专利名称：抗髓鞘相关糖蛋白(mag)抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及与髓鞘相关糖蛋白(MAG)结合并中和其功能的修饰抗体、编码该抗体的多核苷酸、含有所述抗体的药物制剂以及所述抗体在神经疾病的治疗和/或预防中的用途。本发明的其它方面、目的及优势将在以下描述中阐明。
背景技术：
在西方世界，中风是导致死亡和残疾的一个主要原因。除组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)外，还没有获得批准的中风治疗的疗法，t-PA必须在发病的3小时内经CT扫描后给药以防止大出血。目前针对急性中风治疗(即神经保护)的大多数治疗药物主要作用于谷氨酸受体及其下游信号传导途径，已知这些途径参与急性细胞死亡过程。然而迄今为止，这些治疗策略在临床试验中证明并不成功，而且常常伴随着剂量限制性副作用(Hill&Hachinski，The Lancet，352(suppl III)10-14(1998))。因此需要血流中断后缓解细胞死亡的新方法。
中风发作后，在许多病人中观察到某种程度自发的功能恢复，这表明脑在损伤后具有修复和/或重建的能力(虽然有限)。因此，具有增强此种修复的潜力的药物可使在大脑局部缺血发作后介入治疗的时间大为推迟(可能几天)。能同时提供急性神经保护以及促进功能恢复作用的药物与现行有潜力的神经保护策略相比，具有显著的优势。
迄今，人们对功能恢复的机制依然不甚了解。已经提出的一种可能的机制是损伤或非损伤轴突的发芽。然而，虽然体内试验显示使用神经营养性因子来治疗脊髓损伤或中风可导致功能恢复的加快以及一定程度的轴突发芽，但是这不能证明轴突发芽的程度与功能恢复的程度之间存在直接的关系(Jakeman，et al.1998，Exp.Neurol.154170-184；Kawamata et al.1997，Proc Natl Acad.Sci.USA.，948179-8184；Ribotta，et al.2000，J Neurosci.205144-5152)。此外，轴突发芽需要活的神经元。因此，在诸如中风等与大面积细胞死亡相关的疾病中，中风后给予的药物所产生的功能恢复的加快可能是通过轴突发芽之外的机制，如内源性干细胞的分化、备用途径的激活、受体分布或神经元或神经胶质的兴奋性的改变(Fawcett&Asher，1999，Brain Res.Bulletin，49377-391；Horner&Gage，2000，Nature407 963-970)。
人们认为损伤后中枢神经系统(CNS)的修复能力有限的部分原因是CNS环境中的分子对轴突发芽(轴突生长)具有抑制作用。一般认为CNS髓鞘质中含有抑制性分子(Schwab ME and Caroni P(1988)J.Neurosci.8，2381-2193)。两种髓鞘蛋白质——髓鞘相关糖蛋白(MAG)和Nogo已被克隆并鉴定为公认的神经突派生抑制剂(Sato S.etal(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163，1473-1480；MckerracherL et al(1994)Neuron 13，805-811；Mukhopadhyay G et al(1994)Neuron 13，757-767；Torigoe K and Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262；Schafer et al(1996)Neuron 16，1107-1113；WO 9522344；W0 9701352；Prinjha R et al(2000)Nature403，383-384；Chen MS et al(2000)Nature 403，434-439；GrandPreT et al(2000)Nature 403，439-444；US005250414A；WO200005364A1；WO0031235)。
髓鞘相关糖蛋白是一种表达于髓鞘表面的细胞表面跨膜分子，它由五个胞外免疫球蛋白结构域、一个单一的跨膜结构域和一个胞内结构域组成。MAG的表达仅局限于CNS和外周神经系统(PNS)中处于髓鞘形成过程的神经胶质中。通常认为MAG作用于神经元受体，该受体介导针对神经元细胞骨架的作用，包括神经丝的磷酸化作用和体外神经突派生抑制作用。虽然MAG的拮抗物被推定对损伤后轴突发芽有促进作用(WO9522344，WO9701352和WO9707810)，但是这些权利要求并未得到体内数据的支持。此外，MAG对体内CNS神经元轴突发芽的抑制作用也未得到证实(Li CM et al(1994)Nature 369，747-750；Montag，D et al(1994)Neuron 13，229-246；Lassmann H et al(1997)GLIA 19，104-110；Li C et al(1998)J.Neuro.Res.51，210-217；Yin X et al(1998)J.Neurosci.18，1953-1962；Bartsch U et al(1995)Neuron 15 1375-1381；Li M et al(1996)46，404-414)。
抗体一般由两条轻链和以二硫键连接在一起的两条重链组成。每条轻链以二硫键与相应的重链相连。每条重链的一端为一个可变区，紧随其后的是若干恒定区。每条轻链在一端有一个可变区，而在另一端有一个恒定区。轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起。轻链和重链的恒定区不直接参与抗体与抗原的结合。
每对轻链和重链的可变区形成抗原结合位点。轻链和重链上的可变区大体结构相同，每个区域含有由四个序列相对保守的区域组成的骨架，这四个区域由三个通常被称作高变区的互补决定区(CDR)将他们连接。这四个骨架区大部分采取β-片层构象，而CDR形成环状连接β-片层结构，在某些情况下构成β-片层结构组成部分。骨架区CDR紧密相邻，CDR一起构成抗原结合位点。抗体的CDR和骨架区可根按照Kabat等的文献(“Sequences of proteins of immunologicalinterest”US Dept.of Health and Human Services，US GovernmentPrinting Office，1987)来鉴定。
现在已经发现，一种抗MAG单克隆抗体，参见文献(Poltorak etal(1987)Journal of Cell Biology 105，1893-1899；DeBellard et al(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang et al(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；Torigoe K and Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262)并可获得商品(MAB1567(Chemicon))，当对局灶性大脑局部缺血后小鼠(一个中风模型)直接脑部给药或者静脉给药时，可提供神经保护以及促进功能恢复。因此，抗MAG抗体可提供用于中风后急性神经保护以及促进功能恢复的潜在治疗药物。该抗体为小鼠源抗体。虽然小鼠源抗体常常用作诊断试剂，它们的治疗效用仅在极少实例中得到证实。其应用受限的部分原因是重复对人给予鼠源单克隆抗体通常会激发人类对这些分子的免疫反应。为克服鼠源单克隆抗体本质的缺陷，已经开发出了目标为引入人类抗体结构功能域的“修饰的”抗体，这一技术在本技术领域已很成熟。例如，人源化抗体含非人类来源的互补决定区(“CDR”)，而其余的大部分结构来源于人类抗体。
神经退变过程是引起许多神经疾病/紊乱包括如中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤的急性疾病以及包括阿耳茨海默氏病、额颞性痴呆(tauopathies)、周围神经病、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病和多发性硬化的慢性疾病的原因。因此，抗MAG单抗可通过缓解这些疾病/紊乱相关的细胞死亡以及促进功能恢复，用于这些疾病/紊乱的治疗。
本发明说明书中公开的所有出版物包括期刊和专利，通过引用整体结合到本文中。
发明简述本发明提供一种结合并中和MAG的修饰抗体或其功能片段，该抗体含有一个或多个下述CDR。CDR可根按照Kabat描述的方法进行鉴定(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest；Fifth Edition；US Department of Health and Human Services；NIH publication No 91-3242)。CDR优选为Kabat所阐述的CDR，但应遵循Chothia和Lesk所述蛋白结构和折叠的原则(Chothia et al.，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions；Nature342，p877-883)。应该知道，其它残基也可被看作为抗原结合区的组成部分，因而也包含在本发明中。
轻链CDR
重链CDR
本发明还涉及一种与具有上述CDR的抗体结合相同表位的抗体。可用竞争抑制法来对抗原上的表位进行定位。因此，本发明也提供一种竞争性抑制具有上述CDR的修饰抗体与MAG(优选为人MAG)结合的抗体(修饰型或非修饰型)。
再一方面，本发明提供一种修饰抗体或其功能片段，该修饰抗体或其功能片段含有含有一个或多个选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR的重链可变区和/或含有一个或多个选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR的轻链可变区。
本发明进一步提供一种修饰的抗MAG抗体或其功能片段，它含有a)其序列中含有CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区(VH)，
和/或b)序列中含有CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区(VL)进一方面，本发明提供一种药用组合物，该药用组合物含有本发明修饰抗MAG抗体或其功能片段以及药学上可接受的释释剂或载体。
另一方面，本发明提供一种人类中风和其它神经疾病的治疗或预防方法，该方法包括给予所述需要病人有效剂量的本发明抗MAG抗体或其功能片段。
又一方面，本发明提供本发明抗MAG抗体或其功能片段在制备中风和其它神经疾病的治疗或预防药物中的应用。
再一方面，本发明提供一种在罹患中风或其它神经疾病或有发生这些疾病风险的病人中抑制神经退变和/或促进功能恢复的方法，该方法包括给予所述需要病人有效剂量的本发明抗MAG抗体或其功能片段。
进一方面，本发明提供本发明的抗MAG抗体或其功能片段在制备用于对罹患中风或其它神经疾病或有发生该疾病风险的病人抑制神经退变和/或促进功能恢复的药物中的应用。
本发明其它方面及优势将在详细说明及其优选实施方案中作进一步的描述。
附图简述
图1一种小鼠/人嵌合抗MAG抗体的重链序列(Seq ID No.27)。
图2一种小鼠/人嵌合抗MAG抗体的轻链序列(Seq ID No.28)。
图3一种小鼠/人嵌合抗MAG抗体的重链序列(Seq ID No.29)。
图4嵌合抗MAG抗体与大鼠MAG结合图5人源化抗MAG抗体序列图6与大鼠MAG结合的人源化抗MAG抗体图7与大鼠MAG结合的人源化抗MAG抗体图8与人MAG结合的人源化抗MAG抗体图9小鼠和人源化抗MAG抗体的竞争ELISA。
发明详述抗MAG抗体本发明的修饰抗体优选为单克隆抗体(mAb)，并优选为嵌合的、人源化的或改造的抗体，其中特别优选为人源化抗体。
修饰抗体优选具有天然抗体或其片段的结构。因此该抗体可包括完整的抗体、(Fab1)2片段、Fab片段、轻链二聚体或重链二聚体。抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；或IgA、IgE或IgD或其修饰的变体。抗体重链的恒定区可以根据需要进行选择。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。此外，抗体可包括所有类型如IgG二聚体的改良型、不再与Fc受体结合或介导Clq结合的Fc突变体(封闭抗体)。抗体也可以是WO 86/01533所述类型的嵌合抗体，该抗体含有抗原结合区和非免疫球蛋白区。该抗原结合区是抗体轻链可变区或重链可变区。典型的抗原结合区同时含有轻链和重链可变区。所述非免疫球蛋白区在C端与抗原结合区融合。典型的非免疫球蛋白区为非免疫球蛋白，并可为酶、毒素或是已知具有结合特异性的蛋白质。该种类型嵌合抗体的两个区域也可以通过一个可切割接头序列连接起来。具有上文所述CDRS的免疫粘附素也在本发明的考虑之列。
恒定区可以根据所需要的功能进行选择。通常IgG1通过与补体结合表现出裂解能力和/或介导ADCC(抗体依赖的细胞毒性)。如果需要无细胞毒性的封闭抗体，那么优选IgG4。然而，IgG4抗体在生产中表现出不稳定性，所以对通常更为稳定的IgG1进行改造也许更优选。建议的改造在EPO307434中有描述，其中优选改造包括在235和237位的改造。因此本发明提供本发明抗体的裂解或非裂解型形式。
在一优选方面，该修饰抗体为IgG型，更优选为IgG1。
因此，在优选方案中，本发明的抗体为具有上述CDR的全长非裂解性IgG1。在最优选方案中，我们提供具有序列SEQ ID No 13和16的CDR的全长非裂解性IgG1以及具有序列SEQ ID No 15和18的CDR的全长非裂解性IgG1。
再一方面，本发明提供编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的多核苷酸。优选多核苷酸序列为轻链CDR
重链CDR
再一方面，本发明提供编码修饰抗MGA抗体的轻链可变区的多核苷酸，所述抗体序列包含至少一个选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR(优选含全部3个CDR)。
又一方面，本发明提供编码修饰抗MGA抗体的重链可变区的多核苷酸，所述抗体序列包含至少一个选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR(优选包含全部3个CDR)。
在一个特别优选方面，本发明的抗MAG抗体为人源化抗体。
因此，本发明进一步提供一种结合并中和MAG的人源化抗体或其功能片段，它含有含一种下列氨基酸序列的重链可变区QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No 13)。
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS(Sequence ID No 14)QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS(sequence ID No 15)另一方面，本发明提供一种结合MAG的人源化抗体或其功能片段，它含有序列Sequence ID No 13、14或15的重链可变区以及含有氨基酸序列Sequence ID No 16、17、18或19的轻链可变区
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 16)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 17)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 18)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTHESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 19)进一方面，本发明提供人源化抗体，它含有包含序列SEQ ID No 13、14或15的重链可变区片段以及人类重链恒定区部分或其片段和包含序列SEQ ID No 16、17、18或19的轻链可变区片段以及人类轻链恒定区部分或其片段。
在一个优选方面，人源化抗体为IgG型，更优选为IgG1。
本发明的优选抗体含有含有序列SEQ ID No 13的重链可变区以及含有序列SEQ ID No16的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 13的重链可变区以及含有序列SEQ ID No17的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 13的重链可变区以及含有序列SEQ ID No18的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 13的重链可变区以及含有序列SEQ ID No19的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 14的重链可变区以及含有序列SEQ ID No16的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 14的重链可变区以及含有序列SEQ ID No17的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 14的重链可变区以及含有序列SEQ ID No18的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 14的重链可变区以及含有序列SEQ ID No19的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 15的重链可变区以及含有序列SEQ ID No16的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 15的重链可变区以及含有序列SEQ ID No17的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 15的重链可变区以及含有序列SEQ ID No18的轻链可变区；含有序列SEQ ID No 15的重链可变区以及含有序列SEQ ID No19的轻链可变区。
另一个方面，本发明提供编码含有序列Sequence IDs No 13、14和15的重链可变区以及含有序列Sequence ID No.16、17、18和19的轻链可变区的多核苷酸。
编码氨基酸序列SEQ ID No 13的优选多核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No 20)
编码氨基酸序列Sequence ID No 14的优选多核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No 21)编码氨基酸序列Sequence ID No 15的优选多核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No 22)编码氨基酸序列Sequence ID No 16的优选多核苷酸序列为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No23)编码序列SEQ ID No 17的优选多核苷酸序列为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No24)
编码序列SEQ ID No 18的优选多核苷酸序列为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No25)编码序列SEQ ID No 19的优选多核苷酸序列为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No26)“中和”指全部或部分抑制MAG功能，包括其与神经元的结合，以及抑制轴突生长。
“修饰抗体”指由修饰的免疫球蛋白编码区编码的蛋白质，它可通过在所选宿主细胞中表达而获得。这些修饰抗体包括基因工程抗体(如嵌合抗体、重构抗体、人源化抗体或载体抗体)或缺失全部或部分免疫球蛋白恒定区的抗体片段如Fv、Fab或F(ab)2等。
“修饰的免疫球蛋白编码区”指编码修饰抗体的核酸序列。当修饰抗体为CDR移植抗体或人源化抗体时，编码非人类免疫球蛋白的互补决定区(CDR)的序列被插入到含有人类可变区骨架序列的第一免疫球蛋白配偶体中。第一免疫球蛋白配偶体可选择性地与第二免疫球蛋白配偶体有效地连接在一起。
“第一免疫球蛋白配偶体”指编码人类抗体骨架区或人类免疫球蛋白可变区的核酸序列，其中天然CDR编码区被供体抗体CDR编码区所取代。人类可变区可以是免疫球蛋白重链、轻链(或两种链)、类似物或其功能片段。这些位于抗体(免疫球蛋白)可变区内的CDR区域可通过本技术领域的已知方法进行鉴定。例如，Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))公开了CDR定位原则。此外，已知计算机程序对鉴别CDR区域/结构也很有帮助。
“第二免疫球蛋白配偶体”指编码另一种蛋白质或多肽的核苷酸序列，它与第一免疫球蛋白配偶体按阅读框融合或通过任选通用接头序列连接在一起(即有效连接)。优选为免疫球蛋白基因。第二免疫球蛋白配偶体可包含编码相同(即同源，第一和第二修饰抗体均来源相同)或其它(即异源)的目的抗体整个恒定区的核酸序列。它可以是免疫球蛋白的重链或轻链(或两条链，同为一条多肽的组成部分)。第二免疫球蛋白配偶体不限于某一特定的免疫球蛋白类型或同种型。此外，第二免疫球蛋白配偶体可含有免疫球蛋白恒定区部分，如在Fab或F(ab)2中发现的那些(即适当的人类恒定区或骨架区的不连续部分)。第二免疫球蛋白配偶体还可含有编码暴露在宿主细胞外表面的整合膜蛋白的序列，如噬菌体展示文库组成部分或编码用于分析或诊断检测的蛋白质如辣根过氧物酶、β-半乳糖苷酶等的序列。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2使用其标准含义(参见如Harlow等，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，(1988))。
本说明书中所用的“基因工程抗体”描述一种修饰抗体，即全长合成的抗体(如嵌合抗体、重构抗体或人源化抗体，与抗体片段含义相反)，其中所选受体抗体的部分轻链和/或重链可变区被对所选表位具有特异性的一个或多个供体抗体的类似部分所取代。例如，这种分子包括特征为与非修饰轻链(或嵌合轻链)连接在一起的人源化重链的抗体，反之亦然。基因工程抗体特征也可为改变编码受体抗体的轻链和/或重链可变区的骨架区的核苷酸序列以保持供体抗体的结合特异性。这些抗体可含有以本发明所述供体抗体的CDR替换受体抗体的一个或多个CDR(优选全部)。
“嵌合抗体”指一种基因工程抗体，它含有来源于供体抗体、与来源于受体抗体的轻链和重链恒定区连接在一起的天然可变区(轻链和重链)。
“人源化抗体”指一种基因工程抗体，它具有来源于非人类供体免疫球蛋白的CDR，而分子中其余免疫球蛋白部分来源于一种(或多种)人类免疫球蛋白。此外，也可对骨架支持残基进行改造以使其保持结合亲合力(参见如，Queen et al.，Proc.Natl Acad Sci USA，8610029-10032(1989)；Hodgson et al.，Bio/Technology，9421(1991))。适当的人类受体抗体可根据与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性，从常用数据库如KABAT_数据库、Los Alamos数据库和瑞士蛋白质数据库中选择。特征为与供体抗体骨架区同源(在氨基酸基础上)的人类抗体，也许适于提供用于供体CDR插入的重链恒定区和/或重链可变骨架区。合适的能贡献轻链恒定区或可变骨架区的受体抗体也可用类似的方法进行选择。必须注意的是受体抗体的重链和轻链不需要来源于相同的受体抗体。先有技术描述了生产这些人源化抗体的几种方法——参见如EP-A-0239400和EP-A-054951等。
“重构人源抗体”指一种修饰抗体，其中来自于第一人源单克隆供体抗体的至少一个CDR被用来替换第二人类受体抗体中的CDR。优选所有六个CDR都被替代。更优选来自于第一人源单克隆供体抗体的整个抗原结合区(如Fv、Fab或F(ab’)2)被用来替换第二人源单克隆受体抗体的相应区域。最优选来自于第一人类供体的Fab区与适当的第二人类受体抗体的恒定区有效地连接在一起以形成一个全长单克隆抗体。
“载体抗体”指连接药物以增强透过血脑屏障(BBB)运输的抗体。(综述参见Pardridge；Advanced Drug Delivery Review 36，299-321，1999)。该连接可以是化学连接或者将该半分子人为地设计到抗体中。一个实例是用大脑毛细血管内皮细胞受体抗体如抗胰岛素抗体或抗运铁蛋白受体抗体来制造嵌合体(Saito et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 10227-31；Pardridge et al(1995)Pharm.Res.12 807-816；Broadwell et al(1996)Exp.Neurol.142 47-65；Bickel et al(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90，2618-2622；Friden et al(1996)J.Pharm.Exp.Ther.278 1491-1498，US5182107，US5154924，US5833988，US5527527)。一旦与受体结合，双特异性抗体的两个组分就可通过转胞过程穿过BBB。或者该药物可以是一个配基，该配基可与所述细胞表面受体如胰岛素、运铁蛋白或低密度脂蛋白结合(Descamps etal(1996)Am.J.Physiol.270 H1149-H1158；Duffy et al(1987)BrainRes.420 32-38；Dehouck et al(1997)J.Cell Biol.1997 877-889)。也可采用已知的促进跨BBB运输的天然多肽如渗透素和SynB1和SynB3(Rouselle et al(2000)Mol.Pharm.57，679-686 and Rouselle et al(2001)Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296，124-131)。
术语“供体抗体”指一种抗体(单克隆抗体或重组抗体)，它将其可变区、CDR、或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体，其目的是提供供体抗体的修饰的免疫球蛋白编码区及其表达所得的抗原特异性和中和活性。
术语“受体抗体”指一种与供体抗体异源的抗体(单克隆抗体或重组抗体)，它为第一免疫球蛋白配偶体贡献编码其重链和/或轻链骨架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部(或任何部分，优选为全部)氨基酸序列。优选受体抗体为人类抗体。
“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，它是免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。参见如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1987)。免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本说明书中所用的“CDR”指所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或所有重链和轻链CDR，如适当)。抗体的结构和蛋白质折叠方式意味着其它残基也应被认作是抗原结合区的一部分并且可被技术人员如此理解。参见如，Chothia et al，(1989)Conformations of immunoglobulinhypervariable regions；Nature 342，p877-883。为方便起见，Kabat所阐明的CDR在序列表SEQ ID Nos 13-26中以下划线标出。
CDR提供了抗体与抗原或表位结合接触的残基的大部分。本发明的目的CDR来源于供体抗体的重链和轻链可变区序列，并且包括天然的CDR的类似物，该类似物也分亨或保留了与其来源供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
“功能片段”是部分重链或轻链可变区序列(如对免疫球蛋白N末端或C末端的细微的缺失)，它保留了与片段来源抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
“类似物”是至少对一个氨基酸进行了修饰的氨基酸序列，其中所述的修饰可以是化学修饰，或是少量氨基酸(即不超过10个)的替代或重排，该修饰允许氨基酸序列保留未修饰序列的生物学特性如抗原特异性和高亲和力。例如，当在CDR编码区内或附近创建某些限制性内切酶位点时，可通过置换来构建(沉默)突变。本发明考虑了本发明抗体的类似物的用途。大家已熟知，氨基酸或核苷酸序列的微小改变会导致诸如保留原始蛋白质基本相同特性的原始蛋白质等位型等。因此本发明抗体类似物所包括那些类似物，其中重链和轻链高变区中的CDR与上述CDR如CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3至少有80％的同源性，优选为至少90％同源性，更优选为至少95％同源性，并保留MAG中和活性。当氨基酸序列最优化排列时，如果在相同位置上有80％相同的氨基酸残基，缺失和插入计作非相同的残基，那么氨基酸序列至少有80％同源性。本发明还关注本发明抗体的类似物，其中骨架区与Seq ID 1-5所列骨架区至少有80％同源性，优选为至少90％同源性，更优选为至少95％同源性。当氨基酸序列最优化排列时，如果在相同位置上有80％相同的氨基酸残基，缺失和插入计作非相同的残基，那么氨基酸序列至少为80％同源。
类似物也可产生等位变异体。“等位变异体或修饰型”是核苷酸序列中的改变。该变异体或修饰型可能是由于基因编码的简并性或经特意地人为设计以提供满意的特性。这些变异体或修饰体可导致或不导致氨基酸序列的改变。
术语“效应物”指非蛋白质载体分子，其上通过常规方法连接有修饰抗体、和/或天然或合成的供体抗体的轻链或重链或供体抗体的其它片段。所述非蛋白质载体包括诊断领域常规使用的载体如聚苯乙烯或其它塑料珠、如用于BIAcore[Pharmacia]系统的多糖、或其它用于医学界并可安全给予人类和动物的非蛋白质物质。其它效应物包括用于螯合金属原子或放射性同位素的大环。此效应物也可用于提高修饰抗体的半衰期如聚乙二醇。
对MAG特异的中和抗体已有描述(Poltorak et al(1987)Journal ofCell Biology 105，1893-1899；DeBellard et al(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang et al(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；TorigoeK and Lundborg(1997)Exp.Neurology 150，254-262)并有商品可获得(MAB1567(Chemicon))。
换句话说，人们可构建抗体、修饰抗体和片段，方法是给非人类物种(如牛、绵羊、猴子、鸡、啮齿动物(如小鼠和大鼠)等)免疫接种任何物种的天然MAG，如人或鸡的MAG而产生需要的免疫球蛋白，产物的抗MAG抗体与人MAG有交叉抗体反应性。可采用常规的杂交瘤技术来提供分泌抗MAG的非人源单克隆抗体的杂交瘤细胞系。然后对该杂交瘤的结合能力进行筛选，筛选可用包被MAG的384或96孔板、结合于链霉亲合素包被板的生物素化MAG或采用生物素化MAG的同源性铕-APC偶联免疫法(homogenous europium-APC linked immunoassay)。
天然人类抗体可在人类抗体小鼠如“Xenomouse”(Abgenix)中生产，在该人类抗体小鼠中，小鼠免疫球蛋白基因被移除，而编码人免疫球蛋白的基因被插入到小鼠染色体中。小鼠按常规方法免疫，并产生源于人类基因的抗体应答。因此，该小鼠产生的人类抗体避免了对筛选出的阳性杂交瘤的后续人源化处理(参见Green L.L.，JImmunol Methods 1999 Dec 10；231(1-2)11-23)。
本发明还包括来源于抗MAG单克隆抗体的Fab片段或F(ab’)2片段的应用。这些片段可用作活体内保护性药物。Fab片段含有完整的轻链和重链的氨基末端部分；而F(ab’)2片段为两个Fab片段通过二硫键连接而形成的片段。Fab片段和F(ab’)2片段可以通过常规的方法获得，如用适当的蛋白水解酶——木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶切割mAb或用重组技术。Fab和F(ab’)2片段本身可以用作治疗或预防药物，也可用作包括可变区和CDR序列的序列供体，用于本说明书所述重组或人源化抗体的生产。
Fab和F(ab’)2片段也可通过组合噬菌体文库(参见如，Winter etal.，Ann.Rev.Immunol.，12433-455(1994))或通过免疫球蛋白链改组(参见如，Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992))来构建，上述两篇文献被整体引用而结合到本文中。
因此，MAG特异的人类抗体片段(Fv、scFv、Fab)可采用人类抗体片段噬菌体展示文库进行分离。展示人类抗体片段蛋白质的噬菌体颗粒文库通过检测对MAG蛋白的结合能力筛选。结合MAG的那些噬菌体展示抗体片段得以从文库中保留，其克隆也得以扩增。然后将人类抗体基因从特定的噬菌体中切割下来并插入到含有人IgG恒定区的人类IgG表达结构中，表达结构与来自于分离到的抗MAG特异性噬菌体的可变区一起形成完整的人类IgG分子。
供体抗体可贡献出诸如重链和/或轻链的可变区多肽序列、骨架序列、CDR序列、功能片段及其类似物等序列以及编码它们的核苷酸序列，所述序列可用于设计和获得各种修饰抗体，该修饰抗体特征为具有供体抗体的抗原结合特异性。
考虑到基因编码的简并性，可构建各种编码具有供体抗体抗原特异性的重链和轻链可变区氨基酸序列、CDR序列以及功能片段和类似物的编码序列。当分离所得的编码可变链多肽序列或CDR的核苷酸序列与第二免疫球蛋白配偶体有效地结合时，可用于生产修饰抗体如嵌合抗体或人源化抗体或其它基因工程抗体。
修饰的免疫球蛋白分子可编码包括基因工程抗体如嵌合抗体和人源化抗体的修饰抗体。所需的修饰免疫球蛋白编码区含有插入到第一免疫球蛋白配偶体(人类骨架区或人类免疫球蛋白可变区)中的CDR编码区，该CDR编码区编码的多肽具有抗MAG抗体(优选为高亲和力抗体)的抗原特异性。
优选第一免疫球蛋白配偶体有效地与第二免疫球蛋白配偶体连接在一起。第二免疫球蛋白配偶体的定义如上，并可含编码目的第二抗体区的序列，例如Fc。第二免疫球蛋白配偶体还可含编码另一个免疫球蛋白的序列，它与配偶体的轻链或重链恒定区按阅读框融合或通过一个接头序列连接。可对针对MAG功能片段或类似物设计基因工程抗体以增强其抗原结合能力。
第二免疫球蛋白配偶体也可连接上述效应物，包括非蛋白质载体分子，第二免疫球蛋白配偶体可通过常规的方法与效应物有效地连接。
第二免疫球蛋白配偶体如抗体序列与效应物的融合或连接可以采用任何适当的方式，如常规的化学键合或离子键合、蛋白质融合或异双功能交叉连接物如碳化二亚胺、戊二醛等。这些方法在本技术领域中为公知技术，并在常规的化学和生物化学教材中已有描述。
此外，仅用来为第二免疫球蛋白配偶体与效应物之间提供所需空间的常规接头序列，也可构建到修饰的免疫球蛋白编码区中。该接头的设计为本技术领域技术人员所熟知。本发明涉及的更深入的方面提供具有一个或多个上述可结合并中和MAG功能的CDR的双抗体(二价抗体或双特异性抗体)、三抗体、四抗体和其它多价scFV蛋白种类。
在一个更深入的实施方案中，本发明的抗体可连接上其它的物质。例如，可采用重组DNA技术来生产本发明的基因工程抗体，其中完整抗体分子的Fc片段或者CH2-CH3区被一种酶或其它可探测分子(即，多肽效应物或报道分子)替代。
第二免疫球蛋白配偶体也可有效地连接上一个与具有抗MAG抗体抗原特异性的与含CDR的序列异源的非免疫球蛋白多肽、蛋白或其片段。所得蛋白在表达后，可同时表现抗MAG抗原特异性和非免疫球蛋白特征。融合配偶体的特征可以是，例如，功能特征如其它的结合或受体结构功能域，或治疗特征(当融合配偶体本身是一个治疗蛋白时)，或其它的抗原特征。
本发明的另一个所需蛋白质可为含有具有全长重链和轻链的完整的抗体分子、或其不连续的片段如Fab或F(ab’)2片段、重链二聚体，或其最小重组片段如Fv或单链抗体(SCA)或任何与所选供体mAb具有相同特异性的其它分子。该蛋白可以以修饰抗体的形式来使用，或以非融合的形式来使用。
当第二免疫球蛋白配偶体来源于与供体抗体不同的抗体，如为免疫球蛋白骨架区或恒定区的任一同种型或同类时，会得到基因工程抗体。基因工程抗体可含有同一种来源如受体抗体的免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变骨架区，以及来源于供体抗体的一个或多个CDR。此外，可在核苷酸或氨基酸水平上对受体mAb轻链和/或重链可变骨架区或供体CDR区域进行修饰如缺失、替换或插入，以保留供体抗体的抗原结合特异性。
该基因工程抗体设计为含有抗MAG mAb的一个(或两个)重链和/或轻链可变区或一个或多个重链或轻链CDR。如上所述，基因工程抗体也可中和抗原。
该基因工程抗体包括含所选人类免疫球蛋白或亚型骨架区的人源化抗体，或含与抗MAG抗体功能片段融合在一起的人类重链和轻链恒定区的嵌合抗体。合适的人源(或其它动物)受体抗体可通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性从常用数据库如KABAT_数据库、Los Alamos数据库和瑞士蛋白质数据库中选择。特征为与供体抗体骨架区的同源性(蛋白质基础上)的人类抗体可适于提供重链恒定区和/或用于供体CDR插入的重链可变骨架区。能提供轻链恒定区或可变骨架区的适宜的受体抗体可通过类似的方法进行选择。必须指出的是受体抗体的重链和轻链不必来源于相同的受体抗体。
优选异源骨架区和恒定区选自人类免疫球蛋白类和亚型如IgG(亚型1-4)、IgM、IgA和IgE。然而，受体抗体不必仅含人类免疫球蛋白序列。例如，基因可构建为其中的编码部分人类免疫球蛋白链的DNA序列与编码非人类免疫球蛋白序列如多肽效应物或报道分子的DNA序列融合在一起。
在人源化抗体中，人类重链和轻链的可变区优选通过进行一个或多个CDR替换而改造。可使用所有六个CDR，或少于六个CDR的各种组合方式。优选所有六个CDR被替换。可使用如同轻链的人受体抗体来源的未修饰轻链，仅替换人重链中的CDR。或者，兼容性轻链可借助于常用的抗体数据库，选自其它人类抗体。基因工程抗体的其余部分可来源于任何适当的受体人类免疫球蛋白。
因此，基因工程人源化抗体优选具有天然人类抗体或其片段的结构，并具有有效治疗所需的各种特性。
本技术领域的技术人员应能理解到还可通过改变可变区的氨基酸对基因工程抗体进行进一步修饰(即类似物)，该改变不必影响供体抗体的特异性和强结合力。可以预见的是，重链和轻链的氨基酸可被可变骨架区或CDR之一或两者中其它的氨基酸所替代。
此外，也可对恒定区进行修饰以提高或降低本发明分子的选择性。例如，二聚体化、与Fc受体的结合或结合和激活补体的能力(参见如，Angal et al.，Mol.Immunol，30105-108(1993)；Xu et al.，J.Biol.Chem，2693469-3474(1994)；Winter et al.，EP 307，434-B)。
作为嵌合抗体的修饰抗体与上述人源化抗体所不同的是，它提供与来源于其它物种(优选为人类)免疫球蛋白两条链的恒定区连接在一起的整个非人类供体抗体的重链和轻链可变区包括骨架区。
在通过下列方法构建本发明的修饰抗体(优选人源化抗体)的方法中，优选采用合适的供体mAbs的轻链和/或重链可变区序列和CDR及其核苷酸编码序列。可采用相同或类似的方法来生产本发明的其它实施例。
生产所选供体抗体mAb的杂交瘤为常规方法所克隆的杂交瘤，其重链和轻链可变区的DNA可通过本技术领域技术人员已知的方法来获得，如Sambrook等所描述的方法(Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))。可用多核苷酸引物和逆转录酶来获得重链和轻链可变区以及抗体链中其余的来源于人类免疫球蛋白的免疫球蛋白部分，该重链和轻链可变区至少含CDR编码区和那些保留供体mAb结合特异性所需的受体mAb轻链和/或重链可变骨架区部分。可用已知的数据库，通过与其它抗体进行比较来鉴别CDR编码区。
于是，可制备鼠/人嵌合抗体并对其结合能力进行分析。该嵌合抗体含有在两条链上与人Ig恒定区结合在一起的完整非人类供体抗体VH和VL区。
来自人类抗体重链可变区的同源骨架区可用计算机数据库如KABAT_数据库进行鉴别，具有与供体抗体同源的人类抗体可选作受体抗体。可以类似的方式设计合适的轻链可变骨架区。
人源化抗体可来源于嵌合抗体，或者优选通过将来自于重链和轻链的供体mAb CDR编码区适当地插入到所选重链和轻链骨架区内而合成制得。或者，人源化抗体可用标准的诱变技术来制得。因此，所得人源化抗体含有人类骨架区和供体mAb CDR编码区。还可对骨架区的残基进行后续操作。所得人源化抗体可在重组宿主细胞如COS、CHO或骨髓瘤细胞中表达。
常规的表达载体或重组质粒可通过将抗体编码序列与常用的调控序列有效地连接而生产，该调控序列可调控复制和在宿主细胞中的表达和/或从宿主细胞的分泌。调控序列包括启动子序列如CMV启动子和信号序列，该序列可来源于其它已知抗体。可用类似的方法生产具有编码互补抗体轻链或重链DNA序列的第二表达载体。除所关注的编码序列和选择性标记外，优选该第二表达载体与第一表达载体相同，这样可以尽可能地保证每条多肽链能被有功能地表达。或者，修饰抗体的重链和轻链编码序列可位于同一载体上。
可通过常规方法用第一和第二载体同时对所选宿主细胞进行共转染(或用单一载体进行简单地转染)以创建同时含有重组或合成的轻链和重链的转染宿主细胞。然后用常规方法培养转染细胞来生产本发明的基因工程抗体。含有重组重链和/或轻链的联合物的人源化抗体可通过适当的分析方法如ELISA或RIA从培养物中筛选出来。也可采用类似的常用的方法来构建其它的修饰抗体和分子。
在本发明的方法和组合物构建中克隆和亚克隆的合适载体可由本技术领域的技术人员选择。例如，可用常规的pUC系列克隆载体。pUC19载体有商品可从供应商如Amersham(Buckinghamshire，United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala，Sweden)处获得。此外，用于克隆的载体应能容易复制、具有丰富的克隆位点和选择性基因(如抗生素抗性)并易于操作。因此，克隆载体的选择在本发明中不是一个限制因素。
同样，用于抗体表达的载体也可由本技术领域的技术人员从常规载体中选择。该载体也含有所选调制序列(如CMV启动子)，它指导外源DNA序列在所选宿主细胞中的复制和表达。这些载体含有上述编码抗体的DNA序列或修饰的免疫球蛋白编码区。此外，该载体可含有所选免疫球蛋白序列，该序列可通过插入需要的限制性酶切位点来进行修饰以便于操作。
表达载体的特征也可为适于扩大外源DNA序列表达的基因如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其它优选载体序列含有一个诸如来自牛生长激素(BGH)的多聚腺苷酸信号序列和β球蛋白启动子序列(betaglopro)。本说明书所用的表达载体可用本技术领域技术人员熟知的方法来合成。
该载体的组成成分如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等可通过商业途径或天然来源或用已知的方法合成来获得，以用于指导重组DNA产物在所选宿主细胞中的表达和/或分泌。也可选用其它合适的载体用于此目的，这些载体中有许多是本技术领域中已知的哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的载体。
本发明还包括用含有抗体或其修饰免疫球蛋白分子编码序列的重组质粒转染而来的细胞系。用于这些克隆载体的克隆和其它操作的宿主细胞也是常用的细胞。然而，最优选多种大肠杆菌(E.coli)菌株的细胞用于构建本发明修饰抗体中克隆载体的复制和其它步骤。
适当的用于表达本发明抗体的宿主细胞或细胞系优选为哺乳动物细胞如NS0、Sp2/0、CHO、COS、成纤维细胞(如3T3)和骨髓瘤细胞，更优选为CHO或骨髓瘤细胞。也可用人类细胞，这样能使分子按人类糖基化方式进行修饰。或者也可采用其它真核细胞系。合适的哺乳动物细胞的选择以及转化、培养、扩增、筛选和产品生产和纯化的方法为本技术领域所公知。参见如，在上面已引用的Sambrook等。
细菌细胞被证实适于作为宿主细胞用来表达本发明的重组Fabs(参见如，Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130151-188(1992))。然而，由于细菌细胞中表达的蛋白质倾向于为非折叠或不正确折叠形式或非糖基化形式，因此必须对细菌细胞中生产的任何重组Fab的抗原结合能力的保留情况进行筛选。如果细菌细胞表达的分子以适当的折叠形式产生，那么该细菌细胞为所需的宿主。例如，许多用于表达的大肠杆菌(E.coli)菌株作为宿主细胞在生物技术领域广为人知。本方法中也可采用枯草杆菌(B.subtillis)、链霉菌(Strptomyces)、其它杆菌等的许多菌株。
如需要，本技术领域的技术人员所熟悉的酵母细胞株也可用作宿主细胞，同样昆虫细胞如果蝇和鳞翅目昆虫(Lepidoptera)以及病毒表达系统也可用作宿主。参见如，Miller et al.，Genetic Engineering，8277-298，Plenum Press(1986)及其中引用的文献。
载体构建的一般方法、生产本发明宿主细胞所需的转染方法以及从该宿主细胞中生产本发明的修饰抗体必需的培养方法都是常规方法。同样地，本发明的抗体一旦生产后，可按照本技术领域标准方法从细胞培养物中进行纯化，这些方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这些方法为本技术领域内的专门技术，并不限制本发明。例如，在WO 99/58679和WO 96/16990中描述了修饰抗体的制备。
还有另一个抗体表达方法为在转基因动物中表达，如美国专利美国专利号4,873,316中所述。它所涉及采用动物酪蛋白启动子的表达系统，当转基因到哺乳动物时，可使雌性在其乳汁中产生所需的重组蛋白质。
抗体一旦通过理想的方法表达后，可通过采用适当的分析方法对其体外活性进行检测。目前，常采用常规的ELISA分析方法来定性和定量地评价抗体与MAG的结合。此外，其它的体外分析方法也可用来在随后的临床试验前检验抗体的中和效力，进行临床试验的目的是评价抗体在体内常规清除机制下的持续性。
本发明的治疗药物可在预防时给药，或在损伤后或其它需要的情况下给药。治疗的剂量和疗程与本发明的分子在人体循环中的相对持续时间有关，并可由本技术领域的技术人员依据所治疗的情况和病人的一般健康状况来进行调整。
本发明治疗药物的给药方式可以是将药物输送到受体的任何适当途径。本发明的拮抗剂和抗体以及药用组合物特别适于非胃肠道给药，即皮下注射、肌内注射、静脉注射或鼻内给药。
本发明的治疗药物可配制成药用组合物，所述药用组合物含有效剂量的本发明的拮抗剂或抗体作为活性成分以及药学可接受的载体。本发明的预防药物优选为直接注射应用的含有基因工程抗体的水性悬浮液或溶液，优选缓冲于生理pH。用于非胃肠道给药的组合物通常为溶于药学上可接受的载体(优选水性载体)的本发明抗体或拮抗物溶液或其混合物。可以采用许多水性载体，如0.9％NaCl、0.3％甘油等。这些溶液为无菌，并一般不含有颗粒性物质。这些溶液可用常规的熟知的灭菌方法(如过滤)进行灭菌。根据需要，组合物可含药学上可接受的助剂如pH调节和缓冲剂等，使其接近生理状态。本发明的拮抗剂或抗体在所述药物制剂中的浓度可在很大的范围内变化，即从小于约0.5％(重量)，通常为1％(重量)或不小于1％(重量)，最高达15％(重量)或20％(重量)，按照所选给药具体方式主要根据液体体积、粘度等进行选择。
因此，用于肌内注射的药用组合物可制成含无菌缓冲水溶液1mL和本发明的拮抗物或抗体约1ng-100mg，如约50ng-约30mg，更优选约5mg-25mg。同样地，用于静脉输液的本发明的药用组合物可制成含无菌林格溶液约250ml和本发明的基因工程抗体约1-30mg，优选为约5mg-25mg。制备非胃肠道给药的组合物的实际方法为本技术领域广为人知的方法或技术人员显而易见的方法，这些方法在如Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania中有更详细地描述。
本发明的治疗药物，当制成药用制剂时，优选制成单剂剂型。合适的有效治疗剂量易于由本技术领域技术人员确定。为有效治疗人类中风和其它神经疾病，应经非胃肠道给予(优选i.v.或i.m.(肌内注射))每70kg体重最多700mg剂量的本发明的拮抗物或抗体。如需要，该药剂可每隔适宜的时间重复给药，该间隔是否合适由医师选择。
本说明书中描述的抗体可以冻干贮存并可在使用前重配于一适当的载体中。该方法对于常规免疫球蛋白被证明是有效的，可以采用本技术领域公知的冻干和重配方法。
另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防中风和其它神经疾病的药用组合物，该药用组合物含有本发明的抗MAG抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。
进一方面，本发明提供一种用于在罹患或有危险罹患中风或其它神经疾病的病人中抑制神经退变和/或促进功能恢复的药用组合物，该药用组合物含有本发明的抗MAG抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。
以下实施例用于阐明本发明。
实施例1——中风模型中的抗MAG抗体材料和方法抗MAG单克隆抗体抗MAG单克隆抗体为从Chemicon公司获得的小鼠抗鸡MAG单克隆抗体MAB 1567。该抗体具有如下特征抗原髓鞘相关糖蛋白(人、小鼠、大鼠、牛、鸡、青蛙)同种型IgG1中和能力参见DeBellard et al(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang et al(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；Torigoe K andLundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262。
对照IgG1单抗从R+D Systems公司购得。
经脑室套管插入术(仅用于试验1)在氟烷麻醉的情况下，经脑室(i.c.v.)将插管放置于左侧脑室内(坐标距中线1.6mm、距前囟点近尾部0.8mm、距颅骨表面4.1mm、门齿条下方3.2mm，据Paxinos and Watson，1996)。对所有大鼠单笼饲养以避免损坏导管或模型插管。手术后7天，通过对血管紧缩素II(100ng，Simpson，et al. 1978)强烈的饮用反应来校正插管的正确的定位。9天后，动物遭受大脑局部缺血。
短暂局灶性大脑局部缺血在每只体重为300-350g的雄性Sprague Dawley大鼠中诱导短暂(90min)局灶性大脑局部缺血。对动物的麻醉开始用置于面罩上的5％氟烷、60％氧化亚氮和30％氧气的混合物，后续麻醉用1.5％氟烷来维持。用文献(Zea Longa，et al.，1989)所述的腔内扎线术来造成中脑动脉梗塞。在整个手术过程中，使动物维持正常体温，并在单独圈养前，在一个培养箱中，使动物苏醒1h。本试验仅包括梗塞1小时后神经学分数为3的那些动物(用5分制评价0，无缺陷；1，对侧反射；2，握力减弱；3，绕行；4，不动；5，死亡)。动物饲养至1星期，此时用透心灌注0.9％NaCl后灌注4％多聚甲醛的100mM磷酸缓冲液来处死动物。将大脑置于4℃下4％多聚甲醛中48h进行后期固定，此时将其从颅骨除下并用大鼠大脑基片切成2mm大小的块。然后用Shandon Citadel 1000组织处理机对2mm切片进行石蜡包埋，用薄样切片机切成6μm大小的切片并封藏于包被多聚L-赖氨酸的载片上。然后对切片进行处理以进行甲苯基坚牢紫(Cresyl FastViolet，CFV)染色。
给药方案抗MAG单克隆抗体和小鼠IgG1同种型对照抗体对无菌0.9％NaCl溶液透析过夜，进行适当的浓缩。
试验1在MCAO后1、24和72h时经i.c.v.给予动物2.5μg抗MAG mab或2.5μg小鼠IgG(5μl/剂)。
试验2在MCAO后1和24h时经i.v.给予动物200μg抗MAGmab或200μg小鼠IgG。
不要让研究者看到每种剂量溶液的标识。
神经学评价在诱导大脑局部缺血前，用于试验1的大鼠接受横木行走和不干胶标签实验的训练。未同时达到两个试验标准的动物被排除在进一步试验之外。在训练后，剩余的动物按表现分成两个相等的组。在神经学评价过程中，不让研究者知道治疗动物组。
双侧不干胶标鉴试验用双侧不干胶标鉴试验(Schallert et al.，PharmacologyBiochemistry and Behaviour 16455-462，(1983))来评价对侧忽视和同侧斜倚。该模型的触觉消失在人类中风病人中也能观察到(Rose，etal.1994)。该试验此前有详细地描述(Hunter，et al.，Neuropharmacology 39806-816(2000)；Virley et alJournal of CerebralBlood Flow&Metabolism，20563-582(2000))。简单地说，圆形不干胶纸标鉴随机地用相同的压力牢固地粘在前爪的无毛区附近(左、右)。在MCAO前进行为期6天的训练，第六天的数据用作手术前的基线(0天)。在MCAO后24小时和7天对动物进行试验，数据表示的是两次试验的平均值。接触和除下标鉴的反应时间被记录下来并用Logrank test(Cox，J.Royal Statistical Society B 34187-220(1972))进行分析。
横木行走横木行走是通过在空中100cm横木(直径2.3cm，距地板48cm)上的行走距离来测量前肢和后肢的协调性，如文献(Virley et alJournal of Cerebral Blood Flow&Metabolism，20563-582(2000))的详细描述。训练大鼠从头到尾走过横杆。对于测试，在MCAO后24h和7d对每只大鼠进行试验，数据表示两次试验的平均值。按Student’s t-test的ANOVA进行，先进行NAOVA，然后进行Student’s t检验。
27分制神经学分数(试验1)该试验由一组评价神经学状态的试验组成，包括爪定位、可视前爪接触试验、横木、对侧旋转、斜面、正位反射、对侧反射、活动和一般状况，如文献(Hunter，et al.Neuropharmacology 39806-816(2000))所述，加上握力测量(右前肢握力良好2分，弱1分)。对于正常动物总分＝27。
对于试验2，该试验进一步作如下改变握力——正常分数3，良好-2，弱-1，极弱-0；活动——正常分数4，优秀-3，优良-2，良好-1，一般-0；一般状况——正常分数4，优秀-3，优良-2，良好-1，一般-0；绕行——没有为分数5，一侧偏好为4分，大圈为3分，中圈为2分，小圈为1分，原地打转为0分。对于正常动物总分＝32。
在两次试验中，在MACO后1、24、48h和7d对动物进行测试，健康正常动物的分数分别为27或32。数据表示的是均值，进行Kruskil Wallis ANOVA统计学分析。
损伤评价试验1——对于每只动物，用来自大脑中三个预先设定位置(分别距前囟点0、-2.0、-6.0mm)的切片进行病变区评价。用甲苯基坚牢紫染色来对神经元损伤进行评价，损伤面积用Optimas 6.1imagingpackage软件包来进行测量。数据表示为平均面积(mm2)±sem。
试验2——对于每只动物，用来自大脑中七个预先设定水平(+3mm至-8mm w.r.t.前囟点)的切片进行病变区评价。用甲苯基坚牢紫染色来对神经元损伤进行评价，损伤面积用Optimas 6.1imagingpackage软件包来进行测量。数据表示为平均面积(mm2)±sem。
结果试验1——抗MAG单抗的经脑室(i.c.v)给药MCAO后一小时时，两治疗组动物都表现出显著的神经学分数减少(每组的平均分数为12)。此时两组之间没有显著差异。然而，在MCAO后24小时(p＝0.02)、48小时(p＝0.005)和7天(p＝0.006)时用抗MAG单抗(2.5μg，MCAO后1、24和72h)治疗的动物与那些用对照IgG治疗的动物相比，神经学总分表现出显著的改善。IgG1治疗组中MCAO后24小时、48小时和7天的神经学分数分别为15、14和18，而在抗MAG单抗治疗的动物中则分别为19.5、21.5和22。通行为的进一步分析，包括部分，显著改善主要归因于下列试验方面机能改善爪定位(24h，p＝0.045；48h，p＝0.016；7d，p＝0.008)、握力(24h，p＝0.049；48h，p＝0.0495；7d，p＝0.243)、活动(24h，p＝0.199；48h，p＝0.012；7d，p＝0.067)、横木(24h，p＝0.065；48h，p＝0.005；7d，p＝0.016)、斜面(24h，p＝0.006；48h，p＝0.006；7d，p＝0.169)、前爪接触视力试验(48h，p＝0.049；7d，p＝0.049)和绕行的程度(24h，p＝0.417；48h，p＝0.034；7d，p＝0.183)。
横木行走在手术前，训练所有动物跨过横木(100cm)。与手术前的值相比，在手术后24小时时，无论是抗MAG治疗动物还是IgG1治疗动物，其穿越横木的距离都有明显的减少(分别为50±18cm和22±14cm)。在tMACO后24h，虽然无显著性差异，抗MAG治疗的动物比IgG1治疗动物表现出明显的改善，它穿越的距离是抗MAG治疗的动物的二倍。虽然手术后七天，两组随时间都表现出明显的改善，但是与基线相比，IgG1治疗动物的机能仍然存在显著性机能障碍(55±15cm；p＝0.005)。然而，抗MAG单抗治疗的动物(2.5μg，1、24和72h，MCAO后i.c.v)则相反，其机能与基线没有显著差异(75±15cm；p＝0.07)。该数据显示，与IgG1治疗动物对照相比，抗MAG单抗治疗能增强横木行走任务的恢复。
不干胶标鉴在手术前，每一治疗组中的动物都能快速地接触并除下每只前爪上的标鉴，在治疗前各组之间无显著性差异(表1)。在MCAO后24小时和7天，每一治疗组中左前爪接触时间相对保持不变，而右前爪的则明显增加。但是抗MAG治疗动物和IgG1治疗动物的除下时间之间无显著性差异。此外，MCAO后24h，与基线相比，两治疗组中从两前爪除下的时间都有显著性地增加，但是抗MAG治疗动物的从左前爪除下的时间比IgG1治疗动物有显著性地减少(p＝0.03)。与IgG1治疗动物相比，抗MAG治疗动物的从右前爪除下的等待时间也有减少的趋势(p＝0.08)(表1)。在第7d，IgG1治疗动物有某种程度的恢复，与24h时相比，其每只前爪的除下标鉴的等待时间都有所减少(表1)。数据表明用抗MAG单抗来治疗大鼠可促进其在tMCAO后不干胶标鉴试验中的恢复。
表1-不干胶标签数据
(*p＝0.03Anti-MAG对IgG1，Logrank检验)病变区测量当在tMCAO后7天时进行检测时，与用等量小鼠IgG1治疗的那些动物相比，用抗MAG单抗经i.c.v给药的动物所检测的三个大脑位置中的两个的病变区面积有显著性地减少(表2)。
表2
(*p＝0.02、$p＝0.03、#p＝0.06，抗MAG对IgG1，单向非配对Studentst检验)试验2——静脉(i.v.)给药神经学分数MCAO后一小时和24小时，两组动物都表现出显著的神经学分数的减少。此时两组之间没有显著差异，在抗MAG单抗和IgG1治疗后的平均分数分别为20和18(p＝0.5)。MCAO后48h，用抗MAG单抗(200μg，MCAO后1、24h时i.v.)治疗的动物在爪定位(p＝0.048)和握力(p＝0.033)方面表现出显著的改善。在大脑局部缺血发作后几天，抗MAG单抗治疗的动物会持续改善(爪定位p＝0.041；握力p＝0.048；活动p＝0.05)，与IgG1治疗的那些小鼠(平均分数23)相比，在神经学分数方面表现出显著性的提高(平均分数25，p＝0.047)。
病变区测量当在tMCAO后7天时进行检测时，与同种型对照相比，当MACO后经i.v.给药时，抗MAG抗体显著性地减少七个预定大脑位置(+3至-8mm w.r.t.前囱点)中的五个的病变区面积
*p＜0.05——非配对单向Students t检验结论在对短暂中脑动脉梗塞后的大鼠，无论是直接向CSF给药还是静脉给予抗MAG单克隆抗体，与对照治疗的动物相比，都能减少细胞死亡面积和促进功能恢复。在这些试验中所观察到的神经保护水平表明，此效应不能归因于轴突发芽，因为它不能导致神经元的不足。与对照治疗动物相比，在MCAO后24h和48h时观察到的功能恢复的改善可能反映了抗体所提供的神经保护的程度。然而，动物会随时间表现出进一步的改善，表明MAG活性的阻断也能随时间增强功能修复。
本实施例中的试验表明，MAG反应性的阻断可对大鼠中风模型提供神经保护，促进功能恢复，因而抗MAG抗体可提供用于中风后急性神经保护和/或促进功能恢复的潜在治疗药物。经i.v途径给药的抗体的低含量以及所得到的抗体的低血清水平依次表明，由于血脑屏障对抗体渗透的制约，脑中的抗体浓度会极低。奇怪的是，虽然如此，它仍然导致可观察到的神经保护以及功能恢复的增强。抗MAG抗体还有可能用于其它细胞和/或神经纤维退化的神经紊乱如脊髓损伤、外伤性脑损伤、周围神经病、阿耳茨海默氏病、额中颞性痴呆、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病和多发性硬化症。在随后的实施例中，本说明书所公开的嵌合抗体和人源化抗体的CDR为实施例1抗体的CDR。
实施例2——嵌合抗体修饰抗体包括嵌合抗体，其中来源于一种物种的可变区与来源于另一种物种的恒定区相连。本发明的小鼠-人嵌合抗MAG免疫球蛋白链的实施例如图1、2和3所示。可生产采用人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD恒定区的小鼠-人嵌合抗体，同样也可生产将小鼠可变区与来自于非人类物种的重链或轻链恒定区连接在一起的异源嵌合体。
图1(Seq ID No.27)提供一个嵌合免疫球蛋白重链的氨基酸序列，其中鼠源抗MAG重链可变区与一个功能性免疫球蛋白分泌信号序列及人类IgG1恒定区的一种修饰型连接在一起，该修饰型中Kabat 248和250残基被突变为精氨酸，其目的是消除与FcγRI和补体蛋白Clq结合的效应物功能(Duncan，A.R.and Winter，G.Localization of theClq binding site on antibodies by surface scanning.Nature 332，738-740，1988.Duncan，A.R.，Woolf，J.M.，Partridge，L.J.，Burton，D.R.and Winter，G.Localization of the binding site for human FcRl onIgG.Nature 332，563-564，1988)。任选制造该种突变以定制修饰抗体的性能来获取特定的治疗效果——例如，不激活裂解效应物机制而与抗原结合并阻断其功能。
图2(Seq ID No.28)提供一个嵌合免疫球蛋白轻链的氨基酸序列，其中鼠源抗MAG轻链可变区与一个功能性免疫球蛋白分泌信号序列及人类κ恒定区连接在一起。
同样地，抗MAG可变区也可与缺少灭活效应物功能的突变的免疫球蛋白恒定区连接在一起。图3(Seq ID No.29)提供一个嵌合免疫球蛋白重链的氨基酸序列，其中鼠源抗MAG重链可变区与一个功能性免疫球蛋白分泌信号序列及人类IgG1恒定区的野生型连接在一起。
从图1-3提供的信息来看，编码这些嵌合链的cDNA插入序列可通过本技术领域技术人员所熟知的标准分子生物学方法来制备。简单地说，用遗传密码来确定编码所需氨基酸的核苷密码子并创建一个编码嵌合蛋白的有效cDNA序列。如果需要在某一特定生物中表达cDNA插入序列，那么可以根据已知的密码子使用偏好来选择特定的偏好密码子。然后可通过PCR扩增来合成所需要的核苷序列，PCR扩增模板含有代表所需序列用作叠连群的重叠的合成寡聚核苷酸。所得产物还可用PCR或诱变来进行修饰使其连接上限制性酶切位点，从而使其易于克隆进入合适的质粒进行表达或进一步操作。
实施例3——ELISA中嵌合抗体与大鼠MAG的结合含本发明的轻链和重链CDR的嵌合抗MAG抗体可通过CHO细胞瞬时转染来生产。为此，采用Transfast转染试剂(Promega；E2431)并按制造商说明书进行转染。简单地说，在6孔培养板上，每孔加入～106CHO细胞。第二天，向培养基(Optimeml withGlutamax；Gibco #51985-026)中按1∶1的比例(5μg总DNA)加入编码适当的重链或轻链的哺乳动物表达载体DNA并混合。加入Transfast转染试剂并将该溶液转移到长满细胞层的板孔中。在细胞培养箱中37℃培养1h后，在DNA/Transfast混合物上铺上2mlOptimem培养基并置于培养箱继续培养48-72h。收获上清，通过离心和经过0.2μm滤器过滤来使其澄清。CHO细胞培养上清中的抗体浓度用ELISA进行测定，估计约为0.5μg/ml。对MAG的结合，可采用商品大鼠MAG-Fc。由于与人类Fc融合，结合的嵌合抗体不能用抗人IgG第二抗体来检测。而用抗人类κ轻链特异性抗体来代替。图4显示的是该嵌合抗体即使在1/64稀释度时也能结合MAG。在本测试中，无关的人源化抗体和模拟转染细胞的培养上清不产生任何信号。
程序ELISA微量滴定板(Nunc Maxisorp)用1μg/ml大鼠MAG-Fc融合蛋白(R&D systems；538-MG)的PBS溶液在4℃包被过夜。用PBS洗板两次，然后用PBS/BSA(1％w/v)于室温(室温)下封闭1h。将瞬时转染的CHO细胞的培养上清用0.2μm滤器过滤，并从上清原液开始用PBS/BSA作连续稀释至1/64稀释度。样品的各稀释度于室温放置1h。然后用PBS/Tween 20(0.1％v/v)洗板三次。检测抗体为用PBS/BSA稀释至1/2000的山羊抗人κ轻链特异性抗体-过氧化物酶结合物(Sigma A-7164)。检测抗体在室温下保温1h，并按上述方法洗板。加入底物溶液(Sigma Fast OPD P-9187)，保温至检测到适宜的颜色显示为止，然后用3M H2SO4中止。在490nm处读取颜色显示。
实施例4——人源化抗体修饰抗体包括含有与人类恒定区连接在一起的人源化可变区的人源化抗体。本发明的人源化抗MAG免疫球蛋白链的实例如图5所示。可生产采用人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD恒定区的人源化抗体。
图5(Seq ID No30)提供一个人源化免疫球蛋白重链的氨基酸序列的实例，其中人源化抗MAG重链可变区与一个功能性免疫球蛋白分泌信号序列及人类IgG1恒定区的修饰型连接在一起，该修饰型中的Kabat 248和250残基被突变为精氨酸以消除其与FcγRI和补体蛋白Clq结合的效应物功能(Duncan，A.R.and Winter，G.Localization ofthe Clq binding site on antibodies by surface scanning.Nature 332，738-740，1988.Duncan，A.R.，Woolf，J.M.，Partridge，L.J.，Burton，D.R.and Winter，G.Localization of the binding site for humanFcRl on IgG.Nature 332，563-564，1988)。任选制造该突变以定制修饰抗体的性能来获取特殊的治疗效果——如不激活裂解效应物机制而与抗原的结合并阻断的功能。
图5(Seq ID No.31)还提供一个人源化免疫球蛋白轻链的氨基酸序列的实施例，其中人源化抗MAG轻链可变区与一个功能性免疫球蛋白分泌信号序列及人类κ恒定区连接在一起。
同样地，抗MAG可变区也可与缺少灭活效应物功能突变的免疫球蛋白连接在一起。图5(Seq ID No.32)提供一个人源化免疫球蛋白重链的氨基酸序列，其中人源化抗MAG重链可变区与一个功能性免疫球蛋白分泌信号序列及人类IgG1恒定区的野生型连接在一起。
从图5提供的信息来看，编码这些人源化链的cDNA插入物可通过本技术领域技术人员熟知的标准分子生物学方法来制备。简单地说，用遗传密码来确定编码所需氨基酸的核苷密码子和创建编码该蛋白的有效eDNA序列。如果需要在某一特定生物中表达cDNA插入物，那么可根据已知的密码子使用偏好来选择特定的偏好密码子。然后可通过PCR扩增来合成所需要的核苷序列，PCR扩增模板含代表所需序列用作叠连群的重叠的合成寡聚核苷酸。所得产物还可用PCR或诱变来进行修饰以连接上限制性酶切位点，从而使其易于克隆进入一合适的表达或进一步操作的质粒中。
实施例5——ELISA中人源化抗体与大鼠和人MAG的结合1)9种人源化重链和轻链复合物与培养上清中标准化量的大鼠MAG-Fc融合蛋白的直接结合ELISA含本发明的轻链和重链CDR的人源化抗MAG抗体可通过CHO细胞瞬时转染来生产。为此，使用Transfast转染试剂(Promega；E2431)并按制造商指南进行转染。简单地说，在6孔培养板上每孔加入～106CHO细胞。第二天向培养基(Optimeml with Glutamax；Gibco#51985-026)中按1∶1的比例(5μg总DNA)加入编码适当重链或轻链的哺乳动物表达载体DNA并混合。加入Transfast转染试剂并将该溶液转移到长满细胞层的板孔中。在细胞培养箱中37℃培养1h后，在DNA/Transfast混合物上铺上2ml Optimem培养基并置于培养箱继续培养48-72h。收获上清，通过离心和经过0.2μm滤器过滤来使其澄清。9种重链和轻链可变链复合物由下表所示序列生产，而IgG1重链恒定区是Seq.ID.的功能区。
抗体浓度可用ELISA进行测定，用于试验的上清量可标准化至起始浓度为250或500ng/ml(根据培养上清的浓度而决定)。抗原可采用商品化大鼠MAG-Fc(R&D Systems；538-MG)。由于与人类Fc融合，结合的人源化抗体不能用一般的抗人IgG第二抗体来检测。用抗人类κ轻链特异性抗体来代替。图6显示的是本实施例中检测的所有9种人源化抗体以类似的结合曲线与大鼠MAG结合，结合曲线低至～4ng/ml。虽然不是绝对，这表明本实施例中检测的人源化抗体的亲和度与本实施例中用作对照的非人源化嵌合抗体的亲和度的范围非常接近。
程序96孔Nunc Maxisorp板用大鼠MAG-Fc融合蛋白(1μg/ml；R&Dsystems；Cat.No.538-MG)的PBS溶液在4℃包被过夜。用含有Tween 20的PBS(0.1％v/v；PBST)洗板两次，并用含BSA的PBS(1％w/v)于室温(室温)下封闭1h。不同含量的培养上清用封闭缓冲液进行连续稀释，并以约500或250ng/ml的起始浓度加入到封闭的板孔中。上清的抗体浓度基于对存在于每一培养上清中人源化抗体量的独立分析。试验中还包括作为对照的嵌合小鼠-人(非人源化)抗体。抗体样品于室温下保温1h，然后用PBST洗板三次。加入用封闭缓冲液稀释至1/5000的第二抗体(山羊抗人轻链特异性抗体-过氧化物酶结合物；Sigma A-7164)并在室温下保温1h。按上述方法洗板三次，加入底物(根据说明书溶解的OPD片；Sigma P-9187)检测结合。观察显色反应，用3M H2SO4中止反应。在490nm处读取颜色显示。
2)2种纯化的人源化抗MAG抗体重链-轻链复合物与大鼠MAG-Fc融合蛋白的直接结合ELISA由重链和轻链可变区复合物BVh1/CVl1和BVh3/CVl3(表图5)和序列表SEQ.I.D.NO30所示的IgG1突变恒定区(它是BVh1/CVl1突变IgG1，本技术领域技术人员能轻易地导出BVh3/CVl3同等物的序列)组成的两种人源化抗体，可通过实施例3所述的瞬时转染的放大形式来生产并用蛋白A亲和层析进行纯化。纯化的抗体材料可对PBS透析，并在OD280读数进行测定浓度。将抗体浓度调至5000ng/ml，并在大鼠MAG-Fc结合ELISA中用于其连续稀释。图7显示的是纯化抗体材料与大鼠MAG-Fc的结合，并且本实施例中所检测的两种重链和轻链可变区复合物极其相似。
方法96孔Nunc Maxisorp板用大鼠MAG-Fc融合蛋白(2.5μg/ml；R&D systems；Cat.No.538-MG)的PBS溶液在4℃包被过夜。用含有Tween 20的PBS(0.1％v/v；PBST)洗板两次，并用含BSA的PBS(1％w/v)于室温(室温)下封闭1h。纯化人源化抗体用封闭缓冲液调节至起始浓度为5μg/ml，并进行连续稀释。抗体样品于室温下保温1h，然后用PBST洗板三次。加入用封闭缓冲液稀释至1/5000的第二抗体(山羊抗人轻链特异性抗体-过氧化物酶结合物；Sigma A-7164)并在室温下保温1h。按上述方法洗板三次，并加入底物(根据说明书溶解的OPD片；Sigma P-9187)检测结合。观察显色反应，用3MH2SO4中止反应。在490nm处读取颜色显示。
结果不带有或带有几个骨架区突变的两种纯化的人源化抗体表现出极为相似地与大鼠MAG的结合。结果如图7所示。
3)两种人源化重链-轻链复合物标准化量的培养上清与CHO细胞表达的人MAG的结合对与实施例5 2)所述相同的人源化重链和轻链复合物，测试其澄清培养上清与CHO细胞表面上表达的人MAG的结合。基于由ELISA测定的抗体浓度对每种抗体所用的培养上清的量进行标准化。为此，用山羊抗人IgG(γ)链(Sigma I-3382；碳酸氢盐缓冲液pH9.6；2μg/ml)于4℃包被96孔板(Nunc Maxisorp)过夜。第二天用洗涤缓冲液(PBST)洗板两次，并加入至少75μl封闭缓冲液(含BSA的PBS，1％w/v)于室温(室温)下封闭1h。对抗体样品液用封闭缓冲液进行等分连续稀释(起始稀释度为原液或1/2)。抗体标准品为一种非相关特异性已知浓度的纯化人源化IgG1。也对标准品溶液在板上作连续稀释，起始浓度为500ng/ml。所有抗体溶液于室温下保温1h。按上述方法洗板三次，然后与用封闭缓冲液稀释成1/5000的山羊抗人轻链(κ)特异性抗体(游离或结合的)-过氧化物酶结合物(SigmaA-7164)共同在室温下保温1h。再次按上述方法洗板三次，并与底物(OPD片；Sigma P-9187)一起保温至显很深的颜色。加入3M H2SO425μl中止显色反应，在490nm下读板。
图8显示本实施例中测试的两种抗体都能识别人MAG并且其结合特性非常相似。CHO/-为无MAG表达的阴性对照CHO细胞。
基于细胞的Eu ELISA方法在96孔板(Costar 3595)上每孔加入100μl细胞悬液(推荐在第1、2、3或4天进行测试的细胞数目参见下表)。
移去培养基，用含FCS(10％)、BSA(1％)、NaN3(1％)的DMEM/F12(Sigma D6421；封闭缓冲液)于室温对板封闭1h。然后去除封闭溶液，加入样品(溶于封闭缓冲液，50μl/孔)。样品于4℃保温1h。然后在Skatron洗板机上用PBS洗板三次。洗涤后，用0.5％多聚甲醛(用PBS稀释)于4℃对细胞固定20分钟，再次按上述方法洗涤。每孔加入50μl用铕缓冲液(50mM Tris碱、150mM NaCl、0.5％BSA、0.1g/l Tween 20、7.86mg/l DTPA，pH7.3)稀释的铕结合第二抗体并于4℃保温1h。
按上述方法洗板并每孔加入200μl Delphia增强溶液。于室温下保温5-10分钟。于24小时内在Victor酶标仪上读板。
4)两种纯化的人源化抗体和非人源化大鼠单克隆抗体与大鼠MAG-Fc融合蛋白的竞争ELISA方法96孔Nunc Maxisorp板用大鼠MAG-Fc融合蛋白(2.5μg/ml；R&D systems；Cat.No.538-MG)的PBS溶液在4℃包被过夜。用含有Tween 20的PBS(0.1％v/v；PBST)洗板两次，并用含BSA的PBS(1％w/v)于室温(室温)下封闭1h。将纯化的人源化抗体调节至浓度为200ng/ml，并与等体积的用封闭缓冲液稀释至范围为6000-0ng/ml制成的竞争性分子混合。竞争物为相同浓度(仅为BVh1/CVh1)的亲本单克隆抗体(抗MAG)或非相关大鼠单克隆抗体(INN1)。抗体/竞争物溶液于室温下保温1h，然后用PBST洗板三次。加入用封闭缓冲液稀释至1/5000的第二抗体(山羊抗人轻链特异性抗体-过氧化物酶结合物；Sigma A-7164)并在室温下保温1h。按上述方法洗板三次，并加入底物(根据说明书溶解的OPD片；Sigma P-9187)检测结合。在490nm处读取颜色显示。
结果两种纯化抗体制品都同等地被原始大鼠单克隆抗体所竞争，而不被具有非相关特异性的大鼠单克隆抗体所竞争——参见图9。这表明原始大鼠单克隆抗体与本实施例测试的人源化抗体可能识别相同的表位并可能具有类似的对大鼠MAG的亲和力。
权利要求
1.一种修饰抗体或其功能片段，所述修饰抗体或其功能片段结合并中和MAG，而且含有一个或多个下列CDR轻链CDR
重链CDR
。
2.一种修饰抗体或其功能片段，所述修饰抗体或其功能片段含有重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有一个或多个选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR，所述轻链可变区含有一个或多个选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR。
3.一种修饰抗-Mag抗体或其功能片段，所述修饰抗体或其功能片段含有重链可变区(VH)，其序列中含有高变区CDRH1、CDRH2和CDRH3；和/或轻链可变区(VL)，其序列中含有高变区CDRL1、CDRL2和CDRL3。
4.权利要求3的抗体，所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求4的抗体，所述抗体为人源化抗体。
6.权利要求5的抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段含有包含一种下列氨基酸序列的重链可变区QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAPNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No 13).QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Sequence ID No 14)QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFINYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (sequence ID No 15)。
7.权利要求6的抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段还含有轻链可变区，所述轻链可变区含有氨基酸序列Sequence ID No 16、17、18或19DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 16)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 12)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 18)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 19)。
8.权利要求6-7任一项的抗体，所述抗体含有包含序列SEQ ID No 13、14或15的重链可变区片段以及人类重链恒定区部分或其片段；和包含序列SEQ ID No 16、17、18或19的轻链可变区片段以及人类轻链恒定区部分或其片段。
9.任一项前述权利要求的人源化抗体，所述抗体选自含有下述区段的抗体含有SEQ ID No 13的重链可变区以及含有SEQ ID No 16的轻链可变区；含有SEQ ID No 13的重链可变区以及含有SEQ ID No 17的轻链可变区；含有SEQ ID No 13的重链可变区以及含有SEQ ID No 18的轻链可变区；含有SEQ ID No 13的重链可变区以及含有SEQ ID No 19的轻链可变区；含有SEQ ID No 14的重链可变区以及含有SEQ ID No 16的轻链可变区；含有SEQ ID No 14的重链可变区以及含有SEQ ID No 17的轻链可变区；含有SEQ ID No 14的重链可变区以及含有SEQ ID No 18的轻链可变区；含有SEQ ID No 14的重链可变区以及含有SEQ ID No 19的轻链可变区；含有SEQ ID No 15的重链可变区以及含有SEQ ID No 16的轻链可变区；含有SEQ ID No 15的重链可变区以及含有SEQ ID No 17的轻链可变区；含有SEQ ID No 15的重链可变区以及含有SEQ ID No 18的轻链可变区；含有SEQ ID No 15的重链可变区以及含有SEQ ID No 19的轻链可变区。
10.一种编码含Sequence ID No 15的重链可变区的多核苷酸，其为CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA。
11.一种编码氨基酸序列Sequence ID No 14的多核苷酸序列，其为CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA。
12.一种编码氨基酸序列Sequence ID No 15的多核苷酸序列，其为CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA。
13.一种编码氨基酸序列Sequence ID No 16的多核苷酸，其为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
14.一种编码氨基酸序列SEQ ID No 17的多核苷酸序列，其为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
15.一种编码氨基酸序列SEQ ID No 18的多核苷酸，其为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
16.一种编码氨基酸序列SEQ ID No 15的多核苷酸，其为GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
17.一种药用组合物，其包含权利要求1-8任一项的修饰抗MAG抗体或其功能片段以及药学上可接受的稀释剂或载体。
18.一种治疗或预防人类中风及其它神经疾病/紊乱的方法，所述方法包括给予所述有需要病人有效剂量的权利要求1-8任一项的抗MAG抗体，所述抗体包括修饰抗体或其功能片段。
19.权利要求1-8任一项抗MAG抗体，包括修饰抗体或其功能片段，在制备治疗或预防中风和其它神经疾病/紊乱的药物中的应用。
20.一种在罹患或有危险罹患中风或其它神经疾病/紊乱的病人中抑制神经退变和/或促进功能恢复的方法，所述方法包括给予所述有需要病人有效剂量的权利要求1-6任一项的抗MAG抗体，所述抗体包括修饰抗体或其功能片段。
21.权利要求1-8任一项的抗MAG抗体，包括修饰抗体或其功能片段，在制备罹患或有危险罹患中风或其它神经疾病/紊乱的病人中抑制神经退变和/或促进功能恢复的药物中的应用。
22.一种治疗或预防人类中风或其它神经疾病/紊乱的方法，所述方法包括胃肠道外给予所述病人治疗有效剂量的抗MAG抗体的步骤。
23.权利要求22的方法，其中抗MAG抗体经静脉给药。
24.权利要求18、20或24任一项的方法，其中其它神经疾病/紊乱选自外伤性脑损伤、脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、额颞性痴呆、周围神经病、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病和多发性硬化症。
25.一种促进轴突发芽的方法，所述方法包括使人轴突接触权利要求1-8任一项的抗MAG抗体的步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述方法为体外方法。
全文摘要
本发明涉及抗髓鞘相关糖蛋白(MAG)的修饰抗体、含有所述抗体的药物制剂以及所述抗体在神经疾病/紊乱的治疗和/或预防中的应用。
文档编号C07K16/28GK1671417SQ03818477
公开日2005年9月21日 申请日期2003年8月5日 优先权日2002年8月6日
发明者J·H·艾利斯, V·格尔马谢夫斯基 申请人:葛兰素集团有限公司