专利名称：6－(4－取代－苯胺基)嘧啶衍生物、其制备方法以及包含其的抗病毒药物组合物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用作抗病毒剂的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物，更具体地，本发明涉及一种由下式表示的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其药学可接受盐，其对丙型肝炎病毒(HCV)的复制具有极强的抑制作用 其中，R代表C1-C4直链或支链烷氧基羰基、杂环基羰基、或者羧基烷基，本发明还涉及制备该化合物的方法，以及含有作为活性成分的该化合物的抗病毒药物组合物。
背景技术：
丙型肝炎病毒是主要为输血后和社区获得性的非甲型、非乙型病毒性肝炎的主要致病因素。一旦感染HCV后，根据其表现的症状，约80％的感染人群发展为慢性肝炎，而约20％的感染人群发展为引起肝硬化的急性肝炎，而肝硬化最终转化为肝癌。根据最近发表的报道，世界范围内2亿以上的人口感染了HCV。例如，450万以上的美国人感染了该病毒(该数量最多可达到1千5百万)，且5百万以上的欧洲人为HCV患者。
HCV是黄病毒(Flaviviridae)科的成员之一。更具体地，HCV在其膜内具有大小约为9.5kb的(+)-RNA(单链正指向RNA)基因组。RNA基因组在5’和3’端具有非翻译区域(UTR)和长的开放阅读框架(ORF)。该ORF由宿主细胞酶表达为包括3,010至3,040个氨基酸的多蛋白质，且被宿主细胞及其本身的蛋白酶分成3个结构蛋白和6个非结构蛋白。此外，在该基因组的5’和3’端分别具有均一保守区域。该区域被认为在病毒的蛋白质生成和RNA复制中具有重要作用。
长的ORF表达为多蛋白质，通过共翻译加工或者翻译后加工，将其加工为结构蛋白，即，核心抗原蛋白(核心)和表面抗原蛋白(E1，E2)，以及非结构性蛋白，NS2(蛋白酶)、NS3(丝氨酸蛋白酶，解旋酶)、NS4A(丝氨酸蛋白酶辅助因子)、NS4B(涉及抗性的蛋白酶辅助因子，)、NS5A、以及NS5B(RNA依赖性RNA聚合酶，RdRp)，其中每种蛋白都与病毒复制相关。结构蛋白通过宿主细胞的信号肽酶分为核心、E1、和E2。同时，非结构蛋白由病毒的丝氨酸蛋白酶(NS3)及辅助因子(NS2，NS4A，和NS4B)进行加工。结构蛋白中的核心抗原蛋白与表面抗原蛋白一起形成病毒的壳体，而诸如NS3和NS5B的非结构蛋白质在病毒的RNA复制中起到重要的作用(参考文献Bartenschager，R.，1997，Molecular targets ininhibition of hepatitis C virus replication，Antivir.Chem.Chemother.8281-301)。
与其它黄病毒类似，病毒RNA的5’和3’端具有具有均一保守的非翻译区域(UTR)。已知该区域通常在病毒的复制中起到重要的作用。5’端具有由341个核苷酸组成的5’-UTR，该部分具有4个茎环结构(I，II，III，和IV)。实际上，该部分是作为内在核糖体进入位点(IRES)而起作用，该位点对于表达蛋白质的翻译加工是必须的。特别是，已有报道说具有最大和最稳定结构且具有保守序列的茎III是核糖体结合中最重要的部分。此外，已知病毒蛋白质通过从AUG启动翻译加工来进行表达的，其中AUG存在于茎IV的单链RNA中(参考文献Stanley，M.Lemon and MasaoHonda，1997，Internal ribosome entry sites within the RNA genomes ofhepatitis C virus and other Flaviviruses，seminars in Virology 8274-288)。
另外，3’端具有包含318个核苷酸的3′-UTR。已知该部分在NS5B结合的起始步骤中起到重要的作用，其中NS5B是RNA复制的一种必须的酶。根据三级结构的序列可以看出，3′-UTR由3个不同的部分组成从5’端起始至第98个核苷酸(98nt.)的-X-tail-5′、具有连续UTP的-poly(U)、以及其余的3′-UTR-。更具体地，X-tail-5′部分由具有非常保守序列的98个核苷酸组成，且具有3个茎环结构，从而形成非常稳定的三级结构。这可能是为何认为X-tail-5′部分对NS5B结合非常必要的原因。而且，有报导说-poly(U)-部分诱导了嘧啶轨迹(track)，因此促进了RNA聚合酶作用。最后，剩余部分的3′-UTR部分具有环状三级结构且在NS5B结合中起到重要作用。但是，其结构稍微有些不稳定。总体说来，已知HCV RNA的3’端区域RNA复制启动时具有NS5B结合的必要结构(参考文献Yamada etal.，1996，Genetic organization and diversity of the hepatitisC virus genome，Virology 223255-281)。
在HCV的其它酶中，NS5B是一个直接参与RNA复制的酶，因此其非常重要。NS5B是一个包含591个氨基酸的酶，其分子量约为68kDa。NS5B酶中有两个RNA-结合结构域，即RBD1和RBD2。RBD1存在于83至194位的氨基酸之间，RBD2存在于196至298位的氨基酸之间。同时，对RNA结合及活性所必须的结构域氨基酸为′Asp′(220位氨基酸)、，′Gly′(283位氨基酸)、′Gly′(317位氨基酸)、′Asp′(318位氨基酸)、′Asp′(319位氨基酸)，以及′Lys′(346位氨基酸)。进一步地，只要存在病毒本身的RNA模板，该酶就能启动聚合酶反应而无需其它引物(参考文献Lohmann，V.etal.，1997，Biochemical properties of hepatitis C virusNS5B RNA dependent RNA polymerase and identification of amino acidsequence motifs essential forenzymatic activity，J.viral.718416-8428)。
HCV的RNA基因组在1989年通过分子克隆被分离出来(参考文献Choo，Q-L，etal.，1989，Isolation of acDNA clone derived from ablood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome.Science 244359-362)。尽管从那时开始已经对HCV进行了大量的分子生物学研究，但是由于缺少更有效的细胞培养系统以及动物模型，因此上述研究都有限制性。幸运的是，通过引入肝细胞瘤细胞系已经在一定程度上解决了上述问题，利用上述细胞系能够更稳定地复制HCV(参考文献Lohmann，V.，F.Korner，J-O Koch，U.Herian，L.Theilmann，R.Bartenschlarger，1999，Replication of subgenomic hepatitis c virus RNAs in a hepatoma cell line.Science 285110-113)。
迄今为止，实际上还没有发现对HCV非常有效的疫苗或者疗法。因此，目前世界上许多药厂和研究单位正致力于开发丙型肝炎的疗法和预防方法。世界上的HCV患者很普遍，且HCV发展成为肝硬化/或者肝癌的频率要远高于HBV。而且，尽管发展为慢性肝炎的频率很高，但是对病毒感染机制的研究仍在进行中。人们通过输血、静脉给药或者纹身被传染上HCV，但是大多数的HCV传染通过直接的血液接触发生。然而，仍不确切知道40-50％的HCV患者是怎样被传染上的。考虑到这种情况，非常迫切需要研制出一种新的疫苗和疗法来治疗该疾病。通常，HCV在不同的株系和突变种之间具有不同的基因型。一旦一个人由HCV而发展为慢性肝炎，则不难发现由于遗传性变型其很容易再次感染或者同时感染。由于这一原因，几乎不可能成功开发出有效的HCV疫苗。HCV治疗的另一个实例是利用α干扰素。但是，已经证实该方法并非很好，原因是由于α干扰素对不同的HCV基因型的作用具有很大差别，并且当停止给药时，多数情况下患者会复发感染丙型肝炎。因此非常有必要研制出一种抑制剂，其仅与特异的HCV蛋白结合，从而控制HCV的复制。这类研究的最佳靶点为HCV的NS3蛋白酶/解旋酶和NS5B RNA聚合酶。由于宿主细胞并不需要这些酶，但是这些酶对HCV自身的复制确是必须的，因此这些酶在开发抗HCV的制剂中非常有用。换言之，HCV的NS5B{RNA依赖性RNA聚合酶(复制酶)}是HCV的一个必需的酶，这使得该酶成为抑制HCV复制的一个良好的靶点。
既然不能通过疫苗来防治HCV，就引入了一种利用α干扰素和利巴韦林的新的治疗方法。但是，该方法也导致了副作用，且在丙型肝炎的治疗上不那么有效。例如，约25％的HCV患者对干扰素治疗没有反应，有约25％对其有暂时性反应，但是又复发感染为丙型肝炎。剩余的50％患者在治疗完成后ALT保持在正常水平，HCV RNA转为阴性。但是，其中的50％在3-6个月内又复发感染为丙型肝炎。简单说来，仅有25％的HCV患者表现出多于6个月的持续反应。同时，在全世界的患者中所发现的最多的HCV亚型为1型(1a，1b)，与2型和3型相比，1型不容易通过干扰素进行治疗。当采用干扰素和利巴韦林联合治疗时，疗效也为双倍的。已知单独使用利巴韦林时，其对HCV几乎没有作用，甚至还会产生诸如红细胞溶血性贫血等副作用。因此仅在干扰素治疗效果不好或者再次复发时才使用利巴韦林。迄今为止，还没有人研制出这样一种抗病毒剂，其能通过抑制HCV的复制来治疗丙型肝炎，而这种作用是通过其对HCV的特异性作用产生的。
因此，本发明的目的在于研制一种非核苷酸化合物，其几乎没有毒性和副作用，但是表现出对HCV的极佳的抗病毒活性，本发明是通过研究任何可能抑制重组HCV RNA聚合酶(NS5B，RNA聚合酶)活性的化合物来进行的。
本发明人进行了很多努力来研制对HCV具有极好抗病毒活性的化合物从而试图开发一种新的几乎没有毒性和副作用的HCV治疗剂。本发明人最终成功合成了一种如式1所示的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物，已经证实这些化合物对抑制HCV的复制确实非常有效。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，以及制备所述化合物的方法。
本发明的另一目的在于提供一种包含作为活性成分的上述化合物的药物组合物，该组合物对抑制和治疗丙型肝炎几乎没有副作用，且很经济。
为了实现上述目的，本发明提供了一种可用下式I表示的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其药学可接受盐
其中，R代表C1-C4直链或支链烷氧基羰基、杂环基羰基、或者羧基烷基。
优选地，式I中的R为异丙氧羰基、(3-吡啶基)羰基、(4-吡啶基)羰基或羧甲基。
如前所述，可使用上述化合物的药学可接受盐的形式。对于所述盐来说，可使用通过药学可接受的游离酸制备的酸加成盐。具有化学式I结构的化合物能够采用现有技术中已知的常规方法来制备药学可接受的酸加成盐。所使用的游离酸可为有机酸以及无机酸。例如，无机酸包括氢氯酸、氢溴酸、硫酸，以及磷酸。有机酸包括柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、羟基乙酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸或天冬氨酸。
在另一方面，本发明提供了一种制备6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物的方法，该方法以下述反应路线表示
反应路线(I) 其中R代表R代表C1-C4直链或支链烷氧基羰基、杂环基羰基，或者羧基烷基。
如上述反应路线(I)所示，根据本发明制备6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物的方法包括下述步骤(i)使式II的4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶与式III的4-(4-吗啉基)苯胺反应，以生成式IV的2-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-氯代嘧啶中间体；(ii)使步骤(i)中制得的式IV的中间体与式V的哌嗪反应，以生成式VI的2-(甲基硫代)-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶中间体；以及(iii)使步骤(ii)中制得的式VI的中间体与适宜的卤代化合物反应以生成本发明的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物。
在上述反应路线(1)中所用的起始原料以及反应物的4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶、4-(4-吗啉基)苯胺、哌嗪和卤代化合物等都可购买得到。在步骤(iii)中所用的卤代化合物是向目标化合物中引入取代基的适宜反应物，本领域技术人员可根据所引入的取代基的不同来进行适当的选择。
更详细地，上述制备方法中的步骤(i)和(ii)中，反应在有机溶剂中在有机碱的存在下进行，所述有机溶剂例如甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮等，所述有机碱例如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡啶、2，6-二甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺等。在40-65℃的温度范围内反应12至45小时完成反应。
更详细地，上述制备方法中的步骤(iii)中，反应在有机溶剂中在有机碱的存在下进行，所述有机溶剂例如二氯甲烷、氯仿、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等，所述有机碱例如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡啶、2，6-二甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺等。根据所用卤代化合物的种类以及活性的不同，可在0-10℃的温度范围内反应1小时完成上述反应步骤，或者在40-80℃的温度范围内反应12小时完成反应。
本发明还提供了用于治疗和预防丙型肝炎的药物组合物，其包含作为活性成分的以式I所表示的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物和/或其药学可接受盐。
采用化学式I的化合物作为丙型肝炎治疗剂时，其可通过口服或者临床所用的其它路径进行给药，且可用作普通药物的形式。在需要制备时，可采用常规使用的稀释剂，包括填充剂、辅助剂(builder)、粘结剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂，或者赋形剂。而且，可用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。所述固体制剂包括一种以上的化学式I的化合物以及一种以上的赋形剂，所述赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖，或者明胶。用于口服给药的液体剂型可以为悬浮液、溶液、油性药物或者糖浆，但也可使用单纯的稀释剂，例如水、液体石蜡，或者其它诸如润湿剂、增甜剂、香味剂、防腐剂等赋形剂。用于非口服给药的液体制剂可以为无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液或者油性药物。优选使用的非水性溶剂和悬浮液为丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、以及诸如油酸乙酯的可注射酯类。
可根据患者的性别、年龄、以及状态等来控制化学式I的化合物的有效剂量。一般说来，可按照10至1000mg/天、更优选20至500mg/天的剂量对成人给药，或者每天分成1至3次给药。
优选实施例的详细描述现在将通过下述实施例对本发明进行详细描述。但是，所述实施例仅用于解释本发明而非对本发明作出限制。
制备12-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-氯嘧啶的制备顺次向80ml甲醇中加入4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶5.85g、4-(4-吗啉基)苯胺5.35g、以及三甲胺5.1ml，然后在55-60℃加热18小时。将反应混合物冷却至20℃，搅拌2小时，过滤，并用25ml的甲醇洗涤，得到结晶产物。将所得产物于30-40℃下进行真空干燥，得到8.79g的所需化合物(收率87％)。
m.p.159-161℃1H-NMR(CDCl3)，ppmδ2.51(s，3H)，3.15(t，4H)，3.86(t，4H)，6.19(d，1H)，6.76(s，1H)，6.91(d，2H)，7.16(d，2H)制备22-甲基硫代-6-4-[(4-吗啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶的制备顺次向80ml甲醇中加入制备例1中制备的2-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-氯嘧啶5.6g、无水哌嗪14.3g，以及三甲胺2.6ml，然后在55-60℃加热40小时。将反应混合物冷却至20℃，搅拌2小时，过滤，并用25ml的甲醇洗涤，得到结晶产物。将所得产物于30-40℃真空干燥，得到6.17g的所需化合物(收率96％)。
m.p.232-234℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.39(d，3H)，2.70(brs，4H)，3.02(brs，4H)，3.35(brs，4H)，3.70(m，4H)，5.53(s，1H)，6.87(d，2H)，7.34(d，2H)，8.78(s，1H)实施例12-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-(异丙氧基羰基)哌嗪-1-基]嘧啶的制备顺次向40ml二氯甲烷中加入2-甲基硫代-6-4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-(4-哌嗪-1-基)嘧啶1g和三甲胺0.4ml，搅拌10分钟充分溶解，然后冷却到0℃。在0-5℃下缓慢加入2.85ml的氯甲酸异丙基酯(1.0M的甲苯溶液)，然后在0-5℃下搅拌反应混合物20分钟。加入40ml水，然后在20℃下搅拌10分钟。分离有机层并用40ml的水洗涤一次，减压浓缩。残余物用30ml乙醚结晶，室温搅拌2小时，然后过滤得到产物。用5ml乙醚洗涤所得产物，然后在30-40℃下进行真空干燥，得到1.05g的所需化合物(收率86％)。
m.p.155-157℃1H-NMR(CDCl3)，ppmδ1.23(d，6H)，2.48(s，3H)，3.15(brs，4H)，3.50(brs，8H)，3.85(t，4H)，4.93(m，1H)，5.41(s，1H)，6.42(s，1H)，6.90(d，2H)，7.15(d，2H)实施例22-甲基硫代-6-4-[(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-[(3-吡啶基)羰基]哌嗪-1-基]嘧啶的制备顺次向40ml二氯甲烷中加入2-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶1g和三甲胺0.4ml，搅拌10分钟充分溶解，然后冷却到0℃。在0-5℃下缓慢加入0.48g的盐酸烟酰氯，然后在0-5℃下搅拌反应混合物30分钟。加入40ml水，然后在20℃下搅拌10分钟。分离有机层并用40ml的水进行洗涤一次，减压浓缩。残余物用4ml的二氯甲烷助溶剂和40ml乙醚结晶，室温下搅拌2小时，然后过滤得到固态产物。将所得产物用5ml的乙醚洗涤然后在30-40℃下进行真空干燥，得到1.13g的所需化合物(收率89％)。
m.p.131-133℃1H-NMR(CDCl3)，ppmδ2.47(d，3H)，3.15(brs，4H)，3.49(m，6H)，3.86(m，6H)，5.43(s，1H)，6.89(d，2H)，7.15(d，2H)，7.35(t，1H)，7.75(dd，1H)，8.67(d，2H)实施例32-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-[(4-吡啶基)羰基]哌嗪-1-基]嘧啶的制备采用与上述实施例2相同的方法制备所需的化合物，但采用盐酸异烟酰氯来代替盐酸烟酰氯。
收率93％m.p.155-156℃H-NMR(CDCl3)，ppmδ2.47(d，3H)，3.15(brs，4H)，3.41(brs，2H)，3.57(brs，4H)，3.85(m，6H)，5.42(s，1H)，6.50(s，1H)，6.91(brs，2H)，7.15(brs，2H)，7.28(m，2H)，8.70(d，2H)实施例42-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-(羧甲基)哌嗪-1-基]嘧啶的制备步骤12-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-(乙氧基羰甲基)哌嗪-1-基]嘧啶的制备顺次向50ml乙腈中加入制备2中制备的2-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶3g、氯代乙酸乙基酯0.9ml以及三甲胺1.3ml，并加热。将反应混合物在70-80℃下搅拌7小时。然后使反应混合物缓慢冷却到20℃，加入30ml的甲醇，搅拌1小时，过滤得到固态产物。用15ml甲醇洗涤所得产物，在35-45℃下真空干燥，得到3.41g的所需化合物(收率93％)。
m.p.88-90℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.16(m，3H)，2.39(d，3H)，3.02(brs，4H)，3.15(m，2H)，3.35(d，4H)，3.44(brs，4H)，3.70(d，4H)，4.04(m，2H)，5.56(d，1H)，6.87(m，2H)，7.34(d，1H)，7.37(d，1H)，8.82(s，1H)步骤22-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-(羧甲基)哌嗪-1-基]嘧啶的制备顺次向30ml甲醇中加入在步骤1中制备的2-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-[4-(乙氧羰甲基)哌嗪-1-基]嘧啶2.5g、水25ml、浓度为3N的氢氧化钠水溶液5.3ml，并加热。将反应混合物在50-60℃下搅拌1小时。然后使反应混合物缓慢冷却，在10～20℃下加入浓度为3N的盐酸调节pH至6.0～7.0。搅拌混合物1小时，过滤得到固态产物。用20ml水洗涤所得产物，在40-50℃下真空干燥，得到2.24g的所需化合物(收率95％)。
m.p.156-158℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.39(d，3H)，2.62(brs，4H)，3.02(brs，4H)，3.20(s，2H)，3.47(brs，4H)，3.71(m，4H)，5.57(s，1H)，6.87(d，2H)，7.34(d，2H)，8.84(s，1H)试验例1对HCV RNA聚合酶(RNA依赖性RNA聚合酶，NS5B)活性的体外抑制作用的测试进行下述的体外实验来检测本发明的化合物对HCV RNA依赖性RNA聚合酶活性的抑制作用。
重组HCV RNA聚合酶的构建体采用下述方法制备HCV RNA聚合酶。
从HCV-1b型的HCV患者的血液中得到HCV cDNA，利用PCR对NS5B区域(1773碱基对)进行扩增，并克隆至杆状病毒转移载体VLHIS中，籍此制备重组转移载体。将制得的转移载体和野生型AcNPV载体共转染至Sf9昆虫细胞系中，得到含有组氨酸标记的重组载体pVLHIS-NS5B的重组杆状病毒。使充分培养的昆虫细胞感染上所得的重组杆状病毒，并在含有10％FBS的Grace’s培养基中培养3-4天。离心培养物肉汤，只取被感染的细胞。用PBS洗涤细胞3次，然后用结合缓冲液[50mM磷酸钠(pH 8.0)，30mM NaCl，1mM咪唑，1mM DTT，10％甘油，1％ NP-40]重悬浮细胞，超声破碎，得到澄清化的裂解液。利用Ni-NTAHis结合树脂(Novagen)通过亲和柱层析来纯化重组NS5B，制备纯化的NS5B蛋白。(His)6-标记的NS5B与Ni-NTA树脂结合，用含有50mM咪唑的结合缓冲液进行洗涤。采用步骤梯度(100-300mM)的方法利用含有咪唑的结合缓冲液来洗脱结合的NS5B。利用缓冲液[50mM Tris-HCl，50mMNaCl，1mM DTT，5mg MgCl2，10％甘油]来透析NS5B蛋白组分，然后于-70℃分成小的等分试样。
含有HCV 3’端(3′-UTR)的RNA模板的构建体采用下述方法来制备含有HCV 3’端(3′-UTR)的RNA模板。
利用PCR方法从丙型肝炎患者血液的1b HCV RNA中得到HCV的3′UTR cDNA(220bp)，并将其克隆至pcDNA3载体中。利用限制性酶EcoRI来制备含有3′-UTR的线性DNA片段，在采用T7 RNA聚合酶来制备含有3′-UTR的RNA片段的体外转录中，可采用上述制备的DNA片段作为模板。
检测本发明的化合物在体外对重组HCV RNA聚合酶的抑制活性采用下述方法来检测本发明的化合物对重组HCV RNA聚合酶的体外抑制活性。
制备适于待检测的样品的抗生蛋白链菌素包被的板。向每孔加入25μl的检测缓冲液[50mM Tris-Cl(pH 7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，20mM KCl，1mM EDTA，1mM DTT]、10μl纯化HCV RNA聚合酶、以及200ng的聚合酶和3′-UTR模板RNA。然后，加入5μl的待检测样品，使终浓度分别为10、1、0.1和0.01μg/ml。最后，向每孔中加入10μl的反应物溶液，该反应物溶液含有DIG-(地高辛)-UTP、生物素-UTP、ATP、CTP、GTP，以及UTP，这些物质作为与HCV 3′-UTR RNA的RNA模板进行聚合酶反应的核苷酸。将反应混合物在22℃温育60分钟。在HCV聚合酶的作用下，复制了包括与生物素和DIG偶联的UTP的新生成RNA，这些新的RNA能够通过生物素偶联的UTP与包被在孔上的抗生蛋白链菌素相结合。当反应完成后，将板用200μl的洗涤缓冲液(pH 7.0，Roche Co.)洗涤3次，以除去未结合的物质和杂质。然后，向每孔中加入100μl的抗-DIG-POD的二级抗体(过氧化物酶，Roche Co.)，并在37℃温育1小时。然后，再次用洗涤缓冲液洗涤板孔。最后，向每孔中加入100μl的ABTSR(Roche Co.)作为POD底物，并反应15至30分钟。利用ELISA读数器(Bio-Tek instrument Co.)在405nm来测量光密度(OD)。对HCV聚合酶活性的抑制作用通过减去没有样品的阳性对照的OD值来进行计算。结果如下述表1所示。
表1
由上表可以看出，本发明化合物对HCV RNA聚合酶的活性具有很强的抑制作用，由于该酶在HCV的复制中起到重要的作用，因此利用本发明化合物的这一特性可抑制HCV的复制。优选地，本发明的化合物能用作丙型肝炎的治疗剂或者预防剂。
试验例2细胞毒性检测利用Hep G2细胞采用MTT方法检测式I化合物的细胞毒性，其中MTT是一种公知的细胞毒性的体外检测方法。结果发现，试验中所用的所有化合物的CC50都大于100μg/ml，这显示这些化合物很安全，毒性极低。
工业实用性如上所述，以式I表示的本发明的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物对丙型肝炎病毒的复制具有很强的抑制作用，且毒性很低。因此，可有利地将其用作丙型肝炎的治疗剂或者预防剂。
权利要求
1. 6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，由下式I表示 其中，R代表C1-C4直链或支链烷氧基羰基、杂环基羰基，或者羧基烷基。
2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中R选自异丙氧基羰基、(3-吡啶基)羰基、(4-吡啶基)羰基或羧甲基。
3.一种制备6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物的方法，包括下述步骤(i)使式II的4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶与式III的4-(4-吗啉基)苯胺反应，生成式IV的2-甲基硫代-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-氯代嘧啶中间体；(ii)使式IV的中间体与式V的哌嗪反应，生成式VI的2-(甲基硫代)-6-[4-(4-吗啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶中间体；以及(iii)使式VI的中间体与适宜的卤代化合物反应以生成6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物 其中，R代表C1-C4直链或支链烷氧基羰基、杂环基羰基，或者羧基烷基。
4.用于治疗和预防丙型肝炎的药物组合物，包括作为活性成分的权利要求1所述的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及用作抗病毒剂的6－(4－取代－苯胺基)嘧啶衍生物，更具体地涉及一种由下式(I)表示的新的6－(4－取代－苯胺基)嘧啶衍生物或其药学可接受盐，其对丙型肝炎病毒(HCV)的复制具有极强的抑制作用，其中，R代表C
文档编号C07D413/14GK1642950SQ03806667
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月25日 优先权日2002年4月4日
发明者金钟宇, 李常旭, 李根炯, 韩在辰, 朴相珍, 朴乙镛, 慎重哲 申请人:B&C生物制药株式会社