专利名称：一种提纯制备三磷酸核苷衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种核甘酸衍生物的提纯方法，特别涉及一种提纯制备三磷酸核苷衍生物的方法。
背景技术：
核苷酸是可解离化合物，其主体是阴离子，所以常用717、201等阴离子交换树脂或DEAE-Sephadex等弱碱性阴离子交换树脂加以分离提纯。
对于人工合成的核苷酸衍生物，通常也用相应阴离子交换树脂进行分离提纯。
文献(J.Med.Chem.1999，42213)报道，在下面的单磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反应中 目标产物是三磷酸核苷衍生物。反应结束后，对含目标产物三磷酸核苷衍生物的反应处理液采用DEAE-Sephadex阴离子交换树脂，以三乙胺的碳酸氢盐或碳酸氢铵水溶液作为洗脱液进行分离提纯，得到的三磷酸核苷铵盐如易吸潮，用碘化钠的丙酮溶液将其转化成钠盐。结果是，目标产物三磷酸核苷衍生物的提纯制备收率很低，通常只有8％左右。
造成这种情况的主要原因是，未反应的原料单磷酸核苷衍生物与目标产物三磷酸核苷衍生物，单用阴离子交换树脂不能得到有效彻底分离，原料和产物形成的交叉馏分很多，含纯产物的馏分很少，因而损失很大。即使将交叉馏分再进行一次阴离子交换树脂分离，收效甚微，原料和产物仍不能得到彻底有效分离。另外，用碘化钠的丙酮溶液将由阴离子交换树脂分离得到的易吸潮的纯三磷酸核苷衍生物铵盐转化成钠盐的过程中，转化率不高，结晶析出时又大打折扣。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提高合成型三磷酸核苷衍生物的纯化收率；优化制备型三磷酸核苷衍生物的提纯方法。
本发明的思路是本发明将用阴离子交换树脂分离得到的所有含产物的混合交叉部分合并，再用强酸性阳离子交换树脂进行离子交换，可以彻底截住未反应的原料单磷酸核苷衍生物，而目标产物三磷酸核苷衍生物则在树脂上被交换成原酸型无损耗地流淌下来，如有必要可将提纯后的三磷酸核苷衍生物的铵盐直接用碳酸氢盐转化成相应的三磷酸腺苷盐。
本发明技术方案是一种提纯制备三磷酸核苷衍生物的方法，单磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反应得到含有目标产物三磷酸核苷衍生物的反应处理液，用阴离子交换树脂按常规方法提纯得到的含单磷酸核苷和三磷酸核苷混合馏分，其特征在于用阳离子交换树脂对含单磷酸核苷和三磷酸核苷混合馏分进行彻底分离纯化，得到提纯的三磷酸核苷衍生物，必要时用碳酸氢盐直接制成相应的三磷酸核苷盐。
本发明所涉及的强酸性阳离子交换树脂为Dowex 50wx及相应型号强酸性离子交换树脂，对于所分离纯化的分子长度大于20A的三磷酸核苷衍生物，最好用Dowex 50wx大孔径的D001或相应型号强酸性离子交换树脂。
本发明所涉及的碳酸氢盐是碳酸氢钠或碳酸氢钾。
本发明所涉及的三磷酸核苷衍生物通式为 上式中B为嘌呤类或嘧啶类碱基，也可以为其它含氮杂环。
P为由三个磷原子组成的基团，相邻两个磷原子间除以氧原子构成磷酸酐形式外，也可以通过其它原子相连。
实施本发明前，先要把反应做好，反应结束后用过滤方法，将反应液中的不溶性杂质除去，抽干有机溶剂，用水溶解，上阴离子交换树脂，水洗，接着用梯度浓度有机胺的碳酸氢盐或碳酸氢铵溶液，以洗去无机物和有机质，合并含有产物的馏分。
实施本发明是很简单的，先将强酸性阳离子交换树脂转化成H+型，再将含有产物和原料的混合交叉部分合并，上样，原料单磷酸核苷被截留在树脂上，而产物三磷酸核苷的阳离子被树脂上的H+交换后以酸的形式流淌到含有碳酸氢铵的容器内，重新形成铵盐，完成了一个净化过程。经高真空冷冻干燥机干燥，多余的碳酸氢铵被彻底除去，得到的是纯净的目标产物铵盐。
如得到的衍生物铵盐纯品易吸潮，按照本发明，可用准确当量的碳酸氢钠或碳酸氢钾将其直接转化成相应的钠盐或钾盐
(注ATP表示三磷酸核苷衍生物)本发明的有益效果是采用本发明方法，目标产物三磷酸核苷衍生物的提纯制备收率比已知文献方法提高6倍以上。
图1为实例1阴离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐1H-NMR谱2为实例1阴离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐31P-NMR谱3为实例1阴离子交换树脂分离后不纯物1H-NMR谱4为实例1阴离子交换树脂分离后不纯物31P-NMR谱5为实例1阳离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐1H-NMR谱6为实例1阳离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐31P-NMR谱7为实例1三磷酸核苷钠盐1H-NMR谱8为实例1三磷酸核苷钠盐31P-NMR谱9为实例2阴离子交换树脂分离后粗品1H-NMR谱10为实例2阴离子交换树脂分离后粗品31P-NMR谱11为实例2阳离子交换树脂分离后回收单磷酸核苷1H-NMR谱12为实例2阳离子交换树脂分离后回收单磷酸核苷31P-NMR谱13为实例2阳离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐1H-NMR谱14为实例2阳离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐31P-NMR谱15为实例2三磷酸核苷钠盐1H-NMR谱16为实例3阳离子交换树脂分离后三磷酸核苷铵盐31P-NMR谱图
具体实施例方式
实例1反应式 将185毫克三正丁胺溶于15毫升吡啶中，加583毫克单磷酸核苷铵盐，搅拌溶解后于40℃下高真空抽干，氮气下解除真空。加12毫升无水DMF，溶解后加810毫克CDI，搅拌过夜。加246毫克甲醇，搅拌一小时后滴加1392毫克二氯磷酸和1056毫克三正丁胺溶于35毫升DMF的溶液，室温下搅拌反应26小时，过滤，60℃以下高真空抽去DMF，加20毫升去离子水，上阴离子交换树脂DEAD-Sephadex A-100柱进行分离。用500毫升去离子水洗，接着用250毫升0.1M碳酸氢铵和250毫升0.2M碳酸氢铵洗去未反应完的二氯磷酸，最后用0.3M的碳酸氢铵洗脱。洗脱过程中，用UV监测产物是否流出，一旦流出，每25毫升为一份。冷冻后，分别置真空冷冻干燥机内干燥，以H1-NMR和P31-NMR检测，合并相同部分。得纯产物三磷酸核苷铵盐35毫克，收率3.89％，见谱图1(1H-NMR)和谱图2(31P-NMR)；另得474毫克不纯物，见谱图3(1H-NMR)和谱图4(31P-NMR)，从磷谱看，约含14％(mol/mol)未反应完的单磷酸核苷铵盐(δ3.495单峰)。
取预先处理好的20克大孔强酸性阳离子交换树脂D001(H+型)装入柱子，将上述得到的474毫克白色粉末溶于50毫升去离子水中，上样，控制流量缓慢流出，馏分呈酸性并有UV吸收时，表明产物三磷酸核苷已馏出。含有产物的馏出液直接流入盛有320毫克碳酸氢铵的容器内。当样品液面降到树脂顶部时，继续用水洗，至馏出液呈中性或无UV时，表明产物已馏完。单磷酸核苷留在树脂内，而三磷酸核苷铵盐同H+型的阳离子交换树脂发生离子交换后以原酸型馏出，馏出后又与碳酸氢铵作用形成铵盐。馏出液冷冻后，置真空冷冻干燥机内干燥，多余的碳酸氢铵升华饴尽。得纯三磷酸核苷铵盐403毫克，连同用阴离子交换树脂DEAD-Sephadex A-100进行分离得到的35毫克纯三磷酸核苷铵盐，共438毫克，收率49.29％，从谱图5(1H-NMR)和谱图6(31P-NMR)上可以看出，已无单磷酸核苷痕迹。
得到的三磷酸核苷衍生物铵盐易吸潮，可用等当量碳酸氢钠将其转化成钠盐将得到的纯三磷酸核苷铵盐438毫克(0.497mmol)溶入含有125毫克碳酸氢钠(1.491mmol)10毫升纯净水的溶液中，冷冻后置真空冷冻干燥机内干燥，得445毫克纯三磷酸核苷钠盐白色粉末。见谱图7(1H-NMR)和谱图8(31P-NMR)。
实例2将彻底干燥的2006毫克单磷酸核苷铵盐溶入10毫升无水吡啶中，加665毫克三正丁胺，溶解后减压抽干，之后继续用油泵将水分彻底抽干，用氮气解除真空。加35毫升绝对无水DMF，溶解后加2718毫克CDI。搅拌14小时加936毫克无水甲醇。两小时后滴加4893毫克二氯磷酸和3694毫克三正丁胺溶入120毫升绝对无水DMF的溶液，室温下搅拌反应24小时。过滤，油泵抽干DMF，加100毫升去离子水，用弱碱性阴离子交换树脂DEAD-Sephadex A-50柱进行分离。先用2000毫升去离子水洗，再用1000毫升0.1M碳酸氢铵和1000毫升0.2M碳酸氢铵洗，以洗去未反应完的二氯磷酸，最后用0.3M的碳酸氢铵洗脱。洗脱过程中，用UV检查产物是否流出，将含有产物的馏分冷冻后，置真空冷冻干燥机内干燥，共2089毫克粗品，从图谱9(1H-NMR)和图谱10(31P-NMR)看，显示有单磷酸核苷存在，含有约18％(mol/mol)的单磷酸核苷(31P-NMR)。
将上述白色粉末粗品溶入200毫升去离子水中，另取预先处理成H+型的100克大孔强酸性阳离子交换树脂D001装入柱子。上样，控制流量缓慢流出，通过UV监视产物三磷酸核苷是否馏出，将馏出液直接流入盛有2000毫克碳酸氢铵的容器内，继续用去离子水洗，直至无产物馏出。(产物馏完，单磷酸核苷还留在树脂内，改用2M的氨水洗脱，将含有单磷酸核苷的馏分冷冻后真空冷冻干燥，回收到382毫克原料单磷酸核苷，见图谱111H-NMR和图谱1231P-NMR)。将含有产物三磷酸核苷的馏出液冷冻后，置真空冷冻干燥机内干燥，得纯三磷酸核苷铵盐1622毫克，收率53.45％。见图谱13(1H-NMR)和图谱14(31P-NMR)。将上述纯净的三磷酸核苷铵盐溶入含有463毫克碳酸氢钠的50毫升纯净水中，冷冻后置真空冷冻干燥机内干燥，得1650毫克白色磷酸核苷钠盐。见图谱15(1H-NMR)。元素分析C17H22Cl2F3N5Na3O12P3S2·4H2O，912.94，C计算值22.33％，实验值22.66％。
实例3反应式 在20毫升无水吡啶中加入2.62克单磷酸核苷铵盐和1.3克三正丁胺，搅拌溶解后于40℃下高真空抽干，氮气下解除真空。加70毫升无水DMF和5.44克CDI。搅拌过夜加1.88克无水甲醇。搅拌下滴加9.8克二氯磷酸和7.4克三正丁胺溶入240毫升无水DMF的溶液，室温下搅拌反应一天。滤除白色固体，用油泵抽去DMF，加200毫升去离子水，搅拌后倒入弱碱性阴离子交换树脂DEAD-Sephadex A-50柱，进行分离，用4000毫升去离子水洗，再分别用2000毫升0.1M碳酸氢铵和2000毫升0.2M碳酸氢铵洗，然后用0.3M的碳酸氢铵洗。UV监测洗脱过程，将含有产物的馏分冷冻后，置真空冷冻干燥机内干燥，得3250毫克粗品。将此白色粉末粗品溶入300毫升去离子水中。另取预先处理成H+型的200克大孔强酸性阳离子交换树脂D001装入柱子。上样，控制流出速度，用UV监视产物三磷酸核苷是否馏出，将馏出液直接流入盛有4000毫克碳酸氢铵的容器内，继续用去离子水洗，直至无产物馏出。将含有产物三磷酸核苷的馏出液冷冻后，置真空冷冻干燥机内干燥，得纯三磷酸核苷铵盐白色粉末2520毫克，收率58.79％。见图谱16(31P-NMR)。
元素分析C11H25Cl2N8O12P3·4H2O，696.06，C计算值18.95％，实验值19.02％；H计算值4.77％，实验值4.72％。
权利要求
1.一种提纯制备三磷酸核苷衍生物的方法，单磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反应得到含有目标产物三磷酸核苷衍生物的反应处理液，用阴离子交换树脂按常规方法提纯得到的含单磷酸核苷和三磷酸核苷混合馏分，其特征在于用阳离子交换树脂对含单磷酸核苷和三磷酸核苷混合馏分进行彻底分离纯化，得到提纯的三磷酸核苷衍生物，必要时用碳酸氢盐直接制成相应的三磷酸核苷盐。
2.按照权利要求1所描述的方法，其特征在于所涉及的阳离子交换树脂最好用Dowex 50wx及相应型号强酸性离子交换树脂。
3.按照权利要求1或2所描述的方法，其特征在于对于所分离纯化的分子长度大于20A的三磷酸核苷衍生物，最好用Dowex 50wx大孔径的D001或相应型号强酸性离子交换树脂。
4.按照权利要求1所描述的方法，其特征在于碳酸氢盐为碳酸氢钠或碳酸氢钾。
5.按照权利要求1所描述的方法，其特征在于用提纯后的三磷酸核苷衍生物的铵盐加等当量的碳酸氢钠或碳酸氢钾，共溶于水，经真空冷冻干燥后制成不易潮解的相应钠盐或钾盐。
6.按照权利要求1所描述的方法，其特征在于所涉及的三磷酸核苷衍生物是指 上式中B为嘌呤类或嘧啶类碱基，也可以为其它含氮杂环；P为由三个磷原子组成的基团，相邻两个磷原子间除以氧原子构成磷酸酐形式外，也可以通过其它原子相连。
全文摘要
本发明涉及一种核甘酸衍生物的提纯方法，特别涉及一种提纯制备三磷酸核苷衍生物的方法。解决了现有利用阴离子交换树脂或DEAE－Sephadex等弱碱性阴离子交换树脂分离提纯三磷酸核苷衍生物存在的提纯得率低的缺陷。一种提纯制备三磷酸核苷衍生物的方法，单磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反应得到含有目标产物三磷酸核苷衍生物的反应处理液，用阴离子交换树脂按常规方法提纯得到的含单磷酸核苷和三磷酸核苷混合馏分，其特征在于用阳离子交换树脂对含单磷酸核苷和三磷酸核苷混合馏分进行彻底分离纯化，得到提纯的三磷酸核苷衍生物，必要时用碳酸氢盐直接制成相应的三磷酸核苷盐。主要用于三磷酸核苷衍生物的提纯制备。采用本发明方法，目标产物三磷酸核苷衍生物的提纯制备收率比已知文献方法提高6倍以上。
文档编号C07H19/20GK1613864SQ20031010833
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月3日 优先权日2003年11月3日
发明者徐继有, 陈华祥, 马汝建, 李革 申请人:上海药明康德新药开发有限公司