专利名称：用于单独测定scca同形异构体的免疫测定法的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及单独测定SCCA的各种同形异构体，以及用不同的同形异构体的血清学浓度和它们之间的比率作为诊断癌症的一种方法。
背景技术：
鳞状细胞癌抗原(SCCA)是子宫，子宫颈，肺部，头颈部，阴门和食管的鳞状细胞癌(SCC)的血清学标记(1，2)。它最初在70年代末由Kato及其合作者从人类子宫颈的鳞状细胞癌，分子量为42-48kDa的TA-4复合物中提纯得到的(1，3)。TA-4复合物的电泳现象揭示了有10个以上的片断，并且抗原等电位聚集暗示了有两个亚片断，一个酸性的(pI＜6.25)和一个中性的(pI≥6.25)同形异构体(4)。
克隆SCCA的cDNA显示，它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)一族(6)。进一步克隆染色体18q21.3上的基因区，显示出两个衔接排列的基因(7)。有较多端粒的一个，即原始的SCCA，叫做SCCA1；而有较多着丝粒的一个叫做SCCA2(图1)。两种都包含8个外显子和假定的内含子-外显子界面，剪接部位，起始密码子，以及相同的终止密码子。它们有98％的核苷酸水平相同，有92％的氨基酸水平相同。SCCA1和SCCA2基因产物推导出的pI值显示，中性的同形异构体由SCCA1编码，而酸性的同形异构体由SCCA2编码。
人类丝氨酸蛋白酶抑制剂图谱对应两个染色体族之一。PI6，PI9和ELNAH2图谱对应6p25；而PI8，Bomapin，PAI2，SCCA1，SCCA2，Headpin和Maspin图谱对应18q21.3(图1)(7-12)。人们认为通过两个独立染色体间的重复作用和几轮染色体内的重复作用，出现了这些族(9)。经常有报道说染色体区18q是基因重排频率很高的区域(9，13-16)。丝氨酸蛋白酶抑制剂的目标和功能还没有完全掌握。对大多数情况来说，其主要功能是调节与凝固作用，纤维蛋白溶解作用，编程性细胞死亡和炎症相关的蛋白水解事件，而其它功能如运输激素和调节血压也曾经报道过(17-24)。
尽管SCCA1和SCCA2几乎相同，但它们的反应活性部位环不同(图2和3)。SCCA1抑制木瓜蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶S，K和L(25，26)，而SCCA2抑制胰凝乳蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶组织蛋白酶G和肥大细胞类糜蛋白酶(27)。对SCCA1反应活性部位环(RSL)的研究表明，反应活性部位环(RSL)对于抑制半胱氨酸蛋白酶是必要的(28)。反应活性部位环(RSL)的可变部分指明了由SCCA1和SCCA2交换突变体以及单个突变体的反应活性部位环显示出对目标蛋白酶的专一性(28，29)。很可能丝氨酸蛋白酶抑制剂利用普通的基于反应活性部位环(RSL)的机理来抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。
对于SCCA1和SCCA2的生物学角色，人们还没有完全了解。它们被认为是有抑制作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂。资料显示SCCA与编程性细胞死亡与表达有关，通过抑制编程性细胞死亡，使癌细胞抵抗各种致死机理(30)。
在正常的鳞状上皮细胞的细胞质里发现了SCCA1和SCCA2(31，33)。出现在病人血清中的抗原可能是由肿瘤细胞和它们的正常更新引起SCCA过度生产的作用(34)。已有报道，利用抗体放射免疫学测定或实时-PCR，RT-PCR，在血清中发现的SCCA主要是SCCA2(1，35，36)；但利用PCR的其它研究表明两种抗原都能在病人样本中被放大并发现(37)。
患有SCC的病人的血清浓度与临床阶段和肿瘤的组织分化程度相关(1)。对于子宫颈癌，一些研究显示了预处理值与临床结果之间的关系(1，38-43)。研究还显示了高的SCCA水平与肿瘤体积之间的关系。复发或病情加重能够在出现临床迹象前几个月被发现(39)。在肺部，阴门，头和颈部以及食道处的鳞状细胞癌均可看到类似的结果(1，2，44，45)。在所有这些研究中，他们已测量出SCCA总量水平。
SCCA’s属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，并且很可能在组织和循环中发现不同形式的丝氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂通常的功能是调节不同蛋白水解酶的活性，并且可以推测在组织和血清中的SCCA1和SCCA2也可以“游离的”丝氨酸蛋白酶抑制剂和与它们目标蛋白酶结合形成的复合物存在。这类似于丝氨酸蛋白酶PSA，发现它在血清中主要是与丝氨酸蛋白酶抑制剂α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物。相对于“总量”SCCA，单独测定SCCA1和SCCA2以及相应丝氨酸蛋白酶抑制剂“游离的”和复合物形式也可以提供另外的临床信息。
发明概述本发明公开了确立能分辨SCCA1和SCCA2以及分辨“游离的”和相应丝氨酸蛋白酶抑制剂“总量”的单克隆抗体。另外，本发明描述了将确立的鉴别抗体用于实现测定SCCA1和SCCA2丝氨酸蛋白酶抑制剂的总量及“游离”形式的免疫测定法的意图，以及将免疫测定法用于诊断癌症并发现疾病复发。
详细实施例分别确立对抗SCCA1和SCCA2抗原决定部位的单克隆抗体，以及暴露和隐藏在SCCA’s的丝氨酸蛋白酶复合物中的Pan SCCA，可能设计出用于测定SCCA相应形式的特定免疫测定法。另外，本发明还公开了利用特定免疫测定法诊断癌症的方法。
实施例1重组SCCA的制备1.1克隆SCCA利用快速制备微量mRNA纯化试剂盒(QuickPrep Micro mRNA PurificationKit)(Pharmacia公司)制备来自细胞系Caski(子宫颈)，C-4I(子宫颈)，A549(肺部)和RPMI2650(咽部)的mRNAs，利用第一链cDNA合成试剂盒(First-Strand cDNA Synthesis Kit)(Pharmacia公司)制备cDNA。在100μl含有10mM Tris-HCl pH 8.85，25mM KCl，5mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4(Boehringer公司)，0.2mM dNTP(Pharmacia公司)，10μM SCCA 1-7F(所有引物的DNA序列在表1中列出)，10μM SCCA 391-397B，2μl cDNA和2.5U Pwo-聚合酶(Boehringer公司)的反应液中，通过PCR反应将覆盖着SCCA编码序列的1218bp DNA片断放大。在96℃使样本变性5分钟后，完成总数为30次的循环，每次循环包括在96℃变性15秒，在60℃退火15秒，以及在72℃伸展30秒。最后在72℃伸展10分钟完成PCR反应。
SCCA1和SCCA2的发现通过用限制性内切酶SacII剪切，产生两个片断，分别是245和973bp，或者通过SCCA1-特定PCR反应，引物SCCA1-7F和SCCA1 323-329B用在标准PCR反应中(75mM Tris-HCl pH8.8，20mM(NH4)2SO4，0.01％特威恩(Tween)20，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，每种引物10μM，模板，及0.025U/μl反应Taq聚合酶；在96℃使样本变性5分钟后，完成总数为30次的循环，每次循环包括在96℃变性15秒，在最佳的退火温度退火15秒，以及在72℃伸展30秒。最后在72℃伸展10分钟完成PCR反应。)，Ta＝50℃，产生997bp片断，从而发现在PCR产物中存在SCCA1。通过标准PCR反应，使用SCCA1-7F和SCCA2-特定引物，SCCA2 357-363B，Ta＝60℃，给出1090bp片断，发现SCCA2的存在。
克隆用PCR-Script Amp cloning kit(Stratagene公司)克隆PCR-产物。通过如1.2中所描述的PCR反应完成菌落筛选。利用Wizard Plus微量制备质粒DNA纯化系统(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)(Promega公司)从选出的含有SCCA1或SCCA2的无性繁殖系中制备质粒-DNAs。
DNA序列测定用ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing(PE Biosystems公司)对无性繁殖系进行测序。样品在ABI Prism 310上检测。
再克隆将选出的无性繁殖系再克隆到expression vector pGEX-6P-3中(Pharmacia公司)。用BamHI和XhoI从PCR-Script Amp vector上切除片断，并在10μl含1×OPA，1mM ATP，50ng被剪切的载体，SCCA插入片断，对应于末端载体插入片断的摩尔数比例为1∶5-1∶8，和7.5-10U T4DNAligase(所有都购自Pharmacia公司)的反应液中将片断连接到expression vector中。将反应试管在10℃保温过夜，并在65℃失活10分钟。2-4μl的反应物转化成E.Coli JM109(46)。选出的无性繁殖系的Plasmid-DNAs转化成E.Coli BL21用于蛋白质表达(proteinexpression)。
克隆基因的保持Plasmid-DNA(含有SCCA1/A2融合基因的pGEX-6P-3)在10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲溶液中在-80℃贮存。为恢复蛋白质表达(protein expression)，根据Sambrook等(参考文献46 1.82-1.84页)，将plasmid-DNA转化成具有反应潜能的E.coli BL21。为制备更多的plasmid-DNA，优选转化成E.coli JM109。
1.1.2蛋白质表达和纯化蛋白质表达小规模制备决定表达条件。对于大规模表达，将500ml 2×YT培养物和100μg氨苄青霉素/ml与5ml过夜的培养物接种，并在37℃培育。在OD600＝0.5-1.3通过加入IPTG直至最终浓度为0.1mM来诱导蛋白质表达。
蛋白质纯化在2000g下离心10分钟后采集细胞，用50ml TE pH8.0洗涤细胞，然后将细胞溶解于3ml TE/g细菌沉淀物中。加入溶菌酶直至最后浓度为800μg/g沉淀物，并将混合物在冰上培养30-60分钟，然后将混合物在-70℃冷冻一晚。加入氯化镁和DNA酶直至最后浓度分别为12mM和20μg/g沉淀物。在冰上培养30分钟后，样本在40000g下离心30分钟。向每份上清夜中加入0.5ml 50％的谷胱甘肽Sepharose琼脂糖凝胶(Pharmacia公司)，并在室温平缓搅拌培养30分钟-2小时。用1×PBS洗涤浆状物5-7次。用0.5-1ml还原型谷胱甘肽(Pharmacia公司)洗脱GST-SCCA融合蛋白，并在室温培养30-60分钟或在4℃培养一夜，两者均平缓搅拌。通过GST和SCCA之间剪切，洗脱SCCA蛋白。加入0.48ml剪切缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.0，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)和20μl PreScission蛋白酶，并在4℃培养样本保持平缓搅拌4小时或一夜。用Phast-system全自动水平电泳系统(Pharmacia公司)在SDS-PAGE上分析蛋白质。
实施例2杂交瘤和单克隆抗体的确立
2.1抗SCCA杂交瘤的免疫接种和初步选择用重组SCC抗原给兔子进行皮下免疫接种并根据标准程序收集免疫血清，由此获得与SCC抗原反应的多克隆抗血清。通过测定抗血清与固定在链霉抗生物素平皿(Labsystems Oy公司，芬兰赫尔辛基)中的生物素化的SCCA2和SCCA1的反应性，检测多克隆抗血清的滴定度。根据标准程序用生物素-N-琥珀酰亚胺己酸酯对重组SCCA2和SCCA1进行生物素化。
用Ribi佐剂中10-50μg的重组SCCA对Balb/c小鼠进行腹膜内免疫接种，获得与SCCA1和SCCA2反应的单克隆抗体。经过免疫接种，在60-90天内接受2-4次促升剂量后，免疫接种了的小鼠的脾细胞与所述的P3×63Ag 8骨髓瘤细胞融合。
通过对处于覆盖有抗小鼠IgG+M的亲和性纯化多克隆抗血清(Jackson免疫研究实验室，美国)的微量滴定容皿中的杂交瘤上清夜进行ELISA筛选，选出产生抗体与SCCA1和/或SCCA2反应的杂交瘤。然后用SCCA抗原培养容皿，经过洗涤后，通过用多克隆兔子抗SCC(polyclonal Rabbit Anti SCC)和标记为Swine抗兔子Ig的HRP(HRP labeled Swine Anti Rabbit Ig)(Dako公司，丹麦哥本哈根)培养，发现了结合抗原。
2.2选出的杂交瘤与SCC抗原的反应性在ELISA中检测确立的杂交瘤的反应性类似于筛选程序。简单地将由杂交瘤产生的单克隆抗体固定在覆盖有抗小鼠IgG+M的多克隆抗血清(Jackson免疫研究实验室，美国)的微量滴定平皿中。然后用50μL不同的重组SCC抗原(SCCA1，SCCA2，SCCA1/A2和SCCA2/A1融合蛋白)在PBS 1％BSA中对容皿进行1小时的培养，洗涤后，用100μL兔子抗-SCC按1/5000的比例稀释在PBS-1％BSA中的溶液对平皿进行培养，并再培养1小时。通过用HRP-Swine抗兔子Ig培养，发现结合的兔子抗-SCC，用OPD底物并测定450nm处OD值，使其显现。
图4列出了选出的杂交瘤的反应性。其在以下的表1中也是很明显的。
表1SCC单克SCCA1 SCCA2 SCCA1/A2 SCCA2/A1隆抗体SCC107 84 69 71 100SCC113 79 72 82 100SCC131 98 100100 92SCC133 99 80 87 97SCC134 81 58 99 66SCC136 88 89 78 79SCC140 10057 77 100SCC143 97 70 68 90SCC154 79 54 74 68SCC162 94 62 79 81SCC163 80 65 73 80SCC164 85 54 82 63SCC110 89 1 87 12SCC111 97 0 78 15SCC118 94 0 68 15SCC124 1002 88 16SCC141 5 42 080SCC161 0 43 045SCC103 0 10085 0SCC104 0 90 85 0SCC109 0 79 100 0
2.3选择能鉴别游离和复合物-结合SCCA的单克隆抗体通过测定与SCCA-蛋白酶复合物的结合和与“游离”的SCCA的结合，选出与暴露在SCCA-蛋白酶复合物中的抗原决定部位反应的单克隆抗体(MAb)及与“隐藏”在丝氨酸蛋白酶抑制物-蛋白酶复合物中的抗原决定部位反应的单克隆抗体。
2.3.1 SCCA-蛋白酶复合物的确立将2μg SCCA-蛋白与0.5μg组织蛋白酶G(Biodesign公司)或0.9μg组织蛋白酶L(Calbiochem公司)于1×PBS缓冲液得到总体积为4.5μl的溶液0.5μg混合，得到SCCA与目标蛋白酶结合的复合物。样本在37℃培养30分钟。向每份样本中加入0.5μl 10×复合物-缓冲液(20％SDS，140mM巯基乙醇，溴酚蓝)。样本在95℃培养3分钟，并在12.5％SDS-PAGE-凝胶上分析。
下面的表2和图5明显地反映出复合物结合的反应性。
2.3.2与SCCA-蛋白酶复合物的反应性。
单克隆抗体识别出抗原决定部位，其分别对SCCA1和组织蛋白酶L之间以及SCCA2和组织蛋白酶G之间的复合物形成无干扰，通过分别对能识别出位于SCCA1和SCCA2外显子2-7中的抗原决定部位的抗体进行预温育，然后在所描述的ELISA测定法中测定复合物形成，发现了此单克隆抗体。
由于能分别抑制SCCA1和组织蛋白酶L之间以及SCCA2和组织蛋白酶G之间的复合物形成，可推知，许多抗体识别出不受丝氨酸蛋白酶抑制物和目标蛋白酶之间复合物形成影响的抗原决定部位。图5和下面的表2显示了抗体与丝氨酸蛋白酶抑制物-蛋白酶的反应性。
表2SCC单克 SCCA1-组 组织蛋白 SCCA2-组织 组织蛋隆抗体织蛋白酶L 酶L 蛋白酶G 白酶GSCC10788 2 81 12SCC13386 3 75 21SCC15492 2 83 15SCC16279 4 85 16SCC16482 5 87 7SCC13494 2 39 15SCC13683 2 60 13SCC11393 5 100 17SCC14092 5 96 12SCC16378 4 70 9SCC13188 4 45 15SCC14380 5 28 12SCC12472 1 12 15SCC11877 1 12 18SCC11087 2 15 21SCC11194 3 8 12SCC14112 0 68 14SCC16115 0 56 17SCC1044 0 12 8SCC1092 0 8 17SCC1035 0 100 142.3.1中描述的抗体与处于外显子8中的抗原决定部位反应，这些抗体抑制相应的丝氨酸蛋白酶抑制物和它的蛋白酶之间复合物的形成。可以推断，这些抗体识别“隐藏的”抗原决定部位。
与“游离的”SCCA的复合物如下面的表3及图6所示。
表3SCC 单 SCCA1 SCCA2 SCCA1/A2 SCCA2/A1克隆抗体SCC10784697185SCC13399808790SCC15479547468SCC16294627981SCC16485548263SCC13481589966SCC13688897879SCC11379728289SCC140957777100SCC16380657380SCC13198100 100 92SCC14397706890SCC124852 8816SCC118940 6815SCC110891 8712SCC111970 785SCC14110520 80SCC1610 530 55SCC1040 90850SCC1090 79100 0SCC1030 100 850
2.3.3确立的单克隆抗体反应性概述确立的单克隆抗体对不同形式SCCA的反应性概括在表4中。
表4
A1b组和A3b组优选与“游离的”SCC反应；C1a组和C2a组识别“SCCA2总量”，而C1b组和C2b组仅识别“游离的SCCA2”。
2.4不同的单克隆抗体产物通过在试管中培养杂交瘤无性繁殖系，通过在旋转瓶里将104细胞/mL接种于含5％胎牛血清的DMEM培养基中，产生单克隆抗体，并让其生长10-14天。然后根据厂商的建议，利用蛋白A(Bioprocessing公司，英国达累姆)亲合色谱法从培养基中提纯单克隆抗体。
实施例3免疫测定法的确立利用确立的单克隆抗体和重组蛋白，很可能开发出用于单独测定SCCA总量和“游离的”SCCA总量的免疫测定法，和用于分别单独测定SCCA1总量和“游离的”SCCA1的测定法及用于单独测定SCCA2总量和“游离的”SCCA2的测定法。
3.1用于测定SCCA总量的免疫测定法3.1.1用于测定“SCCA总量”的免疫测定法将A1a(表1)中的抗体与来自A2组或A3a组的抗体结合使用，设计出特定用于SCCA的测定法，即“游离的”SCCA1，“游离的”SCCA2，复合的SCCA1和复合的SCCA2之总和。
优选组合是抗体SCC113用作捕获抗体，SCC107用作检测抗体。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化学公司，美国)，使用标准程序对SCC113单克隆抗体进行生物素化，并用作捕获抗体。根据Nakone程序的修饰，SCC107单克隆抗体与HRP结合。
根据下列方案，在一步酶免疫测定(one-step EIA)中使用生物素化的SCC113单克隆抗体和结合了HRP的SCC107单克隆抗体。
测定过程1.向覆盖着链霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems Oy公司，芬兰赫尔辛基)里的测定缓冲液中加入25μL SCCA重组抗原(在PBS缓冲液中的浓度为0-50μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，加入100μL生物素SCC113单克隆抗体，1μg/mL和HRPSCC107，1μg/mL。
2.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
3.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75洗涤6次。
4.加入100μL TMB，美国ELISA技术公司。
5.培养30分钟±5分钟6.ELISA读数仪测620nm处OD值。
游离和复合的SCCA1和SCCA2抗原的剂量-反应曲线显示了此测定法识别出了所有形式的SCCA。
3.2用于单独测定SCCA1的测定法3.2.1对SCCA1总量的测定将B1组的抗体与来自A1a组，A2组或A3a组的抗体结合使用，设计出特别测定SCCA1总量的测定法，即游离和复合的SCCA1，与SCCA2无显著的反应性。优选组合是SCC110单克隆抗体用作捕获抗体，SCC107用作检测抗体。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化学公司，美国)利用标准程序对SCC111单克隆抗体进行生物素化，并将其用作捕获抗体。根据Nakone程序的修饰，SCC107单克隆抗体与HRP，V型(Sigma化学公司，美国)结合。
根据下列方案，在两位点酶免疫测定(two-site EIA)中使用生物素化的SCC111单克隆抗体和结合了HRP的SCC107单克隆抗体。
测定过程1.向覆盖着链霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬兰赫尔辛基)中的测定缓冲液中加入50μL SCC重组抗原(在PBS缓冲液中的浓度为0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCC111单克隆抗体，2μg/mL。
2.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
3.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤3次。
4.在测定缓冲液中加入100μL HRP SCC107单克隆抗体2μg/mL。
5.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
6.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技术公司，美国
8.培养30分钟±5分钟9.ELISA读数仪测620nm处OD值。
基于SCCA1和SCCA2的剂量-反应曲线图，可推断出，实施例3.2.1的测定法能识别出与SCCA2交叉反应性＜5％的所有形式的SCCA1。
3.2.2对“游离的”SCCA1的测定将B2组抗体与A1a组抗体结合使用，设计出单独测定“游离的”SCCA1的测定法，即特定用于非复合的SCCA1，与复合的SCCA1或SCCA2无显著的反应性。优选组合是SCCK134单克隆抗体用作捕获抗体，SCC107用作检测抗体。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化学公司，美国)利用标准程序对SCCK134单克隆抗体进行生物素化，并将其用作捕获抗体。根据Nakone程序的修饰，SCC107单克隆抗体与HRP，V型(Sigma化学公司，美国)结合。
根据下列方案，在两位点酶免疫测定(two-site EIA)中使用生物素化的SCCK134单克隆抗体和结合了HRP的SCC107单克隆抗体。
测定过程1.向覆盖着链霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬兰赫尔辛基)里的测定缓冲液中，加入50μL SCC重组抗原(在PBS缓冲液中的浓度为0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCCK134单克隆抗体，2μg/mL。
2.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
3.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤3次。
4.在测定缓冲液中加入100μL HRP SCC107单克隆抗体2μg/mL。
5.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
6.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技术公司，美国8.培养30分钟±5分钟9.ELISA读数仪测620nm处OD值。
基于SCCA1和SCCA2的剂量-反应曲线图，可推断出，实施例3.2.2的测定法能识别出与复合SCCA1或SCCA2交叉反应性＜5％的仅“游离”的SCCA1。
3.3用于单独测定SCCA2的测定法3.3.1用于测定SCCA2总量的测定法将C1a组或C2a组的抗体与A1a组的抗体结合使用，设计出单独测定SCCA2总量的测定法，即游离和复合的SCCA2，与SCCA1无显著的反应性。优选组合是SCC103单克隆抗体用作捕获抗体，SCC107用作检测抗体。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化学公司，美国)利用标准程序对SCC103单克隆抗体进行生物素化，并将其用作捕获抗体。根据Nakone程序的修饰，SCC107单克隆抗体与HRP，V型(Sigma化学公司，美国)结合。
根据下列方案，在两位点酶免疫测定(two-site EIA)中使用生物素化的SCC103单克隆抗体和结合了HRP的SCC107单克隆抗体。
测定过程1.向覆盖着链霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬兰赫尔辛基)里的测定缓冲液中，加入50μL SCC重组抗原(在PBS缓冲液中的浓度为0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCC103单克隆抗体，2μg/mL。
2.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
3.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤3次。
4.在测定缓冲液中加入100μL HRP SCC107单克隆抗体2μg/mL。
5.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
6.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技术公司，美国8.培养30分钟±5分钟9.ELISA读数仪测620nm处OD值。
基于SCCA1和SCCA2的剂量-反应曲线图，可推断出，实施例3.3.1的测定法能识别出与SCCA2交叉反应性＜5％的所有形式的SCCA2。
3.3.2对“游离的”SCCA2的测定将来自C2b组的抗体与A1a组的抗体结合使用，设计出单独测定“游离的”SCCA2的测定法，即非复合的SCCA2，与SCCA2-蛋白酶复合物或SCCA1无显著反应性。优选组合是SCC104单克隆抗体用作捕获抗体，SCC107用作检测抗体。
用生物素NHRS己酸酯(Sigma化学公司，美国)利用标准程序对SCC104单克隆抗体进行生物素化，并将其用作捕获抗体。根据Nakone程序的修饰，SCC107单克隆抗体与HRP，V型(Sigma化学公司，美国)结合。
根据下列方案，在两位点酶免疫测定(two-site EIA)中使用生物素化的SCC104单克隆抗体和结合了HRP的SCC107单克隆抗体。
测定过程1.向覆盖着链霉抗生物素蛋白的微量滴定皿(Labsystems公司，芬兰赫尔辛基)里的测定缓冲液中，加入50μL SCC重组抗原(在PBS缓冲液中的浓度为0-100μg/L，60g/L牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，和100μL生物素SCC104单克隆抗体，2μg/mL。
2.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
3.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤3次。
4.在测定缓冲液中加入100μL HRPSCC107单克隆抗体2μg/mL。
5.培养1小时±10分钟，并一直摇动。
6.用5mM Tris缓冲液，0.05％Tween 40，pH7.75，洗涤6次。
7.加入100μL TMB，ELISA技术公司，美国8.培养30分钟±5分钟9.ELISA读数仪测620nm处OD值。
基于SCCA1和SCCA2的剂量-反应曲线图，可推断出，实施例3.3.2的免疫测定法能识别出与复合SCCA2或SCCA1交叉反应性＜5％的仅“游离”的SCCA2。
实施例4用鉴别“游离的”SCCA的免疫测定法诊断癌症。
将实施例3的免疫测定法用于测定健康个体和患有鳞状细胞癌病人体内不同形式的SCCA。
正如所料，所有的测定法都显示出了健康个体与癌症患者之间的区别。然而，对于测定SCCA2的测定法，健康受测体和癌症患者之间的鉴别比率较高，此测定法可通过测定游离与复合的SCCA2之间的比率以及SCCA2与SCCA1之间的比率得以进一步改善。
测定50名供血者和50名健康受测者年龄在50-65岁的SCCA同型异构体以便得到测定的正常水平上限。根据实施例3的测定法，测定94个诊断患有子宫颈癌的女性样本和20名患有鳞状细胞肺癌患者的SCCA同型异构体。
实施例4.1图2显示了鳞状细胞肺癌的结果。有14个病人SCCA1高于正常水平上限，而SCCA2高于正常水平上限的病人增加到18个。相比于SCCA1，SCCA2水平也相对高些，从而增大了健康受测者与恶性病患者之间的区别。
实施4.2子宫颈癌中的SCCA图7-10显示了来自患子宫颈癌的女性预治疗样本中SCCA1和SCCA2的水平。与SCCA1相比，SCCA2一般增加地相对高些。从而增大了健康受测者与子宫颈癌患者之间的区别。
实施例4.3治疗控制子宫颈癌中的SCCA1和SCCA2利用实施例3的测定法，在治疗控制期间，对6位病人的SCCA1和SCCA2进行测定。无论SCCA1和SCCA2都伴随着疾病临床发病病程，并在4/4病人疾病临床症状出现之前，SCCA1和SCCA2发现疾病复发。而病人中，SCCA2的相对增加高于SCCA1，从而提供了疾病复发的早期信号。有NED的病人经过治疗后，无论SCCA1和SCCA2均能达到正常。
病人53在治疗后18个月发现病情复发。SCCA1和SCCA2升高说明病情复发，但SCCA2与SCCA1相比，作出反应更早，并且对于指示复发迹象显示出更高的水平。
经过治疗后16个月临床发现病人29病情复发，从治疗后8个月的时候，SCCA2升高指示出复发情况，这比SCCA1早了2-3个月。
病人83在开始治疗后7个月表现出病情加重。SCCA2从未正常过，而SCCA1在开始治疗后3个月正常，然后在临床诊断出病情加重时胃里的SCCA1或多或少地有所升高。
13个月后临床诊断出病人70病情复发。治疗后5-6个月之间SCCA2处于上升状态。治疗后9个月SCCA1也轻微升高，后来伴随着临床发病病程。而SCCA2在临床诊断前5-7个月就更加清楚地指示出病情复发。
病人48的SCCA2的水平从未正常过，这暗示了在治疗后2个月病情已经复发并加重。SCCA1在治疗后5个月之前一直都处于正常水平上限，之后才开始升高。
病人45对治疗有响应，治疗后没有观察到疾病迹象。通过SCCA1和SCCA2的水平均正常并停留在正常范围内，说明了这一点。
无论SCCA1还是SCCA2都跟随着疾病的临床发病病程。而SCCA2与SCCA1相比，对病情复发作出的反应更早且更明显。
图1人类丝氨酸蛋白酶抑制剂图谱对应两种染色体族之一。PI6，PI9和ELNAH2图谱对应6p25；而PI8，Bomapin，PAI2，SCCA1，SCCA2，Headpin和Maspin图谱对应18q21.3。
图2-3显示了SCCA1和SCCA2的反应活性部位环。
图4显示了SCC单克隆抗体相关的反应性。
图5显示了复合物结合的SCC单克隆抗体相关的反应性。
图6显示了“游离的”SCC单克隆抗体相关的反应性。
图7显示了在20个鳞状细胞肺癌，限制病情，样本中的SCCA1和SCCA2。
横条分别指示SCCA1和SCCA2的参考水平上限。
图8第I阶段子宫颈癌中的SCCA1和SCCA2。
横条分别指示SCCA1和SCCA2的参考水平上限。
图9第II阶段子宫颈癌中的SCCA1和SCCA2。
横条分别指示SCCA1和SCCA2的参考水平上限。
图10第III-IV阶段子宫颈癌中的SCCA1和SCCA2。
横条指示正常水平上限。
参考文献1.Kato，H.(1992)in Serological Cancer Markers，ed. Sell，S.(The Humana Press，Totowa，NJ)，pp.437-451.
2..Yamawaki，T.，Takeshima，N.，Shimizu，Y.，Teshima，H.& Hasumi，K.(1996)J ObstetGynaecol Res 22，341-6.
3.Kato，H.& Torigoe，T.(1977)Cancer 40，1621-8.
4.Kato，H.，Nagaya，T.& Torigoe，T.(1984)Gann 75，433-5.
5.Suminami，Y.，Nawata，S. & Kato，H. (1998)Tumour Biol 19，488-93.
6.Suminami，Y.，Kishi，F.，Sekiguchi，K.& Kato，H.(1991)Biochem Biophys Res Commun181，51-8.
7.Schneider，S.S.，Schick，C.，Fish，K.E.，Miller，E.，Pena，J.C.，Treter，S.D.，Hui，S.M.& Silverman，G.A.(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，3147-51.
8..Bartuski，A.J.，Kamachi，Y.，Schick，C.，Overhauser，J.& Silverman，G.A.(1997)Genomics 43，321-8.
9.Scott，F.L.，Eyre，H.J.，Lioumi，M.，Ragoussis，J.，Irving，J.A.，Sutherland，G.A.& Bird，P.I.(1999)Genomics 62，490-9.
10.Abts，H.F.，Weiss，T.，Mirmohammadsadegh，A.，Kohrer，K.，Michel，G.& Ruzicka，T.(1999)J Mol Biol 293，29-39.
11..Spring，P.，Nakashima，T.，Frederick，M.，Henderson，Y.& Clayman，G.(1999)BiochemBiophys Res Commun 264，299-304.
12.Nakashimaa，T.，Pakb，S. C.，Silvermanb，G.A.，Springa，P.M.，Fredericka，M.J.&Claymana，G.L.(2000)Biochim Biophys Acta 1492，441-446.
13..Silverman，G.A.，Bartuski，A.J.，Cataltepe，S.，Gornstein，E.R.，Kamachi，Y.，Schick，C.& Uemura，Y.(1998)Tumour Biol 19，480-7.
14.Katz，S.G.，Schneider，S.S.，Bartuski，A.，Trask，B.J.，Massa，H.，Overhauser，J.，Lalande，M.，Lansdorp，P.M.& Silverman，G.A.(1999)Hum Mol Genet 8，87-92.
15.Gotte，K.，Riedel，F.，Coy，J.F.，Spahn，V.& Hormann，K.(2000)Oral Oncol 36，360-364.
16.Takebayashi，S.，Ogawa，T.，Jung，K.Y.，Muallem，A.，Mineta，H.，Fisher，S.G.，Grenman，R.& Carey，T.E.(2000)Cancer Res 60，3397-403.
17.Carrell，R.W.& Evans，D.L.I.(1992)Current Opinion in Structural Biology 2，438-446.
18.Potempa，J.，Korzus，E.& Travis，J.(1994)J Biol Chem 269，15957-60.
19.Wright，H.T.(1996)Bioessays 18，453-64.
20.Bird，P.I.(1998)Results Probl Cell Differ 24，63-89.
21.Bird，C.H.，Sutton，V.R.，Sun，J.，Hirst，C.E.，Novak，A.，Kumar，S.，Trapani，J.A.&Bird，P.I.(1998)Mol Cell Biol 18，6387-98.
22.Van Patten，S.M.，Hanson，F.，Bernasconi，R.，Zhang，K.，Manavalan，P.，Cole，E.S.，McPherson，J.M.& Edmunds，T.(1999)J Biol Chem 274，10268-76.
23.Worrall，D.M.，Blacque，O.E.& Barnes，R.C.(1999)Biochem Soc Trans 27，746-50.
24.Sim，R.B.& Laich，A.(2000)Biochem Soc Trans 28，545-550.
25.Takeda，A.，Yamamoto，T.，Nakamura，Y.，Takahashi，T.& Hibino，T.(1995)FEBS Lett359，78-80.
26.Schick，C.，Pemberton，P.A.，Shi，G.P.，Kamachi，Y.，Cataltepe，S.，Bartuski，A.J.，Gornstein，E.R.，Bromme，D.，Chapman，H.A.& Silverman，G.A.(1998)Biochemistry37，5258-66.
27.Schick，C.，Kamachi，Y.，Bartuski，A.J.，Cataltepe，S.，Schechter，N.M.，Pemberton，P.A.& Silverman，G.A.(1997)J Biol Chem 272，1849-55.
28.Schick，C.，Bromme，D.，Bartuski，A.J.，Uemura，Y.，Schechter，N.M.& Silverman，G.A.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95，13465-70.
29.Luke，C.，Schick，C.，Tsu，C.，Whisstock，J.C.，Irving，J.A.，Bromme，D.，Juliano，L.，Shi，G.P.，Chapman，H.A.& Silverman，G.A.(2000)Biochemistry 39，7081-91.
30.Suminami，Y.，Nagashima，S.，Vujanovic，N.L.，Hirabayashi，k.，kato，H.& Whiteside，T.L.(2000)Br J Cancer 82，981-9.
31.Cataltepe，S.，Gornstein，E.R.，Schick，C.，Kamachi，Y.，Chatson，K.，Fries，J.，Silverman，G.A.& Upton，M.P.(2000)J Histocher Cytochem 48，113-22.
32.Kato，H.，Suehiro，Y.，Morioka，H.，Torigoe，T.，Myoga，A.，Sekiguchi，K.& Ikeda，I.(1987)Jpn J Cancer Res 78，1246-50.
33.Cataltepe，S.，Schick，C.，Luke，C.J.，Pak，S.C.，Goldfarb，D.，Chen，P.，Tanasiyevic，M.J.，Posner，M. R.& Silverman，G.A.(2000)Clin Chim Acta 295，107-27.
34.Uemura，Y.，Pak，S.C.，Luke，C.，Cataltepe，S.，Tsu，C.，Schick，C.，Kamachi，Y.，Pomeroy，S.L.，Perlmutter，D.H.& Silverman，G.A.(2000)Int J Cancer 89，368-77.
35.Murakami，A.，Suminami，Y.，Sakaguchi，Y.，Nawata，S.，Numa，F.，Kishi，F.& Kato，H.(2000) Tumour Biol 21，224-34.
36.Hamakawa，H.，Fukizumi，M.，Bao，Y.，Sumida，T.，Onishi，A.，Tanioka，H.，Sato，H.&Yumoto，E.(1999)Clin Exp Metastasis 17，593-9.
37.Stenman，J.，Lintula，S.，Hotakainen，K.，Vartiainen，J.，Lehvaslaiho，H.& Stenman，U.H.(1997) Int J Cancer 74，75-80.
38.Crombach，G.，Scharl，A.，Vierbuchen，M.，Wurz，H.& Bolte，A.(1989)Cancer 63，1337-42.
39.Brioschi，P.A.，Bischof，P.，Delafosse，C.& Krauer，F.(1991)Int J Cancer47，376-9.
40.Duk，J.M.，Groenier，K.H.，de Bruijn，H.W.，Hollema，H.，ten Hoor，K.A.，van der Zee，A.G.& Aalders，J.G.(1996)J Clin Oncol 14，111-8.
41.de Bruijn，H.W.，Duk，J.M.，van der Zee，A.G.，Pras，E.，Willemse，P.H.，Boonstra，H.，Hollema，H.，Mourits，M.J.，de Vries，E.G.& Aalders，J.G.(1998)Tumour Biol 19，505-16.
42.Tabata，T.，Takeshima，N.，Tanaka，N.，Hirai，Y.& Hasumi，K.(2000)Tumour Biol 21，375-80.
43..Gaarenstroom，K.N.，Kenter，G.G.，Bonfrer，J.M.，Korse，C.M.，Van de Vijver，M.J.，Fleuren，G.J.& Trimbos，J.B.(2000)Gynecol Oncol 77，164-70.
44.Mino，N.，Iio，A.& Hamamoto，K.(1988)Cancer 62，730-4.
45.Snyderman，C.H.，D’Amico，F.，Wagner，R.& Eibling，D.E.(1995)Arch OtolaryngolHead Neck Surg 121，1294-7.
46.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.& Maniatis，T.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.
47.Lindholm，L.，Holmgren，J.，Svennerholm，L.，Fredman，P.，Nilsson，O.，Persson，B.，Myrvold，H.& Lagergard，T.(1983)Int Arch Allergy Appl Immunol 71，178-81.
权利要求
1.单克隆抗体，能分辨游离的SCCA与SCCA总量。
2.根据权利要求1的单克隆抗体，能分辨游离的SCCA1与SCCA1总量。
3.根据权利要求1的单克隆抗体，其中抗体由杂交瘤产生。
4.单克隆抗体，抗体片断，重组抗体，scFv或肽片断具有与根据权利要求1和3的抗体基本相同的结合特性。
5.基于根据权利要求1-3的抗体或其它结合结构的免疫测定法用于单独测定游离的SCCA1。
6.用根据权利要求5的免疫测定法，诊断癌症或发现癌症疾病复发的方法。
7.计算游离的SCCA1与SCCA1总量或复合物-结合的SCCA1之间的比率，诊断癌症的方法。
8.计算游离的SCCA1与SCCA总量之间比率，诊断癌症的方法。
9.根据权利要求1的单克隆抗体，能分辨游离的SCCA2与SCCA2总量。
10.根据权利要求10的单克隆抗体，其中抗体由杂交瘤产生。
11.单克隆抗体，抗体片断，重组抗体，scFv或肽片断具有与根据权利要求10和11的抗体基本相同的结合特性。
12.基于根据权利要求10-12的抗体或其它结合结构的免疫测定法用于单独测定游离的SCCA2。
13.用根据权利要求13的免疫测定法，诊断癌症或发现癌症疾病复发的方法。
14.计算游离的SCCA2与SCCA总量之间的比率，诊断癌症或癌症疾病复发的方法。
15.计算游离的SCCA2与SCCA1总量，复合物结合的SCCA1和/或游离的SCCA1之间的比率，诊断鳞状癌或癌症疾病复发的方法。
16.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法和计算，诊断鳞状细胞癌的方法。
17.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法和计算，诊断鳞状细胞子宫颈癌的方法。
18.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法或计算，诊断鳞状细胞肺癌的方法。
19.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法或计算，诊断鳞状细胞子宫癌的方法。
20.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法或计算，诊断鳞状细胞食道癌的方法。
21.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法或计算，诊断鳞状细胞头部和颈部癌的方法。
22.利用根据权利要求6-8和14-16中的任何一种免疫测定法或计算，诊断鳞状细胞阴门癌的方法。
23.用于诊断癌症或发现癌症疾病复发的试剂盒，其中，试剂盒包括能分辨游离的SCCA与SCCA总量的单克隆抗体。
24.用于诊断癌症或发现癌症疾病复发的试剂盒，其中，试剂盒包括能分辨游离的SCCA1与SCCA1总量的单克隆抗体。
25.用于诊断癌症或发现癌症疾病复发的试剂盒，其中，试剂盒包括能分辨游离的SCCA2与SCCA2总量的单克隆抗体。
26.用于诊断癌症或发现癌症疾病复发的试剂盒，其中，试剂盒包括杂交瘤，杂交瘤识别能分辨游离的SCCA与SCCA总量的单克隆抗体。
27.用于诊断癌症或发现癌症疾病复发的试剂盒，其中，试剂盒包括杂交瘤，杂交瘤识别能分辨游离的SCCA1与SCCA1总量的单克隆抗体。
28.用于诊断癌症或发现癌症疾病复发的试剂盒，其中，试剂盒包括杂交瘤，杂交瘤识别能分辨游离的SCCA2与SCCA2总量的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及单克隆抗体，它能分辨游离的或复合物结合形式的鳞状细胞癌抗原，SCCA，优选抗原SCCA1和SCCA2；以及识别此类抗体的杂交瘤；用于诊断SCC的方法；及用于发现SCCAs的诊断试剂盒。
文档编号C07K16/18GK1684981SQ03823516
公开日2005年10月19日 申请日期2003年8月27日 优先权日2002年9月10日
发明者伊万·罗杰, 尼尔松·奥利 申请人:康钠格诊断公司