专利名称：抗cd20和上皮细胞粘附分子的人源抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗CD20和抗上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的人源抗体及其制法和用途。
背景技术：
抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。早期制备抗体的方法是将某种天然抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。
实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。多克隆抗体是人类有目的利用抗体第一步。多克隆抗体的不均一性，限制了对抗体结构和功能的进一步研究和应用。
杂交瘤技术的诞生被认为是抗体工程发展的第一次质的飞跃，也是现代生物技术发展的一个里程碑。利用这种技术制备的单克隆抗体在疾病诊断、治疗和科学研究中得到广泛的应用。这种单克隆抗体多是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，具有鼠源性，进入人体会引起机体的排异反应；完整抗体分子的分子量较大，在体内穿透血管的能力较差；生产成本太高，不适合大规模工业化生产。在80年代初，抗体基因结构和功能的研究成果与重组DNA技术相结合，产生了基因工程抗体技术。
抗体工程技术的发展，即将鼠源单克隆抗体改造为人源化抗体，或者直接产生人源抗体，大大减少鼠源抗体带来的副作用如人抗鼠抗体反应等，有利于临床应用。
目前，人源化或人源抗体的产生主要采用三种方法(1)鼠源抗体改造用人类抗体的Fc段和部分Fab替换鼠源抗体片段，减少小鼠来源的片段，以减轻人类对抗体的不良反应；(2)转基因方法将人类抗体基因转移至小鼠，免疫动物后产生人类抗体；(3)噬菌体展示技术是近年发展的新方法，利用噬菌体的特性筛选抗体可以直接筛选人源抗体，该方法利用人抗体基因构建含有VH和VL的组合文库，以噬菌体表面显示系统筛选抗原特异性人源抗体。它以细菌克隆取代了B细胞克隆，被誉为抗体技术的革命性进展。
上述三种方法各有利弊。前二种方法能筛选高亲和力抗体，但费用大，不易操作，第三种方法操作简便、花费少，但亲和力有时较低。
采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体、筛选全人源性抗体和高亲和力抗体。噬菌体抗体库技术是生命科学研究的突破性进展之一，同时也将抗体工程的研究推想了一个新的高潮。
噬菌体选择方法对于抗体或短肽的分离都不受限制，而且适用于其它具有生物活性的分子的研究，如细胞因子、受体、酶底物、酶抑制剂、抗体酶、DNA结合蛋白、构建具有特异性结合分子的受体域、以及纤维素结合域等。据报道，抗体的支架不同可形成用于各种类型分子的合适的结合配体，而且许多例子可说明，宿主支架可容纳许多有效的可调节一些合适的置换的区域，(可根据这点制备局部变化的库)，这些支架包括β-折叠蛋白、α-螺旋束蛋白、这两个蛋白的组合、以及绿色荧光蛋白(GFP)和纤维素结合域等。
CD20是一种非糖化的细胞膜跨膜磷酸化蛋白，分子量为35kD，分布密度为50,000～200,000位点/个细胞，其功能不很清楚，可能对Ca2+的跨膜传导、B淋巴细胞的增殖和分化具有调节作用。研究表明，CD20广泛表达于前B淋巴细胞、未成熟和成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞及超过90％的B细胞性NHL中(泛B细胞抗原)，而在造血干细胞、浆细胞、淋巴祖细胞以及其它组织均无表达，人体血清中亦无游离CD20的存在。CD20不会轻易从细胞膜上脱落，也不会因与抗体的结合发生抗原调变，发生内在化。CD20不同于肿瘤特异性抗原，在淋巴瘤侵犯的器官如脾、淋巴结中存在大量的正常淋巴细胞，也可以与标记核素的CD20抗体结合，从而可以放大杀伤侵犯这些器官的肿瘤细胞的作用，因此CD20可作为B淋巴细胞瘤治疗的最佳靶点。CD20的具体序列可见登录号HS.438040。
EpCAM为一种细胞表面糖蛋白，分布于少数正常及大多数赘生上皮细胞。研究表明，在大多数结肠癌病人的肿瘤细胞表面存在EpCAM的表达。抗EpCAM抗体已被证实可引起一系列的免疫反应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应(ADCC)和补体反应等，从而抑制肿瘤的生长。因此EpCAM被认为是一个重要的结肠癌肿瘤治疗靶点。EpCAM的具体序列可见登录号HS.23582。
目前，还缺乏有效针对CD20和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体，因此，本领域迫切需要开发新的针对CD20和EpCAM的高特异性和中和力的单克隆抗体，尤其是人源化的高亲和力的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供一种抗CD20和EpCAM的特异性抗体，尤其是人源化单克隆抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体，该抗体的重链可变区含有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列。
在另一优选例中，该抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO4或8的氨基酸序列。
更佳地，所述的抗CD20抗体具有SEQ ID NO2所示的重链和SEQ ID NO4所示的轻链。一种抗CD20抗体具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
更佳地，所述的抗EpCAM抗体具有SEQ ID NO6所示的重链和SEQ ID NO8所示的轻链。一种抗EpCAM抗体具有SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体是人源化的单克隆抗体。更佳地为单链抗体。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明所述的抗CD20和抗EpCAM的特异性的抗体。
在另一优选例中，所述的核酸分子含有SEQ ID NO1或5所示的编码抗体重链可变区的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的核酸分子还含有SEQ ID NO3或7所示的编码抗体轻链可变区的核苷酸序列。
更佳地，所述的编码抗CD20抗体的核酸分子具有SEQ ID NO1所示的重链编码序列和SEQ ID NO3所示的轻链编码序列。
更佳地，所述的编码抗EpCAM抗体的核酸分子具有SEQ ID NO5所示的重链编码序列和SEQ ID NO7所示的轻链编码序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有编码本发明所述的抗CD20和抗EpCAM的特异性抗体的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列的操作性相连的表达调控序列。
在本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体。
在本发明的第五方面，提供了一种制备抗体的方法，该方法包括a)培养本发明上述的转化的宿主细胞，从而表达抗体；和d)分离纯化所述抗体，从而获得本发明所述的抗CD20或抗EpCAM的特异性抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种组合物，它含有安全有效量的本发明所述的抗CD20和/或抗EpCAM的特异性的抗体以及药学上可接受的载体。
图1显示了对抗CD20单链抗体的鉴定，表明抗CD20抗体具有高亲和力及特异性。
图2显示了对抗EpCAM单链抗体的鉴定，表明抗EpCAM抗体具有高亲和力及特异性。
具体实施例方式
本发明人利用噬菌体表面展示系统，首次筛选出与CD20和EpCAM有良好亲和力和特异性的抗体，测定序列后。合成全基因，进行了重组表达，获得了重组的抗CD20和抗EpCAM的单克隆抗体。
本发明提供了一种重组抗CD20人源化单克隆抗体，它包括人源恒区(如人源恒区IgG1-Fc)，而其重链可变区和轻链可变区具有独特的不同于现有技术的结构。
本发明提供了一种重组抗EpCAM人源化单克隆抗体，它包括人源恒区(如人源恒区IgG1-Fc)，而其重链可变区和轻链可变区具有独特的不同于现有技术的结构。
本发明还提供了抗CD20或EpCAM单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为超变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以用常规方法，通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学比较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
如本文所用，术语“本发明抗体”指CD20单克隆抗体和/或嵌合CD20抗体；以及EpCAM单克隆抗体和/或嵌合EpCAM抗体。该术语还包括与GST等形成的融合蛋白，只要在该融合蛋白中抗体部分仍然保留与CD20或EpCAM的结合活性。
本发明的CD20单克隆抗体含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重链，并且还含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的轻链。
本发明的EpCAM单克隆抗体含有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的重链，并且还含有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的轻链。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。可用于本发明的形成嵌合抗体的技术是本领域中已知的。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中，“核酸分子”指聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，还包括由核苷酸类似物形成的DNA或RNA的等效物、类似物，单链(有义链或反义链)和双链聚核苷酸。该术语还包括同源序列。对本领域技术人员来说，很显然，任意一种上述形式的核酸分子都当然地涵盖了该“核酸分子”的所有上述等效形式。
在本发明的一优选例中，编码所述CD20单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO1所示序列，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO3所示序列。
在本发明的一优选例中，编码所述EpCAM单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO5所示序列，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO7所示序列。
此外，目前已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种治疗移植排斥的药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于本发明的单克隆抗体对CD20和EpCAM有高亲和力和特异性，并且本发明的单克隆抗体是人源化的。这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1从抗体库中筛选抗CD20和抗EpCAM抗体的可变区基因本发明利用噬菌体抗体组合文库技术将人源抗体轻链基因和重链基因在体外重组并借助噬菌体表面展示技术(phage display)系统筛选针对目的抗原的特异性抗体基因。该技术绕过杂交瘤途径，不经过免疫就可制备和生产可用于检测目的抗原表达的单克隆抗体。方法如下按照中国专利申请01126858.1(申请日2001.09.25；公开号1408874
公开日2003.04.09；发明名称原核细胞体内抗体文库构建、抗体的筛选和优化及用途)中描述的方法构建人源抗体库。简而言之，从淋巴细胞制备免疫球蛋白重链和轻链的基因，用PCR方法进行体外扩增，并将其克隆到噬菌体载体，利用抗体分子片段在噬菌体表面呈现的特点，以CD20蛋白或EpCAM为抗原，筛选到相应的特异性抗体。
用CD20基因的原核表达纯化产物作为抗原对人源噬菌体单链抗体文库淘洗三轮，出现特异性富集，获得产生抗CD抗体的阳性克隆。用Clontech公司的哺乳动物双杂交系统对这抗CD20单链抗体的特异性及亲和力进行了鉴定。经鉴定CD20单链抗体具有较好的特异性及亲和力(图1)。
用EpCAM基因的原核表达纯化产物作为抗原对人源噬菌体单链抗体文库淘洗三轮，出现特异性富集，获得产生抗CD抗体的阳性克隆。用Clontech公司的哺乳动物双杂交系统对这抗EpCAM单链抗体的特异性及亲和力进行了鉴定。经鉴定EpCAM单链抗体具有较好的特异性及亲和力(图2)。
所获得的抗CD20抗原和抗EpCAM抗原的scFv基因用常规方法进行序列测定，与NCBI人免疫球蛋白数据库中的已知序列进行Blast比较分析，结果显示其重链基因序列和轻链基因均符合人免疫球蛋白可变区框架结构特征。
抗CD20抗体的VH由333bp组成(SEQ ID NO1)，编码111个氨基酸的多肽(SEQ ID NO2)；VL由339bp组成(SEQ ID NO3)，编码113个氨基酸的多肽(SEQID NO4)。
抗EpCAM抗体的VH由333bp组成(SEQ ID NO5)，编码111个氨基酸的多肽(SEQ ID NO6)；VL由339bp组成(SEQ ID NO7)，编码113个氨基酸的多肽(SEQID NO8)。
实施例2抗CD20单链抗体的重组表达根据SEQ ID NO1和3所示的抗体重链及轻链序列，以及设计的用于连接重链和轻链的连接序列，用人工合成的方法全合成单链抗体的DNA片段(序列如SEQ ID NO9所示)。
以此DNA片段为模板用以下引物进行PCR反应，正向引物CGG AAT TCC CAG GAG TCG GGC(SEQ ID NO11)反向引物CCGCTCGAGACGTTTGATTTCCACCTT(SEQ ID NO12)将PCR产物经EcoR I和Xho I酶切后，装入pGEX 5X-2表达载体(购自Amersham公司)，转化大肠杆菌。此单链抗体基因经原核GST融合系统表达，亲和纯化，获得纯度达90％的可溶性表达产物，即GST-单链抗体的融合蛋白(GST融合抗CD20单链抗体)，分子量约为52KD。
获得的融合蛋白(抗体)的特异反应活性用它在体外沉淀人CD20蛋白的能力加以评估。结果发现，该融合蛋白(SEQ ID NO10)可特异性地与CD20蛋白发生结合。
实施例3抗EpCAM单链抗体的重组表达根据SEQ ID NO5和7所示的抗体重链及轻链序列，以及设计的用于连接重链和轻链的连接序列，用人工合成的方法全合成单链抗体的DNA片段(序列如SEQ ID NO13所示)。
以此DNA片段为模板用以下引物进行PCR反应，正向引物CGG AAT TCC GTG CAG TCT GGG CCT(SEQ ID NO15)反向引物CCGCTCGAGACGTTTGATTTCCAGCTTGG(SEQ ID NO16)将PCR产物经EcoR I和Not I酶切后，装入pGEX 5X-2表达载体(购自Amersham公司)，转化大肠杆菌。此单链抗体基因经原核GST融合系统表达，亲和纯化，获得纯度达87％的可溶性表达产物，即GST-单链抗体的融合蛋白(GST融合抗EpCAM单链抗体)，分子量约为52KD。
获得的融合蛋白(抗体)的特异反应活性用它在体外沉淀人EpCAM蛋白的能力加以评估。结果发现，该融合蛋白(SEQ ID NO14)可特异性地与EpCAM蛋白发生结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>抗CD20和上皮细胞粘附分子的人源抗体<130>036974<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
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权利要求
1.一种抗体，其特征在于，该抗体的重链可变区含有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，该抗体的轻链可变区含有SEQ IDNO4或8的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，它是人源化的单克隆抗体。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，它含有SEQ ID NO1或5所示的编码抗体重链可变区的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，它还含有SEQ ID NO3或7所示的编码抗体轻链可变区的核苷酸序列。
7.一种载体，其特征在于，它含有编码权利要求1所述抗体的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列的操作性相连的表达调控序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体。
9.一种制备抗体的方法，其特征在于，该方法包括a)培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达抗体；和d)分离纯化所述抗体，从而获得所述抗体。
10.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的抗体以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明属于免疫学领域，具体涉及抗CD20和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的人源抗体及其制法和用途。该抗体对CD20和EpCAM有高亲和力和特异性。
文档编号C07K16/18GK1618812SQ20031010875
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者张新, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心