大肠杆菌菌毛抗原；(2)用大肠杆菌菌毛抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，从卵黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述收集大肠杆菌菌毛抗原的具体步骤是收集菌体，提取抗原，将其溶于PBS缓冲溶液，加入佐剂，得到大肠杆菌菌毛抗原；所述佐剂为弗氏佐剂。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述从卵蛋黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的提取方法为从免疫鸡卵中分离蛋黄，以蒸馏水稀释8倍，调至pH至5.0-7.1，优选为pH7.0，4℃静置2-6小时，优选为静置2小时，6000转/分钟水平离心30分钟，除去大量脂类，收集上清，通过0.45μm膜过滤除菌，喷雾干燥或冷冻干燥得到抗大肠杆菌鸡卵黄抗体粉。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述稀释剂为灭菌蒸馏水。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述pH为7.0；所述温度为4℃。
9.权利要求1所述抗大肠杆菌鸡卵黄抗体在制备检测大肠杆菌感染引起的相关疾病的制剂中的应用。
10.权利要求1所述抗大肠杆菌鸡卵黄抗体在制备预防和/或治疗大肠杆菌感染引起的相关疾病的药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗大肠杆菌鸡卵黄抗体及其制备方法与应用。本发明所提供的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体，可用下述方法得到(1)收集菌体，提取抗原，将其溶于PBS缓冲溶液，加入佐剂，得到大肠杆菌菌毛抗原；(2)用步骤(1)制备的大肠杆菌菌毛抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，从卵黄中提取抗大肠杆菌鸡卵黄抗体。本发明的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体的分子量约为180KD。本发明的抗大肠杆菌鸡卵黄抗体可用于制备预防和/或治疗大肠杆菌感染引起的相关疾病的药物、保健品、食品添加剂以及饲料添加剂，也可用于制备检测大肠杆菌感染引起的相关疾病的制剂。
文档编号C07K16/12GK1634989SQ200310112980
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月29日 优先权日2003年12月29日
发明者刘国华, 金立志, 郑爱娟 申请人:北京锐思嘉业饲料应用技术研究中心